JPH08501444A

JPH08501444A - Recombinant xylanase

Info

Publication number: JPH08501444A
Application number: JP6501304A
Authority: JP
Inventors: ピーターヘーゼルウッド，ジェフリー; ジョンギルバート，ハリー
Original assignee: バイオテクノロジーアンドバイオロジカルサイエンシズリサーチカウンシル; ユニバーシティオブニューカッスル−アポン−タイン
Priority date: 1992-06-17
Filing date: 1993-06-17
Publication date: 1996-02-20
Also published as: EP0652961A1; BR9306580A; FI945928A0; WO1993025693A1; FI945928A; NZ253280A; CA2138383A1

Abstract

(57)【要約】嫌気性菌類、特にＮｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍから、組換えキシラナーゼが誘導される。その酵素は、キシランに対して高度に特異的であり、特にパルプ及び紙産業において工業的価値を有する。その酵素の特定の短縮された形態、及び短縮されたＤＮＡ配列によってコードされた酵素はその高い発現レベルゆえに好ましい。 (57) [Summary] Recombinant xylanase is derived from anaerobic fungi, especially Neocallimastix patriciliarum . The enzyme is highly specific for xylan and has industrial value, especially in the pulp and paper industry. The particular truncated form of the enzyme and the enzyme encoded by the truncated DNA sequence are preferred due to their high expression levels.

Description

【発明の詳細な説明】組換えキシラナーゼ本発明は嫌気性菌類より誘導し得る組換えキシラナーゼ（ｘｙｌａｎａｓｅ）に関する。植物ヘミセルロースの主要な成分であるキシランは、主にアセチル、アラビソシル及びグルクロノシル残基によって置換された１，４−結合β−Ｄ−キシロピラノースユニットのポリマーから成る。堅木キシランは、典型的には、キシロースユニットのおよそ１０パーセントが４−Ｏ−メチルグルクロン酸側鎖にα−１，２−結合、そしてキシロース残基の７０パーセントがＣ−２またはＣ−３位置でアセチル化されているＯ−アセチル−４−Ｏ−メチル−グルクロノキシランである。針葉樹のキシランは、一般に１０パーセントを越えるキシロースユニットがα−１，３−結合アラビソフラノース残基で置換されているアラピソ−４−Ｏ −メチル−グルクロノキシランである。キシランをそれを構成している単糖に転換するには、一組の微生物酵素が協同的に作用する。これらは、エンド−β−１．４−キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８），β−キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３７）及びキシランのバックボーンから側鎖糖（グリコシダーゼ）を切断し、あるいはアセチル基を除去する一連の酵素を含む（ＤｅｋｋｅｒＲ．Ｆ．Ｈ．，及びＲｉｃｈａｒｄｓ，Ｇ．Ｎ．，Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.32:277-35 2(1976);Ｂｉｅｌｙ，TrendsBiotechnol.3:286-290(1985);Ｐｏｕｔａｎｅｎら、“AccesoryEnzymes Involved in the Hydrolysis of Xylans”In:Enzymes in Biomass Conversion,ACS Symposium Series 460,pp426-436,Ed.G.F.Letham,(199 1)）。キシランを分解する微生物は、一般に多数の遺伝子によってコードされているキシラナーゼのイソ酵素型を発現する。（Ｈａｚｌｅｗｏｏｄら、FEMS Mic robiol.Lett.51:231-236(1988);Ｇｉｌｂｅｒｔら、J.Gen.Microbiol.134:3239- 3247(1988);Ｃｌａｒｋｅら、FEMS Microbiol.Lett.83:305-310(1991)）。いくつかのキシラナーゼはキシランのみを加水分解する（Ｈａｌｌら、Mol.Mi crobiol.3:1211-1219(1989);Ｗｏｎｇら、Microbiol.Rev.52:305-317(1988)）。キシランを加水分解する多くの微生物はセルロースも分解する。切断される結合の類似性（β−１，４−グリコシド結合）、及び、セルラーゼとキシラナーゼとの間に時々観察される交差特異性（ｃｒｏｓｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）から、これらの酵素の系統発生上の関係は興味深い問題である。昨今、配列の比較位置づけ（ｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔ）及び疎水性クラスター分析を用いて植物の細胞壁ヒドロラーゼを８つの酵素群に分けた（Ｈｅｎｒｉｓｓａｔら、Gene 81:83-95(1989);Ｇｉｌｋｅｓら、Micrbiol.Rev.55:303-315(1991)）．キシラナーゼはセルラーゼとの決め手になるような配列上の同一性を示さず、このことは、その２つの酵素が別個の先祖の遺伝子から進化したことを示唆している。多くの植物細胞壁ヒドロラーゼは２つの別個の蛋白質領域から成る。すなわち、触媒領域（ＣＤ）が、ヒドロキシアミノ酸／プロリンを多く含有する連結配列（ｌｉｎｋｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ）によって非触媒セルロース結合領域（ＣＢＤ；Ｇｉｌｋｅｓら、Microbiol.Rev. 55:303-315(1991)；Ｋｅｌｌｅｔｔら、Biochem.J.272:369-376(1990)；Ｇｉｌｂｅｒｔら、Mol.Microblol.4:759-767(1990)）に連結している。ＣＢＤの正確な役割については議論が多いが、好気性菌類セルラーゼについてはＣＢＤはその酵素の結晶セルロース加水分解において決定的役割を果たす（Ｔｏｍｍｅら、Eu r.J.Biochcm.170:575-581(1988)）。原核生物のセルラーゼ及びキシラーゼにおけるこの蛋白質領域の役割はより不明確である（Ｆｅｒｒｅｉｒａら、Biochem. J.269:261-264(1990)）。それらのモジュール状の構造に加え、セルラーゼは、延長された反復配列をしばしば含む（Gilkes et al.Microbiol.Rev.55:303-315( 1991)）。これらの直列的反復の正確な役割の多くは未解明である。多くのセルロース分解及びヘミセルロース分解原核生物はウシやヒツジのルーメンに棲んでいる。最近、嫌気性ルーメン菌類もセルロースとキシランとの双方を効率的に分解することが示され（Ｏｒｐｉｎ及びＬｅｔｃｈｅｒCurr.Microbi ol.3:121-124(1979)；Ｌｏｗｅら、Appl.Environ.Microbiol.53:1216-1223(1987 )）、また、類似の菌類が大型の草食動物の消化管に棲んでいる（Ｏｒｐｉｎ及びＪｏｂｌｉｎ，“Anaerobic fungi”.In：TheRumen Microbiol Ecosystem,P.N .Hobson(Ed),pp 129-150,Elsevier,London(1988)）。ルーメン菌類ネオカリマスティクスフロンタリス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘｆｒｏｎｔａｌｉｓ）のセルラーゼ複合体はＷｏｏｄら、Biochemistry and Geneticsof Cellulose Degr adation:FEMS Symp.43:31-52(1988)によって特徴を述べられている。下等な真核生物は、Ｍｒ１，０００，０００−２，０００，０００の大きな多酵素複合体を合成し、それはすみやかに結晶セルロースを加水分解する。その複合体は実質的なエンドグルカナーゼ、及びいくらかのβ−グルコシダーゼ活性を含有する。その菌類はまた、アビセラーゼ（Ａｖｉｃｅｌａｓｅ）、恐らくセロビオヒドロラーゼも合成する。もう一つのルーメン菌類ネオカリマスティクスパトリシアルム（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍ）は、ろ紙セルロース、Ａｖｉｃｅｌ^TM（微細結晶セルロースのトレードマーク）とキシラン（Ｗｉｌｌｉａｍｓ及びＯｒｐｉｎCan．J.Microbiol .33:418-426(1987)）を加水分解する細胞外酵素を産生する。これらの酵素のいずれもその特徴を定められていない。植物細胞壁ヒドロラーゼをコードするネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）についての限定された情報は述べられている（Ｒｅｙｍｏｎｄら、FEMS Microbiol.Lett.77:107-112(1991 )）。キシランはリグニンと共に大部分の植物の第１及び第２細胞壁中に見い出される。キシランとリグニンの併存関係は特に紙パルプ処理におけるキシラナーゼの商業上の潜在的可能性への鍵である。ＵＳＡのＳａｎｄｏｚＰｒｏｄｕｃｔｓＬｔｄは既に、紙及びその他の木材山来製品の製造の際木材パルプの処理において歓迎されない茶色のリグニン由来の残渣を漂白する為に通常使用される塩素及び塩素誘導化合物に少なくとも部分的に取って替わらせる為、粗菌類キシラナーゼを使用した試みを実際に行なった。今日の木材パルプ処理プラントの塩素需要がそのようであるので、各プラントが自身の二酸化塩素製造ユニットを持っている場合もある。塩素の使用を回避することによる紙産業への利点は明白である。すなわち、廃物処理、操作員の安全及びプラント資本の改善が、もし塩素の適切な代替物が得られれば、達成され得る。しかしながら、紙産業は競争がきびしく、利益マージンが狭い。従っていかなる塩素代替物でも高価でなく経済的に生産され得なければならず、また、当然のことながら、パルプ及び紙製造業者が、その使用の利点に納得するほど十分に効果的なものでなければならない。ネオカリマスティクスパトリシアルム（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍ）由来キシラナーゼの完全な長さのｃＤＮＡ及び蛋白質配列は、ドイツ、ハイデルベルグのＥＭＢＬデータバンクから、１９９２年５月５日、アクセス番号Ｘ６５５２６によって入手可能であった。キシラナーゼはＸＹＬＡと称し、対応遺伝子はｘｙｎＡと称した。Ｎ．パトリシアルム（Ｎ．ｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍ）由来ＸＹＬＡ酵素のような嫌気性菌類由来の個々のキシラナーゼから得られる修正されたキシラナーゼは産業上使用、特にパルプ及び紙の製造において適切になるような特質を持っていることが判った。驚くべきことに、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）が、酵素の発現を増加させるものと考えられる。本発明の第一の局面によれば、嫌気性菌類のキシラナーゼと実質的に相同な少なくとも一つの触媒領域を有し、かつ完全な長さの天然キシラナーゼではないキシラナーゼが提供される。より好ましい触媒領域は、嫌気性菌類山来の天然キシラナーゼの触媒領域と同一である。しかしながら、本発明の目的の為、例えば、もし第１の配列が第２の配列の生物学的活性を共有し、アミノ酸レベルにおいて少なくとも約４０％の相同性があれば、第１の配列は第２の配列と実質的に相同である。従って本発明のこの局面のキシラナーゼの触媒領域は、嫌気性菌類の天然キシラナーゼの触媒領域と少なくとも約４０％の相同性を有する。一般に、比較される２つのアミノ酸配列間の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％あるいは９０％の相同性（後ほど好ましい）があるほうがより好ましい。相同性は、代替的あるいは付加的に核酸レベルで評価しても良い。第１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡは第２のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（ｃＤＮＡであってもゲノムのＤＮＡであっても良い）と実質的に相同であり、それとハイブリダイズ（ｈｙｂｒｉｄｉｓｅ）するものであってもよく、あるいは遺伝暗号の縮重がなければハイブリダイズするものでもよい。ハイブリダイズ形成条件はおよそ０．９モルの塩溶液中６５ ℃といったストリンジェントな条件にし得る。嫌気性菌類、それらは消化管（特にルーメン）菌類であり得るが、以下のものを含む：Ｎ．パトリシアルム（Ｎ．ｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍ）、Ｎ．フロンタリス（Ｎ．ｆｒｏｎｔａｌｉｓ）、Ｎ．フルレイエンシス（Ｎ．ｈｕｒｌｅｙｅｎｓｉｓ）及びＮ．スタントペンシス（Ｎ．ｓｔａｎｔｈｏｒｅｎｓｉｓ）のようなネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）ｓｐｐ．，Ｓ．コミュニス（Ｓ．ｃｏｍｍｕｎｉｓ）のようなスフェロモナス（Ｓｐｈａｅｒｏｍｏｎａｓ）ｓｐｐ．，Ｃ．エキ（Ｃ．ｅｑｕｉ）のようなカエコミセス（Ｃａｅｃｏｍｙｃｅｓ）ｓｐｐ．，Ｐ．コミュニス（Ｐ．ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、Ｐ．エキ（Ｐ．ｅｑｕｉ）、Ｐ．ドウンボニカ（Ｐ．ｄｕｍｂｏｎｉｃａ），Ｐ．レタルギクス（Ｐ．ｌｅｔｈａｒｇｉｃｕｓ）及びＰ．マイ（Ｐ．ｍａｉ）のようなピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）ｓｐｐ．，Ｐ．エレガンス（Ｐ．ｅｌｅｇａｎｓ）のようなルミノミセス（Ｒｕｍｉｎｏｍｙｃｅｓ）ｓｐｐ．，Ａ．ミユークロナトス（Ａ．ｍｕｃｒｏｎａｔｕｓ）のようなアナエロミセス（Ａｎａｅｒｏｍｙｃｅｓ）ｓｐｐ．及びＯ．ボビス（Ｏ．ｂｏｖｉｓ）及びＯ．ジョイオニ（Ｏ．ｊｏｙｏｎｉｉ）のようなオルピノミセス（Ｏｒｐｉｎｏｍｙｃｅｓ）ｓｐｐ．。Ｃａｅｃｏｍｙｃｅｓｅｑｕｉ，Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓｅｑｕｉ，Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓｄｕｍｂｏｎｉｃａ及びＰｉｒｏｍｙｃｅｓｍａｉはウマにおいて見られ、上記の他の菌類のように他の家畜のルーメンには見い出されない。Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘｓｐｐ．特にＮ．ｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍが好ましい。本発明によるキシラナーゼは高い比活性を持ち得る。その比活性は細菌由来のキシラナーゼのそれより有意に高くなり得、例えば、少なくとも１０００、２０００、３０００、４０００、４５００、５０００あるいは５５００Ｕ／ｍｇ蛋白であり得、後ほど好ましい。（キシラナーゼ活性の１単位はキシロース当量として、３７℃にて１分経過後に測定された、生成物１μｍｏｌｅを放出する酵素の量として定義される）。更に特筆すべきことは、本発明のこの局面によるキシラナーゼは天然のＸＹＬＡがＮ．ｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍによって発現するよりも、有意差が認められる程度に、より良く発現し得る。発現は野性型の酵素よりも少なくとも１０倍かあるいは好ましくは少なくとも１００倍改良され得る。本発明によるキシラナーゼは、高い効率でキシランを分解する能力を有し得る。少なくとも０．１の、そして好ましくは少なくとも０．５か０．７５ｇでさえある還元糖がｇキシラン基質当たり生成され得る。本発明によるキシラナーゼは、多くの既知のキシラナーゼとは対照的にセルロースに対する有意な残存活性を有しないことも可能である。その酵素はセルロースファイバーを損なうことなく植物ファイバーからキシランを除去し、リグニンを解離することができるので、この特質は本発明を特にパルプ及び紙産業に応用する場合に有用である。本発明によるキシラナーゼは、少なくとも２つの触媒領域を持ち得る。触媒領域の配置は、野性型のキシラナーゼ酵素におけるようであっても良いし、またあるいはその酵素のキシラン分解活性を増加または改良する人工的形態で配置されても良い。本発明において使用する為の触媒領域の起源として特に好ましいキシラナーゼは、Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍ由来のもので、ＸＹＬＡと称する。それは以下の特質を有する。 (i)以下のプロトコールにより調製される場合、精製酵素について、５９８０Ｕ／ｍｇ蛋白の比活性；宿主細胞（その酵素を発現するプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅ）を遠心によって集菌し、ｐＨ８．０のトリス−ＨＣｌ緩衝液５０ｍＭに再び懸濁し、Ｃｌａｖｋｅら、（FEMS Microbiol.Letts.83 305-310(1991)）によって記述された様に細胞質画分を調製する。硫酸アンモニウム（０．３９ｇ／ｍｌ）添加により沈澱したキシラナーゼをｐＨ８の１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液に再び溶解する。同一緩衝液を３回入れ替える毎にそれに対し、透析を行なった後、キシラナーゼは、Ｈａｌｌらによって本質的に記述されたように（Mol.Micr obiol.3 1211-1219(1989)）DEAE−トリアクリルＭ上での陰イオン交換クロマトグラフィーにより実質的に精製する。 (ii)基質１ｇにつき０．９ｇの還元糖を放出する、高い効率でキシランを分解する能力； (iii)セルロースに対する有意の残存活性が無い（カルボキシメチルセルロース、大麦β−グルカン、ラミナリンあるいはリチナンからの検出し得るような還元糖の放出が無いことにより決定）；そして (iv)２つの触媒領域。成熟ＸＹＬＡの構造は以下のように示し得る（Ｎ−末端からＣ−末端へ）：ＣＡＴ１−ＬＩＮＫ１−ＣＡＴ２−ＬＩＮＫ２−ＣＴＲ１−ＣＴＲ２ここにおいて、ＣＡＴ１は以下の配列を有する第１の触媒領域を表す：ＣＡＴ２は以下の配列を有する第２の触媒領域を表す：ＬＩＮＫ１は、以下の配列を有する第１のリンカーを表す：ＬＩＮＫ２は、以下の配列を有する第２のリンカーを表す：ＣＴＲ１は、以下の配列を有する第１のＣ−末端反復を表す：そしてＣＴＲ２は以下の配列を有する第２のＣ−末端反復を表す：これら全ての部分配列は、ＳＥＱＩＤＮＯ：１及びＳＥＱＩＤＮＯ：２に見られる。他の嫌気性菌類由来のキシラナーゼの構造は概ね類似し得るが、当然、構成成分の正確な配列は起源である生体がＮ．ｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍに大変密接に関係しているのでなければ一般に異なる。活性である為に各領域の（特に触媒領域の）全体が完全に揃っていなくとも良い。本発明においては触媒領域の全体が存在することも可能であるが、その触媒領域の活性部位が存在すれば充分である（つまり触媒領域は、機能的に存在していなければならない）。２つの触媒領域は互いに大変類似して見えるが同一でないこともあり得る。それらの間の相異は特に好ましいとされる天然配列との相同性の度合を示唆する。２つのＣ−末端反復も互いに類似して見られ得る（しかし２つの触媒領域ほどではない）。それらの間の相異は、これも依然高度に好ましいとされる相同性の度合を示唆する。その２つのリンカー配列の詳細な配列は特に重要でなくとも良い。必要なのは、触媒領域の空間的配置がそれらを効果的に（そして好ましくは、最高に）機能させ得るものであるということのみである。本発明のより好ましい具体例は、ＣＡＴ１及びＣＡＴ２のうちの少なくとも１つと実質的に相同である触媒領域から成り、ＣＡＴ２の下流（即ちＣ−末端に向って）のアミノ酸配列の少なくとも一部を欠いている。少なくともＣＴＲ２の一部を欠如し得、代替的または（好ましくは）付加的にＣＴＲ１の少なくとも一部を欠如し得る。本発明によるキシラナーゼの特定の具体例は以下の領域を含有する（そしてより好ましくは、本質的にそれらから成る）ものを含む：Ａ．ＣＡＴ１−ＬＩＮＫ１−ＣＡＴ２−Ｌ１ＮＫ２−ＣＴＲ１（短縮）（例えばｐＮＸ３）；Ｂ．ＣＡＴ１−ＬＩＮＫ１−ＣＡＴ２−ＬＩＮＫ２（短縮）（例えばｐＮＸ４）；Ｃ．ＬＩＮＫ１（短縮）−ＣＡＴ２−ＬＩＮＫ２（短縮）（例えばｐＮＸ５）；Ｄ．ＣＡＴ１−ＬＩＮＫ１（短縮）（例えばｐＮＸ６）；Ｅ．ＣＡＴ１（短縮）（例えばｐＮＸ７）；Ｆ．ＬＩＮＫ１（短縮）−ＣＡＴ２−ＬＩＮＫ２−ＣＴＲ１−ＣＴＲ２（例えばｐＮＸ８）；Ｇ．ＬＩＮＫ１（短縮）−ＣＡＴ２−Ｌ１ＮＫ２−ＣＴＲ１（短縮）（例えばｐＮＸ９）；Ｈ．ＬＩＮＫ１（短縮）−ＣＡＴ２（短縮）（例えばｐＮＸ１０）；（カッコ内のプラスミドの名称は、その発現生成物が、表示されているキシラナーゼである、具体例のプラスミドを示している。）シグナル配列が最初は存在するかもしれないが、最終分子においては存在しないほうが良い。構造Ｃ、Ｆ、Ｇ及びＨが好ましく、構造Ｃ、Ｇ及びＨは特に好ましい。本発明による酵素は単一のＣＡＴ１領域と単一のＣＡＴ２領域を備えることもでき、または２つ以上の触媒領域を備え、そのいずれもＣＡＴ１及びＣＡＴ２から独立的に選択されるものとすることもできる。実質的には触媒領域のみが存在することも可能で、また、上に示したように、充分を活性の為にすべての天然触媒領域が必須とされなくても良い。未成熟蛋白質にはシグナルペプチドが存在し得る。天然のシグナルペプチドの配列は、である。この配列も、ＳＥＱＩＤＮＯ：１及びＳＥＱＩＤＮＯ：２に見られる。本発明によるキシラナーゼは適切ないかなる手段によって調製しても良い。供給源嫌気性菌類の大量発酵を行なっても良いし、有機化学法によってポリペプチド合成を試みても良いが、その調製法には組換えＤＮＡ技術が一般に選択される。上記のキシラナーゼは、従って、宿主細胞中の異種のキシラナーゼをコードするＤＮＡの発現生成物であることがより好ましい。本発明の第２の局面によれば、そのＤＮＡ分子キシラナーゼをコードする天然ｍＲＮＡの完全な長さのコピーを含まないという前提で、嫌気性菌類のキシラナーゼと実質的に相同の触媒領域を有するキシラナーゼをコードする、単離または組換えＤＮＡ分子が提供される。ＮｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘｆｒｏｎｔａｌｉｓのキシラナーゼをコードするｃＤＮＡ（明らかにｍＲＮＡの完全な長さのコピーから成る）はＲｅｙｍｏｎｄら、FEMS Microbiol.Lett.77: 107-112(1991)によって記述されているが、発現は報告されていない。本発明のこの局面によるＤＮＡには天然ｍＲＮＡの完全な長さのコピーは存在しないが、本発明が短縮ｃＤＮＡに限定されないことは理解されるべきである。対応する野性型遺伝子に天然に存在するイントロン（もしあれは）のいくつかあるいはすべてが存在してもよいことが意図されている。しかしながら、完全な長さのｃＤＮＡに存在する少なくともなんらかの配列が本発明のこの局面によるＤＮＡにおいて不在である。本発明のこの局面は、完全な長さのキシラナーゼをコードするＤＮＡを包含し、欠如しているＤＮＡの部分は、３’および／または５ ’非翻訳領域とすることができ、いくつかの具体的においては好ましいことも理解されるべきである。従って実質的に完全な長さのあるいは短縮されたキシラナーゼが本発明のこの局面によるＤＮＡから生成され得、それは（ａ）３’非翻訳領域を実質的に欠くかまたは（ｂ）５’非翻訳領域を実質的に欠くか、または（ｃ）３’及び５’非翻訳領域の双方を実質的に欠く。嫌気性菌類のキシラナーゼをコードする完全な長さのｃＤＮＡ（Ｎ．ｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍのｘｙｎＡ遺伝子を原形として）は次の構造を有し得る：５’ｕｔｒ−ｓｉｇ−ｃａｔ１−ｌｉｎｋ１−ｃａｔ２−ｌｉｎｋ２−ｃｔｒ１−ｃｔｒ２−３’ｕｔｒ：ここにおいて、５’ｕｔｒは、５’非翻訳領域を表し、ｓｉｇは、シグナルペプチドをコードし、ｃａｔ１は、第１の触媒領域をコードし、ｌｉｎｋ１は、第１のリンカー配列をコードし、ｃａｔ２は、第２の触媒領域をコードし、ｌｉｎｋ２は、第２のリンカー配列をコードし、ｃｔｒ１は、第１のＣ−末端反復をコードし、ｃｔｒ２は、第２のＣ−末端反復をコードし、そして３’ｕｔｒは、３’非翻訳領域を表す。ゲノムの配列は、上の構造内に介在した１以上のイントロンを有し得る。Ｎ．ｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍのＸＹＬＡ酵素をコードするｘｙｎＡ遺伝子においては、上記種々のＤＮＡセグメントが下記の配列を有する：（５′ｕｔｒセグメントの最初の３つのヌクレオチドが終止コドン−これは一般に存在する−を構成することに注意。）これらのＤＮＡセグメントまたは、それらと実質的に相同の配列の使用（それらの全てではない）が、本発明のこの局面においては好ましい。より好ましい具体例は、一般に本発明の第１の局面によるキシラナーゼそのもののより好ましい具体例に一致するが、次の考慮が付加される、即ち(a)ペプチドシグナル配列をコードするＤＮＡ配列が存在することが好ましく及び／または(b)非翻訳領域の１つまたは両方が短縮されまたは不在であることが好ましい。本発明のこの局面による特定の具体例は次のセグメントを含有する（そしてより好ましくは、ベクター由来配列とは別に、本質的にそれらから成る）ものを含む：ａ．５’ｕｔｒ−ｓｉｇ−ｃａｔ１−ｌｉｎｋ１−ｃａｔ２−ｌｉｎｋ２−ｃｔｒ１（短縮）（例えばｐＮＸ３）；ｂ．５’ｕｔｒ−ｓｉｇ−ｃａｔ１−ｌｉｎｋ１−ｃａｔ２−ｌｉｎｋ２（短縮）（例えばｐＮＸ４）；ｃ．ｌｉｎｋ１（短縮）−ｃａｔ２−ｌｉｎｋ２（短縮）（例えばｐＮＸ５）；ｄ．５’ｕｔｒ−ｓｉｇ−ｃａｔ１−ｌｉｎｋ１（短縮）（例えばｐＮＸ６）；ｅ．５’ｕｔｒ−ｓｉｇ−ｃａｔ１（短縮）（例えばｐＮＸ７）；ｆ．ｌｉｎｋ１（短縮）−ｃａｔ２−ｌｉｎｋ２−ｃｔｒ１−ｃｔｒ２−３’ ｕｔｒ（例えばｐＮＸ８）；ｇ．ｌｉｎｋ１（短縮）−ｃａｔ２−ｌｉｎｋ２−ｃｔｒ１（短縮）（例えばｐＮＸ９）；ｈ．ｌｉｎｋ１（短縮）−ｃａｔ２（短縮）（例えばｐＮＸ１０）．（カッコ内のプラスミドの名称は表示されているＤＮＡ配列を含む実施例におけるプラスミドを示す。）構造ｃ，ｆ，ｇ及びｈが好ましく、構造ｃ，ｇ及びｈは特に好ましい。本発明による組換えＤＮＡはベクターの形態であっても良い。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミドあるいはファージである。それらによってトランスフェクションした（または形質転換した：本明細書はこれらの用語を互換的に用いる）細胞を選択できるようにする為に、また、より好ましくは、異種ＤＮＡを導入しているベクターを有する細胞を選択できるようにする為にベクターはしばしば１以上の選択可能なマーカーを含有する。適切な開始及び終止シグナルが一般的に存在する。更に、ベクターに発現を意図する場合、発現を導く為の充分な調節配列が存在するであろう。調節配列を含まないベクターはクローニングベクターとして有用である。また当然、発現ベクターもまた、クローニングベクターとして有用であり得る。クローニングベクターはそれらの操作を容易ならしめるＥ．ｃｏｌｉあるいはその他の適切な宿主に導入され得る。本発明のいま一つの局面によれば、従って上記のＤＮＡでトランスフェクションあるいは形質転換した宿主細胞が提供される。本発明によるＤＮＡは、連続するヌクレオチドをカップリングし、及び／またはオリゴ及び／またはポリヌクレオチドをライゲートすることを含む、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）プロセスを含めた、都合の良いいかなる方法によっても調製し得るが、組換えＤＮＡ技術の形態が方法として選択される。キシラナーゼをコードするＤＮＡはＤＮＡライブラリーからクローンされ得る。ＤＮＡライブラリーは上記菌類の１から調製され得る。ライブラリーはゲノムのものであっても良いが、ｃＤＮＡライブラリーのほうが、特に、ｃＤＮＡライブラリーにおいてキシラナーゼをコードするｃＤＮＡの存在可能性を増加させる処置が取られたのならば、調製がより容易でかつより扱い易い。Ｎ．ｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍのような、選択された菌類の培養はルーメン液を含有する適切な培地中で嫌気的に進行し得、キシラナーゼ発現を促進する為に、従ってキシラナーゼをコードするＲＮＡの量の増加を起こさせる為、唯一のあるいは主要の炭素源はキシランとし得る。しかしながら、キシラン存在下における培養は必須ではなく、炭素源はその代わりにＡｖｉｃｅｌのトレードマークで販売されている微細結晶セルロースのようなセルロースであっても良い。菌類の培養後、総ＲＮＡは適当ないかなる方法によっても抽出され得る。菌類の細胞は、ろ過によって採集し続いて機械的破砕により適切な細胞溶解緩衝液中で溶菌され得る。グアニジウムチオシアナートのような適明なＲＮＡ保存化合物も菌類の細胞に加え、ＲＮａｓｅ−媒介消化を減少あるいは阻止し得る。次いで総ＲＮＡは、得られたホモシネートから、ＣｓＣｌ₂クッションを通した超遠心による、あるいはＳａｍｂｒｏｏｋら、 Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第２版、Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)に記述されたような適切ないかなる技術によっても単離され得る。上述のものに加え、菌類の総ＲＮＡの調製のもう一つの方法はPuissant及びHo udebine Bio-techniques 148-149(1990)に記述された方法に基づく、あるいはその方法を採用したものとすることもできる。この方法においては、ｐＨ４にてフェノール／クロロフォルム抽出により上のホモジネートから菌類の総ＲＮＡを単離し、ＤＮＡ及びそれに伴う蛋白質を除去することができる。結果として得られる粗ＲＮＡはリチウムクロリドーウレア溶液で洗浄することにより更に精製された。菌類ＲＮＡ抽出の更なる適切な技術はＴｅｅｒｉら（Anal.Biochem.164 60-67 (1987)）のそれである。総ＲＮＡが、どの方法によるにしろ一度抽出されれば、例えば、ｍＲＮＡのポリＡ尾部が結合できる多数のチミジンまたはウラシル残基を含有する化合物上に親和（ａｆｆｉｎｉｔｙ）クロマトグラフィを行うこと等によりポリ−Ａ⁺ｍＲＮＡは総ＲＮＡから単離し得る。適切な化合物の例としてはオリゴ−ｄＴセルロース及びポリ−ＵＳＥＰＨＡＤＥＸ^TMが挙げられる。ポリ−Ａ⁺ｍＲＮＡは、次いで適切な緩衝液によって溶出することができる。そこでｃＤＮＡ発現ライブラリーは、逆転写酵素によるポリ−Ａ⁺ｍＲＮＡのｃＤＮＡへの変換に基づく標準的技術を用い構築され得る。ゲノムのライブラリーを構築することは可能であるが、菌類のゲノムのＤＮＡ中のイントロンの存在によって起きるいかなる難点をも回避することからｃＤＮＡライブラリーのほうが好ましい。ｃＤＮＡの第１の鎖は逆転写酵素を用いて合成され得、第２の鎖は、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｅ．ｃｏｌｉｐｏｌＩ）のようないかなるＤＮＡ志向ＤＮＡポリメラーゼを用いても合成され得る。ｃＤＮＡは次いで適切なサイズに分画し、適切なベクターにリゲートし得る。ベクターは、好ましくは、λＺＡＰ、λＺＡＰIIあるいはλｇｔ１１のようなファージベクターである。その目的に適するキットはＳｔｒａｔａｇｅｎｅより入手可能である。更なる、あるいはこれに代わるガイダンスはＮ．ｆｒｏｎｔａｌｉｓからのｃＤＮＡライブラリーの調製を詳細に記述したＲｅｙｍｏｎｄら（FE MS Microbiol.Lett. 17 107-112(1991)）から得られる。結果として得られるｃＤＮＡライブラリーはインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）でパッケージした後、Ｅ．ｃｏｌｉの適切な菌株のような適当ないかなる宿主細菌細胞を用いても増幅し得る。キシラナーゼ陽性組換えクローンのスクリーニングは適当ないかなる技術によっても遂行し得る。その技術はキシランの加水分解に基づくものであり得る。この方法においては、キシランを導入した培地上にクローンを生育させ、適切な呈色因子（ｃｏｌｏｕｒｉｎｄｉｃａｔｏｒ）の適切な助けを借りてキシラナーゼ陽性プラークの存在により加水分解が検出され得る。キシラナーゼ⁺クローンを選択する方法は、文献に記されている。２つの例は、Ｃｌａｒｋｅら（FEMS M icrobiol.Lett. 83 305-310(1991)）及びＴｅａｔｈｅｒ及びＷｏｏｄ（Appl.Env iron.Microbiol.43777-800 (1982)）である。キシラナーゼ陽性組換えクローンは、次いで、よく確立した方法により精製され得る（即ち、プラークが細菌コロニーに変換され得る）。適切な技術がＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）（ｌｏｃ．ｃｉｔ．）に見い出されるが、どれでも使用されているキットの製造業者の指示に単に従うのが常である。そして、クローン中のｃＤＮＡインサートは切り出され、一例として、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ^SK(-) のような選択されたベクターに挿入され得る。他の適切なプラスミドをサブクローニングに使用することができる。その例には、ＳａｍｂｒｏｏｋらMole cular Cloning ：Ａ Laboratory Manual,第２版、Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)に記述されたような、ｐＵＣプラスミド及びそれら由来のプラスミドが含まれる。キシラナーゼをコードするＤＮＡが適切なプロモーターの制御下にある発現ベクター（特にプラスミド）はまたライゲーションによっても形成され得、また適切な発現宿主に形質転換及びトランスフェクションされ得る。適当な発現ベクターの例としてはｐＵＣシリーズ（ｌａｃＺｐプロモータを有する）、ｐＭＴＬシリーズ（これらもｌａｃＺｐプロモータを有する）及びｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（ｌａｃＺｐプロモータとＴ₇プロモータの両方を有する）が挙げられる。プロモータの性質は、一般に、特に決定的であるとは信じられていなく、それは発現宿主及び発現の望まれている条件に依存する。上に示したように、Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌発現宿主に適する例はＬａｃＺプロモータである。細菌宿主の為の、これに代わるプロモータにはバクテリオファージＴ₇プロモータが含まれる。それらの発現宿主から組換えキシラナーゼを精製することは必要とされなくてもよい。宿主細胞としてのＥ．ｃｏｌｉは本発明のキシラナーゼのパルプ製造への応用に適するかもしれないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓを含むグラム陽性細菌や乳酸菌のような他の宿主細胞が用いられ得るものと理解される。真核生物の発現宿主も代替的に用いられ得る。その例はイースト（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような）である。上記のようにキシラナーゼを発現し、及び／または上記のようなＤＮＡ配列（発現の為の、あるいはそうでないにかかわらず）を有する宿主細胞は、それら自体、本発明の更なる局面を構成する。宿主細胞の調製法及びキシラナーゼの生成法もまた本発明に含まれ、その宿主細胞調製法においてはキシラナーゼをコードするＤＮＡが細胞を形質転換あるいはトランスフェクションし、そのキシラナーゼ生成法においては発現宿主が培養され、キシラナーゼをコードするＤＮＡを発現する。宿主細胞の性質によっては、本発明による組換えＤＮＡがシグナル配列を含むほうが好ましいこともある。宿主に特異的なシグナル配列が含まれていても、あるいは、真核生物における発現の為、その酵素自身のシグナル配列が用いられてもよい。発現宿主に適応させた、あるいは発現宿主に好まれる翻訳開始部位を付与することもできる。しかしながら、その蛋白質自体の翻訳開始部位で充分であるか、あるいは、ある状況ではそれが好ましい。そこで、発現宿主から得た組換えキシラナーゼを特徴づけることができる。本発明の特定の具体例について確かめられた主要な特質は次の通りである： (i)クローニングされたキシラナーゼは非常に高い比活性（５９８０Ｕ／ｍｇ精製酵素の蛋白）を有する；これは、今までに報告されてきた多くのクローニングされた、細菌のキシラナーゼと対照的である： (ii)その酵素は非常に高い効率でキシランを分解することができ、基質のグラム当たり０．９ｇの還元糖を放出する； (iii)他の多くのキシラナーゼがなんらかのセルラーゼ活性を有するのに対し、その酵素は、セルロースに対する残存活性が無い； (iv)その酵素は２つの触媒領域を含有し、それらは、キシラナーゼｃＤＮＡを更に遺伝子操作することにより非常に効率的なキシラナーゼ産出クローンを構築する潜在的可能性を持ち得る。クローニングされた完全な長さのキシラナーゼ（以後キシラナーゼＡと呼ぶ）の高い比活性（５９８０Ｕ／ｍｇ精製酵素蛋白）は、この菌類キシラナーゼに本質的な特徴である。しかしながら、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター（ｐＮＸ１）におけるｘｙｎＡｃＤＮＡの現在の構築物の発現レベルは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて比較的低く、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞によって合成された可溶蛋白質の０．３％である。一般的に言って、クローニングされた遺伝子の発現は、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞の総蛋白の１０％を越えるレベルで達成可能である。ｘｙｎＡｃＤＮＡの短縮形は制限酵素の使用により調製され得る。ｐＮＸ５と称されるプラスミドにおけるそれを含むいくつかの短縮形は、ｐＮＸ１よりも数１００倍高いキシラナーゼ活性を産生する。この観察についての１つの説明は、短縮キシラナーゼＡ合成の為にＬａｃＺ翻訳開始配列を利用した結果であるとすることである。いま一つの説明は、ＡＴを多く含む領域を避ける結果高い発現レベルとなるというもので、理論は、ＲＮａｓｅＥのｍＲＮＡ分解活性は蛋白質合成における律速段階であってＲＮａｓｅＥはｍＲＮＡのＡＴを多く含む領域をより好む傾向があるというものである。バクテリオファージＴ₇プロモータのようなより強力なプロモータの使用によりＥ．ｃｏｌｉ内におけるその発現レベルを更に高めることが可能である。ｘｙｎＡを有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉから精製された組換えキシラナーゼＡ（ＸＹＬＡ）は５３０００のＭ_rを有し、オートスペルトキシランをキシロビオースとキシロースに加水分解した。その酵素はいかなるセルロース様基質も加水分解しなかった。ｘｙｎＡのヌクレオチド配列からＭ_r６６１９２の蛋白質をコードする１８２１ｂｐの１つの読取り枠（オープンリーディングフレーム）が判明した。予測されたＸＹＬＡの第１構造はＮ−末端シグナルペプチドとそれに続く２２５アミノ酸の反復配列で、その反復配列はスレオニン／プロリンリンカー配列によって、直列的な４０残基のＣ−末端反復から分けられていた。大きなＮ−末端反復領域は完全な長さの酵素と類似した基質特異性を示す別々の触媒領域から成っていた。本発明によるキシラナーゼは、食品、飼料、パルプ及び紙産業における多くの応用形態を有する。これらの産業における、ここに記述したキシラナーゼの使用は本発明の範囲内に含まれる。先ず、食品産業について触れる。パン生地及びその結果であるパン、焼菓子類の特定の性質は、用いられた小麦粉のペントサン及び澱粉の含有量に依存する。これらの性質は、パンのきめ、ボリューム、鮮度（ｓｔａｌｉｎｇ）を含む。キシラナーゼの使用は、パン、焼菓子類を改良し、潜在的商業価値のある製品を提供する。キシラナーゼ処理によって改良することのできる性質の中にパンの比体積がある。アミラーゼがキシラナーゼと組み合わせて添加されると比体積の増加は更に高められる。この効果に寄与している因子の一つは、炭水化物の水結合能（ｗａｔｅｒ−ｂｉｎｄｉｎｇｃａｐａｃｉｔｙ）である。本発明はここに記述されたキシラナーゼを含むパン生地を提供する。動物飼料産業においては、ニワトリのひなの飼料を改良する為の酵素補足物（ｅｎｚｙｍｅｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）の使用が１９５７年に既に報告された。もっと最近の結果は、小麦、そして特にライ麦のような特定の穀類においてはその内胚乳中のペントサンが、乏しい栄養吸収やニワトリのひなの粘り気のある糞の主要な原因であることを示唆している。いずれの問題点も未消化ペントサンの高い粘度の結果と見受けられる。このことは栄養素の拡散を妨げ、水を結合して排泄物を水っぽくする。これらの問題はキシラナーゼ調製物を用いることで回避することができる。キシラナーゼの作用は、ひなの体重増加と飼料変換効率（ｆｅｅｄｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）の両者を向上させることができる。キシラナーゼ補足物は、ニワトリのひなの飼料へのライ麦の使用を促進すべく、ライ麦の栄養価を向上する為に用いられ得る。この処置の効果は、ライ麦の多様性に依存するかもしれない。本発明は、これらの目的の為の、キシラナーゼのニワトリのひなの飼料及び穀類における使用を提供する。パルプ産業において、溶解（ｄｉｓｓｏｌｖｉｎｇ）パルプはビスコースレーヨン、セルロースエステル及びセルロースエーテルを製造する為に用いられる精製セルロースである。それらは予め加水分解されたクラフトパルプまたは酸性硫酸塩パルプから誘導される。それらの処理は、１つの段階においてセルロースの誘導体形成を行うことにより特徴づけられ、その誘導体は普通の溶剤に可溶で従ってファイバー、フィルム及びプラスチックの形成を可能にする。セルロース中の不純物は誘導を妨げ、スプレーヤ（ｓｐｒａｙｅｒｓ）の口を詰まらせ、最終産物に欠陥を与える不溶解物となる。更には、特定のキシラン不純物はアセテート製品に色、薄煙（ｈａｚｅ）熱不安定性をもたらす。従ってキシラナーゼは不純物を除去する役割を有し、ここに記述されたキシラナーゼのこの目的の為の使用は、本発明の範囲内として考えられる。セルラーゼを含まないキシラーゼを用いたクラフトパルプの漂白による前処理は、近い将来パルプ及び紙産業に最も受け容れられそうなバイオテクノロジーの１つと見られてきたが、ただ、それには適切なキシラナーゼが入手可能でなければならない。強力な木材ファイバーを生産し、また、化学物質が回収されリサイクルされることから、カナダにおいてはクラフト（アルカリあるいは硫酸塩としても知られている）プロセスは優勢なパルプ処理技術となっている。クラフトパルプ、特に針葉樹由来のものは漂白が比較的困難である。パルプを所望の明るさ（ｂｒｉｇｈｔｎｅｓｓ）、〜９０％に効果的に漂白する為には、伝統的には、元素としての塩素及び塩素含有化合物を用いた一連の段階を要する。漂白プロセスは、特に元素としての塩素を使用している時には、塩素有機化合物を生成し、それはこれまで排液と共に漂白プラントから流出してきた。しかしながら、目下、公衆の要求及び立法化した規則の双方がパルプ工場に対し、これらの汚染物をの排出を減少あるいは除去するよう圧力をかけている。パルプ及び紙産業は、その工場の環境への影響を軽減する為に種々の代替的技術を行うことを考慮している。それらの選択枝はクラフトパルプのキシラナーゼ前漂白（ｘｙｌａｎａｓｅｐｒｅｂｌｅａｃｈｉｎｇ）を含む、本発明によるキシラーゼはこの目的の為に特によく適している。本発明のキシラナーゼは特に紙及びパルプ産業に適用し得ると信じられている。酵素の使用が化学品に完全に取って代わることはないものと認められるが、環境を懸念する側から化学物質の使用を減少するべく圧力がかけられている。また、紙及びパルプ産業において化学物質の使用を削減する実際上の理由もある。パルプ処理プラントは通常、その場において自ら塩素及び二酸化塩素を供給するが、このことは潜在的に危険であるばかりでなく、能力（ｃａｐａｃｉｔｙ）をも制限し得る。リグニンを除去する為の紙パルプ（例えばクラフトパルプ）の処理には塩素、ＮａＯＨ、Ｈ₂Ｏ₂及び二酸化塩素が関わる。アメリカ合衆国のＳａｎｄｏｚ社は、２つのキシラナーゼを含有する、３０−５５℃ 、ｐＨ３ないし５で活性な菌類キシラナーゼ（粗）である自社製品ＣＡＲＴＡＺＹＭＥを用いて実際的試みを行い、ＩＵキシラナーゼ／ｇｍパルプを用いると２５−３３％の塩素削減が可能であることを見い出した。また、化学物質のみが使用される場合よりも、製品はその色が明るい。キシラナーゼのもう一つの利点は、化学物質がリグニン含量の低いセルロースを攻撃してファイバーの強度を低くしたり他の望ましくない物理的性質を与え得るのに対し、キシラナーゼは特異性があるという点である。従ってキシラナーゼがパルプ漂白においてより重要になることは明らかであり、また、組換えキシラナーゼはその特異性及び高い収率の為特に重要となることが明らかである。リグニンはヘミセルロースに結合していることが信じられており、そしてもしヘミセルロース（キシラン）が解重合するとリグニンはセルロースから部分的に解離し、次いで洗い流される。現在のところ、しかしながら、なんらかの化学的処置が未だ必要である。本発明キシラナーゼについての、商業利用に関する、主要な点は、(i)その大変高い特異性及ひ高レベル発現は、大規模生産を経済的にし、(ii)そのセルロース活性欠如は紙製造及び織物産業に適用される際、キシランを特異的に除去することが必要な場合に特に有用である。本発明のキシラナーゼは、製糖産業に、さとうきびのしぼり殻（ｂａｇａｓｓｅ）の処理あるいはキシランを含有する他の製品の効率的な処理に関して価値のある用途を見い出し得る。ＸＹＬＡの蛋白質配列及びｘｙｎＡの遺伝子配列は１９９２年５月５日、ＥＭＢＬデータベースにおいてアクセス番号Ｘ６５５２６により入手可能になったことは前に述べた。この入手可能性は、本発明において指定した国の全ての管轄区において、有効な先行技術を構成し得るものではない。ＥＭＢＬデータベースへのエントリーが有効な先行技術を構成しない管轄区に対しては本発明が上に表示したよりも広く定義されている、また、されるであろうということをここで通告する。本発明は以下の更なる局面において存在し得ることを特記する：嫌気性菌類のキシラナーゼと実質的に相同な少なくとも１つの触媒領域を有するキシラナーゼ、そのキシラナーゼは嫌気性菌類の完全な長さの天然キシラナーゼであり得；そして嫌気性菌類のキシラナーゼと実質的に相同な触媒領域を有するキシラナーゼをコードする、単離されたあるいは組換えられたＤＮＡ分子で、もしそのＤＮＡ分子がＮｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘｆｒｏｎｔａｌｉｓのキシラナーゼをコードするｃＤＮＡならばそのＤＮＡは機能的にプロモータに結合させることを前提とする；そのＤＮＡ分子はキシラナーゼをコードする天然ｍＲＮＡの完全な長さのコピーから成り得る。本発明は、上記の組換えキシラナーゼのみならずここに記述された方法で調製され得る上記のような他の嫌気性菌類山来のキシラナーゼをもその範囲に含めることは、前述のことから明らかになるであろう。本発明はまたＮ．ｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍ由来のいかなる変異株も、あるいは、選択または遺伝子転移（ｇｅｎｅｔｒａｎｓｆｅｒ）によってＮ．ｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍより誘導されたいかなる菌株をもその範囲内に含む。本発明は、その範囲内に以下のことをも含む： (i) ｐＮＸ１、ｐＮＸ４、ｐＮＸ５、ｐＮＸ６、ｐＮＸ８、ｐＮＸ９及びｐＮＸ１０由来のＤＮＡ配列及びそれらとハイブリダイズすることのできるＤＮＡ配列； (ii) (i)におけるようなＤＮＡ配列を含有し、適切な宿主内においてキシラナーゼ活性を有するポリペプチドの発現または過剰発現（ｏｖｅｒ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）を導くことのできる調節領域に機能的に連結されているＤＮＡ構築物； (iii) (ii)におけるような発現構築物を含有する、菌類キシラナーゼの発現または過剰発現の可能な形質転換微生物宿主； (iv) iii)におけるような微生物宿主を用いた発現によって生成される、キシラナーゼ活性を有するポリペプチド； (v) 成分Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤを含有する第４図に示すアミノ酸配列及びこのキシラナーゼから誘導されるアミノ酸配列；及び (vi) 第１図に記されたプラスミド。本発明はまた、第１図に示す組換えプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉからのキシラナーゼの調製法をその範囲内に含む。本発明の１局面についてより好ましい上述の特質は他の各局面に対しても同様に好ましいものとして準用される。そこで、本発明を以下の実施例により例示する。実施例は以下の添付図面に言及する：第１図はｘｙｎＡを含有する組換えプラスミドの制限地図である。ＥｃｏＲＩ（Ｒ），ＳｓｔＩ（Ｓ），ＳｃａＩ（Ｓｃ），Ｈｐａｌ（Ｈｐ），ＫｐｎＩ（Ｋ），ＸｈｏＩ（Ｘ），ＳｍａＩ（Ｓｍ），ＰｖｕＩＩ（Ｐｖ），ＮａｅＩ（Ｎａ），ＮｒｕＩ（Ｎｒ），ＳｔｕＩ（Ｓｔ）及びＨｉｎｄＩＩＩ（Ｈ）の切断部位が示されている。多クローニング領域またはカッコ内のベクターの制限部位は破壊されている。^*によって示されるベクターの多クローニング領域はそれそれｐＳＫ（Ｓ）、ｐＭＴＬ２０（２０）及びｐＭＴＬ２２（２）由来である。矢印のついた実線は、ｘｙｎＡ読み取り枠の方向と範囲を示す。ｘｙｎＡの削除変異株の構築は下記に詳細に示す。組換えプラスミドを有するＥ．ｃｏｌｉ株の表現型も示されている。第２図Ａ及びＢはＸＹＬＡの精製を示す。ｐＮＸ１（Ａ）またはｐＮＸ５（Ｂ）を有するＥ．ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅの、菌体を含まない抽出物から精製したＸＹＬＡのＳＤＳ／ＰＡＧＥ。第１レーンは、陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製されたＸＹＬＡを含有し、第２レーンは、ｐＮＸ１またはｐＮＸ５を有するＥ．ｃｏｌｉからの菌体を含まない抽出物を含有し、第３レーン（Ｂのみ）は、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫを含有するＥ．ｃｏｌｉからの菌体を含まない抽出物を含有していた。Ａ及びＢに写されているゲルは各々１０％（ｗ／ｖ）あるいは１５％（ｗ／ｖ）ポリアクリルアミドを含有していた。蛋白質サイズは、Ｓｉｇｍａ社製高（第２図Ａ）または低（第２図Ｂ）分子量マーカーであるマーカー蛋白質から推論してｋＤにおいて示した。第３図は、精製ＸＹＬＡの、ｐＨ６．５、３７℃におけるｐＣ緩衝液中の可溶性キシラン（０．５％）の比粘度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｖｉｓｃｏｓｉｔｙ）への影響を示した。比粘度（■）及び還元糖（●）は下記のように測定した。第４図は、ＸＹＬＡの一次構造を示す。Ａ及びＢと称する２つの相同な触媒領域は、２重のＣ−末端配列（Ｃ及びＤ）を枠内に示す。第５図は、Ｎ．ｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍＸＹＬＡ及び原核生物のキシラナーゼの相同領域の配列比較（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を示す。比較された酵素は以下の通りである：Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓキシラナーブＡ（ＸＹＬＡＢ；（Ｆｕｋｕｓａｋｉら、FE BS Lett.171:197-201(1984)）、Ｂ．Ｃｉｒｃｕｌａｎｓｘｙｌａｎａｓｅ（ＸＹＬＢＣ；Ｙａｎｇら、Nucl.Acids Res.16:7178(1988)）及びＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍキシラナーゼＢ（ＸＹＬＢＣＡ；Ｚａｐｐｅら、Nucl． Acids Res.18 2179(1990)）。比較されたすべての１次構造中の、同一性あるいは類似性を示す残基は枠内に示す。相同領域の各々の第１配列における最初及び最終の残基の位置も示してある。第６図は、プラスミドｐＮＸ１の構造を示す。第７図は、ＮｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍキシラナーゼＡをコードするｃＤＮＡのクローニング及び特徴づけを示す。実施例１ｐＮＸ１の調製１．１微生物株、ベクター及び培地嫌気性菌類ネオカリマスティクスパトリシアルム（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｔｉｘｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍ）（亜種）は、Ｏｒｐｉｎ，Ｃ．Ｇ．及びＭｕｎｎ，Ｅ．Ａ．，Trans.Br.Mycol,Soc.86:178-181(1986)により、ヒツジのルーメンから単離した。ｃＤＮＡクローニングの為の宿主株はＥ．ｃｏｌｉＰＬＫ− Ｆ’及びＸＬＩ−Ｂｌｕｅであった。Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ８３株はキシラナーゼ⁺ ｃＤＮＡクローンを特徴づける為に用いられた。ベクターはλＺＡＰＩＩ、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ^SK(-)（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ），ｐＭＴＬ２０，ｐＭＴＬ２２及びｐＭＴＬ２３（Ｃｈａｍｂｅｒｓら、Gene 68:139-149(1988)）．Ｎ．パトリシアルム（Ｎ．ｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍ）の培養物は、ＫｅｍｐらJ.Gen.Microbiol,130:27-37(1984)によって記述された様に１０％ルーメン液を含有する培地中で維持された。Ｅ．ｃｏｌｉ株は、Ｌ−ブロース（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Molecular Cloning,ＡLaboratory Manual ,第２版Cold Spring Harbor,New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press( 1989)）中で生育させた。組換え体ファージはＳｔｒａｔａｇｅｎｅの指示によりＮＺＹ培地を用いてＥ．ｃｏｌｉ株中で生育させた。１．２ −般的な組換えＤＮＡ技術アガロースゲル電気泳動、Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換、及び制限酵素とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いたＤＮＡの修正はＧｉｌｂｅｒｔら、J.Gen.Microbiol.134 32 39-3247(1988)により記述された通りである。大量のプラスミドＤＮＡがブリジ溶菌（Ｂｒｉｊｌｙｓｉｓ）及びそれに続くＣｓＣｌ密度勾配遠心によってＥ．ｃｏｌｉから抽出された（Ｃｌｅｗｅｌ．Ｄ．Ｂ．及びＨｅｌｉｎｓｋｉ，Ｄ．Ｒ．，Proc.Natl.Acad.Sci.USA62:1 159-1166(1969)）。迅速な制限（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）分析及びヌクレオチド配列決定の為のプラスミド単離には、各々Ｈｏｌｍｅｓ，Ｄ．Ｓ．及びＱｕｉｇｌｅｙ，M.Anal.Biochem.114:193-197(1981)の急速沸とう法（ｒａｐｉｄｂｏｉｌｉｎｇｍｅｔｈｏｄ）及びＢｉｒｎｂｏｉｍ，Ｈ．Ｌ．及びＤｏｌｙ，J.Nucl.Acids Rcs. 7：1513-1523(1979)のアルカリ溶菌法(ａｌｋａｌｉｎｅｌｙｓｉｓｍｅｔｈｏｄ）を採用した。ノーザンハイブリダイゼーションは、Ｇｉｌｂｅｒｔら、J.Bacteriol.161:314-320(1985)に記述されていた。Ｎ．パトリシアルム（Ｎ．ｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍ）は１％ＡＶＩＣＥＬ、３９℃存在下４８時間嫌気的条件でルーメン含有培地（Ｋｅｍｐら、J.Gen.Microb iol.130:27-37(1984)）中で生育させた（Ｐｈｉｌｉｐｓ，Ｍ．Ｗ．，及びＧｏｒｄｏｎ，Ｇ．Ｌ．Ｒ．，Appl.Environ.Microbiol.55:1695-1702(1989)及びＬｏｗｅらJ.Gen.Microbiol.131:2225-2229(1985)に記述された様な代替的培地が用いられ得る）。１．４総ＲＮＡ単離冷凍した菌糸体を乳鉢と乳棒で液体窒素下微細粉末に砕いた。冷凍菌糸体粉末に５−１０容のチオシアン酸グアニジニウム溶液（４Ｍチオシアン酸グアニジニウム、０．５％ラウリルサルコシンナトリウム、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１ｍＭＥＤＴＡ及び０．１Ｍβメルカプトエタノール）を加え、混合物を乳鉢と乳棒で５分間ホモゲナイズ（均質化）し、ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）ホモジナイザを用いてフルスピードで更に２分間ホモジナイズした。総ＲＮＡはホモゲナイズした混合物から、ＣｓＣｌクッションを通して超遠心により単離した（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Molecular Cloning.A Labo ratory Manual 、第２版、Cold Spring Harbor,New York:Cold Spring Harbor La boratoryPress(1989)）．（Ｐｕｉｓｓａｎｔ，Ｃ．，及びＨｏｕｄｅｂｉｎｅ，Ｌ．Ｍ．，Bio-Techniqucs 148-149(1990)によって記述された方法の採用など、代替的総菌類ＲＮＡ調製法が用いられ得る。）１．５ポリＡ⁺ｍＲＮＡ精製ポリＡ⁺ｍＲＮＡはオリゴ（ｄＴ）セルロースクロマトグラフィ（ＳａｍｂｒｏｏｋらMolecular Cloning.A Laboratory Manual、第２版、Cold Spring Harbo r,New York:Cold Spring HarborLaboratory Press(1989)）によって精製した。ｃＤＮＡライブラリは、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅのλＺＡＰｃＤＮＡ合成キットを用い、基本的には、製造者の指示に従い構築した。その手順を以下に簡単に記す：ポリＡ⁺ｍＲＮＡは、ＸｈｏＩリンカ−オリゴ（ｄＴ）プライマ及び５−メチルｄＣＴＰを用いて逆転写酵素（リバーストランスクリプターゼ）によって第１ストランドｃＤＮＡに転換した。二本鎖ｃＤＮＡは第１ストランドｃＤＮＡからＲＮａｓｅＨ及びＤＮＡポリメラーゼＩの作用により合成した。ｃＤＮＡの末端を平滑化した後、ＥｃｏＲＩアダプタでライゲートし、リン酸化し、ＸｈｏＩで消化して５’領域にＥｃｏＲＩ部位、３’領域にＸｈｏＩ部位を有するｃＤＮＡを作成した。ｃＤＮＡは１％低融点アガロースゲル電気泳動により、サイズ分画し、フェノール抽出により１．２−８ＫｂサイズのｃＤＮＡが回収された（ＳａｍｂｒｏｏｋらMolecular Cloning.ALaboratory Manual 第２版、Cold Spring Harbor,New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press(1989)）。サイズ分画したｃＤＮＡを、次にＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ消化λＺＡＰＩＩベクター（他の発現ベクタを使用し得る）にライゲートした。ｃＤＮＡライブラリをｉｎｖｉｔｒｏにパッケージし、プレーティング細胞としてのＥ．ｃｏｌｉＰＬＫ−Ｆ’を用いて増幅した。１．７キシラナーゼ−陽性組換えバクテリオファージ・クローンのスクリーニング組換えファージは０．１％キシラン及び１０ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ、ＬａｃＺプロモータに制御された遺伝子発現誘発剤）を含有する０．７％トップアガー中のＥ．ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅ中で生育させた。３７℃にて一晩インキュベートした後トップアガー上に０．５％コンゴーレッド（Ｃｏｎｇｏｒｅｄ）溶液を加えた。ＲＴで１５分間インキュベート後未結合染料を１ＭＮａＣｌで洗浄除去した。赤い背景に対しキシラナーゼ産生ファージプラークは黄色の光輪（ｈａｌｏｅｓ）に取り囲まれていた。キシラナーゼー陽性の組換えファージは、そのファージを２〜３回上記のように再度プレーティングしスクリーニングすることにより精製し、均質化した。キシラナーゼー陽性ファージのｃＤＮＡインサートはＶＣＳ−ｍ１３ヘルパーファージを用いてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ^-に挿入した。１．８キシラナーゼ及び関連酵素アッセイキシラナーゼー陽性組換えプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉから取った酵素抽出物をＫｅｌｌｅｔｔらBiochem.J.272:369-376(1990)によって記述されたように調製した。キシランあるいはその他の基質の３７℃における５０ｍＭリン酸カリウム／１２ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ６．５中における加水分解について、酵素のアッセイを行ない、キシランあるいはその他の植物多糖（カルボキシメチルセルロース、大麦β−グルカン、ラミナリン、リチナン）から放出された還元糖をＫｅｌｌｅｔｔら、Biochem.J.272:369-376(1990)及びＨａｚｌｅｗｏｏｄら、J.Gen.Mic robiol. 136:2089-2097(1990)に記述された様に測定した。人工的基質（メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−セロビオシドメチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルコシド、メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−キシロシド及ひｐ−ニトロフェニル −β−Ｄ−キシロシド）に対する活性についてのアッセイはＨａｚｌｅｗｏｏｄら、J.Gen.Microbiol.136:2089-2097(1990)によって記述された。１．９ＤＮＡ配列決定アルカリによって変性したプラスミドＤＮＡを中和し、スピン透析によって更に精製した（ｍｕｒｐｈｙ，Ｇ．，及びＫａｖａｎａｇｈ，Ｔ．，Nucl.Acid Re s. 16:5198(1988)）。結果として得られるＤＮＡの配列決定は、シーケナーゼＤＮＡ（ＳｅｑｕｅｎａｓｅＤＮＡ）配列決定キット（ＵＳＡ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）の製造者により推奨されているプロトコールに基づいた。適切な制限フラグメントをｐＭＴＬを基本とするベクターにクローニングすることにより、重なり合う配列を生成した。配列を収集して、Ｓｔａｄｅｎ，Ｒ．，Nucl.Aci ds Res. 16：3673-3694(1980)に記されたコンピュータプログラムを用いて整理した。ｐＮＸ１というプラスミド中に含まれるｃＤＮＡの完全な配列を両方の鎖について決定した。そのプラスミドに含まれるキシラナーゼをコードする遺伝子はｘｙｎＡと称し、その遺伝子産物、キシラナーゼ酵素自体はＸＹＬＡと称した。実施例２−ｐＮＸ１（ｘｖｎＡ）の削除変異体、ｐＮＸ４の構築ｐＮＸ１をＸｈｏＩにより線状にし、Ｂａｌ−３１消化によってｘｙｎＡｃＤＮＡの３’領域を除去した（Ｈａｌｌ，Ｊ．，及びＧｉｌｂｅｒｔ，Ｈ．Ｊ．，MolGen.Genet. 213:112-117(1988)）。末端を平滑化した後、その短縮ｃＤＮＡをＥｃｏＲＩ消化によりｐＮＸ１から明り取り、ＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩで消化されたｐＭＴＬ２２ベクターに入れクローニングした。実施例３−ｐＮＸ１（ｘｙｎＡ）の削除変異体、ｐＮＸ５の構築７２０ｂｐＳｃａＩ／ＮｒｕＩフラグメントをｐＮＸ４から切り取り、ｐＭＴＬ２０ベクターに入れ、クローニングした。結果として、ｐＮＸ１に関するよりも数百も酵素発現レベルの高い高度発現クローンが得られた。実施例４−ｐＮＸ１（ｘｙｎＡ）の削除変異体ｐＮＸ６の構築ｐＮＸ６は、ｐＮＸ１をＥｃｏＲＩ／ＳｃａＩで切断し、得られたフラグメントをＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩ切断ｐＭＴＬ２２に入れクローニングした。実施例５−ｐＮＸ１（ｘｙｎＡ）の削除変異体ｐＮＸ８の構築ｐＮＸ１をＳｃａＩ及びＸｈｏＩで消化し、１．３ｋｂフラグメントを得、それをｐＭＴＬ２０中にクローニングし、ｘｙｎＡ配列が、そのベクタ中に含まれるＬａｃＺＡＴＧと同調するようにした。その結果、発現レベルがｐＮＸ１のそれのおよそ１５倍である高度発現クローンが得られた。実施例６−ｐＮＸ１（ｘｙｎＡ）の削除変異体ｐＮＸ９の構築ｐＮＸ８はＫｐｎＩで切断（ベクタポリリンカの１部位）し、そのインサートフラグメントを電気泳動溶出後、ＲｓａＩ（遺伝子のＰＴリンカー領域中の切断）で消化し、７００ｂｐフラグメントを生成させ、ＫｐｎＩ及びＳｔｕＩで切断されているｐＭＴＬ２０中にクローニングした。結果としてベクタＬａｃＺＮ −末端と共に第２の触媒領域を有する高度発現クローン（ｐＮＸ８を含有するクローンよりはるかに良い）が得られた。実施例７−ｐＮＸ１（ｘｙｎＡ）の削除変異体ｐＮＸ１０の構築ｐＮＸ８をＫｐｎＩで消化し、そのフラグメント（−８５０ｂｐ）をＫｐｎＩ切断ｐＭＴＬ２０にライゲートした。このクローンも良好に発現したが、発現した蛋白質はカルボキシ末端にいくらかの残渣（ｒｅｓｉｄｕｅｓ）を含んでおり、それを除去すると、ｐＮＸ９において観察された高レベルが得られる。実施例８−キシラナーゼＡのＮ−末端の精製及びアミノ酸配列決定ｐＮＸ１またはｐＮＸ５を有するＥ．ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅをアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢブロース中で１６時間培養した。遠心分離により集菌した細胞をｐＨ８．０の５０ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液中に再び懸濁し、先に記述した様に（Ｃｌａｒｋｅら、FEMS Microbiol.Lett.83:305-310 (1991)）細胞質画分を調製した。硫酸アンモニウム（０．３９ｇ／ｍｌ）添加により沈殿したキシラナーゼを再び、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ８．０に溶解させた。同一の緩衝液を３回入れ替えて透析し、Ｐｏｏｌｅら、Mol.Gen. Genet .223:217-223(1990)に本質的に記されている様に、ＤＥＡＥ−トリスアクリルＭ上における陰イオン交換クロマトグラフィによってキシラナーゼを実質的に精製した。ｐＮＸ１を有するＥ．ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅの、菌体を含有しない抽出物から精製したキシラナーゼ（ＸＹＬＡと称す）をＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分画し、プロブロット（ＰＲＯＢＬＯＴ）膜（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．）上にエレクトロブロットした。Ｎ−末端配列は１２０Ａオンラインフェニルチオヒダントインアナライザを装備した４７０気相シーケネータ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．Ｈｕｎｋａｐｉｌｌａｒら、Methods Enzymol.91:399-413(1983)）を用い、自動化エドマン配列決定により決定した。実施例９ｘｙｎＡ単離の概略１０⁶クローンから成るｃＤＮＡライブラリは、唯一の炭素源としてのアビセル（Ａｖｉｃｅｌ）で生育させたＮ．パトリシアルム（Ｎ．ｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍ）から単離されたｍＲＮＡを用いて構築した。キシランを加水分解した３１の組換えバクテリオファージを、ライブラリから５×１０⁴クローンスクリーニングした後、同定して、１６の強度にキシラナーゼ陽性のファージを更にその特徴を決定する為、単離した。制限地図作成及びハイブリダイゼーションデータにより、全てのキシラナーゼ陽性組換え体は同一のｍＲＮＡ種由来のｃＤＮＡ配列を含有することが示された。機能的キシラナーゼをコードする、ｘｙｎＡと称する最も大きなｃＤＮＡ配列の制限地図を第１図に示す。１．７ＫｂのｘｙｎＡの５’領域から成る核酸プローブは、１つの２．５Ｋｂネオカリマストリクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｒｉｘ）ＲＮＡ種とハイブリッド形成した。このことは、単離された最も長いｘｙｎＡｃＤＮＡはほとんどその完全な長さであることを示す。実施例１０キシラナーゼＡの特徴の決定ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）キシラーゼをコードするｃＤＮＡをλＺＡＰＩＩから切り出し、ｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴＳＫの組換え体としてのＥ．ｃｏｌｉＸＬ１−Ｂｌｕｅに入れた。最も大きな型のｘｙｎＡを含有するプラスミドｐＮＸ１を有する組換え菌株によって発現したキシラナーゼ活性が、菌体を含まない抽出物中で優勢に見い出された。このことはその酵素が、Ｅ．ｃｏｌｉによって効率的に分泌されてはいないことを示した。キシラナーゼＡ（ＸＹＬＡ）と称するキシラナーゼをほぼ均質化する迄（＞９０％純粋）精製した。精製したＸＹＬＡは５９８０Ｕ／ｍｇ蛋白質の比活性を有し、無細胞抽出物の値１６Ｕ／ｍｇ蛋白質と対照された。このことは、ＸＹＬＡがｐＮＸ１を有するＥ．ｃｏｌｉ細胞に合成された０．３％の可溶蛋白質から成ることを示す。精製された酵素は、５３０００のＭｒ（第２図）及びＮ−末端配列ＩＡＴＶＡＫＡＱＷＧＧＧＧＡＳを有していた。ＸＹＬＡはキシランを加水分解したがカルボキシメチルセルロース、大麦β−グルカン、ラミナリン、リチナンあるいは人工基質４− メチル−ウンベリフェリル−β−Ｄ−キシロシド及びｐ−ニトロフェニル−β− Ｄ−キシロピラノシドに対しては活性を示さなかった（第１表）。 ¹⁾１ユニットのＸＹＬＡは１分毎に１μｍｏｌｅの生成物を放出する。酵素は粘性の急速な減少を加速し（第３図）基質１ｇ当たり８９３ｍｇの還元糖を放出させて、エンド−β−１，４−キシラナーゼ（ＥＣ３．１．２．８）に典型的な方法で可溶性キシランを攻撃した。ＨＰＬＣによる加水分解生成物の分析からＸＹＬＡがおよそ等量のキシロビオースとキシロースを開放したことが判明した。オートスペルト（ｏａｔｓｐｅｌｔ）キシランの主要な側鎖であるアラビソースを含有する二糖は反応生成物中に検出されず、このことは、その酵素が側鎖糖に結合したキシロースユニットを含むグリコシド結合を加水分解しないことを示していた。実施例１１−ヌクレオチド配列ｐＮＸ１由来の２．３ｋｂネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）ｃＤＮＡを両鎖共配列決定した（ＥＭＢＬ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ＤＤＢＪヌクレオチド配列データライブラリ（ＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＳｅｑｕｅｎｃｅＤａｔａＬｉｂｒａｒｉｅｓ）におけるアクセスナンバーＸ６５５２６）。そのヌクレオチドの翻訳によって単一の１８２１ｂｐの読取り枠（ＯＲＦ）がＭｒ６６１９２のポリペプチドをコードしていることが判かった。コードされている蛋白質の推諭された第１次構造は第４図に示されている。Ｅ．ｃｏｌｉから精製された組換えＸＹＬＡのＮ末端１５残基は、翻訳された配列のアミノ酸１２から２６と完全に合致した。以下の観察に基づき翻訳開始コドンを推定した；(i)ＯＲＦの上流にはＡＴＧ配列が無い；(ii)翻訳終止コドンは、３つの全ての読取り枠において、推定された翻訳開始コドンの上流にある。推定されたＡＴＧ開始コドンの付近のヌクレオチド配列を調査したところＥ．ｃｏｌｉにおいて翻訳開始コドンとして作用し得る他の配列は見つからなかった。従って、ｘｙｎＡの翻訳開始は腸内細菌と嫌気性菌類で、同一コドンにおいて起こるようである。このことは比較的下等な真核生物ｍＲＮＡが、対応するＥ．ｃｏｌｉ配列に適合するリボソーム結合配列を含有しないという事実にもかかわらず、そうである。恐らく、ＡＴＧ開始コドンの７ｂｐ上流の配列ＡＧＡは、バクテリアにおける弱いリボソーム結合配列として作用するのであろう。ｘｙｎＡｃＤＮＡを２．３ｋｂＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ制限フラグメントでｐＭＴＬ２２においてサブクローニングすると機能的キシラナーゼを指令しない組換えプラスミド（ｐＮＸ２）を生ずるので、恐らく、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｘｙｎＡの転写開始はベクターのｌａｃＺｐにおいてであろう。ベクターのｌａｃＺｐはｐＮＸ２中のｘｙｎＡの３’部位にある。ＸＹＬＡはＥ．ｃｏｌｉによって分泌されないが推論されたキシラナーゼのＮ末端部位は、シグナルペプチドのそれと一致し、Ｎ−末端親水性塩基の領域とそれに続く２３個の大部分が疎水性または中性のアミノ酸の配列から成る。ｘｙｎＡＯＲＦのＧ＋Ｃ含量は４３．４％で５’及び３’非−暗号領域（３ ’ポリＡ尾部を除く）の１０．７％と比較対照される。ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）ＤＮＡの総Ｇ＋Ｃ含量はおよそ１５％（Ｂｉｌｌｏｎ−Ｇｒａｎｄら、FEMS Microbiol.Lett.82:267-270(1991)）でそのゲノムの非蛋白暗号領域が一般にＡ＋Ｔを大変豊富に含むことを示す。ｘｙｎＡにおけるコドン使用の偏りは、６１のアミノ酸コドンのうち１４を欠くことから明らかである。３番目の位置にＴの使用が著しく（全てのコドンの５０％まではＴで終る）ゆらぎの位置ではＧの排除が顕著である。それぞれＭｅｔ及びＴｒｐの唯一のコドンであるＡＴＧ及びＴＧＧを除くと、ＡＡＧ、ＧＡＧ及びＴＴＧの３コドンだけがＧを３番目の位置に持つ。成熟ＸＹＬＡの、推論された一次構造を調べるといくつかの興味深い特徴が判明した。残基２５５−２６５の間、及び４９１−５１９の間はプロリン及びヒドロキシアミノ酸に富む領域である。多くのセルラーゼ及びキシラナーゼはプロリン／ヒドロキシアミノ酸に富む配列によって連結した複数の蛋白領域（ｄｏｍａｉｎｓ）から成る（Ｇｉｌｋｅｓら、Microbiol.Rev.55:303-315(1991)）。ＸＹＬＡ中のそうした２つの“連結配列”は、その酵素が少なくとも３つの明確に区別された蛋白質領域（ｄｏｍａｉｎｓ）から成ることを示唆している。ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）キシラーゼは、連結領域を備えていることに加え、Ｎ−末端に２２５のアミノ酸反復配列そしてＣ−末端の４０残基の反復領域を含有する（第４図）。大小の反復領域の間に明白な配列保存（ｓｅｑｕｅｎｃｅｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ）は無い。その２つのＮ−末端反復配列は９１．６％の同一性、９５．６％の類似性を示した。４０アミノ酸反復領域は８２．９％の同一性及び９５．１％の類似性を呈示した。その２つの反復領域をコードするＤＮＡはまた、配列の同一性も示した。６９９ｂｐ及び１２０ｂｐ反復配列はそれぞれ９２．７％と９０．８％の同一性を示した。実施例１２−相同関係の研究疎水性クラスタ分析は、セルラーゼ及びキシラナーゼが９つの酵素群にグループ分けされ得ることを示した。一群内の蛋白質は構造的に関連していて、多分、共通の祖先にあたる遺伝子から進化したものである（Ｈｅｎｒｉｓｓａｔら、Ge ne 81:83-95(1989)）。ＸＹＬＡをＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴデータベース中の配列と比較すると、その菌類酵素と、バチルスピューミリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｕｍｉｌｉｓ）キシラナーゼＡ（Ｆｕｋｕｓａｋｉら、FEBS Lett.171:197-201(1984)）、バチルスシルクランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ）キシラナーゼ（Ｙａｎｇら、Nucl.Acids Rcs. 16:7178(1988)）、クロストリジウムアセトブチリカム（ＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍキシラーゼＢ（Ｚａｐｐｅら、Nucl.Acids Rcs.18:2179(1990)）及び多領域（ｍｕｌｔｉ−ｄｏｍａｉｎ）ルミノコッカスフラベファシエンス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｆｌａｖｅｆａｃｉｅｎｓ）キシラナーゼのＮ−末端領域（Ｚｈａｎｇ＆Ｆｌｉｎｔ，Mol. Microbiol. 6:1013-1019(1992)、との間に相同関係があることが判った。これらの酵素とＮ．パトリシアルム（Ｎ．ｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍ）ＸＹＬＡとの間の相同性の度合いを第５図に示す。ＸＹＬＡの大きな反復配列だけが他のヘミセルラーゼとの相同性を示し、Ｃ− 末端反復領域はデータベース中の蛋白質との同一性を示さなかったことに留意すると興味深い。このことは、ＸＹＬＡはＮ−末端領域が触媒領域（ｃａｔａｌｙｔｉｃｄｏｍａｉｎ）を構成するモジュールの構造を有することを示す。実施例１３−ＸＹＬＡの構造及び機能Ｎ−末端反復配列がＸＹＬＡの触媒領域（ｃａｔａｌｙｔｉｃｄｏｍａｉｎ）を構成するという主張を吟味する為、ｘｙｎＡの５’及び３’領域を削除し、あるいはベクターにサブクローニングし、結果として得られるｘｙｎＡ誘導体の、機能的キシラナーゼ発現能力を評価した。４０アミノ酸Ｃ−末端反復をコードする３’領域の２９１ｂｐが削除されているｘｙｎＡの短縮形も依然機能的キシラナーゼをコードしていた。コードされている酵素の予測されたＭｒは５３０００であった。これはｐＮＸ１を有するＥ．ｃｏｌｉから精製したＸＹＬＡのサイズに類似している。このように腸内細菌によって完全な長さの遺伝子から合成された組み換えキシラナーゼもまたＣ−末端反復配列を欠くことがある。この見解の支持は、いくつかの多領域（ｍｕｌｔｉｄｏｍａｉｎ）セルラーゼびキシラナーゼは、セリンに富む連結配列内で実質的に切断されたＥ．ｃｏｌｉによって発現したシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）キシラナーゼ（Ｈａｌｌら、Mol.Microbiol.3:12 11-1219(1989)）も含め連結配列内の蛋白分解切断に対して特に感受性がある（Ｔｏｍｍｅら、Eur.J.Biochcm.170:575-581(1988)；Ｇｉｌｋｅｓら、J.Biol.Ch em.263:10401-10407(1988)という事実によって与えられる。１０１１ｂｐにわたる、より実質的な３’削除（ｐＮＸ６）は、機能的キシラナーゼを合成するｘｙｎＡの能力に影響を与えなかった。しかしながら、ｘｙｎＡの３’領域から１３２４ｂｐを除去すると不活性なＸＹＬＡ誘導体が合成される結果となった。これらのデータは、Ｎ．パトリシアルム（Ｎ．ｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍ）キシラナーゼのＮ−末端２７０残基が折り畳まれて触媒として活性な酵素となることを示唆する。Ｎ−末端反復配列が両方共折り畳まれて機能的キシラナーゼとなるか否か決定する為に７２０ｂｐＳｃａＩＮｒｕＩ−制限フラグメント（ＮｒｕＩはｐＮＸ４の多クローニング領域を切断する）をｐＭＴＬ２０中でクローニングし、短縮ｘｙｎＡがベクターＩａｃＺ’翻訳開始コドンと同調する（第１図）ｐＮＸ５を生成した。ｐＮＸ５を有するＥ．ｃｏｌｉは、完全な長さのｘｙｎＡを有するクローンに比べ１５倍も多くのＸＹＬＡを発現した。この菌類酵素発現の向上は、ｐＮＸ５にコードされたｘｙｎＡ中のＥ．ｃｏｌｉ翻訳開始配列の利用の結果と推定される。ｐＮＸ５を含有するＥ．ｃｏｌｉの、無細胞抽出物から精製されたＸＹＬＡは２６０００のＭｒを有していた（第２図Ｂ）。これらのデータは、反復Ｎ−末端２２５残基が明確な触媒領域を構成することを確証させる。興味深いことに、第２の触媒領域のＣ−末端から数個のアミノ残基を削除してｐＮＸ９を生成することにより、キシラナーゼ活性の更なる増加が得られた。Ｎ−及びＣ−末端触媒領域の基質特異性を調べる為、ｐＮＸ６及びｐＮＸ５によってコードされたキシラナーゼの植物構造多糖切断能力を評価した。それらの酵素はキシランのみを切断し、キシロビオース及びキシロースを完全な長さのＸＹＬＡの同様の割合で放出した。このように、両方の触媒領域が完全な長さのＸＹＬＡと同一の基質特異性を示した。多くのセルラーゼ及びキシラナーゼは多数の蛋白領域から成るが、カルドセラムサッカロリティカム（Ｃａｌｄｏｃｅｌｌｕｍｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のｃｅｌＢ（Ｓａｕｌら、Appl.Environ.Microbiol.56:3117-3124(19 90)）は２つの明確な触媒領域を含む酵素のこれまでで唯一の例である。この酵素は、異なる酵素群に属するＮ−末端エクソグルカナーゼ及びＣ−末端エンドグルカナーゼから成る。このように、ｃｅｌＢをコードする遺伝子は恐らく２つの別個のセルラーゼ遺伝子の融合により生じるのであろう。本発明は、菌類のキシラナーゼもまた多数の触媒領域から構成され得るという証拠を提供する。ｃｅｌＢ遺伝子とは対照的にｘｙｎＡは明らかに、先祖に当たる遺伝子が直列的に重複された結果である。遺伝子の重複がどういった選択上の利点を嫌気性菌類に与えるのかは明らかでない。それは、単に、ＸＹＬＡの触媒領域の発現を増加させる為のメカニズムであろうか？これは嫌気的菌類キシラナーゼについての最初の記述であるから、多数の触媒領域が下等真核生物のヘミセルラーゼの共通な特徴であるのか否かは明らかではない。配列リスト (1)一般的情報 (i)出願人 (Ａ)氏名：ハリージョンギルバート（ＨａｒｒｙＪｏｈｎＧＩＬＢＥＲＴ） (Ｂ)番地：１６ＫｅｌｌｓＧａｒｄｅｎｓ，ＬｏｗＦｅｌｌ (Ｃ)市：Ｇａｔｅｓｈｅａｄ (Ｄ)州：ＴｙｎｅａｎｄＷｅａｒ (Ｅ)国：英国 (Ｆ)ポスタルコード（２１Ｐ）：ＮＥ９５ＸＳ (Ａ)氏名：ジエフリーピーターヘイズルウッド（ＧｅｏｆｆｒｅｙＰｅｔｅｒＨＡＺＬＥＷＯＯＤ） (Ｂ)番地：１０９ＡＤｕｃｈｅｓｓＤｒｉｖｅ (Ｃ)市：Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ (Ｄ)州：Ｓｕｆｆｏｌｋ (Ｅ)国：英国 (Ｆ)ポスタルコード（２１Ｐ）：ＣＢ８８ＡＬ (ii)発明の名称：組換えキシラナーゼ (iii)配列の数：１８ (iv)コンピュータによる読取りのフォームＡＳＣＩＩファイルを含む３．５”Ｍｓ−Ｄｏｓフロッピーディスク（９３_０１２８３．ＡＳＣ） (v)現在の出願データ出願番号：ＷＯＰＣＴ／ＧＢ９３／０１２８３ (２)ＳＥＱＩＤＮＯ：１の情報： (i)配列の特徴 (Ａ)長さ：２３３８塩基対 (Ｂ)タイプ：核酸 (Ｃ)鎖の状態：２重鎖 (Ｄ)トポロジー：線状 (ii)分子型：ｃＤＮＡ (iii)仮説性：非 (iii)アンチ−センス：非 (vi)起源 (Ａ)生物：Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘｐａｔｒｉｃｉａｒｕｍ (Ｂ)菌株：（亜種（ｔｙｐｅｓｐｅｃｉｅｓ）） (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ＣＤＳ (Ｂ)位置：１９５．．２０１８ (Ｄ)その他の情報：／機能＝“キシラン分解酵素”／物質＝“ＸＹＬＡ” ／標準名＝“キシラナーゼ” (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ｓｉｇ−ｐｅｐｔｉｄｅ (Ｂ)位置：１９５．．２８１ (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ｍａｔｐｅｐｔｉｄｅ (Ｂ)位置：２８２．．２０１８ (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ｍｉｓｃｆｅａｔｕｒｅ (Ｂ)位置：２８２．．９５９ (Ｄ)その他の情報：／ラベル＝ＣＡＴ１／注＝“第１触媒領域” (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ｍｉｓｃ_ｆｅａｔｕｒｅ (Ｂ)位置：１０１７．．１６９１ (Ｄ)その他の情報：／ラベル＝ＣＡＴ２／注＝“第２触媒領域” (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ｍｉｓｃ_ｆｅａｔｕｒｅ (Ｂ)位置１７６４．．１８８３ (Ｄ)その他の情報：／ラベル＝ＣＴＲ１／注＝“第１Ｃ−末端反復” (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ｍｉｓｃ_ｆｅａｔｕｒｅ (Ｂ)位置：１８８４．．２０１５ (Ｄ)その他の情報：／ラベル＝ＣＴＲ２／注＝“第２Ｃ−末端反復” (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ｍｉｓｃ_ｆｅａｔｕｒｅ (Ｂ)位置：１．．２３３８ (Ｄ)その他の情報：／ラベル＝ｐＮＸ１_インサート (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ｍｉｓｃ_ｆｅａｔｕｒｅ (Ｂ)位置：１．．２３３８ (Ｄ)その他の情報：／ラベル＝ｐＮＸ２_インサート／注＝“ｐＮＸ２インサートは、ｐＮＸ１インサートとは方向が逆である。 (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ｍｉｓｃ_ｆｅａｔｕｒｅ (Ｂ)位置：１．．１８４７ (Ｄ)その他の情報：／ラベル＝ｐＮＸ３_インサート (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ｍｉｓｃ_ｆｅａｔｕｒｅ (Ｂ)位置：１．．１７２５ (Ｄ)その他の情報：／ラベル＝ｐＮＸ４_インサート (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ｍｉｓｃ_ｆｅａｔｕｒｅ (Ｂ)位置：１００２．．１７２５ (Ｄ)その他の情報：／ラベル＝ｐＮＸ５_インサート (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ｍｉｓｃ_ｆｅａｔｕｒｅ (Ｂ)位置：１．．１００１ (Ｄ)その他の情報：／ラベル＝ｐＮＸ６_インサート (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ｍｉｓｃ_ｆｅａｔｕｒｅ (Ｂ)位置：１．．６９０ (Ｄ)その他の情報：／ラベル＝ｐＮＸ７_インサート (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ｍｉｓｃ_ｆｅａｔｕｒｅ (Ｂ)位置：１００２．．２３３８ (Ｄ)その他の情報：／ラベル＝ｐＮＸ８_インサート (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ｍｉｓｃ_ｆｅａｔｕｒｅ (Ｂ)位置：１００２．．１８４７ (Ｄ)その他の情報：／ラベル＝ｐＮＸ９_インサート (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ｍｉｓｃ_ｆｅａｔｕｒｅ (Ｂ)位置：１００２．．１７０９ (Ｄ)その他の情報：／ラベル＝ｐＮＸ１０_インサート (xi)配列の記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：１： (２)ＳＥＱＩＤＮＯ：２の情報 (i)配列の特徴： (Ａ)長さ：６０７アミノ酸 (Ｂ)タイプ：アミノ酸 (Ｄ)トポロジー：線状 (ii)分子型：蛋白質 (xi)配列の記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：２： (２)ＳＥＱＩＤＮＯ：３の情報 (i)配列の特徴： (Ａ)長さ：１８４７塩基対 (Ｂ)タイプ：核酸 (Ｃ)鎖の状態：二重鎖 (Ｄ)トポロジー：線状 (ii)分子型：ｃＤＮＡ (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ＣＤＳ (Ｂ)位置：１９５．．１８４７ (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ｓｉｇ_ｐｅｐｔｉｄｅ (Ｂ)位置：１９５．．２８１ (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ｍｉｓｃ_ｆｅａｔｕｒｅ (Ｂ)位置：１．．１８４７ (Ｄ)その他の情報：／ラベル＝ｐＮＸ３_インサート (xi)配列の記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：３： (２)ＳＥＱＩＤＮＯ：４の情報 (i)配列の特徴： (Ａ)長さ：５５１アミノ酸 (Ｂ)タイプ：アミノ酸 (Ｄ)トポロジー：線状 (xi)配列の記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：４： (２)ＳＥＱＩＤＮＯ：５の情報 (i)配列の特徴： (Ａ)長さ：１７２５塩基対 (Ｂ)タイプ：核酸 (Ｃ)鎖の状態：二重鎖 (Ｄ)トポロジー：線状 (ii)分子型：ｃＤＮＡ (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ＣＤＳ (Ｂ)位置：１９５．．１７２４ (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ｓｉｇ_ｐｅｐｔｉｄｅ (Ｂ)位置：１９５．．２８１ (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ｍｉｓｃ_ｆｅａｔｕｒｅ (Ｂ)位置：１．．１７２５ (Ｄ)その他の情報：／ラベル＝ｐＮＸ４_インサート (xi)配列の記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：５： (２)ＳＥＱＩＤＮＯ：６の情報： (i)配列の特徴： (Ａ)長さ：５１０アミノ酸 (Ｂ)タイプ：アミノ酸 (Ｄ)トポロジー：線状 (ii)分子型：蛋白質 (xi)配列の記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：６： (２)ＳＥＱＩＤＮＯ：７の情報： (i)配列の特徴： (Ａ)長さ：７２４塩基対 (Ｂ)タイプ：核酸 (Ｃ)鎖の状態：二重鎖 (Ｄ)トポロジー：線状 (ii)分子型：ｃＤＮＡ (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ＣＤＳ (Ｂ)位置：１．．７２３ (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ｍｉｓｃ_ｆｅａｔｕｒｅ (Ｂ)位置：１．．７２４ (Ｄ)その他の情報：／ラベル＝ｐＮＸ５_インサート (xi)配列の記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：７： (２)ＳＥＱＩＤＮＯ：８の情報： (i)配列の特徴： (Ａ)長さ：２４１アミノ酸 (Ｂ)タイプ：アミノ酸 (Ｄ)トポロジー：線状 (ii)分子型：蛋白質 (xi)配列の記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：８： (２)ＳＥＱＩＤＮＯ：９の情報： (i)配列の特徴： (Ａ)長さ：１００１塩基対 (Ｂ)タイプ：核酸 (Ｃ)鎖の状態：二重鎖 (Ｄ)トポロジー：線状 (ii)分子型：ｃＤＮＡ (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ＣＤＳ (Ｂ)位置：１９５．．１００１ (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ｓｉｇ_ｐｅｐｔｉｄｅ (Ｂ)位置：１９５．．２８１ (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ｍｉｓｃ_ｆｅａｔｕｒｅ (Ｂ)位置：１．．１００１ (Ｄ)その他の情報：／ラベル＝ｐＮＸ６_インサート (xi)配列の記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：９： (２)ＳＥＱＩＤＮＯ：１０の情報： (i)配列の特徴： (Ａ)長さ：２６９アミノ酸 (Ｂ)タイプ：アミノ酸 (Ｄ)トポロジー：線状 (ii)分子型：蛋白質 (xi)配列の記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：１０： (２)ＳＥＱＩＤＮＯ：１１の情報： (i)配列の特徴： (Ａ)長さ：６９０塩基対 (Ｂ)タイプ：核酸 (Ｃ)鎖の状態：二重鎖 (Ｄ)トポロジー：線状 (ii)分子型：ｃＤＮＡ (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ＣＤＳ (Ｂ)位置：１９５．．６８９ (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ｓｉｇ_ｐｅｐｔｉｄｅ (Ｂ)位置：１９５．．２８１ (ix)特徴： (Ａ)名称／キー：ｍｉｓｃ_ｆｅａｔｕｒｅ (Ｂ)位置：１．．６９０ (Ｄ)その他の情報：／ラベル＝ｐＮＸ７_インサート (xi)配列の記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：１１： (２)ＳＥＱＩＤＮＯ：１２の情報 (i)配列の特徴： 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(xi)配列の記述：ＳＥＱＩＤＮＯ：１８：配列リストの要約ＳＥＱＩＤＮＯ：１ｐＮＸ１ＤＮＡ及びコード領域ＳＥＱＩＤＮＯ：２ＳＥＱＩＤＮＯ：１の蛋白質配列ＳＥＱＩＤＮＯ：３ｐＮＸ３ＤＮＡ及びコード領域ＳＥＱＩＤＮＯ：４ＳＥＱＩＤＮＯ：３の蛋白質配列ＳＥＱＩＤＮＯ：５ｐＮＸ４ＤＮＡ及びコード領域ＳＥＱＩＤＮＯ：６ＳＥＱＩＤＮＯ：５蛋白質配列ＳＥＱＩＤＮＯ：７ｐＮＸ５ＤＮＡ及びコード領域ＳＥＱＩＤＮＯ：８ＳＥＱＩＤＮＯ：７の蛋白質配列ＳＥＱＩＤＮＯ：９ｐＮＸ６ＤＮＡ及びコード領域ＳＥＱＩＤＮＯ：１０ＳＥＱＩＤＮＯ：９の蛋白質配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１１ｐＮＸ７ＤＮＡ及びコード領域ＳＥＱＩＤＮＯ：１２ＳＥＱＩＤＮＯ：１１の蛋白質配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１３ｐＮＸ８ＤＮＡ及びコード領域ＳＥＱＩＤＮＯ：１４ＳＥＱＩＤＮＯ：１３蛋白質配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１５ｐＮＸ９ＤＮＡ及びコード領域ＳＥＱＩＤＮＯ：１６ＳＥＱＩＤＮＯ：１５の蛋白質配列ＳＥＱＩＤＮＯ：１７ｐＮＸ１０ＤＮＡ及びコード領域ＳＥＱＩＤＮＯ：１８ＳＥＱＩＤＮＯ：１７の蛋白質配列Detailed Description of the InventionRecombinant xylanase The present invention is a recombinant xylanase that can be induced from anaerobic fungi. About. Xylan, the main component of plant hemicellulose, is mainly composed of acetyl and arabiso. 1,4-linked β-D-xylopyi substituted by sil and glucuronosyl residues It consists of a polymer of lanose units. Hardwood xylan is typically xylo Approximately 10% of the subunits are α-1 in the 4-O-methylglucuronic acid side chain. , 2-bonds, and 70% of xylose residues in the C-2 or C-3 position With O-acetyl-4-O-methyl-glucuronoxylan which is acetylated with is there. Softwood xylan is typically more than 10 percent xylose units. Is substituted with an α-1,3-linked arabisofuranose residue -Methyl-glucuronoxylan. Convert xylan into its constituent monosaccharides. To do so, a set of microbial enzymes act synergistically. These are endo-β-1 ． 4-xylanase (EC3.2.1.8), β-xylosidase (EC3.2) ． 1.37) and cleave side chain sugars (glycosidases) from the xylan backbone Or a series of enzymes that remove acetyl groups (Dekker RFH ． , And Richards, G .; N. ， Adv.Carbohydr.Chem.Biochem.32: 277-35 2 (1976); Biely, Trends Biotechnol. 3: 286-290 (1985); Poutanen et al. , “AccesoryEnzymes Involved in the Hydrolysis of Xylans” In: Enzymes in Biomass Conversion, ACS Symposium Series 460, pp426-436, Ed.G.F.Letham, (199 1)). Microorganisms that degrade xylan are generally encoded by numerous genes. Expresses the isoenzymatic form of xylanase. (Hazelwood et al., FEMS Mic robiol.Lett.51: 231-236 (1988); Gilbert et al., J. Gen. Microbiol.134: 3239-. 3247 (1988); Clarke et al., FEMS Microbiol. Lett. 83: 305-310 (1991)). Some xylanases hydrolyze only xylan (Hall et al., Mol. Mi. crobiol.3: 1211-1219 (1989); Wong et al., Microbiol. Rev. 52: 305-317 (1988)). Many microorganisms that hydrolyze xylan also degrade cellulose. Bond broken Similarity (β-1,4-glycosidic bond) and cellulase and xylanase From the cross-specificity that is sometimes observed during , The phylogenetic relationship of these enzymes is an interesting issue. Sequence comparison position of these days For sequence alignment and hydrophobic cluster analysis The plant cell wall hydrolases were divided into eight enzyme groups (Henrissat et al. Gene 81: 83-95 (1989); Gilkes et al., Micrbiol. Rev. 55: 303-315 (1991)). Xylanase does not show the identifiable sequence identity with cellulase, Suggest that the two enzymes evolved from distinct ancestral genes It Many plant cell wall hydrolases consist of two distinct protein regions. Ie , A linking sequence in which the catalytic region (CD) contains a lot of hydroxy amino acids / proline (Linker sequence) Non-Catalyzed Cellulose Binding Domain (CBD; Gilkes et al., Microbiol. Rev. 55: 303-315 (1991); Kellett et al., Biochem. J. 272: 369-376 (1990); Gil. Bert et al., Mol. Microblol. 4: 759-767 (1990)). Accurate CBD There is a lot of debate about its role, but for aerobic fungal cellulases, CBD The enzyme plays a crucial role in crystalline cellulose hydrolysis (Tomme et al., Eu. r.J.Biochcm.170: 575-581 (1988)). For prokaryotic cellulases and xylases The role of this protein region in skeleton is less clear (Ferreira et al., Biochem. J. 269: 261-264 (1990)). In addition to their modular structure, cellulases Often contains extended repeat sequences (Gilkes et al. Microbiol. Rev. 55: 303-315 ( 1991)). Many of the precise roles of these tandem repeats are unclear. Many cellulolytic and hemicellulose-degrading prokaryotes are found in bovine and ovine lobes. Living in Men. Recently, anaerobic rumen fungi have also been added to both cellulose and xylan. Has been shown to decompose efficiently (Orpin and Letcher Curr. Microbi ol.3: 121-124 (1979); Lowe et al., Appl. Environ. Microbiol. 53: 1216-1223 (1987). )), And similar fungi inhabit the digestive tract of large herbivores (Orpin and And Joblin, “Anaerobic fungi” .In: TheRumen Microbiol Ecosystem, P.N Hobson (Ed), pp 129-150, Elsevier, London (1988)). Rumen fungus Neocalimus Tix Frontalis (Neocallimastix frontalis)of The cellulase complex is described by Wood et al., Biochemistry and Genetics of Cellulose Degr. Characterized by adation: FEMS Symp. 43: 31-52 (1988) Is stated. Lower eukaryotes have Mr 1,000,000-2,000, 000 large multi-enzyme complexes were synthesized, which quickly hydrolyzed crystalline cellulose. Disassemble. The complex consists of substantial endoglucanase, and some β-glucan. Contains cosidase activity. The fungus is also known as avicelase (Avicelas). e), presumably cellobiohydrolase is also synthesized. Another Rumen Fungus Neoca Limastics Patricialum (Neocallimastix patri ciarum ) Is filter paper cellulose, Avicel^TM(Fine crystalline cellulose Raid Mark) and Xylan (Williams and Orpin Can. J. Microbiol .33: 418-426 (1987)), which produces an extracellular enzyme that hydrolyzes. These enzymes The difference is not defined in its characteristics. Neo encoding plant cell wall hydrolase Kalimatics (NeocallimastixLimited information about (Reymond et al., FEMS Microbiol. Lett. 77: 107-112 (1991). )). Xylan, along with lignin, is found in the primary and secondary cell walls of most plants It The coexistence of xylan and lignin is especially related to xylanase in paper pulp treatment. It is the key to commercial potential. Sandoz Products of USA Ltd has already been used for the treatment of wood pulp in the production of paper and other wood products. Chlorine commonly used to bleach undesired brown lignin-derived residues And the crude fungal xylana to at least partially replace chlorine-derived compounds. An attempt was made to use the enzyme. Chlorine demand in today's wood pulp processing plants. The point is like that Therefore, each plant may have its own chlorine dioxide production unit. The benefits to the paper industry by avoiding the use of chlorine are clear. That is, abolition Improving waste disposal, operator safety and plant capital, if a suitable alternative to chlorine is obtained If done, it can be achieved. However, the paper industry is highly competitive and profits merge. Is narrow. Therefore, any chlorine substitute could not be produced economically and economically. Must, and, of course, the pulp and paper manufacturer to benefit from its use. Must be effective enough to convince. Neo Calimastics Patricialum (Neocallimastix p atriciarum ) Derived xylanase full-length cDNA and protein sequences Rows May 5, 1992 from the EMBL databank of Heidelberg, Germany. The day was available by access number X65526. Xylanase is XY It was designated LA and the corresponding gene was designated xynA. N. Patricialum (N. pat riciarum ) Individual xylana from anaerobic fungi such as XYLA enzyme from The modified xylanase obtained from the enzyme is used industrially, especially in pulp and paper. It turns out that it has the qualities that make it suitable for construction. Surprisingly, It is believed that truncation increases expression of the enzyme. According to the first aspect of the present invention, a minority homologous to the anaerobic fungal xylanase is used. Full length with at least one catalytic area There is provided a xylanase that is not the native xylanase of. A more preferable catalytic region is the same as the catalytic region of the natural xylanase from the anaerobic fungus Yamara. Is one. However, for the purposes of the present invention, for example, if the first sequence is Share the biological activity of sequences and have at least about 40% phase at the amino acid level If homologous, the first sequence is substantially homologous to the second sequence. Therefore, according to the present invention The catalytic domain of xylanase in this aspect is the catalytic domain of the natural xylanase of anaerobic fungi. Have at least about 40% homology with the region. Two amino acids that are commonly compared At least 50%, 60%, 70%, 80% or 90% homology between sequences ( More preferable later) is more preferable. Homology may be alternative or additive Alternatively, it may be evaluated at the nucleic acid level. The DNA encoding the first amino acid sequence is the second DNA encoding the amino acid sequence of May be present) and hybridize therewith (hybridise). ), Or hybridized if the genetic code is not degenerate You can do it. Hybridization conditions are 65 in a salt solution of about 0.9 mol. Stringent conditions such as ° C may be used. Anaerobic fungi, which can be digestive tract (especially rumen) fungi, but Including: N. Patricialum (N. patriciarum), N.N. Frontari Su (N. frontalis), N.N. Full rayensis (N. hurleyen sis ) And N.A. Stunt Pensis (N. stanthorensis)As Neo Neocalimastics (Neocallimastix) Sp p. , S. Communis (S. communis) Like Spheromonas (Sp haeromonas ) Spp. , C. Eki (C. equi) Kaekomi Seth (Caecomies) Spp. , P. Communis (P. communi s ), P.I. Eki (P. equi), P.I. Donbonica (P. dumbonica ), P. Lethal Gix (P. lethargicus) And P.I. My (P. ma i ) Like Pyromyces (Piromyces) Spp. , P. Elegance (P . elegans ) Like Lumino Mrs (Ruminomyces) Spp. , A. Miyu Clonatos (A. mucronatus) Like Anaeromys (Anaeromyces) Spp. And O. Bovis (O. bovis) And O ． Gioni (O. joyoniiOrpinomyces (likeOrpinom yces ) Spp. . Caecomies equi，Piromyces equi，Pi romyces dumbonica as well asPiromyces maiTo the horse Found in other livestock lumens like other fungi above .Neocallimastix spp. In particularN. patriciarumBut preferable. The xylanase according to the present invention can have a high specific activity. Its specific activity is of bacterial origin Can be significantly higher than that of xylanase, eg at least 1000, 20 00, 3000, 4000, 4500, 5000 or 5500 U / mg protein , Which is preferable later. (One unit of xylanase activity is xylose equivalent hand, The amount of enzyme releasing 1 μmole of product, measured after 1 minute at 37 ° C. Defined). More notably, the xylaner according to this aspect of the invention is Ze is a natural XYLAN. patriciarumThan expressed by It can be expressed better to the extent that it makes sense. Less expressed than wild-type enzyme It can be improved at least 10 times or preferably at least 100 times. The xylanase according to the present invention may have the ability to degrade xylan with high efficiency . At least 0.1, and preferably at least 0.5 or even 0.75 g Certain reducing sugars can be produced per g xylan substrate. The xylanase according to the present invention, in contrast to many known xylanases, is a cellulosic It is also possible that it does not have a significant residual activity on the source. The enzyme is cellulos Removes xylan from plant fibers without compromising spiber, lignin This property makes the present invention particularly applicable to the pulp and paper industry as it can be dissociated. It is useful when The xylanase according to the present invention may have at least two catalytic regions. Catalyst area The arrangement of the zones may or may not be as in the wild type xylanase enzyme. Or placed in an artificial form that increases or improves the xylan-degrading activity of the enzyme May be. Particularly preferred xylanase as the source of the catalytic domain for use in the present invention IsNeocallimastix patriciarumOriginated, X It is called YLA. It has the following features Have quality. (i) 5980 U for purified enzyme when prepared by the following protocol / Mg protein specific activity; Host cell (E. coli XL1-Bl carrying a plasmid expressing the enzyme ue) was harvested by centrifugation and reconstituted in Tris-HCl buffer (50 mM, pH 8.0). And suspended in Clavke et al. (FEMS Microbiol. Letts. 83 305-310 (1991)). Prepare the cytosolic fraction as described. Ammonium sulfate (0.39 g / m l) The xylanase precipitated by the addition was added to 10 mM Tris-HCl buffer at pH 8 Dissolve again. Every time the same buffer was replaced three times, it was dialyzed Afterwards, the xylanase was (Mol.Micr.) Essentially as described by Hall et al. obiol.3 1211-1219 (1989)) DEAE-Anion exchange chromatography on Triacryl M Substantially purified by chromatography. (ii) Decomposes xylan with high efficiency, releasing 0.9 g of reducing sugar per 1 g of substrate Ability to (iii) No significant residual activity against cellulose (carboxymethylcellulose , Barley β-glucan, laminarin or detectable reduction from laminin Determined by the absence of sugar release); and (iv) Two catalytic areas. The structure of mature XYLA can be shown as follows (N-terminal to C-terminal): CAT1-LINK1-CAT2-LINK2-CTR1-CTR2 put it here, CAT1 represents the first catalytic domain with the following sequence: CAT2 represents a second catalytic domain with the following sequence: LINK1 represents a first linker having the following sequence: LINK2 represents a second linker having the following sequence: CTR1 represents the first C-terminal repeat with the following sequence: And CTR2 represents a second C-terminal repeat with the following sequence: All these subsequences have SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. Seen in. The structures of xylanases from other anaerobic fungi can be similar, but of course The exact sequence of minutes depends on the originN. patriciarumVery closely related to Generally different if not involved. Because of its activity, each area (especially the catalytic area) The whole doesn't have to be complete. In the present invention, the entire catalytic area is It is possible, but it is sufficient if the active site of the catalytic region is present ( That is, the catalytic region must be functionally present). The two catalytic regions may look very similar to each other but may not be identical. So The differences between them suggest a degree of homology with the native sequence that is particularly preferred. The two C-terminal repeats can also be found similar to each other (but not as much as two catalytic regions) Not). The difference between them is that the degree of homology, which is still highly desirable Suggest a case. The detailed sequence of the two linker sequences need not be particularly important. . All that is required is that the spatial arrangement of the catalytic regions effectively (and preferably It is the only thing that can be worked. A more preferred embodiment of the present invention is at least one of CAT1 and CAT2. And a catalytic region that is substantially homologous to )) At least part of the amino acid sequence. At least one of CTR2 Can be lacking Alternatively or (preferably) additionally may lack at least part of CTR1. Particular embodiments of xylanase according to the invention contain the following regions (and More preferably consisting essentially of them): A. CAT1-LINK1-CAT2-L1NK2-CTR1 (shortened) (eg pNX3); B. CAT1-LINK1-CAT2-LINK2 (shortened) (eg pNX4) ; C. LINK1 (shortened) -CAT2-LINK2 (shortened) (eg pNX5); D. CAT1-LINK1 (shortened) (eg pNX6); E. FIG. CAT1 (shortened) (eg pNX7); F. LINK1 (shortened) -CAT2-LINK2-CTR1-CTR2 (for example, pNX8); G. LINK1 (shortened) -CAT2-L1NK2-CTR1 (shortened) (eg p NX9); H. LINK1 (shortened) -CAT2 (shortened) (eg pNX10); (The name of the plasmid in parentheses indicates the expression product of the 1 illustrates an exemplary plasmid that is a Nase. ) Signal sequence initially present May exist, but it is better not present in the final molecule. Structures C, F, G and H are preferred and structures C, G and H are especially preferred. The enzyme according to the present invention comprises a single CAT1 region and a single CAT2 region. May be provided, or two or more catalytic regions may be provided, both of which have CAT1 And CAT2 may be independently selected. Substantially a catalyst It is possible that only a region is present, and as shown above, enough for activity. Not all natural catalytic regions are required. A signal peptide may be present in the immature protein. Of the natural signal peptide The array is Is. This sequence is also found in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2. Be done. The xylanase according to the invention may be prepared by any suitable means. Companion Large-scale fermentation of anaerobic fungi may be performed, or polypepti Recombinant DNA technology is generally the method of choice . The xylanase described above thus encodes a heterologous xylanase in the host cell. More preferably, it is an expression product of DNA. According to a second aspect of the invention, the natural molecule encoding the DNA molecule xylanase The anaerobic fungal xylana, provided that it does not contain a full-length copy of the mRNA. Isolated or encoding a xylanase having a catalytic region substantially homologous to the enzyme Recombinant DNA molecules are provided. Neocallimastix frontalisThe xylanase of The cDNA (apparently consisting of a full-length copy of the mRNA) is Reymo nd et al., FEMS Microbiol. Lett. 77: 107-112 (1991) but no expression has been reported. There is a full-length copy of native mRNA present in DNA according to this aspect of the invention. However, it should be understood that the invention is not limited to truncated cDNA. Some of the naturally occurring introns (if any) in the corresponding wild-type gene It is intended that all or all may exist. However, full length At least some of the sequences present in the cDNA of Absent in NA. This aspect of the invention provides full-length xylanase coding. The portion of the DNA that includes and lacks the encoded DNA is 3'and / or 5 '. It can also be a'non-translated region, which is also preferred in some embodiments. Should be understood. Therefore, a substantially full length or shortened xylana Nuclease can be generated from DNA according to this aspect of the invention, which is (a) 3'untranslated. Substantially lacking the region or (b) substantially lacking the 5'untranslated region, or ( c) Substantially lacking both 3'and 5'untranslated regions. A full-length cDNA encoding anaerobic fungal xylanase (N. patr iciarum (Based on the xynA gene of), may have the following structure: 5'utr-sig-cat1-link1-cat2-link2-ctr 1-ctr2-3'utr: put it here, 5'utr represents a 5'untranslated region, sig encodes a signal peptide, cat1 encodes the first catalytic region, link1 encodes the first linker sequence, cat2 encodes the second catalytic region, link2 encodes a second linker sequence, ctr1 encodes the first C-terminal repeat, ctr2 encodes the second C-terminal repeat, and 3'utr represents a 3'untranslated region. The genomic sequence may have one or more introns intervening within the structure above.N. patriciarum In the xynA gene encoding the XYLA enzyme of , The various DNA segments above have the following sequences: (The first 3 nucleotides of the 5'utr segment are stop codons- Note that it generally constitutes-. ) Use of these DNA segments or sequences substantially homologous thereto (these But not all) are preferred in this aspect of the invention. More preferable concrete Examples are generally more preferred components of the xylanase itself according to the first aspect of the invention. Consistent with the body example, the following considerations are added: (a) peptide signal sequence It is preferable that there is a DNA sequence to be read and / or (b) one of untranslated regions It is preferred that one or both are shortened or absent. In this aspect of the invention A particular embodiment according to contains (and more preferably, the vector -Consisting essentially of them, apart from the derived sequences): a. 5'utr-sig-cat1-link1-cat2-link2-c tr1 (shortened) (eg pNX3); b. 5'utr-sig-cat1-link1-cat2-link2 (short Contraction) (eg pNX4); c. link1 (shortened) -cat2-link2 (shortened) (eg pNX5) ; d. 5'utr-sig-cat1-link1 (shortened) (eg pNX6) ; e. 5'utr-sig-cat1 (shortened) (eg pNX7); f. link1 (shortened) -cat2-link2-ctr1-ctr2-3 ' utr (eg pNX8); g. link1 (shortened) -cat2-link2-ctr1 (shortened) (Eg pNX9); h. link1 (shortened) -cat2 (shortened) (eg pNX10). (The names of the plasmids in parentheses are in the examples containing the indicated DNA sequences. It shows the plasmid. ) Structures c, f, g and h are preferred, structures c, g and h are Particularly preferred. The recombinant DNA according to the present invention may be in the form of a vector. Vector is an example For example, a plasmid, cosmid or phage. Trance by them Transfected (or transformed): This specification uses these terms interchangeably. Cell), and more preferably heterologous DNA. Vectors are often used to allow selection of cells carrying the introduced vector. It often contains one or more selectable markers. The appropriate start and stop signals are Generally present. Furthermore, if the vector is intended for expression, it may be sufficient to direct expression. There will be regulatory sequences. Vectors without regulatory sequences are cloning vectors It is useful as a target. Of course, the expression vector is also a cloning vector. Can be useful as Cloning vectors facilitate their manipulationE. FIG. coliOr It can be introduced into other suitable hosts. According to another aspect of the invention, A host cell transfected or transformed with the above DNA is provided. It The DNA according to the invention couples consecutive nucleotides and / or Includes ligating oligos and / or polynucleotides, in vitro In-vitro process Recombinant DNA technology, which may be prepared by any convenient method, including Is selected as the method. DNA encoding xylanase can be cloned from a DNA library . A DNA library can be prepared from one of the above fungi. Library is genome However, the cDNA library is more preferable than the cDNA library. Increases the likelihood of cDNA encoding xylanase in brary Once treated, it is easier and more manageable to prepare. N. patriciarumThe selected fungal culture, such as In order to promote xylanase expression, which can proceed anaerobically in an appropriate medium containing, Therefore, it is unique because it causes an increase in the amount of RNA encoding xylanase. Alternatively, the main carbon source may be xylan. However, in the presence of xylan Cultivation is not mandatory and carbon sources are sold under the Avicel trademark instead. It may be cellulose such as commercially available microcrystalline cellulose. After culturing the fungus, total RNA can be extracted by any suitable method. Fungi Cells are harvested by filtration, followed by mechanical disruption in an appropriate cell lysis buffer. Can be lysed with. Suitable RNA-preserving compounds such as guanidinium thiocyanate Can also reduce or prevent RNase-mediated digestion in addition to fungal cells. Then Total RNA was extracted from the obtained homocinate by CsCl₂Ultracentrifugation through a cushion By Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, New York: Described in Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) It can be isolated by any suitable technique such as: In addition to the above, another method for the preparation of fungal total RNA is Puissant and Ho. based on the method described in udebine Bio-techniques 148-149 (1990), or The method may be adopted. In this method, at pH 4 Total fungal RNA was extracted from the above homogenate by phenol / chloroform extraction. It can be isolated and the DNA and associated proteins can be removed. As a result The crude RNA obtained is further purified by washing with a lithium chloride solution. It was A further suitable technique for fungal RNA extraction is described by Teeri et al. (Anal. Biochem. 164 60-67). (1987)). Once total RNA has been extracted by any method, for example, mRNA On compounds containing multiple thymidine or uracil residues to which the Li A tail can bind By performing affinity chromatography, etc., poly-A⁺mR NA can be isolated from total RNA. An example of a suitable compound is oligo-dT cellulosic Base and poly-U SEPHADEX^TMIs mentioned. Poly-A⁺mRNA is It can then be eluted with a suitable buffer. Therefore, the cDNA expression library was prepared by reverse transcriptase poly-A.⁺mRNA It can be constructed using standard techniques based on conversion to cDNA. Genome library The presence of introns in the DNA of the fungal genome, although it is possible to construct CDNA libraries are preferred because they avoid any of the difficulties Is good Good. The first strand of the cDNA can be synthesized using reverse transcriptase and the second strand can beE scherichia coli DNA polymerase I (E. coli po can be synthesized using any DNA-directed DNA polymerase such as II) It The cDNA can then be fractionated to the appropriate size and ligated into the appropriate vector. The vector is preferably a vector such as λZAP, λZAPII or λgt11. It is a rage vector. A kit suitable for that purpose is available from Stratagene. It is possible. Further or alternative guidance isN. frontal is Which described in detail the preparation of the cDNA library fromFE MS Microbiol. Lett. 17 107-112 (1991)). The resulting cd After packaging the NA library in vitro,E. FIG. c oli Can be amplified using any suitable host bacterial cell, such as an appropriate strain of . Screening for xylanase-positive recombinant clones is done by any suitable technique. But it can be done. The technique can be based on the hydrolysis of xylan. This In this method, the clones are grown on a medium containing xylan, and the Xylana with the proper help of color indicators Hydrolysis can be detected by the presence of ze positive plaques. Xylanase⁺clone The method of selecting is described in the literature. Two examples are Clarke et al.FEMS M icrobiol.Lett. 83 305-310 (1991)) and Teather and Wood (Appl. Env. iron.Microbiol.43777-800 (1982)). The xylanase-positive recombinant clones were then purified by well-established methods. (Ie, plaques can be converted into bacterial colonies). The right technology is Sam found in Brook et al. (1989) (loc. cit.). It is usual to simply follow the manufacturer's instructions for the kit being used. And claw The cDNA insert in the clone was excised, and as an example, pBLUESCRIPT^{SK (-)} Can be inserted into a selected vector such as Other suitable plasmids It can be used for cloning. Examples include Sambrook et al.Mole cular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor PUC plasmids and their sources, as described in Laboratory Press (1989) A conventional plasmid is included. Promoting DNA that encodes xylanase is appropriate. Expression vectors (particularly plasmids) under the control of Can also be formed and transformed and transfected into a suitable expression host. Can be An example of a suitable expression vector is pUC series (lac Zp promo Data, pMTL series (these also have the lac Zp promoter) ) And pBLUESCRIPT (lac Zp promoter and T₇Both promoters There is one). The nature of the promoter is generally not believed to be particularly critical, Depends on the expression host and the desired conditions for expression. As shown above,E. FIG. c oli An example suitable for a bacterial expression host such as is the Lac Z promoter. Bacteria lodging For the Lord Bacteriophage T as an alternative promoter₇Includes promoter. Purification of recombinant xylanase from their expression host was not required Good. As a host cellE. FIG. coliTo the pulp production of the xylanase of the present invention May be suitable for the application ofBacillus subtilisIncluding It is understood that other host cells such as Lamb-positive bacteria and lactic acid bacteria can be used. Eukaryotic expression hosts may alternatively be used. An example is East (Saccha romyces cerevisiae Like). Expressing a xylanase as described above and / or a DNA sequence as described above ( Host cells (whether for expression or not) The body constitutes a further aspect of the invention. Host cell preparation and xylanase production A method is also included in the present invention, which encodes xylanase in its host cell preparation method. DNA transforms or transfects cells, and the xylana In the zea production method, the expression host is cultivated to produce the DNA encoding xylanase. Reveal. Depending on the nature of the host cell, the recombinant DNA according to the invention contains a signal sequence Sometimes it is preferable. Even if a signal sequence specific to the host is included, For expression in eukaryotes, the signal sequence of the enzyme itself is used. Good. Include a translation initiation site adapted or preferred for the expression host. You can also give. However, the translation initiation site of the protein itself Position is sufficient or, in some circumstances, preferred. There, the recombinant xylanase obtained from the expression host can be characterized. Book The key features identified for particular embodiments of the invention are as follows: (i) The cloned xylanase has a very high specific activity (5980 U / mg Enzyme-made protein); this is the many cloning that has been reported so far. In contrast to the bacterial xylanase: (ii) The enzyme is capable of degrading xylan with very high efficiency, Releases 0.9 g of reducing sugars per; (iii) Whereas many other xylanase have some cellulase activity, The enzyme has no residual activity on cellulose; (iv) The enzyme contains two catalytic regions that modify the xylanase cDNA. A very efficient xylanase-producing clone is constructed by genetically engineering Can have potential. Cloned full-length xylanase (hereafter referred to as xylanase A) The high specific activity (5980 U / mg purified enzyme protein) of this fungal xylanase It is an essential feature. However, the pBluescript vector (pNX The expression level of the current construct of xynA cDNA in 1) isE. FIG. coliTo Relatively low,E. FIG. coli0.3% of soluble protein synthesized by cells Is. Generally speaking, the expression of the cloned gene isE. FIG. coliof It is achievable at levels above 10% of total cell protein. Short forms of xynA cDNA can be prepared by using restriction enzymes. pNX5 Some truncations containing it in the plasmid designated It produces xylanase activity that is several hundred times higher. One explanation for this observation is The results of using the LacZ translation initiation sequence for shortening xylanase A synthesis. It is to be. Another explanation is high expression as a result of avoiding AT-rich regions. The theory is that the mRNA degrading activity of RNase E is protein RNase E is a rate-limiting step in synthesis They tend to prefer it. Bacteriophage T₇It's a promoter E. coli by using a stronger promoter. its expression level in E. coli Can be further increased. have xynAEscherichia coliRecombinant key purified from Silanase A (XYLA) has an M of 53000_rHas an auto spelled xylan Was hydrolyzed to xylobiose and xylose. The enzyme is any cellulose Substrate also did not hydrolyze. From the nucleotide sequence of xynA, M_r66192 1821 bp open reading frame (open reading frame Lame) was found. The predicted first structure of XYLA is the N-terminal signal peptide. A repeating sequence of 225 amino acids followed by threonine / pro Separated from the tandem 40-residue C-terminal repeat by a phosphorus linker sequence It was The large N-terminal repeat region has a different substrate specificity similar to the full-length enzyme. It consisted of various catalytic areas. The xylanase according to the invention is used in many food, feed, pulp and paper industries. Has an applied form. Use of the xylanase described herein in these industries Are included within the scope of the invention. First, I will touch on the food industry. Bread dough and the resulting bread, baked goods The specific properties of the depend on the pentosan and starch content of the flour used. These properties include bread texture, volume, and staling. Ki The use of silanase improves breads, baked goods and offers products of potential commercial value. To serve. Bread ratio among properties that can be improved by xylanase treatment. There is a product. Increased specific volume when amylase is added in combination with xylanase Is further enhanced. One of the factors contributing to this effect is the ability of carbohydrates to bind water. (Water-binding capacity). The invention is described here. A dough containing the xylanase described is provided. In the animal feed industry, enzyme supplements for improving chicken chick feed ( The use of enzyme supplementation was already reported in 1957. Was told. More recent results have been found for wheat and especially for certain cereals such as rye. In addition, pentosan in the endosperm causes poor nutrition absorption and stickiness of chicken chicks. It is suggested to be the main cause of noxious feces. Both problems are undigested Seems to be the result of the high viscosity of Totosan. This prevents nutrients from spreading and water Combine to make excrement watery. These problems use xylanase preparations This can be avoided. The effect of xylanase is to increase the weight gain of chickens and feed Conversion efficiency (Feed conversion efficiency) Can be Xylanase supplements are used in rye feed for chicken chicks. It can be used to enhance the nutritional value of rye to facilitate its use. Effect of this treatment May depend on rye diversity. The present invention provides for these purposes, Use of xylanase in feed and grains of chicken chicks is provided. In the pulp industry, dissolving pulp is viscose Yarn, cellulose ester and cellulose ether It is made of cellulose. They are pre-hydrolyzed kraft pulp or acid sulphur. Derived from acid salt pulp. The treatment of cellulose in one stage Characterized by conducting derivatization, the derivative is soluble in common solvents and It allows the formation of fibers, films and plastics. In cellulose Impurities impede induction, clog the sprayers' mouth, and It becomes an insoluble substance that gives defects to the product. In addition, certain xylan impurities are Giving the product a color, haze thermal instability. Therefore, xylanase is It has the role of removing pure substances and uses the xylanase described here for this purpose. Uses are considered within the scope of the present invention. Pretreatment of kraft pulp by bleaching with cellulase-free xylase Is one of the biotechs most likely to be accepted by the pulp and paper industry in the near future. It's been seen as one, but For this a suitable xylanase must be available. Strong wood fiber Is produced, and the chemical substances are collected and recycled, so that However, the craft (also known as alkali or sulfate) process is excellent. It has become a vigorous pulp processing technology. Kraft pulp, especially softwood derived White is relatively difficult. Pulp to desired brightness, ~ 9 Traditionally, for effective bleaching to 0%, elemental chlorine and chlorine-containing It requires a series of steps using compound. The bleaching process especially uses chlorine as an element. When used, it produces chlorinated organic compounds which, along with the effluent, have ever been bleached. It came out of the land. However, at present, public demand and legislated rules Both will reduce or eliminate emissions of these pollutants from pulp mills. I'm putting pressure on it. The pulp and paper industry reduces the environmental impact of its mills For this purpose, various alternative techniques are considered. Those branches are craft bags. Xylanase prebleaching of lupus (xylanase prebleaching) The xylase according to the invention, which comprises, is particularly well suited for this purpose. It is believed that the xylanase of the present invention has particular applicability to the paper and pulp industry. . Although it is recognized that the use of enzymes does not completely replace chemicals, Environmental concerns are putting pressure to reduce the use of chemicals. Also There are also practical reasons to reduce the use of chemicals in the paper and pulp industry. Pulp processing plants typically do their own chlorine and diacid in situ. It supplies chlorine dioxide, which is not only potentially dangerous, but also the capacity (ca capacity) can also be restricted. Paper pulp to remove lignin (eg Softwood pulp) chlorine, NaOH, H₂O₂And chlorine dioxide is involved. Candy Sandoz, Inc. of the United States of America contains two xylanases, 30-55 ° C. In-house product CARTAZ, which is a fungal xylanase (crude) active at pH 3 to 5 Practical trials with YME and 2 with IU xylanase / gm pulp It was found that chlorine reduction of 5-33% is possible. Also, only chemical substances are used. The product is lighter in color than it is used. Another advantage of xylanase is , Chemicals attack cellulose with low lignin content to reduce fiber strength Xylanase has specificity, whereas it can give or impart other undesirable physical properties. Is that there is. Therefore, xylanase becomes more important in pulp bleaching. It is clear that the recombinant xylanase has high specificity and high yield. Therefore, it is clear that it will be particularly important. Lignin is bound to hemicellulose It is believed that, and if hemicellulose (xylan) depolymerizes And lignin are partially dissociated from the cellulose and then washed away. The present However, some chemical treatment is still needed. The present invention xylaner For commercial use, the main points are: (i) its very high specificity and high Level expression makes large-scale production economical and (ii) its lack of cellulosic activity makes paper manufacturing And when applied to the textile industry, when it is necessary to specifically remove xylan. Especially useful. The xylanase of the present invention is used by the sugar industry for the production of sugarcane bagasse. of value in regard to the treatment of e) or the efficient treatment of other products containing xylan. Can find some uses. The protein sequence of XYLA and the gene sequence of xynA are described in May 5, 1992, EM. It became available in the BL database with access number X65526. I mentioned earlier. This availability applies to all jurisdictions in the countries specified in this invention. In, it does not constitute an effective prior art. To EMBL database The present invention is presented above for jurisdictions whose entries do not constitute valid prior art Notified here that it is and will be defined more broadly than To do. It is noted that the present invention may exist in the following additional aspects: At least one catalytic region substantially homologous to the anaerobic xylanase A xylanase having a full-length xylanase of an anaerobic fungus An anaerobic fungal xylanase, and a catalytic region substantially homologous to the anaerobic fungal xylanase. An isolated or recombinant DNA molecule encoding a xylanase having And if the DNA moleculeNeocallimastix frontalis If it is a cDNA encoding xylanase, its DNA is functionally a promoter Presumed to be ligated; the DNA molecule is the natural xylanase-encoding It may consist of a full length copy of the mRNA. The present invention is described herein as well as the recombinant xylanase described above. Other anaerobic fungi such as xylanase, which can be prepared by Included within the scope of will be apparent from the foregoing. The present invention alsoN. patriciarumAny mutant strain of origin, or , By selection or gene transferN. patri ciarum Included within its scope are any more derived strains. The invention also includes within its scope the following: (i) pNX1, pNX4, pNX5, pNX6, pNX8, pNX9 and pN DNA sequences derived from X10 and DNA sequences capable of hybridizing with them Row; (ii) contains a DNA sequence as in (i) and is xylana in a suitable host. Expression or overexpression of a polypeptide having enzyme activity (over-expres construct which is operably linked to a regulatory region capable of directing ; (iii) expression of a fungal xylanase containing an expression construct as in (ii). Or a transformed microbial host capable of overexpression; (iv) xyla produced by expression with a microbial host as in iii) A polypeptide having nase activity; (v) The amino acid sequence shown in FIG. 4 containing components A, B, C and D An amino acid sequence derived from Lanase; and (vi) The plasmid shown in FIG. The present invention also has a recombinant plasmid shown in FIG.E. FIG. coliKi from Included within its scope are methods for preparing silanase. The above-mentioned features preferable for one aspect of the present invention are the same for other aspects. Mutatis mutandis as preferred. Therefore, the present invention will be illustrated by the following examples. The examples refer to the following accompanying drawings: FIG. 1 is a restriction map of a recombinant plasmid containing xynA. EcoRI (R), SstI (S), ScaI (Sc), Hpal (Hp), KpnI (K ), XhoI (X), SmaI (Sm), PvuII (Pv), NaeI (Na ), NruI (Nr), StuI (St) and Hind III (H) The rank is shown. Multiple cloning regions or vector restriction sites in parentheses Has been destroyed.^*The multiple cloning regions of the vector indicated by It is derived from pSK (S), pMTL20 (20) and pMTL22 (2). Arrow A solid line with a mark indicates the direction and range of the xynA reading frame. Deletion mutation of xynA The construction of the strain is detailed below. Have a recombinant plasmidE. FIG. coliStock representation The type is also shown. Figures 2A and B show the purification of XYLA. pNX1 (A) or pNX5 (B ) HasE. FIG. coliPurified from cell-free extract of XL1-Blue SDS / PAGE of XYLA. Lane 1 is anion exchange chromatograph The second lane contains XYLA purified by Have X5E. FIG. coliLane 3 (containing the bacterial cell-free extract from B only) contains pBluescript SKE. FIG. coliMycelia from It contained the extract without. A Gels shown in B and B are 10% (w / v) or 15% (w / v), respectively. It contained lyacrylamide. The protein size is Sigma high (Fig. 2). K) deduced from the marker protein, which is A) or low (FIG. 2B) molecular weight marker Shown in D. FIG. 3 shows the solubility of purified XYLA in pC buffer at pH 6.5 and 37 ° C. Xylan (0.5%) to specific viscosity (specific viscosity) Showed the effect of. The specific viscosity (■) and reducing sugar (●) were measured as follows. FIG. 4 shows the primary structure of XYLA. Two homologous catalytic regions designated A and B The region indicates the double C-terminal sequence (C and D) in a box. Figure 5 showsN. patriciarum XYLA and prokaryotic xylaners 3 shows the sequence comparison of the homologous region of ze. The compared enzymes are Is as follows: B. pumilusXylanab A (XYLAB; (Fukusaki et al., FE BS Lett.171: 197-201 (1984)),B. Circulans xylanase ( XYLBC; Yang et al., Nucl. Acids Res. 16: 7178 (1988)) andC. acet obutilicum Xylanase B (XYLBCA; Zappe et al., Nucl. Acids Res. 18 2179 (1990)). Identical or not in all compared primary structures Residues showing similarity are shown in boxes. The first and the first in each first sequence of homologous regions The position of the last residue is also shown. FIG. 6 shows the structure of plasmid pNX1. Figure 7 showsNeocallimastix patricia rum 2 shows cloning and characterization of a cDNA encoding xylanase A .Example 1 Preparation of pNX1 1.1Microbial strains, vectors and media Anaerobic fungus Neocalimastics patricialum (Neocallimati x patriciarum ). G. And Mun n, E. A. , Trans.Br.Mycol, Soc.86: 178-181 (1986) Isolated from The host strain for cDNA cloning isE. FIG. coli PLK- F'and XLI-Blue.E. FIG. coli JM83 strain is xylanase⁺ It was used to characterize the cDNA clone. Vector is λZAPII, pBLUESCRIPT^{SK (-)}(Strage ne), pMTL20, pMTL22 and pMTL23 (Chambers et al. ,Gene 68: 139-149 (1988)). N. Patricialum (N. patriciaru m Cultures described in Kemp et al., J. Gen. Microbiol, 130: 27-37 (1984). As described above, was maintained in a medium containing 10% rumen solution.E. FIG. coliStocks L-Brose (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual , 2nd edition Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1989)). Recombinant phage is directed by Stratagene. Using NZY mediumE. FIG. coliIt was grown in the strain. 1.2-General recombinant DNA technology Agarose gel electrophoresis,E. FIG. coliOf E.coli and restriction enzymes and T4DN Modification of DNA with A ligase is described by Gilbert et al., J. Gen. Microbiol. 134 32. As described by 39-3247 (1988) Is. A large amount of plasmid DNA is generated by Brij lysis and By subsequent CsCl density gradient centrifugationE. FIG. coliExtracted from (Clew el. D. B. And Helinski, D .; R. ,Proc.Natl.Acad.Sci.USA62: 1 159-1166 (1969)). Rapid restriction analysis and nucleoti For plasmid isolation for sequence determination, Holmes, D. et al. S. And Qui gray,M.Anal.Biochem.114: 193-197 (1981) rapid boiling method (rapid b) oiling method) and Birnboim, H .; L. And Doly,J.Nucl.Acids Rcs. 7: 1513-1523 (1979) alkaline lysis method ysis method) was adopted. Northern hybridization is G ilbert et al.J. Bacteriol.161: 314-320 (1985). N. Patricialum (N. patriciarum) Is 1% AVICEL, 3 Rumen-containing medium (Kemp et al., J. Gen. Microb) under anaerobic conditions for 48 hours in the presence of 9 ° C. iol.130: 27-37 (1984)) (Philips, MW, and Go). rdon, G .; L. R. ,Appl.Environ.Microbiol.55: 1695-1702 (1989) and L owe et al.J.Gen.Microbiol.131: 2225-2229 (1985). Can be used). 1.4Total RNA isolation The frozen mycelium was crushed into a fine powder under liquid nitrogen with a mortar and pestle. Frozen mycelium powder with 5-10 volumes of guanidinium thiocyanate solution (4M thiocyanate Guanidinium acid salt, 0.5% sodium lauryl sarcosine, 25 mM citrate Sodium acidate, pH 7.0, 1 mM EDTA and 0.1 Mβ mercaptoethano ) And homogenize the mixture in a mortar and pestle for 5 minutes. Homogenize for another 2 minutes at full speed using a Polytron homogenizer. Genized. Total RNA was extracted from the homogenized mixture using a CsCl cushion. Isolated by ultracentrifugation through (Sambrook et al.,Molecular Cloning.A Labo ratory Manual Second Edition, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor La boratoryPress (1989)). (Puissant, C., and Houdebine L. M. ,Bio-Techniqucs Adopting the method described by 148-149 (1990) , Alternative total fungal RNA preparation methods can be used. ) 1.5Purification of poly A ⁺ mRNA Poly A⁺mRNA is oligo (dT) cellulose chromatography (Sambr books and othersMolecular Cloning.A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbo r, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)). The cDNA library is a λZAP cDNA synthesis kit from Stratagene. Basically, it was constructed according to the manufacturer's instructions. The procedure is briefly described below: Poly A⁺mRNA is XhoI Reverse transcriptase (using a linker-oligo (dT) primer and 5-methyl dCTP ( It was converted to first strand cDNA by reverse transcriptase). The double-stranded cDNA is derived from the first-strand cDNA by RNase H and DNA polymer. It was synthesized by the action of Lase I. After blunting the ends of the cDNA, EcoRI Ligation with Dapter, phosphorylation, digestion with Xho I and EcoR to the 5'region A cDNA having an I site and an Xho I site in the 3'region was prepared. cDNA is 1 % Size fractionation by low melting point agarose gel electrophoresis and phenol extraction A 1.2-8 Kb size cDNA was recovered (Sambrook et al.Molecular Cloning.A Laboratory Manual Second Edition, Cold Spring Harbor, New York: ColdSpring Harbor Laboratory Press (1989)). The size-fractionated cDNA is then transferred to EcoR I / XhoI digested λZAPII vector (other expression vectors can be used) Gated. Package cDNA library in vitro and plate cells AsE. FIG. coli It was amplified using PLK-F '. 1.7 Xylanase-positive recombinant bacteriophage clone screenin G Recombinant phage was 0.1% xylan and 10 mM isopropyl-β-D-thio. Gene expression controlled by galactopyranoside (IPTG, LacZ promoter) In 0.7% top agar containingE. FIG. coli During XL1-Blue Grown in. 0.5% on top agar after overnight incubation at 37 ° C Congo red solution was added. 15 minutes at RT After beating, unbound dye was washed off with 1M NaCl. Xylana against a red background The protease-producing phage plaques were surrounded by yellow haloes. Recombinant xylanase-positive phages were cloned as described above 2-3 times. Purified and homogenized by plating again and screening. Ki The cDNA insert of silanase-positive phage is VCS-m13 helper Using the pBluescript SK^-Inserted in. 1.8Xylanase and related enzyme assays Contains a xylanase-positive recombinant plasmidE. FIG. coliEnzyme taken from Extract the Kellett et al.Biochem.J.272: 369-376 (1990). Was prepared. 50 mM potassium phosphate / 1 at 37 ° C for xylan or other substrates Enzyme assay for hydrolysis in 2 mM citrate buffer, pH 6.5. A. Xylan or other plant polysaccharide (carboxymethyl cellulose) , Barley β-glucan, laminarin, littinan) ett,Biochem.J.272: 369-376 (1990) and Hazlewood et al.,J.Gen.Mic robiol. 136: 2089-2097 (1990). Artificial substrate Umbelliferyl-β-D-cellobioside methyl umbelliferyl-β-D-glu Coside, methylumbelliferyl-β-D-xyloside and p-nitrophenyl -Β-D-xyloside) assay for activity against Hazlewoo d et al.J.Gen.Microbiol.136: 2089-2097 (1990). 1.9DNA sequencing The plasmid DNA denatured by alkali is neutralized, and the DNA is (Murphy, G., and Kavanagh, T.,Nucl. Acid Re s. 16: 5198 (1988)). Sequencing of the resulting DNA was performed using Sequenase D NA (Sequenase DNA) Sequencing Kit (USA, Clevelela) nd, OH) based on the protocol recommended by the manufacturer. Appropriate control By cloning the restricted fragment into a pMTL-based vector , Generated overlapping sequences. Sequences were collected and described in Staden, R .; ,Nucl.Aci ds Res. 16: 3673-3694 (1980) using the computer program It was The complete sequence of the cDNA contained in the plasmid pNX1 is present on both strands I decided about it. The gene encoding xylanase contained in the plasmid is The gene product, the xylanase enzyme itself, was designated as XYLA.Example 2-Construction of a deletion mutant of pNX1 (xvnA), pNX4 pNX1 was linearized with XhoI and digested with Bal-31 to yield xynAcD. The 3'region of NA was removed (Hall, J., and Gilbert, HJ,MolGen.Genet. 213: 112-117 (1988)). After blunting the ends, the shortened cDNA Uncovered from pNX1 by EcoRI digestion and digested with EcoRI / SmaI It was cloned into the pMTL22 vector.Example 3-Construction of pNX5, a deletion mutant of pNX1 (xynA) The 720 bp ScaI / NruI fragment was excised from pNX4 to give pM It was placed in a TL20 vector and cloned. As a result, it's about pNX1 Highly expressed clones with high enzyme expression levels of more than several hundred were obtained.Example 4-Construction of deletion mutant pNX6 of pNX1 (xynA) pNX6 is a fragment fragment obtained by cutting pNX1 with EcoRI / ScaI. Was cloned into EcoRI / SmaI digested pMTL22.Example 5-Construction of deletion mutant pNX8 of pNX1 (xynA) pNX1 was digested with ScaI and XhoI to give a 1.3 kb fragment, It was cloned into pMTL20 and the xynA sequence was included in the vector. Tuned to the LacZ ATG. As a result, the expression level of pNX1 Highly expressing clones were obtained which were approximately 15 times that.Example 6-Construction of deletion mutant pNX9 of pNX1 (xynA) pNX8 was cleaved with KpnI (one site of vector polylinker) and its insert After elution of the fragment by electrophoresis, RsaI (cut in the PT linker region of the gene ) Digest to generate a 700 bp fragment and cut with KpnI and StuI Cloned into pMTL20, which has been described. As a result the vector LacZ N -Highly expressing clones with a second catalytic region together with the end (a clone containing pNX8 Much better than a loan).Example 7-Construction of deletion mutant pNX10 of pNX1 (xynA) pNX8 was digested with KpnI and the fragment (-850b p) was ligated to KpnI cut pMTL20. Good expression of this clone However, the expressed protein showed some residue (residues) at the carboxy terminus. ), And its removal resulted in the high levels observed in pNX9. Can beExample 8-Purification and amino acid sequence of the N-terminus of xylanase A Decision have pNX1 or pNX5E. FIG. coli XL1-Blue is Ampic Incubated for 16 hours in LB broth containing phosphorus (100 μg / ml). Centrifugation The cells collected by the separation were re-dissolved in 50 mM Tris / HCl buffer (pH 8.0). Suspension and as described previously (Clarke et al.,FEMS Microbiol.Lett.83: 305-310 (1991)) A cytoplasmic fraction was prepared. To add ammonium sulfate (0.39 g / ml) The more precipitated xylanase was added again to 10 mM Tris / HCl buffer, pH 8.0. Dissolved in. The same buffer was exchanged 3 times and dialyzed. Poole et al.Mol.Gen. Genet .223: 217-223 (1990), essentially as described in DEAE-TrisAct. Substantially reduced xylanase by anion exchange chromatography on Ril M Purified. have pNX1E. FIG. coli Extraction of XL1-Blue without containing cells The xylanase (referred to as XYLA) purified from the product was separated by SDS / PAGE. Imaged, Problot membrane (Applied Biosystem) ms Inc. ) Electroblotted on top. N-terminal sequence is 120A online 470 gas phase system equipped with inphenylthiohydantoin analyzer -Kenator (Applied Biosystems Inc. Hunkapi) llar et al.Methods Enzymol.91: 399-413 (1983)) using automated Edman sequences Determined by decision.Example 9 Outline of xynA isolation 10⁶A cDNA library consisting of clones is the only source of carbon N. C. grown on Avicel. Patricialum (N. patricial um ) Was used for the construction. Hydrolyzed 31 5 x 10 recombinant bacteriophages from the library^FourClone screeni After identification, 16 xylanase-positive phages were identified and further characterized. Isolated to determine characteristics. For restriction mapping and hybridization data Shows that all xylanase-positive recombinants are cDNA sequences derived from the same mRNA species. It was shown to contain. It is called xynA, which encodes a functional xylanase. The restriction map of the largest cDNA sequence is shown in FIG. 1.7 Kb of xynA A nucleic acid probe consisting of the 5'region is composed of one 2.5 Kb neocalima strix (N eocalimastrix ) Hybridized with RNA species. This is , That the longest isolated xynA cDNA is almost its full length Show.Example 10 Characterization of Xylanase A Neocalimastics (Neocallimastix) Xylase code CDNAs to be excised from λZAPII, and set of pBLUESCRIPT SK As a substituteE. FIG. coli Placed in XL1-Blue. The largest type of xy nA-containing The xylanase activity expressed by the recombinant strain having the rasmid pNX1 is It was found predominantly in body-free extracts. This means that the enzymeE. FIG. co li It was shown that it was not efficiently secreted by. Xylanase A (XY The xylanase designated LA) was purified to near homogenization (> 90% pure). Spirit The prepared XYLA has a specific activity of 5980 U / mg protein, and the value of cell-free extract is 1 Controlled with 6 U / mg protein. This means that XYLA has pNX1E. FIG. coli It is shown to consist of 0.3% of soluble protein synthesized in cells. Refined The enzyme has an Mr of 53000 (Fig. 2) and an N-terminal sequence IATVAKAQWG. Had GGGAS. XYLA hydrolyzed xylan, but carboxymethy Cellulose, barley β-glucan, laminarin, lithinan or artificial substrate 4- Methyl-umbelliferyl-β-D-xyloside and p-nitrophenyl-β- It showed no activity against D-xylopyranoside (Table 1). ¹⁾One unit of XYLA releases 1 μmole of product every minute. The enzyme accelerates the rapid decrease in viscosity (Fig. 3), reducing 893 mg / g substrate. Release of sugar to endo-β-1,4-xylanase (EC 3.1.2.8) Soluble xylan was challenged in a typical manner. Hydrolysis products by HPLC Analysis showed that XYLA released approximately equal amounts of xylobiose and xylose. Revealed Major of oat spelt xylan Disaccharides containing the side chain arabicose were not detected in the reaction products, Adds a glycosidic bond that contains a xylose unit to the side-chain sugar bound by the enzyme. It showed that it did not decompose into water.Example 11-Nucleotide sequence 2.3 kb neocalimastics derived from pNX1 (Neocallimast ix ) The cDNA was co-sequenced on both strands (EMBL / Genbank / DDBJ Nucleotide Sequence Data Library (Nucleotide Sequence) Access numbers X65526) in Data Libraries). So 1821 bp open reading frame (ORF) by translation of the nucleotide It was found to encode the polypeptide of 66192. Is coded The suggested primary structure of the protein is shown in FIG.E. FIG. coliPurified from The N-terminal 15 residues of the resulting recombinant XYLA are from amino acid 12 of the translated sequence. It was a perfect match with 26. The translation initiation codon was estimated based on the following observations: (i) O No ATG sequence upstream of RF; (ii) translation stop codon for all three reads In frame, upstream of the putative translation initiation codon. Estimated ATG start A survey of the nucleotide sequence near DonE. FIG. coliTranslation started at No other sequences were found that could act as codons. Therefore, the translation of xynA Initiation appears to occur in enterobacteria and anaerobes in the same codon. this child Corresponds to a relatively lower eukaryotic mRNAE. FIG. coliMatches to array That is despite the fact that it does not contain a bosome binding sequence. perhaps , ATG start The sequence AGA 7 bp upstream of Don is a weak ribosome binding sequence in bacteria. Will act as. xynA cDNA for 2.3 kb EcoRI-Xh Subcloning in pMTL22 with the oI restriction fragment resulted in a functional clone. Probably because it gives rise to a recombinant plasmid (pNX2) that does not direct silanase,E. FIG. coli The transcription start of xynA in Let's do it. The vector lacZp is at the 3'site of xynA in pNX2. XYL A isE. FIG. coliN-terminal part of xylanase deduced not secreted by Corresponds to that of the signal peptide and is followed by a region of the N-terminal hydrophilic base followed by Most of the 23 consist of a sequence of hydrophobic or neutral amino acids. The G + C content of the xynA ORF was 43.4% with 5'and 3'non-coding regions (3 'Compared to 10.7% of'poly A tail excluded). Neocalimastics (Neocallimastix ) Total G + C content of DNA is approximately 15% (Bil lon-Grand et al.,FEMS Microbiol.Lett.82: 267-270 (1991)) in its genome It is shown that the non-protein coding region of is generally very rich in A + T. in xynA The bias in codon usage is apparent from the lack of 14 of the 61 amino acid codons Is. Significant use of T in the third position (up to 50% of all codons ends with T) The exclusion of G is significant at the fluctuation position. Only Met and Trp respectively Excluding ATG and TGG, which are codons for AAG, GAG and TTG, Only has G in the third position. Examination of the inferred primary structure of mature XYLA reveals several findings. The tasteful characteristics were revealed. Between residues 255-265 and between 491-519 proline and hydroxy It is a region rich in amino acids. Many cellulases and xylanases contain proline / hi Multiple protein regions linked by a sequence rich in droxyamino acids (domains) ) (Gilkes et al.,Microbiol.Rev.55: 303-315 (1991)). During XYLA Two such "linking sequences" of the enzyme are that the enzyme has at least three distinct It is suggested that it is composed of different protein domains. Neo Calimaste Ix (Neocallimastix) Xylase has a junction region In addition to the N-terminal 225 amino acid repeats and the C-terminal 40 residues It contains a repetitive region (Fig. 4). Explicit sequence conservation between large and small repeat regions (seq There is no "uence conversation". The two N-terminal repeats Showed 91.6% identity and 95.6% similarity. The 40 amino acid repeat region It exhibited 82.9% identity and 95.1% similarity. The two repeating regions The encoding DNA also showed sequence identity. 699bp and 120bp opposite The subsequences showed 92.7% and 90.8% identity, respectively.Example 12-Study of homology In the hydrophobic cluster analysis, cellulases and xylanases were grouped into nine enzyme groups. It was shown that it can be divided. The proteins within a group are structurally related, maybe It evolved from a gene that is a common ancestor (Henrissat et al.Ge ne 81: 83-95 (1989)). Comparing XYLA with sequences in the SWISS-PROT database, the fungi Enzyme and Bacillus pumilis (Bacillus umilis) Xylaner Ze A (Fukusaki et al.,FEBS Lett.171: 197-201 (1984)), Bacillus silk Lance(Bacillus circulans) Xylanase (Yang et al.,Nucl.Acids Rcs. 16: 7178 (1988)), Clostridium acetobutyricum (Clo strideum acetobutylicum Xylase B (Zappe et al. ,Nucl.Acids Rcs.18: 2179 (1990)) and multi-domain rule. Minococcus flavefaciens (Ruminococcus flavefa ciens ) N-terminal region of xylanase (Zhang & Flint,Mol. Microbiol. 6: 1013-1019 (1992), it was found that there is a homology. these Enzymes and N. Patricialum (N. patriciarum) Between XYLA The degree of homology is shown in FIG. Only the large repeats of XYLA showed homology with other hemicellulases, C- Note that the terminal repeat region did not show identity with the proteins in the database Interesting. This means that XYLA has a catalytic region at the N-terminal region. TIC domain).Example 13-XYLA Structure and Function The N-terminal repeat is a catalytic domain of XYLA. In order to examine the allegation that it constitutes, the 5'and 3'regions of xynA are deleted and Of the resulting xynA derivative by subcloning into a vector or Functional xylaner The expression capacity was evaluated. 29 of the 3'region encoding a 40 amino acid C-terminal repeat The truncated form of xynA with 1 bp deleted still encodes a functional xylanase. I was The predicted Mr of the encoded enzyme was 53000. this is have pNX1E. FIG. coliIt is similar to the size of XYLA purified from. Recombinant xyla thus synthesized from the full-length gene by enterobacteria Nase may also lack a C-terminal repeat. There is some support for this view. The multidomain cellulase and xylanase of Escherichia coli are rich in serine. Substantially truncated within the ligation sequenceE. FIG. coliPseudomona expressed by Su (Pseudomonas) Xylanase (Hall et al.,Mol. Microbiol.3:12 11-1219 (1989)) and is particularly sensitive to proteolytic cleavage within the connecting sequence ( Tomme et al.Eur.J.Biochcm.170: 575-581 (1988); Gilkes et al., J. Biol. Ch. given by the fact em.263: 10401-10407 (1988). Over 1011bp A more substantial 3'deletion (pNX6) synthesizes a functional xylanase xy It did not affect nA performance. However, 13 from the 3'region of xynA Removal of 24 bp resulted in the synthesis of inactive XYLA derivatives. this The data from N. et al. Patricialum (N. patriciarum) Xylaner Suggests that the N-terminal 270 residues of zease fold into a catalytically active enzyme To do. Determine if both N-terminal repeats fold into a functional xylanase 720 bp ScaI Nru I-restricted to The fragment (NruI cuts the multiple cloning region of pNX4) into pMT Cloned in L20 and truncated xynA is the vector IacZ 'translation initiation codon (Fig. 1), which is tuned with pNX5. have pNX5E. FIG. coliIs Express 15 times more XYLA than clones with full length xynA It was This enhanced expression of fungal enzymes was found in the pNX5-encoded xynA.E. FIG. co li Presumed to be the result of using the translation initiation sequence. Contains pNX5E. FIG. coli , XYLA purified from cell-free extract had an Mr of 26000 (No. (Fig. 2B). These data show that repeated N-terminal 225 residues constitute a well-defined catalytic region. Confirm that you do. Interestingly, a few residues from the C-terminus of the second catalytic domain Further deletion of xylanase activity by deleting the amino residue to generate pNX9. An increase was obtained. To examine the substrate specificity of the N- and C-terminal catalytic regions, pNX6 and pNX5 were selected. Thus, the ability of the encoded xylanase to cleave plant structural polysaccharides was evaluated. Them The enzyme cleaves only xylan and removes xylobiose and xylose in full length X It released at a similar rate of YLA. Thus, both catalytic regions have the full length X It showed the same substrate specificity as YLA. Many cellulases and xylanases consist of many protein domains, but cardosera Musacaroriti cam (Caldocellum saccharolytic um ) Derived celB (Saul et al.,Appl.Environ.Microbiol.56: 3117-3124 (19 90)) is by far the only example of an enzyme containing two distinct catalytic regions. This fermentation The element is N-terminal exoglucanases and C-terminal endoglucanas belonging to different enzyme groups It consists of Thus, the gene encoding celB is probably two distinct It may be caused by the fusion of the cellulase gene. The present invention is a fungal xylaner. Zes also provide evidence that it can be composed of multiple catalytic regions. celB inheritance In contrast to offspring, xynA apparently had a tandem duplication of its ancestral genes The result. What Selection Advantages Do Gene Duplications Confer to Anaerobic Fungi? Is not clear. It is simply a mechanism for increasing expression of the catalytic domain of XYLA. Is it kanism? This is the first description of an anaerobic fungal xylanase. Therefore, multiple catalytic domains are common features of lower eukaryotic hemicellulases. It is not clear whether or not. Sequence list (1) General information (i) Applicant (A) Name: Harry John Gilbert (Harry John GILBERT) (B) Address: 16 Kells Gardens, Low Fell (C) City: Gates head (D) State: Tyne and Wear (E) Country: United Kingdom (F) Postal code (21P): NE9 5XS (A) Name: Jeffrey Peter Hazelwood (Geoffrey Peter HAZL EWOOD) (B) Address: 109A Duchess Drive (C) City: Newmarket (D) State: Suffolk (E) Country: United Kingdom (F) Postal code (21P): CB8 8AL (ii) Title of invention: Recombinant xylanase (iii) Number of sequences: 18 (iv) Computer-readable form 3.5 "Ms-Dos floppy disk containing ASCII files (9 3_01283. ASC) (v) Current application data Application Number: WO PCT / GB93 / 01283 (2) SEQ ID NO: 1 information: (i) Sequence features (A) Length: 2338 base pairs (B) Type: Nucleic acid (C) Chain state: double chain (D) Topology: linear (ii) Molecular type: cDNA (iii) Hypothesis: non (iii) Anti-sense: non (vi) Origin (A) Biological:Neocallimastix patric iarum (B) Strain: (Type species) (ix) Features: (A) Name / Key: CDS (B) Position: 195. ． 2018 (D) Other information: / Function = "xylan decomposition Enzyme ”/ substance =“ XYLA ” / Standard name = "xylanase" (ix) Features: (A) Name / key: sig-peptide (B) Position: 195. ． 281 (ix) Features: (A) Name / key: mat peptide (B) Position: 282. ． 2018 (ix) Features: (A) Name / key: misc feature (B) Position: 282. ． 959 (D) Other information: / Label = CAT1 / Note = "First catalyst area" (ix) Features: (A) Name / Key: misc_feature (B) Position: 1017. ． 1691 (D) Other information: / Label = CAT2 / Note = "Second catalyst area" (ix) Features: (A) Name / Key: misc_feature (B) Position 1764. ． 1883 (D) Other information: / Label = CTR1 / Note = "1st C-terminal repeat" (ix) Features: (A) Name / Key: misc_feature (B) Position: 1884. ． 2015 (D) Other information: / Label = CTR2 / Note = "Second C-terminal repeat" (ix) Features: (A) Name / Key: misc_feature (B) Position: 1. ． 2338 (D) Other information: / Label = pNX1_insert (ix) Features: (A) Name / Key: misc_feature (B) Position: 1. ． 2338 (D) Other information: / Label = pNX2_insert / Note = "What is pNX2 insert is pNX1 insert The direction is opposite. (ix) Features: (A) Name / Key: misc_feature (B) Position: 1. ． 1847 (D) Other information: / Label = pNX3_insert (ix) Features: (A) Name / Key: misc_feature (B) Position: 1. ． 1725 (D) Other information: / Label = pNX4_insert (ix) Features: (A) Name / Key: misc_feature (B) Position: 1002. ． 1725 (D) Other information: / Label = pNX5_insert (ix) Features: (A) Name / Key: misc_feature (B) Position: 1. ． 1001 (D) Other information: / Label = pNX6_insert (ix) Features: (A) Name / Key: misc_feature (B) Position: 1. ． 690 (D) Other information: / Label = pNX7_insert (ix) Features: (A) Name / Key: misc_feature (B) Position: 1002. ． 2338 (D) Other information: / Label = pNX8_insert (ix) Features: (A) Name / Key: misc_feature (B) Position: 1002. ． 1847 (D) Other information: / Label = pNX9_insert (ix) Features: (A) Name / Key: misc_feature (B) Position: 1002. ． 1709 (D) Other information: / Label = pNX10_insert (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 1: (2) Information on SEQ ID NO: 2 (i) Sequence features: (A) Length: 607 amino acids (B) Type: Amino acid (D) Topology: linear (ii) Molecular type: protein (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 2: (2) Information on SEQ ID NO: 3 (i) Sequence features: (A) Length: 1847 base pairs (B) Type: Nucleic acid (C) Chain state: double chain (D) Topology: linear (ii) Molecular type: cDNA (ix) Features: (A) Name / Key: CDS (B) Position: 195. ． 1847 (ix) Features: (A) Name / Key: sig_peptide (B) Position: 195. ． 281 (ix) Features: (A) Name / Key: misc_feature (B) Position: 1. ． 1847 (D) Other information: / Label = pNX3_insert (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 3: (2) Information on SEQ ID NO: 4 (i) Sequence features: (A) Length: 551 amino acids (B) Type: Amino acid (D) Topology: linear (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 4: (2) Information on SEQ ID NO: 5 (i) Sequence features: (A) Length: 1725 base pairs (B) Type: Nucleic acid (C) Chain state: double chain (D) Topology: linear (ii) Molecular type: cDNA (ix) Features: (A) Name / Key: CDS (B) Position: 195. ． 1724 (ix) Features: (A) Name / Key: sig_peptide (B) Position: 195. ． 281 (ix) Features: (A) Name / Key: misc_feature (B) Position: 1. ． 1725 (D) Other information: / Label = pNX4_insert (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 5: (2) Information on SEQ ID NO: 6: (i) Sequence features: (A) Length: 510 amino acids (B) Type: Amino acid (D) Topology: linear (ii) Molecular type: protein (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 6: (2) Information on SEQ ID NO: 7: (i) Sequence features: (A) Length: 724 base pairs (B) Type: Nucleic acid (C) Chain state: Double chain (D) Topology: Linear (ii) Molecular type: cDNA (ix) Features: (A) Name / Key: CDS (B) Position: 1. ． 723 (ix) Features: (A) Name / Key: misc_feature (B) Position: 1. ． 724 (D) Other information: / Label = pNX5_insert (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 7: (2) Information on SEQ ID NO: 8: (i) Sequence features: (A) Length: 241 amino acids (B) Type: Amino acid (D) Topology: linear (ii) Molecular type: protein (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 8: (2) Information on SEQ ID NO: 9: (i) Sequence features: (A) Length: 1001 base pairs (B) Type: Nucleic acid (C) Chain state: double chain (D) Topology: linear (ii) Molecular type: cDNA (ix) Features: (A) Name / Key: CDS (B) Position: 195. ． 1001 (ix) Features: (A) Name / Key: sig_peptide (B) Position: 195. ． 281 (ix) Features: (A) Name / Key: misc_feature (B) Position: 1. ． 1001 (D) Other information: / Label = pNX6_insert (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 9: (2) Information on SEQ ID NO: 10: (i) Sequence features: (A) Length: 269 amino acids (B) Type: Amino acid (D) Topology: linear (ii) Molecular type: protein (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 10: (2) Information on SEQ ID NO: 11: (i) Sequence features: (A) Length: 690 base pairs (B) Type: Nucleic acid (C) Chain state: double chain (D) Topology: linear (ii) Molecular type: cDNA (ix) Features: (A) Name / Key: CDS (B) Position: 195. ． 689 (ix) Features: (A) Name / Key: sig_peptide (B) Position: 195. ． 281 (ix) Features: (A) Name / Key: misc_feature (B) Position: 1. ． 690 (D) Other information: / Label = pNX7_insert (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 11: (2) Information on SEQ ID NO: 12 (i) Sequence features: (A) Length: 165 amino acids (B) Type: Amino acid (D) Topology: linear (ii) Molecular type: protein (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 12: (2) Information on SEQ ID NO: 13: (i) Sequence features: (A) Length: 1337 base pairs (B) Type: Nucleic acid (C) Chain state: double chain (D) Topology: linear (ii) Molecular type: cDNA (ix) Features: (A) Name / Key: CDS (B) Position: 1. ． 1014 (ix) Features: (A) Name / Key: misc_feature (B) Position: 1. ． 1337 (D) Other information: / Label = pNX8_insert (xi) Description of array: SEQ ID NO: 13: (2) Information on SEQ ID NO: 14: (i) Sequence features: (A) Length: 338 amino acids (B) Type: Amino acid (D) Topology: linear (ii) Molecular type: protein (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 14: (2) Information on SEQ ID NO: 15: (i) Sequence features (A) Length: 846 base pairs (B) Type: Nucleic acid (C) Chain state: double chain (D) Topology: linear (ii) Molecular type: cDNA (ix) Features: (A) Name / Key: CDS (B) Position: 1. ． 846 (ix) Features: (A) Name / Key: misc_feature (B) Position: 1. ． 846 (D) Other information: / Label = pNX9_insert (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 15: (2) Information on SEQ ID NO: 16: (i) Sequence features: (A) Length: 282 amino acids (B) Type: Amino acid (D) Topology: linear (ii) Molecular type: protein (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 16: (2) Information on SEQ ID NO: 17: (i) Sequence features: (A) Length: 708 base pairs (B) Type: Nucleic acid (C) Chain state: double chain (D) Topology: linear (ii) Molecular type: cDNA (ix) Features: (A) Name / Key: CDS (B) Position: 1. ． 708 (ix) Features: (A) Name / Key: misc_feature (B) Position: 1. ． 708 (D) Other information: / Label = pNX10_insert (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 17: (2) Information on SEQ ID NO: 18: (i) Sequence features: (A) Length: 236 amino acids (B) Type: Amino acid (D) Topology: linear (ii) Molecular type: protein (xi) Sequence description: SEQ ID NO: 18: Sequence listing summary SEQ ID NO: 1 pNX1 DNA and coding region SEQ ID NO: 2 protein sequence of SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 3 pNX3 DNA and coding region SEQ ID NO: 4 protein sequence of SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 5 pNX4 DNA and coding region SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 5 protein sequence SEQ ID NO: 7 pNX5 DNA and coding region SEQ ID NO: 8 protein sequence of SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 9 pNX6 DNA and coding region SEQ ID NO: 10 protein sequence of SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 11 pNX7 DNA and coding region SEQ ID NO: 12 protein sequence of SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 13 pNX8 DNA and coding region SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 13 protein sequence SEQ ID NO: 15 pNX9 DNA and coding region SEQ ID NO: 16 protein sequence of SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 17 pNX10 DNA and coding region SEQ ID NO: 18 protein sequence of SEQ ID NO: 17

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｓ 3/08 8931−4ＢＤ２１Ｃ 9/10 ＺＡＢＺ 7199−3Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:645） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＺ，ＦＩ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＫ，ＵＡ，ＵＳ，ＶＮ (72)発明者ヘーゼルウッド，ジェフリーピーターイギリス国、シービー８２エイエルサフォーク、ニューマーケット、ダッチェスドライブ 109エイ (72)発明者ギルバート，ハリージョンイギリス国エヌイー９５エックスエスタインアンドウエアー、ゲートシェード、ロウフェル、ケルスガーデンズ 16番地─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification code Internal reference number FI C12N 15/09 C12S 3/08 8931-4B D21C 9/10 ZAB Z 7199-3B // (C12N 9/24 C12R 1: 645) (C12N 1/15 C12R 1: 645) (81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE, DK, ES, FR, GB, GR, IE, IT, LU, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE, SN, TD, TG), AU, BB, BG, BR, CA, CZ, FI, HU, JP, KP, KR, KZ, LK, MG, MN, MW, NO, NZ, PL, RO, RU, SD, SK, UA, US, VN (72) Inventor Hazelwood, J Effrey Peter CB, England 8 2 ELL Suffolk, Newmarket, Dutchess Drive 109 A (72) Inventor Gilbert, Harry John UK 9 5X Stain and Wear, Gateshade, Rowfell, Kels Gardens 16

Claims

[Claims] 1. A xylanase that has at least one catalytic region substantially homologous to an anaerobic fungal xylanase and is not a full-length native xylanase. 2. The xylanase according to claim 1, wherein the catalytic region is the same as that of a natural xylanase derived from an anaerobic fungus. 3. The xylanase according to claim 1 or 2, wherein the anaerobic fungus is a rumen fungus. 4. The xylanase according to claim 3, wherein the rumen fungus is of the genus Neocallimastix . 5. The xylanase of claim 4, wherein the fungus is Neocallimastix patriciarum . 6. A xylanase according to any one of claims 1 to 5 derived from a xylanase having the following structure (N-terminal to C-terminal): CAT1-LINK1-CAT2-LINK2-CTR1-CTR2 where: CAT1 is the first , CAT2 represents a second catalytic region, LINK1 represents a first linker, LINK2 represents a second linker, CTR1 represents a first C-terminal repeat, and , CTR2 represents the second C-terminal repeat. 7. 7. The xylanase of claim 6, wherein CAT1 has a sequence which is identical or substantially homologous to the following sequence: 8. Xylanase of claim 6 or 7, wherein CAT2 has a sequence which is identical or substantially homologous to the following sequence: 9. 9. A xylanase of claim 6, 7 or 8 wherein LINK1 has a sequence which is identical or substantially homologous to the following sequence: TSTGTVPSSSAGGSTANGK. 10. A xylanase according to any one of claims 6 to 9, wherein LINK2 has a sequence that is identical or substantially homologous to the following sequence: TSAAPRTTTTTTTRKSLPTNYNK. 11. A xylanase according to any one of claims 6 to 10, wherein CTR1 has a sequence which is identical or substantially homologous to the following sequence: CSARITAQGYKCCSDPNCVVYYTDEDGTWGVEN NDWCGCG. 12. A xylanase according to any one of claims 6 to 10 wherein CTR2 has a sequence which is identical or substantially homologous to the following sequence: VEQCSSKITSQGYKCCSDPNCVVFYTDDDGKWG VENNDWCCGCF. 13. 13. A method according to claim 6 which comprises a catalytic region substantially homologous to at least one of CAT1 and CAT2 and lacks at least part of the amino acid sequence downstream of CAT2 (ie towards the C-terminus). A xylanase according to any one of the items. 14. 14. The xylanase of claim 13 lacking at least a portion of CTR2. 15. 15. The xylanase of claim 13 or 14 lacking at least a portion of CTR1. 16. 16. The xylanase of any one of claims 6-15 having the following structure: CAT1-LINK1-CAT2-LINK2-CTR1 (shortened); CAT1-LINK1-CAT2-LINK2 (shortened); LINK1 (shortened) -CAT2-LINK2 (shortened); CAT1-LINK1 (shortened); CAT1 (shortened); LINK1 (shortened) Shortened) -CAT2-LINK2-CTR1-CTR2; LINK1 (shortened) -CAT2-LINK2-CTR1 (shortened); or LINK1 (shortened) -CAT2 (shortened). 17． 16. The xylanase of claim 15 having the structure: LINK (shortened) -CAT2-LINK2 (shortened) 18. An isolated or encoding a xylanase having a catalytic region that is substantially homologous to an anaerobic fungal xylanase, provided that it does not consist of a full-length copy of the native mRNA encoding the xylanase. Recombinant DNA molecule. 19. 19. The DNA molecule of claim 18, wherein the missing portion of the DNA, or one of the missing portions, corresponds to the 3'and / or 5'untranslated region of the mRNA. 20. 20. A DNA molecule of claim 18 or 19 derived from a DNA molecule having the structure: 5'utr-sig-cat1-link1-cat2-link2-ctr1-ctr2-3'utr, where 5'utr is 5'untranslated region; sig encodes a signal peptide; cat1 encodes the first catalytic region; link1 encodes the first linking sequence; cat2 represents the second catalytic region. Link2 encodes a second joining sequence; ctr1 encodes a first C-terminal repeat; ctr2 encodes a second C-terminal repeat; and 3'utr is 3'untranslated region is shown. 21. 21. The DNA sequence of claim 20, wherein the 3'utr segment has a sequence that is identical or substantially homologous to the following sequences. 22. 22. A DNA sequence according to claim 20 or 21, wherein the sig segment has a sequence which is identical or substantially homologous to the following sequence: 23. 23. A DNA sequence according to claim 20, 21 or 22, wherein the cat1 segment has a sequence which is identical or substantially homologous to the following sequence: 24. 24. A DNA sequence according to any of claims 20 to 23, wherein the link1 segment has a sequence which is identical or substantially homologous to the following sequence: 25. 25. A DNA sequence according to any one of claims 20 to 24, wherein the cat2 segment has a sequence which is identical or substantially homologous to the following sequence: 26. 26. A DNA sequence according to any one of claims 20 to 25, wherein the link2 segment has a sequence which is identical or substantially homologous to the following sequence: 27. 27. A DNA sequence according to any one of claims 20 to 26 wherein the ctr1 segment has a sequence which is identical or substantially homologous to the following sequence: 28. 28. A DNA sequence according to any one of claims 20 to 27, wherein the ctr2 segment has a sequence which is identical or substantially homologous to the following sequence: 29. 29. A DNA sequence according to any one of claims 20 to 28, wherein the 5'utr segment has a sequence which is identical or homologous to the following sequence: 30. 30. A DNA sequence according to any one of claims 18 to 29 encoding the xylanase of claims 1 to 17. 31. A DNA sequence according to any one of claims 20 to 30 consisting of the following segment: 5'utr-sig-cat1-link1-cat2-link2-ctr1 (shortened); 5'utr-sig- cat1-link1-cat2-link2 (shortened); link1 (shortened) -cat2-link2 (shortened); 5'utr-sig-cat1-link1 (shortened); 5'utr-sig-cat1 (shortened); link1 (shortened) ) -Cat2-link2-ctr1-ctr2-3'utr; link1 (shortened) -cat2-link2-ctr1 (shortened); link1 (shortened) -cat2 (shortened). 32. 32. A DNA molecule according to any one of claims 18 to 31, which is in the form of a vector. 33. 33. The DNA molecule of claim 32, wherein the vector is a plasmid. 34. 34. The DNA molecule of claim 32 or 33, wherein said vector is an expression vector. 35. A DNA molecule, as defined herein, which is or consists of the plasmid pNX3, pNX4, pNX5, pNX6, pNX7, pNX8, pNX9 or pNX10. 36. A DNA molecule as defined herein which is the plasmid pNX5, pNX9 or pNX10 or consists of an insert thereof. 37. A host cell transfected or transformed with the DNA molecule of any one of claims 18 to 36. 38. Use of a xylanase according to any one of claims 1 to 17 in the improvement of bread, baked products. 39. Use of a xylanase according to any one of claims 1 to 17 as an enzyme supplement for animal feed. 40. Use of a xylanase according to any one of claims 1 to 17 as an impurity remover in pulp. 41. Use of a xylanase according to any one of claims 1 to 17 in the prebleaching of kraft pulp. 42. A xylanase having at least one catalytic region substantially homologous to an anaerobic fungal xylanase. 43. An isolated or recombinant DNA molecule encoding a xylanase having a catalytic region substantially homologous to an anaerobic fungal xylanase, provided that the DNA molecule encodes a Neocallimastix frontalis xylanase. A DNA molecule, if cDNA, provided that the DNA molecule is operably linked to a promoter.