JPH08501534A - リンパの搬送組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 リンパ系に活性薬剤を搬送するための組成物は、複数のコロイド粒子と、各粒子に会合した活性薬剤とを有し、この組成物において、各粒子の表面の疎水性比は１０より少ないか、調節薬剤が、この調節薬剤によって与えられる前進接触角が６０゜より少なくなるように、各粒子の表面上に吸着され若しくは付着しているか、吸着される層の厚さが１０nmより少ないか若しくはアルブミン取込比が０．２ないし０．５である。この組成物はこれら要件の一つを満たしていてもまたはそれ以上を満たしていてもよい。好ましい調節薬剤は、非イオン性界面活性剤で、特にポリエチレングリコールを含有するブロック共重合体である。

Description

【発明の詳細な説明】 リンパの搬送組成物 本発明はリンパの搬送組成物に関し、特にリンパ系に活性薬剤を搬送するため の組成物に関する。 リンパ系には、体液およびタンパク質、脂肪粒子等を含む粒状物質を運ぶ際の 重要な役割がある。大きいタンパク質および特定の細胞（リンパ球）は血漿から 組織液中に進む。これら必須の成分を血液循環に戻すことは、リンパの主な機能 である。リンパはまた、胃腸管での脂肪の消化の生成物、乳び脂粒を血液循環中 に運ぶ際に重要な役割を果たす。リンパ系のこの特性は、J. M. YoffreyおよびF . C. Courtice ( lymphatics, lymph and the lymphomyeloid complex, Academi c Press, London, 1970) によって詳細に検討された。リンパ系はまた、腫瘍が 広がる際にも重要な役割を果たす。悪性細胞はリンパ系に入り、リンパ節によっ て捕捉され得るが、そこで第二の腫瘍が生じ得る。最終的に、リンパ鎖(lymph c hain)の全体が巻き込まれ得る。リンパはまた、他の器官、例えば肺に、腫瘍が 広がる際にも巻き込まれ得る。結果として、悪性疾患の診断および治療の際にリ ンパのドレナージおよびリンパ節を検査する必要がかなりある。この主題は、S. E. Strand および他者 (L. Berguist 他、Microspheres and Drug Therapy, Im munological and Medical Aspects p.263 (Davis他編) Elsevier 1984)によって 広範囲にわたって検討された。 コロイド粒子には、薬をリンパ系に搬送する際に果たし得る役割と同様に、リ ンパ系の特性を特徴づける際にも重要な役割がある。コロイド粒子の放射線診断 薬剤としての用途は、Strand 他 (Bergquist 他、Seminars in Nuclear Med. l 2 (1983) 9-19) によって検討された。固体粒子、エマルジヨンおよび小胞（リ ポソーム）を含む広範囲にわたる物質が調べられた。コロイド状薬剤の搬送はそ の粒径に強く依存し、リンフオシンチグラフィー(lymphoscintigraphy)に関して 示唆されるコロイドの大きさの中央値は、約４０〜６０nmであることがわかった 。 例えば皮下投与の後の、局所的なリンパ節中への取り込みはかなり少なく、２〜 ５時間後の典型的な値は１〜１０％である (Strand, S. E. CRC Crit. Rev. Dru g Carrier Systems 6 (1989) 211-237) 。 リンパ系の診断および治療用薬剤の搬送に関するターゲッティングシステム(t argeting system)は、以下の特徴を有していなければならない： (i) 注射部位から十分に広がる (ii) 第一および第二の双方の、局所的なリンパ節中での取り込みが優れて いる。 粒径、粒子数および粒子の性質を変化させることによって、リンパの取り込み を増加させる様々な試みがなされ、これらはStrand(CRC Crit. Rev. Drug Carri er System 6 (1989) 211-237) によって検討された。リポソーム系を用いて、リ ンパ節での取り込みの水準で記録された中で最良のものは、４８時間で１〜２％ である。これは、抗体の付着によって約５％まで増加させることができる。(Lip osomes as drug carriers, G. Gregoriadis編，p.51 John Wiley, 1988,Kaledin , J. 他，Nat. Cancer Inst., 69(1982) 67-71中の Patel, H.M.、Turner, A. 他 ，Biochim. Biophy. Acta 760(1983) 119-125)。 GB 2108967には、クレモフオル系列(Cremophor series)のエトキシル化された 界面活性材およびポロクサマーを有するコロイド状アルブミン粒子の混合材が記 載され、そしてリンパの取り込みに関する測定が記載されている。リンパ節中で 隔離された量が、投与後２時間報告されている。ポロクサマー物質としては、８ ０％のエチレンオキシド含有量を有する親水性物質のみが調べられた。第一のリ ンパ節での取り込みは、ポロクサマー２３８に関して報告されたものでは、１７ ％の高い値で増加した。ポロクサマー１８８に関しては、コロイドの約１３％が 第一の節中で捕捉された。しかし、第二の節中ではわずか１％しか見出せないと 報告された。 第一および第二の双方のリンパ節中に多くを取り込むことは達成されなかった 。そしてこのことは、診断および治療用薬剤をリンパ系に搬送する際に、非常に 不都合である。 Illum および他者は、体循環におけるドラッグデリバリーおよびドラッグター ゲッテイングの応用として、界面活性剤、そして特にポロクサマーおよびポロク サミン(poloxamines)を用いることを記述している。Illumは、米国特許第４９０ ４ ４７９号において、ウサギの骨髄をコロイド状の担体の標的にするために、 またはこの様な粒子を体循環中に抑留するために、この物質、ポロクサマー４０ ７およびポロクサミン９０８が、どのように用いられるかを記述している。本発 明に至る作業において、これらの先行技術の物質の研究を行った：いずれの物質 も、局所的なリンパ節をコロイド状粒子の標的にする際に都合が良くないことが わかった。 大変驚くべきことに、小さいコロイド状粒子の、表面の疎水性／親水性を調節 することにより、局所的なリンパ節でのコロイド状粒子の取り込みを大きく増大 させることができることを我々は見出した。この方法で、投与量の２０％を越え る量を、皮下注射後２４時間目のラットの局所的リンパ節中に搬送することがで きた。さらに、第二のリンパ節での取り込みは、大きく増大した。採用したこの 種の表面調節がリンパ節の取り込みを決定する際に重要であることがわかった。 粒子が過剰に疎水性の場合は、これら粒子は注射の部位で抑留される。粒子が過 剰に親水性の場合は、これら粒子は注射部位からリンパ節を経て循環中に運ばれ る。この様に、中間の親水性／疎水性の特性を有するコーティングが好ましいこ とを我々は見出した。この様な系は注射の部位から十分に運ばれ、常在性マクロ ファージによる捕捉の課程でリンパ節（第一および第二）で十分に抑留される。 この取り込みの課程は、オプソニンとして知られるあるリンパタンパク質で粒子 が被覆される、レセプターで仲介された段階を含んでいてもよい。 このように、本発明は第一に、複数のコロイド粒子と、各粒子に会合した活性 薬剤とを有する、リンパ系に活性薬剤を搬送するための組成物であって、各粒子 の表面の、本書に定義された疎水性比が１０より少なく、好ましくは５より少な くなるように調節されている組成物を提供する。この疎水性比は、ブチルアガロ ースを用いる疎水性相互作用クロマトグラフィーの方法によって測定される。 さらに別の側面において本発明は、複数のコロイド粒子と、各粒子に会合した 活性薬剤とを有する、リンパ系に活性薬剤を搬送するための組成物であり、調節 薬剤か各粒子の表面上に吸着され若しくは付着し、この調節薬剤によって与えら れる、本書に定義された前進接触角が６０゜より少ない組成物を提供する。 前進接触角は、吸着等温線にプラトーを与える濃度でポリスチレンの表面に調 節薬剤が吸着され若しくは付着するときに得られるものである。 さらにまた別の側面において本発明は、複数のコロイド粒子と、各粒子に会合 した活性薬剤とを有する、リンパ系に活性薬剤を搬送するための組成物であり、 調節薬剤が各粒子の表面上に吸着され若しくは付着して、この調節薬剤の層の厚 さが１０nm、好ましくはこの層厚か０．８から４．０nmである組成物を提供する 。この層厚は、被覆されていない粒子を対象として用いる、光子相関分光学によ る。 さらにまた別の側面において本発明は、複数のコロイド粒子と、各粒子に会合 した活性薬剤とを有する、リンパ系に活性薬剤を搬送するための組成物であり、 調節薬剤が各粒子の表面上に吸着され若しくは付着して、この表面の、本書に定 義されたアルブミン取込比（ＡＵＲ）が０．２ないし０．５である組成物を提供 する。このアルブミン取り込み比は対照ポリスチレン粒子に吸着された量に対す る試験粒子に吸着されたヒト血清アルブミンの量の比率として定義される。 上記要件は、本発明による組成物の粒子の表面特性を代わりに測定するために 適用されてもよく、または組成物が１を越える上記要件を満たすように、組み合 わせて適用されてもよい。 本書で用いられる活性薬剤という用語は、調剤上または治療上活性な薬剤とし て、または診断用薬剤として定義される。 この活性薬剤はいかなる公知技術によって粒子と会合されてもよいが、リンパ 節による粒子の取り込み時点まで、活性薬剤が粒子と会合されたままでいるよう な方法によらなければならない。 好ましくは、各粒子の表面は調節薬剤の吸着または付着によって調節される。 「調節薬剤」の語は、粒子の表面疎水性／親水性を調節するいかなる薬剤をも表 すものとして本書では用いられる。好ましい物質は非イオン性界面活性剤であり 、特に好ましい物質は、ポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンのブロ ック共重合体を有するポロクサマーおよびポロクサミン系列の各々である。ポロ クサマー１８２、１８３、１８４、１８５、２３４、２８２、３３３、４０１、 ４０２、４０３およびポロクサミン５０４、９０４および１３０２が特に適して いることがわかった。所望の粒子表面の特徴を与える他の物質を調節薬剤として 用 いてもよく、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、ポリエチレン グリコールーデキストラン コンジユケート(conjugates)等の変性デキストラン 、ガングリオシド、多糖類、リン脂質、糖脂質、タンパク質およびこれらの混合 物および変性物が含まれる。 好適に用いられる調節薬剤の分子量は、１０００より大きい。 この調節薬剤がエチレンオキシド基を含有する重合性物質である場合、親水性 領域が有するエチレンオキシド基は、好ましくは４２より少ない。この重合体は 吸着、合体またはグラフトによって付着され得る。この物質がポロクサミン（プ ルロニック (Pluronic)) またはポロクサマー（テトロニック(Tetronic)）系列 のブロック共重合体である場合は、８０％より低いポリオキシエチレン含有量が 好ましい。 コロイド状粒子は、好ましくは粒径の範囲か１〜２５０nmであり、より好まし くは１〜１００nmであり、最も好ましくは最大６０nmである。 この粒子は、例えばポリスチレン粒子、炭素粒子等の非生分解性のものであっ ても、あるいは生分解性のものであってもよい。好適な生分解性粒子には、マイ クロ球体(microspheres)およびナノ粒子(nanoparticles)、マイクロカプセルま たはナノカプセル(nanocapsules)、エマルジヨン、マイクロエマルジヨン(micro emulsions)、リポソーム、およびリポタンパク質とキロミクロンの擬態が含まれ る。これらに関して好適な物質には、ポリ乳酸およびポリグリコール酸およびこ れらの混合物、ポリラクチドコグリコリド混合物、ポリリンゴ酸、ポリアルキル シアノアクリラート(polyalkylcyanoacrylates)、ポリ酸無水物、ポリカプロラ クトン、ポリフォスファゼン(polyphosphazenes)や、ヒアルロン酸、アルブミン 、デキストラン、ゼラチン、デンプン、コラーゲン、多糖類およびこれらの誘導 体、および大豆油等の植物油、等の天然の物質が含まれる。誘導体とは、このよ うな天然の物質の共有結合エステルおよびエーテルを意味する。 調節薬剤は好ましくは粒子の表面に吸着されるが、所望の表面の疎水性を有す る粒子を生じる他の方法で付着されてもよい。例えば、粒子表面に優先的に存在 する好適な調節薬剤は、粒子生成の際に合体されてもよく(FEBS 268,vol l (199 0), 235-237 およびPolymer,1992,vol 33,No 5, 1112 以降を参照）、好 適な化学的部分が粒子表面上の反応グルーピング(groupings)にグラフトされて いてもよく(Methods in Enzymology vol 112, 1985, p67 以降を参照) 、またさ らに疎水性成分が粒子調製の際に相分離されてもよい。本書で用いられる「付着 した」の語は、調節薬剤を粒子に合体するかまたはグラフトするいかなる方法を も含む。 付着した調製薬剤は、粒子調製の際に合体させることができる。以下は好適な 方法の例である。 生成の際に立体的に安定化された、ポリ（D,L-ラクチド-コ-グリコリド)および ポリ（β-リンゴ酸-コ-リンゴ酸ベンジル）のナノ粒子の調製 ポリ(D,L-ラクチド-コ-グリコリド)またはＰＬＧＡ（７５：２５、Ｍｗ_GPC６ ３kD）を Boehringer Ingelheim (Ingelheim，ドイツ）より Resomer（登録商 標）RG755 の形態で購入した。異なる組成を有する、ポリ（β-リンゴ酸-コ-リ ンゴ酸ベンジル）（ＰＭＬＡＢｅ_100−ｘＨ_ｘ、ｘは重合体の鎖中の酸性繰り返 し単位の百分率を示し、全範囲は頭字語のＰＭＬＡＢｅＨと呼ばれる）共重合体 を用いた：ＰＭＬＡＢｅ₁₀₀（Ｍｗ ３６kD；Ｉ＝１．５ポリスチレン標準を用 いて検定された、ジオキサン中でのサイズ排除クロマトグラフィーによる）、Ｐ ＭＬＡＢｅ₉₀Ｈ₁₀およびＰＭＬＡＢｅ₈₀Ｈ₂₀（部分的加水分解により、ＰＭＬＡ Ｂｅ₁₀₀から誘導される）。ホロクサマー４０７および１８８、およびポロクサ ミン９０８、９０４および１５０４(BASF Corporation，米国)を、購入されたま まで用いた。 この共重合体（ＰＭＬＡＢｅ₁₀₀、ＰＭＬＡＢｅ₉₀Ｈ₁₀またはＰＭＬＡＢｅ₈₀ Ｈ₂₀）をアセトン（１０ml、ＰＬＧＡに関しては２０．０mg/ml、ＰＭＬＡＢｅ Ｈに関しては５．０mg/ml）中に溶解し、共重合体の沈殿を示す濁りか目視で観 察されるまで、脱イオン水およびエタノールの混合物（１：１）をマグネチック スターラー（Ika-Labortechink，ドイツ）によって攪拌されている共重合体溶液 中に滴下して加えた（２５Ｇシリンジ針）。次に、これら予備形成されたナノ粒 子の懸濁物を、ガラスビーカー（５０ml）に入れた水性界面活性剤溶液（１５ml ） に加え、有機溶媒が完全に蒸発するまで室温でマグネチックスターラーを用いて かき混ぜた。このナノ粒子を、脱イオン水を溶離液として用いて（流動率１．５ ml/分）、 Sepharose 4B gel (Pharmacia, Uppsala, スウェーデン) を充填した クロマトグラフィーカラム (C 40/26 Pharmacia, Uppsala, スウェーデン) に通 して調製媒体から分離した。 グラフトされた調節薬剤を有する好適な粒子は、例えば、グラフトされた表面 のＰＥＧ鎖を有する、径の範囲が８０〜１４０nmのヒト血清アルブミンマイクロ 球体である。これらは、攪拌の際に酢酸エチルを用いて、ヒト血清アルブミン- ポリエチレングリコール共重合体の２％水／アセトン混合物溶液を沈殿させるこ とによって調製される。このマイクロ球体は、グルタルアルデヒドを用いて架橋 される。代わりに、 DextranolxPEGをアセトンおよびＰＥＧ４００と混合し、こ の混合物にヒト血清アルブミンの２０％溶液を滴下して加え、一晩攪拌すること により、表面のグラフトされたＰＥＧ鎖を有するヒト血清アルブミンマイクロ球 体を生成することもできる。このDextranolxPEG (変性されたデキストランおよ びＰＥＧの共重合体) は、変性されたデキストラン分子上の活性アルデヒド作用 によって、アルブミンを架橋する。 共有結合したＰＥＯ鎖を有するマイクロ粒子(microparticles)、グラフトされ た粒子、は共重合の課程で生成される。例えば、ポリエチレングリコール巨大モ ノマー(macromonomer)がスチレンと共に用いられる。この共重合反応混合物の組 成は、表面での巨大モノマーの量を変えてマイクロ粒子を調製するように変える ことができる。界面活性剤を用いない、スチレンのＰＥＧ２０００との共重合は 、開始剤として過硫酸カリウムを用いる Ottewill 他 (Br. Polym. J 19, 435, 1987) によって用いられている方法に基づき行われる。この重合は、継続的な窒 素流下で三つ口丸底フラスコ中で行われ、他の二つの口には水冷した還流凝縮器 と温度計とが取り付けられた。この反応フラスコをサーモスタット付きの油浴を 用いて一定温度（７０℃）に保ち、フラスコの内容物をマグネチックスターラー を用いて一定速度で攪拌した。フラスコに超純水を加え、７０℃で平衡を保ち、 このとき一つの口を通して（蒸発を最小限に抑えるために）フラスコの水面より 下にスチレンを加えた。スチレンを加えた直後に、ＰＥＧ２０００（超純水に溶 解 したもの）および開始剤過硫酸カリウム（超純水に溶解したもの）を別々に加え 、７０℃で２４時間反応を進行させた。 生じたラテックスを Watman No 1 ろ紙（イギリス）でろ過し、次いで各ラテ ックスの一部を以下の透析によって精製した。透析物を毎日交換して、２週間か けて、９００mlの超純水に対して約２０mlのラテックスを透析した。 好適なリポソーム系は、リン脂質およびコレステロールの混合物を用いて調製 される。このモル比率は、所望の組成に応じて変えることができる。適当な表面 の特徴を有するリポソームを得るために用いられる、変性されたリン脂質の例と しては、ポリエチレングリコール-ホスファチジルエタノールアミンが挙げられ る。 ポリエチレングリコール-リン脂質の調製は、文献に十分に記載されている(例 えば、Litzingerおよび Huang. Biochim. Biophys. Acta. 1127. 249 1992)。 ポリエチレングリコール リン脂質は、クロロホルム中のリン脂質およびコレ ステロールの混合物に添加される。この脂質混合物は、丸底ガラス管中におかれ 、有機溶媒が真空蒸発される。こうして得られる脂質の膜は、緩衝液を加えるこ とにより懸濁し、多重膜リポソームを形成する。音波処理またはこれらのリポソ ームをヌクレオポア(nucleopore)フィルターに通すことにより、小さな単ラメラ 小胞が形成される。 この組成は、２４時間目でラット肉趾中で測定された場合は、好ましくは以下 の分布になるべきである： (i)投与量の２５％未満が注射部位に残る (ii)投与量の少なくとも２０％が第一および第二のリンパ節中にある (iii)第一の節で少なくとも５％、かつ第二の節中で少なくとも５％で、節間 での分布が良い。 このようなリンパの搬送組成物は、以下を含む多くの用途に関して都合が良い ： (i)リンパ管造影法、リンフォシンチグラフィー、コンピュータ助成断層撮 影法(computer assisted tomography)（ＣＡＴ）、磁気共鳴画像法、超音波等の 画像化および視覚化形式。これらの技術により、新生物の関与、特に悪性疾患 をもつ患者の近付きにくい節の、検知に関する情報が得られる。節の大きさおよ び節の充填(filling)を知るためにも有益な場合がある。 診断の用途でリンパ節に向けられた粒子は、酸化鉄等の強磁性物質や、ペルフ ルオロオクチルブロミド等のペルフルオロケミカル(perfluorochemicals)や、テ クネチウム-９９ｍ、インジウム-１１１、ヨウ素-１３１または１２３などの放 射性同位元素標識や、サマリウム-１５３などの中性子放射化によって精製され た放射性標識等の、適当なコントラスト薬剤または画像化薬剤を含有する。 (ii)放射線治療。放射線核種で標識された、１９８-Ａｕおよび９０-Ｙ等の コロイドや、１３１-Ｉで放射線標識された油を、転移性疾患を切除するために 使用する。 (iii)マイクロ球体、マイクロカプセル、エマルジョンおよびリポソーム等の 担体を用いる、リンパ節への薬の搬送。この点で関連する薬剤および疾患には、 フィラリア症、ブルセラ症、結核症およびＨＩＶ等の節の感染の治療用の抗微生 物薬剤や、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン等の抗腫瘍薬剤または腫瘍に対す る抗体や、インターフェロン、ＭＤＰ、シクロスポリンなどのマクロファージ調 節薬剤が含まれる。 本組成物は、標準的な方法で投与され、特に皮下注射によって投与される。本 組成物は、注射に関する通常の要件を満たし、したがって、無菌で非発熱性の、 そして好ましくは食塩水等の非炎症性の溶液に入れて投与される。この化合物を 投与するために、１回または複数回の注射が行われる。投与量は、治療または検 査される解剖学的面積にしたがうが、典型的には０．５ml未満の容量が注射され る。 これより、添付の図面を参照して本発明の好ましい実施態様を詳細に説明する ： 図１は、粒子表面特性とリンパ節の取り込みとの関係を説明したグラフである 。 図２は、節中の粒子量に対する注射部位における粒子量の比として表した、吸 着層の厚さとリンパ節の取り込みとの関係を示す。 図３は、図２と同様に表した、疎水性の比とリンパ節の取り込みとの関係を示 す。 図４ａは、２４時間後、注射部位において粒径が粒子抑留に及ぼす効果を示す 。図４ｂは、２４時間後、局所的リンパ節において粒径が粒子抑留に及ぼす効果 を示す。 我々は、粒子の表面を調節して疎水性／親水性の中間とすることにより、リン パ節によるコロイド粒子の取り込みが驚くほど増大することを見出した。この方 法で、我々は、第一および第二のリンパ節では少なくとも投与量の１５％の取り 込みを達成し、そのうち少なくとも５％は第一および第二の各リンパ節にあり、 そして投与量の２５％未満が注射部位に残留した。 粒子に求められる疎水性／親水性の中間の定義は、表面自由エネルギー（接触 角もしくは疎水性相互作用クロマトグラフィーもしくはアルブミン取込比）ある いは調節薬剤の層の厚さの概念に基づくものである。これらの概念および目的パ ラメータの測定は、これまでに本発明の発明者他により議論されており、以下を 参照することができる。Advances in Separations using Aqueous Phase System s, Applications in Cell Biology and Biotechnology, Fisher 他編 Plenum Pr ess, New York, 1989, pp149-155 中の Muller, R. H., Davis, S. S. および M ak, E.、Targeting of Drugs with Synthetic Systems, Gregoriadis 他編, Ple num, New York, 1986, pp239-263 中の Muller, R. H., Davis, S. S., Illum, L. および Mak, E.。 ［接触角］ 表面と調節薬剤溶液との間の接触角は、表面の疎水性の評価基準に用いること ができる。用いられる方法は、Troster, S. D. および Kreuter, J., Contact a ngles of surfactants with a potential to alter body distribution of coll oidal drug carriers on poly(methyl methacrylate)surfaces, Int. J. Pharm. 45 (1988) 91-100 に記載されている。測定される接触角は、ブロック共重合 体の０．２％水溶液と標準重合性物質、本願の場合はポリスチレンの平らな表面 との前進接触角である。接触角の値が大きいほど調節薬剤の性質は親水性が高い 。前進接触角の値が小さいことは、親水性が低いことを示す。 次のような方法を用いることができる。 ガラス製の顕微鏡のスライドを使用するに先立ち、クロム酸に浸した後に再蒸 留した水を十分量用いて洗浄した。スライドに付着しているポリスチレンの膜を 除くために、スライドをジクロロジメチルシランの０．５％ジクロロメタン溶液 に１０秒間浸けて予めシラン処理し、アセトンにつづいて蒸留水で濯ぎ、７０℃ にて１２時間乾燥させた。その後スライドを、ポリスチレン（分子量４００００ ；ＢＤＨ, Poole, イギリス）の５％トルエン溶液に一度浸漬し、塵埃のない環 境で７０℃にて１２時間乾燥させることによりポリスチレンをディップコートし た。 調節薬剤の０．２％w/v再蒸留水溶液を予め上述のように洗浄したガラス容器 を用いて調製した。ポリスチレンコーティングしたスライド上での３μｌの液滴 の前進接触角を接触角ゴニオメーター (Troster および Kreuter, 1988; Van Os s および Gillman, 1972) を用いて測定した。結果は、別々の液滴１０例±標準 偏差について接触角測定の平均として与えられる。この操作は室温にて行なった 。 グラフト表面については、表面を適切に処理したスライドの表面に表面群がグ ラフトされ、同様の操作を採用することができ、水滴の接触角が測定された。ポ リエチレングリコール（ＰＥＧ）が接着したポリスチレンの表面疎水性の測定と しては、該ＰＥＧ-ポリスチレン共重合体（Polymer, 33 (5), 1992, 1112 の記 載により製造）を、シラン処理したスライドをこの共重合体の５％トルエン溶液 に浸し、乾燥させることによって、全てこれらのスライドにコーティングした。 前進接触角は、ゴニオメーターを用いて３μlの蒸留水の液滴について測定した 。 ［疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）］ 粒子の疎水性-親水性は、既に引用した Muller 他 (1989) による議論のよう にＨＩＣにより決定することができる。この研究法は、微生物学の分野にて上述 の技術から適用している。本発明においては、ブチルアガロース物質に基づく次 のような操作を行なった。ブチルアガロースカラム（展開溶媒体積２．５ml；Si gma, イギリス）を用いた。０．１％w/v重合体溶液中の、６０mmポリスチレン粒 子０．１％w/v懸濁液（一晩保温したもの）の１５０μｌをカラムに充填し、０ ．２Ｍ ＮａＣｌを含有するリン酸塩緩衝液（pH６．８，０．０２Ｍ）で溶離さ せた（溶離ピーク）。その後、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００を０．１v/v％含有する 緩衝液で全ての粒子が回収されるまでカラムを洗浄した（洗い出しピーク）。 この操作は、室温下で行なった。 粒子の検出は、３８０nmにてＣｅｃｉｌ ＣＥ２７２ 紫外線分光光度計を透 過する光によって行なった。切断し、計量するこの方法は，得られたピーク領域 の測定に用いられ、ＨＩＣ比は以下に定義されるように算出され： ［調節薬剤の層の厚さ］ 粒子表面に吸着される調節薬剤の層の厚さは、様々な技術によって測定するこ とができる。本発明者らは、光子相関分光学(photon correlation spectroscopy )（ＰＣＳ）（レーザー光散乱(laser light scattering)）として知られる方法 を採った。この方法では、例えば、動物実験用のものと同程度の粒径のポリスチ レンの標準粒子が、平衡時にバルク相における濃度が変化せず、吸着等温線の停 滞領域において吸着が起こるような条件を与える濃度の重合体水溶液と平衡に達 する。この停滞領域については、Kayes および Rowlins, Colloid Polymer Sci. 257, 622-629 (1979) の刊行物により詳しく記載されている。これら粒子の粒 径はＰＣＳ法により測定され、同一の特性を有するが、重合体と共に保温されて はいない対照粒子と比較される。粒径における差の半分が吸収層の厚さにあたる 。粒子溶液は、光子相関分光学による吸収層厚さの測定に先立ち、０．１％w/v の重合体溶液中、濃度０．１％w/vの粒子懸濁液として一晩保温された。 続いて、測定に先立ち、試料をマキルヴェイン緩衝液(McIlvaine buffer)（pH ７；）で希釈して低濃度とし、２０００rpmにて５分間遠心機にかけ、塵もしく はアグリケート一切を除去した。測定は、モルヴァーン装置(Malvern apparatus )を用い、２０μｓのコリレーター・サンプル・タイム(correlator sample time )を用いて行なった。粒径は、１２回の測定の平均値を採り、さらにコーティン グさ れていない粒子の径の平均値と比較して吸収層を算出した。 調節薬剤が粒子表面に混入するか、もしくはグラフトする際、調節薬剤の層の 厚さは、Tadros (F. Candau および RH Ottewill (編), Scientific Methods fo r the Study of Polymer Colloids and Their Applications, Kluwer AcademicP ublishers, Netherlands, 1990, pp393-411 中の Polymer colloids as modelsf or studying inferfacial forces in concentrated dispersions) によって、そ して Prestidge および Tadros (Viscoelastic Properties of aqueous concent rated polystyrene latex dispersions containing grafted poly(ethylene oxi de) chains, J. Colloid Interf. Sci, 124, 1988, 660-665) もしくは Costell o 他, J.Colloid Interface Sci, 152, 237, 1992 によって記載されているよう に、レオロジー測定により決定される。 この方法においては、吸収層もしくはＰＥＧのようなグラフト親水性重合体の 層は、粒子の高濃度分散の相対粘度と有効容積分率との関係を研究することによ って測定することができる。 粒子の容積分率から、分散の相対粘度についての確かな経験式は、 上記ドハーティ・クリーガーの式(Dougherty-Krieger equation)により与えられ 、 比質量偏差である。 を与え、この有効容積分率は重合体の層の厚さ（δ）と以下の等式にしたがって 比例する。 レオロジー測定は、シリンダー平面が同心のＭ５００／Ｍ１５０ヘッドに適合 するハーケ・ロトヴィスコ(Haake-Rotovisco)（ＲＶ１００型）を用いて行なう ことができる。実験は２５℃にて行なう。流動曲線は、Ｘ-Ｙ記録計で記録した 一様な剪断応力と剪断比との関係を示している。相対粘度の値は、この曲線の勾 配から求められる。容積分率が低い場合、流動曲線は全くの直線状となり、ニュ ートン則に従うことを示している。容積分率が高い系では、分散はニュートン則 に従わず、流動曲線の直線部分が用いられる。 δの値は、反復操作によって得られ、ドハーティ・クリーガーの式によって与 えられる理想曲線に実験点を適合させるためにδの値が用いられる。 この方法は、下記のように吸着層の厚さを決定するためにも用いられる。 容積分率８％で平均粒径２５０nmのポリスチレンの分散は、共重合体の１％w/ v溶液中２５℃で２４時間平衡とすることによりブロック共重合体の吸着層でコ ーティングされた。 このようなコーティングされた系、もしくは様々な容積分率のグラフトＰＥＧ の分散を調製し、上記のように相対粘度について測定する。高い容積分率の系は 、より希薄な系を遠心することにより調製する。０．３から０．６の範囲の容積 分率を選択する。 調節薬剤のグラフト層の厚さは、'Adsorption from solution', Ottewill 他 編 p139, Academic Press 1983 中の、Harris 他, 'Determination of the adso rption of surface active agents by small angle scattering'、または p287C ogrove 他, An experimental study of polymer conformations at the solid/s olution interface に記載の方法、小角散乱（ＳＡＮＳ）によって測定すること ができる。 ［ヒトの血清アルブミンの吸着］ 粒子表面の相対的な疎水性もまた、タンパク質のような試料物質の取り込みに よって決定することができる。疎水性の粒子が、ヒトの血清アルブミンのような タンパク質を強力に吸着するが、その一方親水性の表面では吸着がずっと弱いこ とはよく知られている。したがって、相対的疎水性の尺度は、単一の精製したタ ンパク質種の水平面もしくは粒子表面への吸着を研究することによって創ること ができる。単位表面領域あたりでのミリグラムに換算した吸着量は、適当なパラ メータとして用いることができる。好ましくは、アルブミンの取込比（ＡＵＲ） を用いるのがよく、対照表面に対して、試験表面上で取り込まれた量の比として 定義されるのがよい。 ＡＵＲは、以下のような方法で決定される。０．５mg/mlのヒトの血清アルブ ミン（ＨＳＡ）溶液２０．０mlに、２４６μlの標識したＨＳＡとヨウ素１２５ とを加えた。ＨＳＡ溶液の特異的活量は８８４０cpm/μgであった。検討される 粒子および、その濃度と粒径が既知である任意の標準粒子を放射性標識アルブミ ンと共に保温した。こうして、ポロクサマーもしくはポロクサミンの２％w/v溶 液１mlを、直径２５０nmのポリスチレン粒子の２％w/v溶液１mlと共に一晩保温 した。０．３mlの粒子懸濁液に、０．２mlの緩衝液を加え、続いて１．０mlの標 識ＨＳＡを滴下して加えた。ＨＳＡとポロクサマーもしくはポロクサミンを含有 する対照を調製した。保温は１２時間行なった（保温管は、予め１mg/mlのＨＳ Ａ溶液４mlでコーティングした。２時間後、混合物を廃棄し、管を水で３回洗浄 した。）保温の後、粒子を１３，５００rpmにて遠心機にかけ、ペレット化させ た。粒子を洗浄し、均一な再懸濁液を得るために超音波をかけた。粒子に付着し た標識ＨＳＡの量は、ガンマ計数管を用いて決定した。 本発明の具体的な実施態様および対照実験を以下に示す。 ［実施例１］ ＰＣＳにより決定された６０nmの粒径のポリスチレン粒子 (Polysciences Ltd .イギリス) は、Huh Y., Donaldson, G.W. および Johnston, F.J., A Radiatio n-induced bonding of iodine at the surface of uniform polystyrene partic les, Radiation Research 60, 42-53 (1974) の方法を用いてヨウ素-１２５で表 面標識した。標識粒子は透析を行なって浄化し、その後ポロクサマーおよびポロ クサミン系列の一連のブロック共重合体と共に保温した。これらのブロック共重 合体は、ポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレン族を含む。該ブロック 共重合体の濃度は０．１％であった。非標識の粒子のアリコートもまた同様に保 温し、これらのＨＩＣパラメータおよび吸着した層の厚さを決定した。対応する 接触角の値は、重合体の０．２％水溶液と水平なポリスチレン表面とを用いて測 定した。 粒子をグループにわけたラットに注射した（ｎ＝４）。全ての実験において、 体重１６０〜２００ｇの雄のウィスター・ラットが、ハロセン麻酔状態で後肢の 肉跳に１００μlの注射量（ヨウ素-１２５で標識された０．１mgのポリスチレン 粒子；０．１％w/v重合体）の皮下注射を受けた。血液試料採取の後、２４時間 の時点で殺し、局所的リンパ節、すなわち膝窩、腸骨および腎臓の節、並びに主 要な身体組織を採り出し、会合したヨウ素-１２５の活量を求めるためにガンマ カウンターにかけた。結果を投与量の％として算出し、４度の注射の平均±標準 偏差として表した。結果を表１にまとめて示す。この結果は、ポロクサマーおよ びポロクサミンのようなコーティング材が、皮下注射した部位からの小粒子のド レナージを改善することを示している。ある特定の物質は、コーティングされて いない粒子および既に先行技術に記載のあるコーティング材と比較すると、リン パ節におけるポリスチレンミクロスフェアの隔絶が驚くべき量で増加している。 その取り込みは遠位（第二および第三の節）においてよりも局所（第一の節）に おいてより明白である。これらの結果は、表面を調製した粒子の適切な選択によ って、もっとも高率のリンパ節取り込みが可能であることを示している。この取 り込みは、既に報告されたいかなるコロイド系で得られるよりもずっと高率であ る。比を算出するには、リンパ節での量の方が、注射部位における量から換算す るよりも有用である。この値は、どの程度の粒子がその投与部位から標的部位に 移動するかを示している。 本発明者らは、効果的な標的設定のためには少なくとも投与量の２０％が２４ 時間で標的部位に到達し、また、上述のようなラット標本において測定するリン パ節取り込みと注射部位との比が１．０より大であることを定義する。なお、適 当な分布、すなわち第一および第二のリンパ節の間が望ましいのは、第一の節に 少なくとも５％、第二の節に５％が発現することによる。表１の結果からは、粒 子表面に疎水性／親水性の中間の性質を与えるような物質を用いることによって のみ、このような分布が達成されることが判る。 試験物質の吸着層の厚さと粒子のリンパ節取り込みとの関係は、リンパ節にお ける粒子の量と注射部位での粒子の量との比として表されるが、これを図２に示 した。この図から、０．８から４．０nmの厚さの吸着層を持つ粒子で取り込みが 最も多いことが判る。 試験物質のＨＩＣ比と粒子のリンパ節取り込みとの関係は、リンパ節における 粒子の量と注射部位での粒子の量との比として表されるが、これを図３に示した 。この図から、リンパ節による粒子の取り込みは疎水性／親水性の中間の性質の 粒子で最も多く、なかでもＨＩＣ比０．５から１０の粒子で多く、最も多いのは ＨＩＣ比が約４の粒子であることが明白に判る。 ［実施例２］（比較例） 同様の６０nmポリスチレン粒子も、英国特許２１０８９６７号に記載のＥＬＲ Ｈ４０とＲＨ６０（ポリエチレート化したヒマシ油、ポリオキシエチレン４０お よび６０、水素化したヒマシ油）のクレモフォル物質および、ＮＰ１Ｏ、ＮＰ４ ０，１５−Ｓ−９、１５−Ｓ−１５（ノンオキシノール（nonoxynol）１０、４ ０、パレス（Pareth）９と１５）のテルジトール物質（Tergitol materials）を 用いてコーティングした（表２）。濃度０．１％のものをコーティングに用いた 。コーティングされていない粒子およびポロクサミン９０４でコーティングした 粒子を対照として用いた。ポロクサミン９０４以外のこれら全ての物質では、性 能は劣悪であった。リンパ節におけるコーティングされた粒子の取り込みは低率 であり、投与部位に留るものは大量であった。 ［実施例３］ 過半数の実験において、粒子は担体重合体溶液と共に注射された。リンパ節の 取り込みを決定する際に重大なのは、界面活性剤として作用する重合体の効果よ りもむしろ、重合体の吸着層であり、それによって組織の粒子浸透特性を調節す ることを確認するために一連の実験が行なわれ、分子量５０，０００のカットオ フチューブ（cut-off tubing）中、１リットルの水に対する透析によって非吸着 性の重合体を除去した（Spectrum，イギリス）。Ｂａｌｅｕｘ検定（Baleux，M ．B．，C．R．Acad．Sci．Paris 274 1617（1972））で過剰の重合体が存在し ないことが示されるまで、透析液を毎日採取し、交換した。選択されたコーティ ング用重合体は、ポロクサミン９０４およびポロクサミン９０８であった。結果 を表３に示す。この結果は、ポロクサマーとポロクサミンの確かな標的設定効果 が、ある種の透析促進剤として作用する重合体よりもむしろ、調節された表面層 の存在によることを示している。実際、過剰なコーティング用重合体の除去は、 ポロクサミン９０４の場合により大幅に増加する。 ［実施例４］ 現行のリンパ節標的設定方式に比して本発明の優れた性能を示すために、実施 例１に述べたように研究を行なったが、実施例１では粒子としてＳｏｌｃｏ Ｎ ａｎｏｃｏｌｌ（Solco AGバーゼル スイス）を用いた。これは、テクネチウム −９９mで標識したアルブミン粒子からなるコロイド状懸濁液である。典型的な 標識コロイドの９５％が、精密濾過により評価した粒径で８０nmより小であるこ とが判っている。表４に示した結果では、この市販のリンパ節イメージング薬剤 が２４時間でリンパ節に供給するのは投与量の１０％末満であることを明示して いる。リンパ節の取込総量と注射部位での総量との比は、０．５未満である。 ［実施例５］ 粒子取り込みの時間的推移を追うために、実施例１に述べたように実験を繰返 したが、コーティングされていない粒子（対照）およびポロクサミン９０４と９ ０８でコーティングされた粒子を用いた。 ２時間、６時間および２４時間までのリンパ節総量の測定を行なった。表５の 結果は、リンパ節への取り込みは時間と共に増加することを示している。重合物 質ポロクサミン９０４を用いる好ましい方式では、２時間でのリンパ節における 取り込みは２１％であり、その一方、２４時間では２４％であった。 ［実施例６］ （アルブミン取込比の決定方法） ２（w/v）％のポリスチレン（ＰＳ）粒子（粒径２４８nm）（１１mg）懸濁液 ０．５５mlを、０．００５Ｍ マキルベインズ（McIlvanes）緩衝溶液、pH７． ４中ポロクサマー／ポロクサミンの２（w/v）％溶液０．５５mlと共に保温した 。対照では緩衝液０．５５mlを粒子に加えた。保温は室温にて一晩（約１８時間 ）行なった。 上記のうち１ｍｌすなわち１（w/v）％のコーティングされた懸濁液とＰＳ粒 子（１０mg）とを超遠心管にいれた。２．５ｍｌの緩衝液を加え、遠心に十分な 体積とした。粒子を５０．３ Ｔｉ ローターを用いて３５，０００ｇ（最大ｒ 、因子ｋ＝３０８）にて、Beckman Instruments （Palo Alto，カリフォルニア ）製のＬ８−６０Ｍ超遠心機中１５分間、減速を６に定めて遠心した。表面に浮 かぶものを除去し、ペレットは３．５mlの緩衝液中で激しく撹拌することにより 再分散した。粒子をさらに４度洗浄した。中間の２度の操作では、遠心を１２分 間に短縮した。最後に洗浄した後、０．８mlの緩衝液を加え、激しく撹拌し、超 音波をかけることによりペレットを最分散させた。各粒子系の濃度を、風袋を差 引いた超遠心管を計量することにより決定した。 使用した全ての試験管およびエッペンドルフ（Eppendorfs）は、ＨＳＡ（Albu tein，Alpha，Thetfordイギリス）で再度コーティングした。このことは、各々 の管を１mg/mlのＨＳＡ溶液と共に室温にて２時間保温することにより達成され た。処置後、蒸留水で管を３度洗浄した。 ０．５mg/mlのＨＳＡ溶液に７１０μ１のＨＳＡ−Ｉ¹²⁵を加えた（Ｉ¹²⁵標識 ＨＳＡ（ＨＳＡ−Ｉ¹²⁵）で、特異的活量は４６kBg/μg。 ＨＳＡ（Albutein） およびAmersham，Buckinghamshire製のＩ¹²⁵より調製したもの。）標識ＨＳＡの 特異的活量は、５０μlの標本５つの放射能を測定することにより決定され、１ ３０．１０Bq/μgであることが判った。 同一の３標本を調製した。約３mgの粒子を与えるに十分な、体積が既知（０． １６８ml〜０．４２３ml）の粒子を５mlのプラスチック試験管に加えた。緩衝液 を加えて０．５mlとした。IKA-Labortechnik（Staufen，ドイッ）製のIKA-Vibr ax-VX horizontal shakerにて２００の速度で振り混ぜながら、１mlの標識ＨＳ Ａを滴下して加えた。添加の後、振り混ぜる速度を４００にまで増大させた。室 温にて２時間保温した。 上記の各管より１．２ml（粒子では約２．４mg）を採り、エッペンドルフにい れた。これらをFicons（イギリス）製のMSE Hicrocentaur中、１１，６００gに て２５分間遠心した。表面に浮ぶものを除去し、粒子を１mlの蒸留水で３度洗浄 した。最後の洗浄の後、ペレットは再分散されなかった。LKB Wallac（フィンラ ンド）製の1282 Compugamma CSガンマ計数管で、各エッペンドルフの放射能を測 定した。エッペンドルフの壁に対するＨＳＡはねかえりの量（対照−粒子なし） は、粒子系としての結果より差引いた。 ［結果］ 結果を表６に示す。その表面が０．２から０．５のアルブミン取込比を有する ような粒子によって、最も高率のリンパ節取り込みが達成されることが判る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 イラム，リスベス イギリス国 ノッティンガム ザ パーク ケーヴンデッシュ クレセント ノース 19 (72)発明者 クリスティ，ニコラ イギリス国 ＮＧ８ ４ＨＪ ノッティン ガム ビルボロー チェトウィン ロード 23 (72)発明者 モグヒミ，モエイン イギリス国 ＮＧ７ １ＤＬ ノッティン ガム ザ パーク ホープ ドライブ 13

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 複数のコロイド粒子と、各粒子に会合した活性薬剤とを有する、リンパ系 に活性薬剤を搬送するための組成物であって、各粒子の表面の疎水性比が１０よ り少ないことを特徴とする組成物。 ２． 疎水性比が５より少ない、請求の範囲第１項記載の組成物。 ３． 複数のコロイド粒子と、各粒子に会合した活性薬剤とを有する、リンパ系 に活性薬剤を搬送するための組成物であり、調節薬剤か各粒子の表面上に吸着さ れ若しくは付着して、この調節薬剤によって与えられる前進接触角が６０゜より 少ないことを特徴とする組成物。 ４． 複数のコロイド粒子と、各粒子に会合した活性薬剤とを有する、リンパ系 に活性薬剤を搬送するための組成物であり、調節薬剤が各粒子の表面上に吸着さ れ若しくは付着して、この調節薬剤の層の厚さが０．８から４．０ｎｍであるこ とを特徴とする組成物。 ５． 複数のコロイド粒子と、各粒子に会合した活性薬剤とを有する、リンパ系 に活性薬剤を搬送するための組成物であり、調節薬剤が各粒子の表面上に吸着さ れ若しくは付着して、この表面のアルブミン取込比（ＡＵＲ）か０．２ないし０ ．５であることを特徴とする組成物。 ６． 複数のコロイド粒子と、各粒子に会合した活性薬剤とを有する、リンパ系 に活性薬剤を搬送するための組成物であり、調節薬剤が各粒子の表面上に吸着さ れ若しくは付着して、この調節薬剤の層の厚さが１０nmより少なくかつ各粒子の 表面の疎水性比が５より少ないことを特徴とする組成物。 ７． 複数のコロイド粒子と、各粒子に会合した活性薬剤とを有する、リンパ系 に活性薬剤を搬送するための組成物であり、調節薬剤が各粒子の表面上に吸着さ れ若しくは付着して、この調節薬剤の層の厚さが１０nmより少なくかつこの調節 薬剤によって与えられる前進接触角か６０゜より少ないことを特徴とする組成物 。 ８． 複数のコロイド粒子と、各粒子に会合した活性薬剤とを有する、リンパ系 に活性薬剤を搬送するための組成物であり、調節薬剤か各粒子の表面上に吸着さ れ若しくは付着して、この調節薬剤の層の厚さが１０nmより少なくかつこの表面 のアルブミン取込比（ＡＵＲ）が０. ２ないし０．５であることを特徴とする組 成物。 ９． 複数のコロイド粒子と、各粒子に会合した活性薬剤とを有する、リンパ系 に活性薬剤を搬送するための組成物であり、調節薬剤が各粒子の表面上に吸着さ れ若しくは付着して、この調節薬剤の層の厚さが１０nmより少なく、各粒子の表 面の疎水性比が１０より少なく、この調節薬剤によって与えられる前進接触角が ６０゜より少なくかつこの表面のアルブミン取込比（ＡＵＲ）が０．２ないし０ ．５であることを特徴とする組成物。 １０． 調節薬剤の層の厚さか０．８から４．０nmであることを特徴とする請求 の範囲第６項ないし第９項のいずれか一項記載の組成物。 １１． 粒径が１から２５０nmの範囲内にあることを特徴とする請求の範囲第１ 項ないし第１０項のいずれか一項記載の組成物。 １２． 各粒子の表面か調節薬剤の吸着又は付着によって調節されていることを 特徴とする請求の範囲第１項又は第２項記載の組成物。 １３． 調節薬剤か非イオン性界面活性剤であることを特徴とする請求の範囲第 １項ないし第１２項のいずれか一項記載の組成物。 １４． 調節薬剤がブロック共重合体であるこを特徴とする請求の範囲第１３項 記載の組成物。 １５． ブロック共重合体がポリエチレングリコールを含有することを特徴とす る請求の範囲第１４項記載の組成物。