JPH08500820A

JPH08500820A - 細胞接着インヒビターとしての置換されたラクトース誘導体

Info

Publication number: JPH08500820A
Application number: JP6502607A
Authority: JP
Inventors: アッバス，サイード; ダスグプタ，ファルグニ; エイサ，ダーウィン; エイチ．ムッサー，ジョン; ナッシュド，ミナ
Original assignee: グライコメッドインコーポレイテッド
Priority date: 1992-06-29
Filing date: 1993-06-25
Publication date: 1996-01-30
Also published as: EP0648223A1; CA2138645A1; AU4652693A; EP0648223A4; AU678373B2; WO1994000477A1

Abstract

(57)【要約】セレクチンレセプターに結合し、細胞−細胞接着事像を調節することにより、炎症、癌、および関連した疾患の進行を調節する、式（Ｉ）を有する化合物、およびそれらの製造方法を記載する。式（Ｉ）において、R¹は、それぞれ独立して、Hまたは低級アルキル（1-4C）であり；R²は、H、OH、低級アルキル（1-4C）、アルキルアリール、あるいは１つまたはそれ以上の他の糖残基であり；R³は、SO₄ ^--、PO₄ ^--を含む、負に荷電した部分であり；Yは、Hまたは低級アルキル（1-4C）であり；そしてXは、-CHR⁴（CHOR¹）₂CHR⁵OR¹であり、ここで、R⁴およびR⁵は、それぞれ独立して、H、低級アルキル（1-4C）、あるいは、一緒になって、O、S、およびNR¹からなる群から選択されるヘテロ原子を随意に含む、５員環または６員環を形成し；該５員環または６員環は、R¹、CH₂OR¹、OR¹、OOCR¹、NR¹ ₂、NHCOR¹、およびSR¹からなる群より選択される１種の置換基で随意に置換され、Xが、ヘキソース置換基を表すときは、R^３およびR⁴は一緒になっても、ヘキソース置換基にはなり得ない。

Description

【発明の詳細な説明】細胞接着インヒビターとしての置換されたラクトース誘導体技術分野本発明は、炎症、アレルギー反応、自己免疫疾患、および関連した状態の治療に有用な化合物に関する。より詳細には、本発明は、セレクチンレセプターに結合する置換されたラクトース、およびそれらを含む薬学的組成物に関する。本発明はまた、これらの類似物および他のラクトース誘導体を得るのに有用な合成方法に関する。背景技術細胞の相互作用が、少なくとも一部はレセプター／リガンド相互作用により仲介されていることは、現在十分に確立されている。レセプターの１つのクラスは、ペプチド部分配列「RGD」を認識することが知られており、他のレセプターは、炭水化物リガンドを認識することが知られている。炭水化物ベースのリガンドを認識するレセプターの１つのクラスは、刺激された血管内皮への、循環好中球の付着を仲介する。これは炎症性応答の最初の事象であり、そしてこれはアレルギーおよび自己免疫応答にも包含されているようである。数種のレセプターが、この相互作用に関与しており、１群の推定レクチンを包含する。このレクチン群には、gp90 ^MEL (Leu8)、ELAM-1、およびGMP-140(PADGEM)、ならびに(Gong，J.-G.ら、Nature (1990)343:757；Johnston,G.I.ら、Cell(1989)56:1033；Geoffrey,J.S.およびRo sen,S.D.、J.Cell Biol.(1989)109:2463；Lasky,L.A.ら、Cell(1989)56:1045)が包含される。これらのレクチンは、L-セレクチン、E-セレクチン、およびP-セレクチンと呼ばれている。 E-セレクチンは、おそらく、これら３種のセレクチンのうち、最も特徴付けられている。これは、IL-1またはTNFに応答する内皮細胞での一過性発現である(Be vilacqua,M.P.ら、Science(1989)243:1160)ため、特に興味深い。この誘導された発現期間（２〜８時間）により、感染および外傷に応答する初期の好中性溢出におけるこのレセプターの役割が示唆される。さらに、Bevilacquaら(Bevilacqu a,M.P.ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1987)84:9238)は、ヒト好中球またはHL-60 細胞が、E-セレクチンレセプターについてコードするcDNAを含むプラスミドを用いてトランスフェクトされたCOS細胞に接着することを示した。内皮細胞−白血球接着分子についてコードするDNA配列に関する情報は、1990年11月15日に公開された、公開PCT出願WO90/13300のなかで開示されている。最近、いくつかの異なるグループが、E-セレクチンに対するリガンドに関する論文を発表した。Loweら、Cell(1990)、63:475-484では、シアリルルイスx(sLex )オリゴ多糖、NeuNac α2-3Ga1-β1-4(Fuc α1-3)-G1cNAcを用いて、HL-60細胞変異物のE-セレクチン依存性接着と、トランスフェクトされた細胞株(line)との間の正の相関が報告された。α(1,3/1,4)フコシルトランスフェラーゼを含むプラスミドで細胞をトランスフェクトすることにより、非骨髄性COSまたはCHO系を、E-セレクチンに依存して結合するsLex陽性細胞に変換し得た。抗sLex抗体を用いてE-セレクチン依存性接着をブロックする試みは、該抗体による試験細胞の凝集反応のために解釈不可能であった。シアリル化フコシル化ラクトサミノグリカンからなるオリゴ多糖群のうちの１種またはそれ以上が、E- セレクチンのレクチンドメインに対するリガンドであると結論された。Phillips ら（(1990)Science,250:1130-1132）は、sLexに対して報告された特異性を有する抗体を用いて、HL-60またはLEC11 CHO細胞の、活性化内皮細胞へのE-セレクチン依存性接着を阻害した。末端sLex構造を有するジフコシル化糖脂質を含むリポソームは、接着を阻害したが、非シアリル化Lex構造を有するリポソームは、部分的に阻害性であった。WalZら（(1990)Science,250:1132-1135）は、sLexに対するモノクローナル抗体を用いて、またはsLex構造を有する糖タンパク質によって、HL-60細胞へのE-セレクチン-1gGキメラの結合を阻害し得たが、CD65またはC D15抗体を用いた阻害は例示され得なかった。これら両グループは、sLex構造がE -セレクチンに対するリガンドであると結論した。現譲渡人に譲渡され、そして本明細書中で参考として援用される、特許出願番号WO92/02527は、上記の最小の四糖類構造を開示し、そして特許請求の範囲とし、そしてELAM-1レセプターと相互作用性であると推定される基を同定している。 E-セレクチンとは対照的に、L-セレクチンおよびP-セレクチンに結合するリガンドの特性は、よく解明されていない。L-セレクチンは、L-セレクチン認識を阻害する、末梢リンパ節の高内皮性小静脈(high endothelial venule)のノイラミニダーゼ処理に基づき、シアル酸を持つリガンドに結合するようである。Trueら、1990,J.Cell Biol.111,2757-2764。さらに、直接的結合／阻害アッセイで可溶性L-セレクチンを用いる、他の研究により、一定の炭水化物部分が、マンノースおよびフコースを含む重要なリガンド構成要素であり得る（特に硫酸化またはリン酸化されるとき）ことを示唆している。Imalら、1990,J.Cell Blol.111,1225- 1232。より最近の研究では、L-セレクチンは、シアリルルイスｘに結合することが示唆されている。Foxall,C.ら、(1992)Cell、印刷中。 P-セレクチンに対するリガンドは、シアリルルイスｘに関連したエピトープを有すると考えられる。この結論は、活性化された血小板またはP-セレクチンを発現するCOS細胞への、HL-60細胞のP-セレクチン仲介接着をブロックするという特異性を有する抗体を用いる研究に基づいている。Larsenら、(1990)Cell 63,467- 474。他の実験では、P-セレクチンでトランスフェクトされた細胞へのHL-60細胞の接着は、ルイスｘエピトープを有する、乳から単離された五糖類によりブロックされることが示された。最近、P-セレクチンは、スルファチドに結合することが示された。Aruffo,A.ら、(1991)Cell,67:3 5-44。疾病（特に、ある一定の細胞タイプにおいて、セレクチン−リガンド結合を介して起こる、所望されない細胞−細胞接着を含む疾病）でのセレクチンの役割のために、そのようなセレクチン−リガンド結合の制御を可能にする、新規なリガンドの同定および単離が非常に必要とされている。発明の目的本発明は、セレクチンレセプターに結合するアゴニストおよびアンタゴニストを提供する。従って、細胞−細胞接着事象を調節することにより、炎症、癌、および関連した応答の経過を調節する。この局面において、本発明は以下の式の化合物に関する：ここで、R¹は、それぞれ独立して、Hまたは低級アルキル(1-4C)であり； R²は、H、低級アルキル(1-4C)、アルキルアリール、あるいは１つまたはそれ以上の他の糖残基であり； R³は、SO₄ ^--、PO₄ ^--、または関連する基を含む、負に荷電した部分であり； Yは、H、OH¹または低級アルキル(1-4C)であり；そして Xは、-CHR⁴(CHOR¹)₂CHR⁵OR¹であり、ここで、R⁴およびR⁵は、それぞれ独立して、H、低級アルキル(1-4C)、あるいは一緒になって、O、S、およびNR¹から成る群から選択されるヘテロ原子を随意に含む５員環または６員環を形成し；該５員環または６員環は、R¹、CH₂OR¹、OR¹、OOCR¹、NR¹ ₂、NHCOR¹、およびSR¹ からなる群から選択される１種の置換基で随意に置換され、Xがヘキソース置換基を表すときには、R⁴およびR⁵は一緒になっても、ヘキソース置換基になり得ない。他の局面においては、本発明はラクトース誘導体を合成する方法に関する。その方法は、下式の中間体を接触させる工程を包含し、ここで、R⁶は、それぞれ独立して、H、低級アルキル(1-4C)、または保護基であり；そしてここで、Y¹は、H、OH⁶、OOCR⁶、またはSR⁶であり；ここで、少なくとも１つのR⁶は、置換されるべき位置にあり、そして、多くても１つの近接したR⁶がHであり、その他の全てのR⁶が保護基であり；そして R⁷は保護基であり、生成物を得るための求電子試薬供給部分を有し、ここで、求電子試薬は、置換されるべき位置で、OHのHに対して置換されている。他の局面において、本発明は、式１の化合物を含む薬剤組成物に関し、そしてこれらの化合物を用いる炎症の治療方法に関する。他の局面において、本発明は、式２の化合物、および、セレクチン結合リガンドまたは他の有用なラクトシル残基含有部分の合成における、付加的な中間体に関する。発明を実施する形態本明細書中で引用する全ての文献全体を、参考として援用することが意図されている。本発明は、セレクチンレセプターに対して結合する能力によって、炎症を治療するのに有用な化合物を提供する。例えば、図１は、炎症を介在するときにセレクチンレセプターの１種，ELAM-1によって行われると考えられている役割の概略図である。血管には、ELAM-1表面レセプターを生成し得る内皮細胞が並んでいる。血管内を循環しているリンパ球は、その表面にELAM-1レセプターと結合し得る炭水化物リガンドを含む。これにより、血管壁を通って周囲の組織中にリンパ球が移動する。これはいくつかの状況において有用な効力を有し得るが、周囲の組織が感染している場合には、血管壁を通り組織中へのリンパ球の過度の移動は、過度であり得、望ましくない炎症を引き起こす。いかなる特別な理論によっても制限されることは望まないが、ELAM-1レセプターに結合する本発明の化合物は、循環しているリンパ球の表面リガンドの反応を拮抗し、従って、周囲の組織内で炎症を引き起こす、リンパ球の血管壁を通る移動を予防すると考えられている。リガンドを同定するアッセイセレクチンリガンドとして作用するラクトース誘導体を同定するためのアッセイは、最も一般的な形態では、適切なセレクチン、L-セレクチン、E-セレクチン、またはP-セレクチンを推定リガンドと接触させ、そしてその結合特性を測定することを包含する。いくつかのアッセイを利用して、L-セレクチン、E-セレクチン、またはP-セレクチンに結合する化合物の能力を測定することが可能であり、そしてこのようなアッセイは、当該分野で周知である。例えば、セレクチンおよび推定リガンドの両方を、充分な時間、溶液中において、セレクチンおよびリガンドからなる複合体を生成させ、次いで複合体を形成していないセレクチンおよびリガンドからこの複合体を分離し、そして生成した複合体の量を測定し得る。あるいは、複合体を形成していないセレクチンまたは化合物の量を測定し得る。第２の、そして好ましいアッセイ形式は、セレクチンまたは推定リガンドのいずれかを固体表面上に固定すること、および、固定化した反応物を固定化していない反応物と接触させることにより、固体表面上にセレクチン−リガンド複合体を生成することからなる。このセレクチン−リガンド複合体を、複合体を形成していない反応物から分離し、そして複合体中に存在する固定化していない反応物の量を測定することにより、生成した複合体の量を測定し得る。例えば、推定リガンドは、マイクロタイターウェルに固相化され得、次いで所望のセレクチンをウェルに添加し、そしてリガンドに結合したセレクチンの量を測定し得る。上記アッセイの変法は、遺伝子工学的に細胞を操作して、細胞表面に高レベルのL-セレクチン、E-セレクチン、またはP-セレクチンを発現させ、そしてその細胞を精製したセレクチンのかわりに用いることである。放射標識したCOS細胞が、このタイプのアッセイに用いられており、そしてL-セレクチン、E-セレクチン、またはP-セレクチンをコードするcDNAを用いて、トランスフェクトされ得る。この細胞を、充分な時間、リガンドをコートしたマイクロタイターウェルに接着させた後、非接着細胞を除去し、そして接着細胞の数を測定する。接着細胞の数は、セレクチンに結合するリガンドの能力を反映する。このタイプのアッセイの代表的用途は、E-セレクチンリガンドの同定である。例えば、ELAM-1レセプターの完全なcDNAは、IL-1刺激したヒト臍静脈内皮から単離した全RNAを用いて開始したPCRによって得られた。得られたcDNAを、CDM8プラスミド(Aruffo,A．およびSeed,B.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1987)84:8573 を参照）中に挿入し、そして大腸菌内で増幅した。個別のコロニーから得たプラスミドDNAを単離し、そしてこれを用いてCOS細胞をトランスフェクトした。ポジティブなプラスミドを、それらがHL-60細胞接着を支持するCOS細胞を生成する能力により、選択した。 DNA塩基配列決定により、これらのクローンの１つがELAM-1をコードするものとして、ポジティブに同定された（Bevilacqua,M.P.ら、Science、(1989)243:1160 ; Polte,T.ら、Nucleic Acids Res.(1990)18:1083; Hession, C.ら、Proc. Natl . Acad.Sci. USA (1990)87:1673)。これらの出版物を、ELAM-1およびそれをコードする遺伝物質の開示に関し、本明細書中で参考として援用する。ELAM-1 cDNA の完全なヌクレオチド配列およびELAM-1タンパク質の予測アミノ酸配列は、上記引用したBevilacquaらの論文中に掲載されている。これらのDNAおよびアミノ酸配列を、本明細書中で参考として援用する（本明細書中で参考として援用する、 1990年11月15日に公開された、公開PCT特許出願W090/13300も参照）。 ELAM-1をコードする完全長cDNAは、非翻訳の隣接配列に対して相補的なプライマーを用いて、IL-1刺激したヒト臍静脈内皮細胞から抽出した全RNA１μｇを用いた、35サイクルのポリメラーゼ連鎖反応によって得られた。上記配列は以下の通り：生成した２Kbインサートをゲル精製し、ポリリンカーへのSalI部位の挿入により改変された噛乳動物発現ベクターCDM8に複製方向にクローンし、大腸菌(MC1061/p3)中で増殖した。プラスミドを個別のコロニーから単離し、そしてこれを用いてCOS細胞をトランスフェクトした。推定E-セレクチンをコードするプラスミドを、これらのトランスフェクトされたCO S細胞が、トランスフェクト後72時間におけるHL-60細胞接着を支持する能力に基づいて選択した。 E-セレクチンの発表された配列（ここでは２つの核酸置換を有する）のポジティブcDNAを、全ての実験で用いた。COS細胞を、3.5〜5.0×10⁵個の細胞当たり、このプラスミドDNA１μｇ、DEAE−デキストラン400μｇ/mlおよびクロロキン100 μＭを用いて、４時間トランスフェクトし、次いで、PBS中の１0％DMSOに短時間曝した。細胞を、代謝的に、キャリアを含まない³²PO₄で一晩放射標識し、そしてトランスフェクションから72時間後、細胞接着の研究で使用するために0.02％のアジドおよび2mMのEDTAを追加したPBS中に回収した。上記手法により産生された、E-セレクチンでトランスフェクトされたCOS細胞を用いて、グルクロニル糖脂質リガンドについてアッセイし得る。同様に、COS 細胞は、L-セレクチンおよび／またはP-セレクチンをコードするcDNAを用いてトランスフェクトされ得る。L-セレクチン−IgGキメラ構造体の産生および特徴付けは、以前にWatson,S.R.ら、(1990)J.Cell Biol.110:2221-2229に記載された。このキメラは、天然での発現と同様、２個の補体結合ドメインを含む。Watson, S.R.ら、(1991)J.Cell Biol.115:235-243を参照。P-セレクチンキメラを、Walz,G.,ら、(1990)Science 250,1132-1135およびAruffo,A.ら、(199 1)Cell,67,35-44にそれぞれ記載の方法と同様の方法で構築した。これらのキメラは、適切な宿主細胞、例えば、293細胞中で発現され、そして精製され得る。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーが、好ましい精製方法である。 E-セレクチンおよびP-セレクチンは、キメラのサイズを標準化し、そしてこれらの分泌を促進する短縮形補体結合ドメインを用いて構築され得る。上記アッセイの１つの変法は、細胞を遺伝子工学的に操作して、高レベルのL-セレクチン、E- セレクチン、またはP-セレクチンを細胞表面に発現させ、そして精製したセレクチンの代わりにこれらの細胞を用いることである。放射性標識したCOS細胞が、このタイプのアッセイで用いられており、そしてL-セレクチン、E-セレクチン、またはP-セレクチンをコードするcDNAを用いてトランスフェクトされ得る。これらの細胞を充分な時間、リガンドをコートしたマイクロタイターウェルに接着させた後、非接着細胞を除去し、そして接着細胞の数を測定する。接着細胞の数は、リガンドがセレクチンに結合する能力を反映する。従って、式１のいかなる候補化合物も、上述のアッセイにおける陽性の結果により、ELAM-1レセプターと結合すると証明し得る。これらのアッセイにより、式１の化合物からなる群の種々のメンバーの相対的な効果を決定するための簡単なスクリーニングが提供される。式１の化合物の非治療的使用以下にさらに記載するように、式１の化合物は、炎症の治療または予防における使用の他に、インビトロ、およびインビボの両方で、診断および予備の手法に有用である。式１の化合物は、固体基質に結合され得、そして生物学的試料からのセレクチンレセプタータンパク質の精製に使用され得る。これは、アフィニティークロマトグラフィーカラムとして結合した基質を配置して、セレクチンレセプタータンパク質が吸着しているが、不純物質は無いという条件下で、セレクチンレセプタータンパク質を含有していると推定される試料を、アフィニティーカラムにかけることによって、最も好都合に行われる。次いで、セレクチンレセプタータンパク質は、例えば、式１の化合物の競合量を含むように、溶離液を調整することによって、あるいは、pHまたは塩のパラメーターを調整することによって、続いて溶出される。アフィニティー精製のための技法はよく理解され、そして型にはまった、最適化された実験により、この手法を行うために適した条件が作り出される。式１の化合物はまた、セレクチンまたは関連の炭水化物結合レセプターリガンドの有無を決定するための検出試薬としても、有用である。こうした診断アッセイでの使用に対して、セレクチンレセプタータンパク質、またはそれに非常に関連のあるレセプタータンパク質を含有すると予想される生物学的試料は、レセプタータンパク質および式１の化合物間で複合体形成が起こる条件下で、式１の化合物で処理されて、複合体の形成が検出される。広範な種々のプロトコールは、免疫アッセイに用いられるプロトコールと類似の手順で有用であり得る。従って、形成された複合体の量が直接測定される直接アッセイは、有用であり得；あるいは、標識したセレクチンレセプタータンパク質が、生物学的試料と共に供給され、そして生物学的試料と競合する、競合アッセイが使用され得る。いくつかの形態の上記アッセイは、標識した形での式１の化合物を供給するのに便利であるので、複合体は直接検出される；それに代わる手順では、複合体は、サイズ分離、２次標識試薬、またはそれに代わる他の手段によって検出され得る。適切な標識は、当業者に既知であり、そして標識には、放射標識、蛍光標識、酵素標識、色素生成標識またはこれらのアプローチを複合したものを包含する。式１の化合物はまた、競合的診断試薬としても、使用され得、生物学的液体中の表面リガンドのようなセレクチンレセプター結合成分の量を検出する。このようなアッセイを行うには、式１の化合物を上記のように標識し、生物学的試料と混合し、そして適切なレセプタータンパク質と接触させる；生物学的試料中に存在するセレクチンレセプターに対する、標識した式１の化合物の結合が減少することが、次いで測定される。式１の化合物はまた、インサイチュてのセレクチンレセプターの場所を決定するためのインビボでのイメージ研究で使用され得る。このようなアッセイで使用するために、式１の化合物は、インジウム111、テクネチウム99、ヨウ素131などを包含するシンチグラフィー標識のような、インビボでのイメージ技法によって検出され得る標識物と共に供給される。式１の化合物などの化合物を標識、クロマトグラフィーの支持体、または関連する手法において化合物を使用するのに有用な他の部分に結合するための技法は、当該分野において周知である。抗体もまた、適切な担体に対して上記化合物を結合させて、適当な含有物であるアジュバントを用いる標準免疫プロトコールで、哺乳類または他の脊椎動物患者に、結合した物質を投与することよって、式１の化合物に対して調製され得る。適切な免疫遺伝学的担体には、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン(K LH)、破傷風トキソイド、ウシ血清アルブミン(BSA)などの種々の血清アルブミン、および、ロタウイルスのVP6プロテインなどの特定のウイルスタンパク質が挙げられる。次いで、これらの結合した物質を、ウサギ、ラット、またはマウスなどの患者に繰り返し注射して投与し、そして、抗体力価を標準免疫アッセイ技法によってモニターした。得られた抗血清は、それ自体が使用され得、または、免疫によって生成された抗体分泌細胞は、標準技法を用いることによって不滅化され、式１の化合物との免疫反応性を有するモノクローナル調製物源として使用され得る。得られた抗体は、関連する式１の化合物の存在および／または量を決定するためのアッセイ系において有用である。このようなアッセイは、以下に記載のような治療方法において、式１の化合物の循環レベルをモニターするのに有用である。抗炎症のプロトコールでの投与本発明の化合物は、それが炎症を予防のために防ぐとき、または、炎症が起こった後にそれを緩和するのに必要である時、患者に投与される。本明細書中で使用している「治療」は、炎症および／または炎症に伴う症候を予防または改善することを意味する。上記化合物は、好ましくは、薬学的に受容可能な担体とともに投与され、その担体の性質は、例えば、通常は固体担体を用いる経口投与、および、液体の塩溶液担体を用いる静脈内投与など、投与の態様で異なる。典型的には、注射し得る組成物は、液体溶液または懸濁液として調製される；注射前に液体媒体に溶解するのに、または懸濁するのに適した固体形態もまた調製し得る。上記化合物はまた乳化され得、または活性成分をリポソーム媒体中にカプセル化した。適切な媒体は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、もし所望であれば、上記媒体は、湿潤剤または乳化剤、あるいはpH緩衝剤などの補助物質を少量含み得る。このような調剤形状の実際的な調製方法は、当業者には既知、または明白である。例えば、Reminton's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, PA, 17版、1985年を参照のこと。処方物は、例えば、薬剤級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンセルロースナトリウム、炭酸マグネシウムなどを含有する種々の賦形剤を使用し得る。経口用組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性処方物、または、散剤の形をとり得る。DMSOのような浸透増強剤を含む経皮用処方物として本願リガンド分子を、患者に直接投与することは、特に有用である。他の局所用処方物は、皮膚の炎症を治療するために投与され得る。さらに、経粘膜投与は、任意に他の洗浄剤分子と組合せて、胆汁酸塩またはフシジン酸誘導体などの浸透剤を使用することで効果的にし得る。これらの処方物は、例えば、坐剤、または鼻用噴霧剤の調製に有用である。坐剤として、媒体組成物は、従来の結合剤および担体（ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドなど）を包含する。このような坐剤は、約0.5％から約10％（w/w）、好ましくは約１％から約２％の範囲の活性成分を含有する混合物から形成され得る。通常、鼻腔内用の処方物は、鼻の粘膜に対する刺激を引き起こさず、または繊毛の機能をほとんど妨害しない媒体を含有する。水、生理食塩水溶液、または他の既知の物質など希釈剤は、本願発明に用いられ得る。鼻用の処方物もまた、クロロブタノールおよび塩化ベンザルコニウムのような保存剤を含有するが、これらに限定されるものではない。界面活性剤は、鼻の粘膜によって対象のタンパク質の吸収を高めるために存在し得る。典型的には、本発明の組成物は、１％未満から約95％までの、好ましくは約10 ％から約50％までの活性成分を含む。好ましくは、約10mgと50mgとの間で子供に対して投与され、そして約50mgと1000mgとの間で成人に対して投与される。投与の回数は、患者の応答性に基づいて与えられる管理によって決定される。他の効果的な用量は、通常の試験で確立する用量反応曲線から、当業者によって容易に決定され得る。投与すべき用量を決定する上で、特定のタイプの全てのセレクチンレセプターを完全に遮断することは望ましいものであり得ないことに注意すべきである。普通の治癒プロセスを進めるために、少なくともいくつかの白血球または好中球が、あらゆる創傷、感染、または病状が生じている患部組織へ運び込まれなければならない。遮断剤として投与されるセレクチンリガンド量は、治療されている疾患の型のような種々の要素を考慮しながら、患者個々の必要性に基づいて、注意深く調節されなければならない。本発明の化合物は、広い範囲の疾患、例えば、慢性関節リウマチおよび多発性硬化症などの自己免疫疾患の治療に有用である。本発明の組成物は、組織の損傷、腫脹、炎症、および／または疼痛を引き起こす程度にまで組織内に白血球蓄積を引き起こした身体に対して免疫系が向けられている、いかなる病状にも適応し得る。本発明の処方物はまた、心臓発作に起因する組織の損傷の望ましくない後遺症を、予防するためにも投与され得る。心臓発作が起こり、抗凝血薬または血栓崩壊薬の（例えば、tPA)の適用によってなど、患者が回復した時、凝血塊が形成された内皮内層は、損傷を受けることがしばしばある。抗血栓薬が凝血塊を除去したとき、凝血塊の下で損傷を受けた組織および内皮内層中の酸素が欠如していた他の損傷を受けた組織は、活性化される。次いで、活性化された内皮細胞は、細胞が損傷を受けてから数時間以内にセレクチンレセプター、例えば、ELAM-1レセプターを合成する。このレセプターは血管中にまで達し、白血球表面の糖脂質リガンド分子に付着する。大量の白血球が素早く捕獲され、そして活性化された内皮細胞の周囲組織中へもたらされて、炎症、腫脹、および壊死が起こり、これによって患者の回復の見込みが減少する。心臓発作が原因で傷害を受けた患者を治療することに加えて、身体のある部分が重傷を負った後に、通常生じる炎症および腫脹の量を軽減するために、現実に物理的な外傷を受けた患者を、本発明の処方物を用いて治療し得た。本発明の処方物を用いて治療し得るその他の条件は、種々の型の関節炎、および成人呼吸障害症候群を包含する。本開示を読んだ後、当業者は、本発明の処方物を投与することによって、治療および／または緩和され得る他の疾患の状態および／または症状を理解する。式２の化合物の適用式２の化合物は、ラクトシル単位を含む化合物を調製する際の中間体である。顕著に、式２の化合物は、本明細書中で使用が上述されている式１の化合物の調製に有用である。式１の化合物に加えて、ラクトース残基を含む他の化合物もまた調製され得、それは、例えば 4-O-(3-O-カルボニメチル-β-D-ガラクトピラノシル）-3-O-[2R,S)-グリセリル]-D-グルコピラノース； 4-O-(3-O-カルボニメチル-β-D-ガラクトピラノシル）-3-O-[2R,S)-2,3-ジデオキシ-2,3-ジフルオロプロピル]-D-グルコピラノース； 4-O-[3-O-{(1R,S)-1-（カルボキシ）エチル}-β-D-ガラクトピラノシル]-3-O-[ (2R,S)-グリコシル]-D-グルコピラノース； 4-O-[3-O-{(1R,S)-1-（カルボキシ）エチル}-β-D-ガラクトピラノシル]-3-O- （α-L-フコピラノシル）-D-グルコピラノース； 4-O-[3-O-（α-Neu5Ac)-β-D-ガラクトピラノシル]-3-O-［(2R,S)-グリセリル］-D-グルコピラノース； 4-O-［3-O-（α-Neu5Ac）-β-D-ガラクトピラノシル］-3-O-［(2R,S)-2,3-ジデオキシ-2,3-ジフルオロープロピル］-D-グルコピラノースである。レセプター結合リガンドの多価性形態レセプターに対する本発明のリガンドの親和性は、好ましくは、担体部分によって提供される土台を用いて、リガンドの非常に近い多数のコピーを提供することにより強化され得る。この部分間の最適な間隔を有するこのような多価性を与えることにより、レセプターに対する結合が劇的に改善することが示された。例えば、Lee,R.ら、Biochem(1984) 23:4255には、ラクトースが多価性物として供給されるとき、ラクトースの多価性形態を与えることにより、標識したASORが哺乳類の肝細胞になおさら効果的に結合するのを阻害することを示した；IC₅₀は、１価のラクトースについての500μMから、２価のラクトシル化合物については９まで、３価のラクトシル化合物については４まで、理想ではまたは３つのラクトース部分間の最適な間隔では0.007μMまで減少した。多価性および間隔は、適切な担体部分を選択することによって制御し得る。このような部分は、本発明のリガンドと会合した官能基と反応し得る官能基の多価性を有する、分子支持体を包含する。特に好ましいアプローチは、本発明のラクトース誘導リガンドが、還元的アミノ化によって担体のアミノ基にカップリングすることを包含する。還元的アミノ化は、最初にシッフ塩基を形成し、次いで、水素化物還元剤のような還元試薬で複合体を処理することにより、遊離アミノ基にアルデヒド部分を結合させる、特に好適な方法である。典型的には、担体を有するアミノ基は、約pH9で炭水化物部分と混合し、そしてシッフ塩基を形成し得る；溶媒は典型的には蒸発させ、そして高いpHで、還元試薬を添加して、反応を完了させる。本発明のリガンドの多価性形態を得るための特に好適な担体部分は、タンパク質およびペプチドを包含し、特に、ε-アミノ基を有するリジン残基を含む担体部分は、結合に利用できる。また少なくとも１つのチロシン残基を有するペプチドまたはタンパク質は有用である。なぜなら、これは、例えば放射性ヨウ素で標識するのに好適な部位を提供するからである。３価結合を得るための特に好適な担体は、ペプチドLys-Tyr-Lysである。このペプチド上での本発明のリガンドと遊離アミノ基との完全な反応は、３価部分をもたらす。従って、次式で示される本発明の化合物は、X、Y、ならびに、R¹およびR³が、上記で定義したように、本発明の多価性化合物を例示する。確かに、BSAまたはHSAなどのタンパク質、例えばペンタペプチド、デカペプチド、ペンタデカペプチドなどを包含する、ペプチドの多価性を包含する、種々の担体が用いられ得る。好ましくは、ペプチドまたはタンパク質は、それらの側鎖に遊離アミノ基を有するアミノ酸残基の所望の数を含む；しかし、スルフヒドリル基またはヒドロキシル基のような他の官能基もまた、安定な結合を得るために用いられ得る。例えば、本発明の炭水化物リガンドは、アミドを形成する遊離アミノ基またはエステルを形成するヒドロキシル基のどちらかで誘導体化され得る還元末端で、カルボキシ基を含有するように酸化され得る。式１の化合物の調製式１の本発明の化合物は、式２の中間体を用いて合成され得る。１つの実施態様では、式２の中間体は、標準的な手順を用いてD-ラクトースから直接調製され得る。この変換では、D-ラクトースは、Hudson,C.，およびKuns,A.,J Am Chem S oc (1925)47:2052に記載の方法で、95％を上回る収率で、結晶性形でオクタアセテートに変換される。オクタアセテートは、順次、Hudson,C.の方法（上記）、または、Fischer, E.およびFischer, H.,Ber(1910)43:2521の方法によって、90 ％より多い収率で、対応する臭化ラクトシルに変換され、これもまた結晶性化合物である。保護化された臭化ラクトシルは、Jansson, K.,ら,J Org Chem(1988)5 3 :5629の方法によって、60％を上回る収率で対応するアシル化トリメチルシリルエチルラクトースに変換され、これは定量的収率で脱アシル化によって脱保護化され得、2-（トリメチルシリル）エチルラクトシド、すなわち、2-（トリメチルシリル）エチルβ-D-ガラクトピラノシル-β-D-グルコピラノシドを得る。二糖の１位の他の保護基もまた、使用され得る。式２の化合物のこの前駆体は、以下の式であり：ここでR⁷は保護基、好ましくはSEまたはBnであって、ここで、SEは-CH₂CH₂SiM e₃を表し、そしてBnはベンジルを表す。反応スキーム１は、この中間体からの式２の化合物の一つの実施態様の形成を概略し、ここでBzはベンゾイルを表す。反応スキームの工程１において、保護化されたラクトース、例えばトリメチルシリルエチル誘導体は、過剰の2,2-ジメトキシプロパンで処理し、そして乾燥カンファースルホン酸を反応混合液に添加し、それを約室温で２〜３日間撹拌する。トリエチルアミンのような適切な塩基を添加し、そして10〜20分間撹拌し続ける；次いで、混合物を、乾燥するまで濃縮し、そして塩基を除去する。ベンジルラクトシドの場合は、用いる方法は、D.Beith-Halahmiら、Carbohydr.Res., (19 67)5:25の方法であり、この方法では、ベンジルラクトシドを、4-トルエンスルホン酸を含有する大過剰の乾燥アセトン中で３〜４時間煮る。この反応混合物を標準的な手法を用いて処理し、生成物６を回収する。この中間体は、次いで適切な条件下で、例えば、塩化ベンゾイルを用いて、ベンゾイル化し、反応スキームに７として示す中間体化合物を得る。中間体７は、次いでグルコシド残基の３位の遊離ヒドロキシル基でさらに誘導体化され得るか、またはこの位置が保護化され得、そして化合物はガラクトシル残基の３位および４位で脱保護化され、そして３位でさらに誘導体化される。ガラクトシル残基の４位は相対的に非反応性である。この鍵となる中間体７の利用に対する典型的なスキームを、反応スキーム2Aに示す。（このスキームにおいて、Bzはベンゾイル（PhCO-）であり、そしてBnはベンジル（PhCH₂-）である）。反応スキーム2Aに示すように、中間体７は、適切な条件下で保護化されたメチル１-チオ-L-フコシドで処理することにより、２つの工程で中間体10に変換される。この反応は、臭化第二銅、臭化テトラブチルアンモニウム、およびモレキュラーシーブの存在下で、非水溶非プロトン性溶媒中で行う。（S.Satoら、Carboh ydr. Res. ,(1986)155:C6）。次いで、10として示される、得られた化合物を、文献の手順に従って、中間体を単離することなく、3,4-オルトエステルを経ることによって、D-ガラクトピラノシル残基の４位を選択的にアセチル化し（R.U.Lemi euxおよびH.Drigwez、 J.Amer.Chem.Soc.，(1975)97:4069）、中間体11を与える。中間体11の硫酸化により、中間体12を生成し、これを脱アセチル化し、そして水素添加して、最終生成物13、セレクチンリガンドを生成する。反応スキーム2Bに示した、本発明の他の実施態様では、中間体11をリン酸化して中間体14を生成し得、これは、脱アセチル化および水素添加により最終生成物15 を生成する。この化合物は、セレクチンリガンドとして作用すると期待される。本発明の化合物および好ましい実施態様本明細書中に使用しているように、アルキル（1-6C）は、1-6Cを含む飽和直鎖または飽和分枝鎖炭化水素残基、あるいは飽和環状炭化水素残基を示し；低級アルキルは、同様に定義されるが1-4Cしか含まない。本明細書中に使用しているように、アルキルアリールは式(CH₂)_m-Arであり、ここでｍは1-10、そしてArは単環状または双環状芳香族残基あり、１種またはそれ以上のヘテロ原子を任意に含む。Arの典型的な実施態様は、フェニル、ナフチル、キノリル、ピリジル、ピリミジル、ベンゾチアゾイル、ベンズイミダゾイルなどを包含する。 R⁷は、糖残基に適切な保護基である。典型的な保護基は、ベンジル、ベンゾイル、トリメチルシリルエチル（SE）のような種々のシリルアルキル基などを包含する。本発明の式１の化合物の代表例は、R³がS0₄-2、P0₄-2、または他の同様の荷電した部分である化合物である。本発明の式１の化合物の他の代表例は、Xが以下のものを包含する： 6-メチル-3,4,5-トリヒドロキシピラン-2-イル、 6-アセチル-3,4,5-トリヒドロキシピラン-2-イル、 6-プロピルアミド-3,4,5-トリヒドロキシピラン-2-イル、 6-プロピルアミド-2,3,4-トリメトキシピラン-2-イル、 6-エチル-2,3-ジヒドロキシ-4-メトキシピラン-2-イル、 6-N-エチルアミノ-2-ヒドロキシ-3,4-エトキシピラン-2-イル、 3,4,5-トリ-n-プロピロキシピラン-2-イル、 3,4,5-トリヒドロキシピラン-2-イル、 2,3,4-トリメトキシフラン-2-イル、 2,3-ジヒドロキシ-4-メトキシフラン-2-イル、 2-ヒドロキシ-3,4-エトキシフラン-2-イル、 3,4,5-トリ-n-プロピロキシフラン-2-イル、および 3,4,5-トリヒドロキシフラン-2-イル；または、ここでR⁵およびR⁶の両方がHであり、そしてX中の全てのR¹がHまたはメチルであり；または、ここで、Xが2,3,4-トリヒドロキシベンゾイルである。従って、特に式１の好ましい化合物は、全てのR¹がHまたはメチルであり、Yが H、OH、OCH₃、またはOAcであり；および／または、Xが-CH₂(CHOH)₃H、 3,4,5-トリヒドロキシピラン-2-イル、3,4,5-トリヒドロキシ-6-メチルピラン-2-イル、3 ,4,5-トリメトキシピラン-2-イル、3,4,5-トリメトキシ-6-メチルピラン-2-イル、3,4,5-トリヒドロキシフラン-2-イル、3,4,5,-トリメトキシフラン-2-イル、2 ,3,4-トリヒドロキシベンゾイル、または2,3,4-トリヒドロキシナフトイルであり；そして、R³がSO₄-2、PO₄-2、または他の同様の荷電した部分である。式１の最も好ましい化合物は、全てのR¹がHであり、R²がHであり、YがH、OR¹ または低級アルキルである。中間体を表す式２の化合物については、好ましい形態は、R⁶によって表される保護基が、ベンジルまたはベンゾイルであり、R⁷によって表される保護基が、トリメチルシリルエチルまたはベンジルであり、そしてここでY¹が、H、OR⁶であり、ここでR⁶が上述のようにベンジルまたはベンゾイルであり、そして、ここでの遊離ヒドロキシ基が、グルコシル部分の３位、またはガラクトシル部分の３位および４位にある。ガラクトシル部分の３位および４位に対する他の好ましい保護基は、イソプロピリデンである。次の実施例は、本発明の例示を意図しており、本発明を限定することを意図していない。実施例１ 2-（トリメチルシリル）エチル2,6-ジ-O-ベンゾイル-4-O-(2,6-ジ-O-ベンゾイル -3,4-O-イソプロピリデン−β-D-ガラトピラノシル）-β-グルコピラノシド(7a) の調製 2-（トリメチルシリル）エチル4-O-(3,4-O-イソプロピリデン-β-D-ガラクトピラノシル）-β-D-グルコピラノシド（K.Janssonら、J.Org.Chem.(1988)53:562 9-5647;6.6g、13.75mmol）を乾燥ピリジン(120mL)に溶解した。この混合物を-45 ℃まで冷却し、そして塩化ベンゾイル（9.07mL、77.4mMo1.）を滴下しながら撹拌し、そして-45℃で４時間撹拌し続けた。 T.I.c（8.5:1.5トルエン−酢酸エチル）により、出発アセタールよりも移動が速い主生成物の存在が明らかになった。少量の、さらに移動が速い生成物（ペンタベンゾエート）も、t.I.c.により明らかになった。この混合物を、氷水に注ぎ、そしてジクロロメタンを用いて抽出した。このジクロロメタン溶液を、引き続いて、水、NaHCO₃水溶液、および水で洗浄し、乾燥（Na₂SO₄）し、そして濃縮した。濃縮物を、9:1トルエン−酢酸エチルを溶出液とするシリカゲルカラムにかけて、そして固体を得、これをメタノールから結晶化して7a（5.2g、42.3％）を得、［α］_D＋17.5（c,1.1、クロロホルム）であ実施例２ベンジル2,6-ジ-O-ベンゾイル-4-O-（2,6-ジ-O-ベンゾイル-3,4-O-イソプロピリデン-β-D-ガラクトピラノシル）-β-D -グルコピラノシド（7b）の調製撹拌しそして冷却（-45℃）した、ベンジル4-O-(3,4-O-イソプロピリデン- β-D-ガラクトピラノシル）-β-D-グルコピラノシド（5g、10.6mmol;D.Beith-Ha lahmiら、Carbohydr.Res.(1967)5:25）の乾燥ピリジン(120mL)溶液を、塩化ベンゾイル（6mL、51.8mmol）を滴下して処理し、そして-45℃で４時間撹拌し続けた。T.l.c(8.5:1.5トルエン−酢酸エチル）により、出発アセタールよりも移動の速い主生成物の存在が明らかになった。少量の、さらに移動の速い生成物（ペンタベンゾエート）も、t.l.c.により明らかになった。この混合物を、氷水に注ぎ、そしてジクロロメタンを用いて抽出した。このジクロロメタン溶液を、引き続いて、水、NaHCO₃水溶液、および水で洗浄し、乾燥（Na₂SO₄）し、そして濃縮した。次いで、濃縮物を、シリカゲルカラムにかけ、9:1トルエン−酢酸エチルを用いて溶出した。濃縮で、主生成物に対応する画分は、固体残渣を与え、これを熱メタノールから結晶化して7b (5.53g、59％）を得た； m.p.159〜161℃；［α］_D-4.2°（c,1.3、クロロホルム）。実施例３ベンジル2,6-ジ-O-ベンゾイル-3-O-（2,3,4-トリ-O-ベンジル-α-L-フコピラノシル）-4-O-(2,6-ジ-O-ベンゾイル-3,4- O-イソプロピリデン-β-D-ガラクトピラノシル）-β-D-グルコピラノシド（9b）の調製湿気から保護した5:1ジクロロエタン-N,N-ジメチルホルムアミド（120mL）中の、化合物7b（4g、4.5mmoI）、メチル2,3,4-トリ-O-ベンジル-1-チオ-α-L-フコピラノシド8(3.6g、7.75mmol）、および粉末状4Aモレキュラーシーブ（10g）の混合物を室温で２時間撹拌した。臭化第二銅（2g、9mmo1）および臭化テトラブチルアンモニウム（0.29g、0.9mmol）を添加し、そして、室温で35時間撹拌し続けた。さらにドナー８（1.2g、2.6mmol、5:1ジクロロエタン-N,N-ジメチルホルムアミド14.4mL中）、臭化第二銅（0.67g、0.3mmol）、およびモレキュラーシーブ4A(2 g)を添加し、そして室温で16時間撹拌し続けた。次いで、T.l.c(9:1 トルエン −酢酸エチル）により、7bよりも移動の速い主生成物の存在が示された；痕跡量の未変化の7bも、t.l.c.により明らかになった。この混合物を濾過し（Celite床）、そして固体をクロロホルムで徹底的に洗浄した。濾液および洗浄液を合わせ、そしてNaHCO₃水溶液および水を用いて洗浄し、乾燥し、そして濃縮した。残渣をシリカゲルカラムにかけ、そして9.5:0.5 トルエン−酢酸エチルを用いて溶出した。主生成物に対応する画分の濃縮により固体が得られ、これをエーテルから結晶化して9b(3.68g、76％）を得た。これは、反応した7bに基づいていた。化合物9bは、m.p.180〜181℃；［α］ _D -８゜（c,1.1、クロロホルム）を有していた。実施例４ 2-（トリメチルシリル）エチル2,6-ジ-O-ベンゾイル-3-O-（2,3,4-トリ-O-ベンジル-α-L-フコピラノシル）-4-O-(2,6-ジ-O-ベンゾイル-3,4-O-イソプロピリデン-β-D-ガラクトピラノシル）-β-D-グルコピラノシド（9a）の調製湿気から保護された5:1ジクロロエタン-N,N-ジメチルホルムアミド（135mL）中の、化合物7a(5.2g、5.78mmol）、化合物８(4.68g、10.17mmol）、および粉末状4Aモレキュラーシーブ(6g)の混合物を室温で２時間撹拌した。臭化第二銅(2.6 g、11.7mmol）および臭化テトラブチルアンモニウム（3.77g、11.7mmol）を添加し、そして室温で合計48時間撹拌し続け、24時間後に追加量の８（2.34g、5.09m mo1、5:1ジクロロエタン−N,N-ジメチルホルムアミド60mL中）、臭化第二銅（1. 3g、5.85mmol）、臭化テトラブチルアンモニウム（1.9g、5.85mmol）、および4A モレキュラーシーブ（3g）を添加した。T.l.c（9:1 トルエン−酢酸エチル）により、7aよりも移動の速い主生成物の存在が明らかになり、いくらかの未反応の7aもt.1.c.により明らかになった。7b（9bを与えた）について記載したように処理した後、カラムクロマトグラフィーにかけ、非結晶性固体として化合物9a（6.7g、88％）を得た；陽イオンLSIMS：1442.6 （M+Na）⁺、1340.8（M-NaS0₃）⁺、陰イオンLSIMS：1396.2（M-Na）^-。実施例５ベンジル2,6-ジ-0-ベンゾイル-3-0-（2,3,4-トリ-0-ベンジル-α-L-フコピラノシル）-4-0-（2,6-ジ-0-ベンゾイル-β-D-ガラクトピラノシル）-β-D-グルコピラノシド（10b）の調製 70％酢酸水溶液（600mL）中の化合物９ｂ（1.0g）を、85〜90℃で撹拌し、t.l .c.（4:1トルエン−酢酸エチル）により反応の進行をモニターした。2.5時間後、出発アセタール9bのほとんどは、移動のより遅い生成物に変換された。T.l.c. により、α-L-フコシル結合の幾分かの開裂も示された。これは、２種の副生成物の存在によって証拠づけられ、これらのうち一方は、生成物（トリベンジルフコース）よりも移動が速く、そして他方は、硝酸化がより遅い（二糖生成物）。酢酸を減圧下で（〜40℃）蒸発させ、最終痕跡量を、幾分か添加したトルエンとの共蒸発により除去した。このようにして得た残渣を、溶離液として9:1トルエン−酢酸エチルを用いて、シリカゲルカラムで精製し、非結晶性固体として10b （0.6g、61.8％）を得た。実施例６ 2-（トリメチルシリル）エチル2,6-ジ-0-ベンゾイル-3-0-（2,3,4-トリ-0-ベンジル-α-L-フコピラノシル）-4-0-（2,6-ジ-0-ベンゾイル-β-D-ガラクトピラノシル）-β-D-グルコピラノシド（10a）の調製化合物9a（3g、2.3mmo1）を70％酢酸水溶液（300mL）中に取り、そして混合物を85〜90（バス）で撹拌しながら２時間加熱した。T.l.c.（4:1トルエン−酢酸エチル）により、10bに相当するクロマトグラフィー移動度を有する主生成物の存在が示された。9b（10bを与えた）について記載したように処理し、次いでカラムクロマトグラフィーにかけることにより、非結晶性固体として三糖ジオール 10a（2.3g、79％）を得た；［α］_D-20.6 実施例７ベンジル2,6-ジ-0-ベンゾイル-4-0-（4-0-アセチル-2,6-ジ-0-ベンゾイル-β-D- ガラクトピラノシル）-3-0-（2,3,4-トリ-0-ベンジル-α-L-フコピラノシル）- β-D-ルコピラノシド（llb）の調製化合物10b（0.56g）を、4-トルエンスルホン酸（0.15g）を含有する、ベンゼン（30mL）とトリエチルオルト酢酸（30mL）との混合物に溶解し、そしてこの混合物を室温で１時間撹拌した。酸を少量のトリエチルアミンで中和し、そしてこの混合物を蒸発乾固した。次いで、これを80％酢酸水溶液（50mL）に取り、そして室温で40分間撹拌した。T.l.c.（4:1トルエン−酢酸エチル）により、ジオール10bよりも移動の速い主生成物の存在が示された。酢酸を減圧下で除去し、そして少量のトルエンを添加し、そして残渣から蒸発して、非結晶性固体としてll b（0.56g、96.6％）を得、［α］_D-14.3°（c,1.1、クロロホルム）であった。実施例８ 2-（トリメチルシリル）エチル2,6-ジ-0-ベンゾイル-4-0-（4-0-アセチル-2,6- ジ-0-ベンゾイル-β-D-ガラクトピラノシル）-3-0-（2,3,4-トリ-0-ベンジル-α -L-フコピラノシル）--D-ガラクトピラノシド（lla）の調製化合物10a（1.87g）の、4-トルエンスルホン酸（0.25g）を含有するベンゼン（50mL）とトリエチルオルト酢酸（50mL）との混合物溶液を、室温で１時間撹拌した。次いで、酸を数滴のトリエチルアミンで中和し、そしてこの混合物を蒸発乾固した。残渣を80％酢酸水溶液（100mL）と混合し、そしてこの混合物を室温で40分間撹拌した。10b（llbを与えた）について記載したように処理して、標記の化合物lla（1.86g、89％）を得た；白色の非結晶性固体；［α］_D-2.7゜（c,l .l、クロロホルム）。実施例９ベンジル2,6-ジ-0-ベンゾイル-3-0-（2,3,4-トリ-0-ベンジル-α-L-フコピラノシル）-4-0-（ソジウム4-0-アセチル-2,6-ジ-0-ベンゾイル-β-D-ガラクトピラノシル3-スルフェート） -β-D-グルコピラノシド（12b）の調製乾燥ピリジン（50mL）中の、化合物llb（0.6g、0.46mmo1）および三酸化イオウ−ピリジン複合体（0.6g、6.3mmol）の混合物を、55〜60℃（バス）で２時間撹拌し、次いで室温で16時間撹拌した。T.l.c.（6:1クロロホルム−メタノール）は、llbの消失および移動のより遅い単一の生成物の存在を示した。メタノール（５mL）を添加し、そしてこの混合物を15分間撹拌し（過剰の試薬を分解し）た。次いで、これを濃縮し、そして10:1、次いで6:1のクロロホルム−メタノールを用いた溶離により、シリカゲルカラムで精製した。濃縮で、生成物に対応する画分は、固休残渣を与え、これを1:1クロロホルム−メタノール（30mL）に溶解し、そしてAmberlite IR 120（Na⁺）カチオン交換樹脂を用いて処理し、そして混合物を室温で１時間撹拌した。次いでこれを濾過し、そして蒸発乾固して、非結晶性固体として12b（0.58G、89％）を与えた：［α］_D-5.1°（c,1.8、1:1 クロロホルム−メタノール）：陽イオンLSIMS：1433（M+Na）⁺、1411.1（M+H）⁺ 、陰イオンLSIMS：1563.9（M+mNBA）^-、1386.7（M-Na）^-。実施例１０ 2-（トリメチルシリル）エチル2,6-ジ-0-ベンゾイル-3-0-（2,3,4-トリ-0-ベンジル-α-L-フコピラノシル）-4-0-（ソジウム4-0-アセチル-2,6-ジ-0-ベンゾイル-β-D-ガラクトピラノシル 3-スルフェート）-β-D-グルコピラノシド（12a）の調製乾燥ピリジン（25mL）中の、化合物lla（0.45g、0.39mmol）および三酸化イオウ−ピリジン複合体（0.45g、4.7mmol）の混合物を、55〜60℃で２時間撹拌し、次いで、室温で１晩撹拌した。上記と同様の方法で処理および精製した後、非結晶性固体として化合物12a（0.46g、95.8％）を得た；［α］_D+2.2°（c,1.5、1: 1クロロホルム−メタノール）；陽イオンLSIMS：１442.6（M+Na）⁺、1341.1（M+ NaS0₃）^-、陰イオンLSIMS：1395.5（M-Na）^-。実施例11 0-α-L-フコピラノシル-（1→3）-0-［ソジウム β-D-ガラクトピラノシル3-スルフェート-（1→4）］-D-グルコピラノース（13b）の調製触媒量のナトリウムメトキシドを含有するメタノール（50mL）中の化合物12b （0.58g）を、45〜50で１晩撹拌した。T.l.c.（13:6:1クロロホルム−メタノール−水）は、移動のより遅い単一の生成物の存在を示した。室温まで冷却した後、この混合物が中性になるまで（pH試験紙）、Amberlite IR 120（H⁺）カチオン交換樹脂を添加した。次いで、この混合物を、Amberlite IR 120（Na⁺）カチオン交換樹脂を含むフラスコ中に直接濾過し、そして混合物を45分間撹拌した。次いで、これを濃縮し、そしてヘキサン−エーテル混合物で繰り返し抽出して安息香酸メチルを除去した。そのようにして得られた、部分的に保護された中間体（ 0.38g）は、充分に純粋てあり、次工程で直接用いた；陰イオンLSIMS：928.1（M-Na）^-。一部分（0.35g）を、さらに精製せずに、パラジウム炭素10％（0.35g）を含有する、80％メタノール水溶液（3 0mL）に加えた。この混合物を、室温で１晩、H₂のわずかな過圧下で撹拌した。このときt.1.c.（5:4:1または13:6:1クロロホルム−メタノール−水）は、移動のより遅い生成物の存在を、痕跡量の、移動のより速い数種の夾雑物（恐らく、不完全な加水分解による）と共に示した。この混合物を、直接、Amberlite IR 1 20（Na⁺）カチオン交換樹脂上に濾過し（Celite床）、そして固体をメタノール水溶液で徹底的に洗浄した。樹脂と共に１時間撹拌した後、混合物を濾過し、そして濃縮して小容量にし、これをシリカゲルカラムにかけ、そして5:4:1クロロホルム−メタノール−水を用いて溶出した。生成物に対応する画分をプールし、濃縮して小容量にし、そしてAmberlite IR 120（Na⁺）カチオン交換樹脂を用いて処理した。樹脂を濾去し、そして水で洗浄し、そして濾液および洗浄液を合わせて、再濾過し（0.2μM酢酸セルロースシリンジフィルター）、そして凍結乾燥して13bを得た（183mg、84.3％；［α］_D-20.5°（c,0.6、水）。実施例１２ 2-（トリメチルシリル）エチル0-α-L-フコピラノシルー（1→3）-0-［ソジウム β-D-ガラクトピラノシル3-スルフェート-（1→4）］-β-D-グルコピラノシド（13a）の調製化合物12a（0.45g）を、正確に10について記載した通りにして、メタノール性ナトリウムメトキシド（50ml）中て0-脱アセチル化し、対応する、部分的にベンジル化された中間体（0.29g）を得た。この中間体は、陽イオンLSIMS：983.9（M +Na）⁺、882.1（M-NaS0₃）、陰イオンLSIMS：938.0（M-Na）^-を示した。この化合物（0.24g）を、さらに精製せずに、80％メタノール水溶液（30mL）中、パラジウム炭素10％（0.24g）の存在下で、触媒的加水分解に供し、次いで上記と類似の方法で処理して、白色の綿毛状物質として化合物13a（125mg、 72.7％）を与えた；実施例１３多価リガンド、N,6N,6N'トリス（20）Lys-Tyr-Lysの調製実施例12で調製した化合物13aまたは13bを、ペプチドLys-Tyr-Lysに誘導体化して、ペプチドの２つのε-アミノリジン基およびα-アミノＮ末端において誘導体化された、３価の複合体を得る。この３価の化合物を得るために、100mMの炭酸ナトリウム（pH9）中の2mMのペプチドLys-Tyr-Lys 50μｌ（100 nmol）を、200mMの20 5μｌ（1mmol）を含む小さいエッペンドルフチューブに入れ、そして試料を約30分間スピードバック（SpeedVac）中て蒸発乾固する。蒸発乾固後、100mMの炭酸ナトリウム（pH9）中の800mMのNaCN・BH₃ 50μｌ（再結晶化、40μmol）を添加し、そして混合物を55℃で48時間インキュベートする。インキュベートして得られた混合物を、GPCペプチドHPLCサイジングカラムにかけて、画分を収集し、そしてBCAタンパク質アッセイによってタンパク質含量をアッセイする。タンパク質含有画分をプールし、凍結乾燥し、そして質量分析を行う。結果は、化合物13aまたは13bを１、２、または３個含む、誘導体化されたペプチドの生成を示す。この３価誘導体は、Lee,R.ら、Biochem（1984） 23:4255に記載のように行ったアッセイにおいて、肝細胞に対するラクトースの結合を阻害することに、特に効果的である。実施例14 ラクトース誘導体のセレクチンリガンド特性化合物13aまたは13bを、ＥおよびＬセレクチンに結合する能力について試験した。用いたELISAアッセイは、ウェル当たり25ピコモルの2,3 sLex糖脂質を、マイクロタイターウェル上にエバポレートし、次いで過剰分を水で洗浄することからなる。ウェルを、５％のＢＳＡを用いて室温で１時間ブロックし、次いで１mM のCaを含有するPBSで洗浄する。プレートがブロックされている間に、１％BSA-PBS（１mM Ca）て1:1500に希釈した、ビオチン標識ヤギＦ（ab'）₂IgG（Fc特異性）およびストレプトアビジン−アルカリ性ホスファターゼを、200ng/mLでE-またはL-セレクチン-IgGキメラ（L9I-10）と結合させ、37℃で15分間インキュベートして複合体を形成させる。これにより、可溶性「多価」レセプターが与えられる。化合物13aおよび13bを、1.5〜5.0mMの範囲の最終濃度で可溶性レセプターに添加し、そして37℃で45分間反応させた。次いで、この溶液を、ブロックした後洗浄しておいたマイクロタイターウェルに入れ、そしてプレートを37℃で45分間インキュベートして、可溶性レセプターを既知の天然リガンド、2,3 sLex糖脂質に結合させた。陽性コントロールは、マイクロタイターウェルにエバポレートされたリガンドのみと反応した、可溶性「多価性」レセプターにより生成されたシグナルであった。これを「100％結合」とみなした。それ以前にインヒビターと反応したレセプターによって生成されたシグナルは、陽性コントロールにより生成されたシグナルで割り、100を掛けてインヒビター存在下で結合したレセプター％を計算した。この反数が、阻害率％である。化合物13aおよび13bが両方とも、Ｅセレクチンの2,3 sLex糖脂質への結合を阻害することは、表１から明らかである。試験した３つの濃度にわたって、13bはより良好なインヒビターであり、最大の差異は明らかに濃度５mMであった。13a の48％に比較して、この濃度では、13bは、82.5％の阻害率を示した。化合物13aおよび13bが両方とも、Ｌセレクチンの2,3 sLex糖脂質への結合を阻害することは、表２から明らかである。しかし、この場合の差異は、Ｅセレクチンへの結合の阻害率％における差異よりもかなり大きかった。例えば、1.25mMで、13bは、驚くべきことに90％の阻害率を示した。２mMおよび５mMで100％の阻害率が観測された。顕著に対照的に、13bは、1.25mMでたった13％の阻害率および5 mMで47％の最大阻害率を示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者エイサ，ダーウィンアメリカ合衆国ミシガン 49053，ゲールスバーグ，サウス 35ティーエイチストリート 3608 (72)発明者ムッサー，ジョンエイチ. アメリカ合衆国カリフォルニア 94804, サンカルロス，マイケルコート 23 (72)発明者ナッシュド，ミナアメリカ合衆国カリフォルニア 94501, アラメダ，ナンバー３，セントラルアベニュー 600

Claims

【特許請求の範囲】１．下式の化合物：ここで、R¹は、それぞれ独立して、Hまたは低級アルキル(1-4C)であり； R²は、H、低級アルキル(1-4C)、アルキルアリール、あるいは１つまたはそれ以上の他の糖残基であり； R³は、SO₄ ^--、PO₄ ^--を含む、負に荷電した部分であり； Yは、H、OH、または低級アルキル(1-4C)であり；そして Xは、-CHR⁴(CHOR¹)₂CHR⁵OR¹である：ここで、R⁴およびR⁵は、それぞれ独立して、H、低級アルキル(1-4C)、あるいは、一緒になって、O、S、およびNR¹からなる群から選択されるヘテロ原子を随意に含む、５員環または６員環を形成し；該５員環または６員環は、R¹、CH₂OR¹、OR¹、OOCR¹、NR¹ ₂、NHCOR¹、およびSR¹ からなる群より選択される１種の置換基で随意に置換され、Xが、ヘキソース置換基を表すときは、R⁴およびR⁵は一緒になっても、ヘキソース置換基になり得ない、化合物。２．すべてのR¹がHである、請求項１に記載の化合物。３．R²がHである、請求項１に記載の化合物。４．YがHまたはOHである、請求項１に記載の化合物。５．Xが、-CH₂(CHOH)₃H、2,3,4-トリヒドロキシベンゾイルであるか、あるいは、Xが、3,4,5-トリヒドロキシピラン-2-イル、3,4,5-トリメトキシピラン-2- イル、3,4,5-トリヒドロキシフラン-2-イル、または3,4,5-トリメトキシフラン- 2-イルである、請求項１に記載の化合物。６．R⁴およびR⁵のうち一方がHであり、そして他方がH、低級アルキル(1-4C)またはフェニルである、請求項１に記載の化合物。７．前記アルキルがメチルである、請求項６に記載の化合物。８．R⁴およびR⁵が共にHである、請求項６に記載の化合物。９．R⁴およびR⁵が一緒になった場合、3,4,5-トリヒドロキシピラン-2-イル、3 ,4,5-トリメトキシピラン-2-イル、3,4,5-トリヒドロキシフラン-2-イル、または3,4,5-トリメトキシフラン-2-イルである、請求項１に記載の化合物。 10．すべてのR¹がHであり、R2がHであり、R³がSO4^--を含み、そしてXがフコシル残基である、請求項１に記載の化合物。 11．ラクトース誘導体を合成する方法であって、下式の化合物を接触させることを包含する、方法：ここで、R⁶は、それぞれ独立して、H、低級アルキル(1-4C)、または保護基であり；ここで、Y¹は、H、OH、OR⁷OOCR⁷、またはSR⁷であり；ここで、少なくとも１つのR⁶は、置換されるべき位置にあり、そして、多くても１つの近接したR⁶はHであり、そしてその他の全てのR⁶は保護基であり； R⁷は保護基であり；生成物を得るための求電子試薬供与部分を有し、ここで該求電子試薬は、置換されるべき位置で、OHのHに対して置換される。 12．前記式の化合物が、以下の群より選択される化合物である、請求項11に記載の方法：ベンジル6-0-ベンゾイル-3-0-(2,3,4-トリ-0-ベンジル-α-L-フコピラノシル) -4-0-(6-0-ベンゾイル-β-D-ガラクトピラノシル)-β-D-グルコピラノシド；ベンジル6-0-ベンゾイル-3-0-(2,3,4-トリ-0-ベンジル-α-L-フコピラノシル) -4-0-(6-0-ベンゾイル-3,4-0-イソプロピリデンβ-D-ガラクトピラノシル)-β-D -グルコピラノシド；ベンジル3-0-(2,3,-トリ-0-ベンジル-α-L-フコピラノシル)-4-0-(3,4-0-イソプロピリデン-β-D-ガラクトピラノシル)-β-D-グルコピラノシド；ベンジル2,6-ジ-0-ベンゾイル-3-0-(2,3,4-トリ-0-ベンジル-α-L-フコピラノシル)-4-0-(2,6-ジ-0-ベンゾイル-3,4-0-イソプロピリデン-β-D-ガラクトピラノシル)-β-D-グルコピラノシド；ベンジル2,6-ジ-0-ベンゾイル-4-0-(2,6-ジ-0-ベンゾイル-3,4-0-イソプロピリデン-β-D-ガラクトピラノシル)-β-D-グルコピラノシド； 2-(トリメチルシリル)エチル3-0-(2,3,4-トリ-0-ベンジル-L-フコピラノシル) -4-0-(2,6-ジ-0-ベンゾイル-β-D-ガラクトピラノシル)-2,6-ジ-0-ベンゾイル- β-D-グルコピラノシド；およびベンジル0-(2,3,4-トリ-0-ベンジル-α-L-フコピラノシル)-(1-3-[0-(2,6-ジ- 0-ベンゾイル-3,4-0-イソプロピリデン-β-D-ガラクトピラノシル)-(1-4)]-2,6- ジ-0-ベンゾイル-β-D-グルコピラノシド。