JPH08325286A - 細胞接着のインヒビターとしての新規複合炭水化物 - Google Patents

細胞接着のインヒビターとしての新規複合炭水化物

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JPH08325286A
JPH08325286A JP7261763A JP26176395A JPH08325286A JP H08325286 A JPH08325286 A JP H08325286A JP 7261763 A JP7261763 A JP 7261763A JP 26176395 A JP26176395 A JP 26176395A JP H08325286 A JPH08325286 A JP H08325286A
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ゲールハルト・クレツチユマル
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Ulrich Sprengard
ウルリツヒ・シユプレンガルト
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Dirk Dr Seiffge
デイルク・ザイフゲ
Horst Kunz
ホルスト・クンツ
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 低分子量の炭水化物受容体ブロッカーの提
供。 【解決手段】 式Ｉ Ｚ−Ｙ−(ＣＨ2)n−〔ＮＨ(ＣＯ)〕p−Ｒ2 Ｉ 〔式中、Ｚは、分岐型四糖であり，Ｙは、酸素またはＮ
Ｈ(ＣＯ)であり、Ｒ2は、アミノ酸もしくは６個までの
アミノ酸のオリゴペプチド残基、脂肪族もしくは脂環式
単位から形成される親油性残基、脂肪族および異項環単
位の組合せまたはトリフェニルメタン染料であり、Ｙが
酸素である場合には、ｐは１であり、ｎは２〜１０の整
数であり、ＹがＮＨ(ＣＯ)でｐが０の場合にはｎは０〜
１０の整数であり、ＹがＮＨ(ＣＯ)でｐが１の場合には
ｎは１〜１０の整数である〕の化合物である。新規な複
合体は天然のリガンドよりもＥ−およびＰ−セレクチン
に強く結合し、過剰な細胞−細胞接着による疾患の予
防、治療および診断に使用できる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細胞接着のインヒ
ビターとして改良された活性を有する四糖の新規な複合
体、好ましくはシアリル−ルイスＸ（ＳＬｅＸ）および
シアリル−ルイスＡ（ＳＬｅＡ）の複合体、これらの化
合物の製造方法、薬理学的活性化合物としておよび診断
薬としてのそれらの使用、ならびにこれらの複合体を含
有する医薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】血液細胞たとえば白血球、好中球、顆粒
球および単球の循環は、分子レベルにおける多段階の極
めて複雑な過程によって行われるが、それは、個々の工
程がわかっているにすぎない（総説：T.A.Springer, Ce
ll 76, 301-314, 1994）。
【０００３】最も最近の研究結果によれば、免疫監視に
重要なリンパ球の再循環と炎症病巣における好中球およ
び単球の集積は極めて類似した分子機構に応答すること
が明らかにされた。すなわち、急性および慢性の炎症過
程においては、白血球の内皮細胞への接着ならびに炎症
病巣および二次リンパ系臓器への遊走が起こる。
【０００４】この過程には、多くの特異的なシグナル分
子、たとえばインターロイキン、ロイコトリエンおよび
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、それらのＧタンパク質に連結
した受容体、ならびに免疫細胞および内皮細胞の特異的
に制御された認識を保証するとくに組織特異的な細胞接
着分子が関与している。この過程に関与する最も重要
な、以下の記述では受容体と呼ぶ接着分子には、セレク
チン（Ｅ−、Ｐ−およびＬ−セレクチン）、インテグリ
ンおよび免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー
が包含される。
【０００５】３種のセレクチン受容体が白血球接着の開
始相を決定する。Ｅ−セレクチンはたとえばインターロ
イキン−１（ＩＬ−１）もしくは腫瘍壊死因子α（ＴＮ
Ｆ−α）による刺激を与えた数時間後に内皮細胞上に発
現し、一方、Ｐ−セレクチンは血小板および内皮細胞に
保存され、トロンビン、過酸化物ラジカルまたはとくに
サブスタンスＰによる刺激後に細胞表面上に提示され
る。Ｌ−セレクチンは絶えず白血球上に発現されてい
る。
【０００６】今日では一般的に、糖スフィンゴ脂質およ
び糖タンパク質の部分構造として細胞膜上に生じる四糖
シアリル−ルイスＸ（ＳＬｅＸ）およびシアリル−ルイ
スＡ（ＳＬｅＡ）が３種すべてのセレクチン受容体のリ
ガンドとして機能できることが認められている（総説：
A．Giannis, Angew．Chem. 106: 188, 1994）。
【化１１】
【０００７】位置異性化合物シアリル−ルイスＡはＸ型
に極めて類似し、匹敵するアフィニティーでセレクチン
受容体に結合する。Ａ型は中央のＮ−アセチルグルコサ
ミン単位上の「側鎖」の単純な交換によってＸ型から生
じる。
【化１２】
【０００８】多くの急性および慢性の疾患の経過は白血
球の冒された組織への過剰な接着およびそれらの浸潤に
よって悪影響を受ける。これらの疾患にはたとえば、リ
ウマチ、心筋虚血／梗塞（ＭＩ）のような再循環傷害、
手術による侵襲、外傷性ショックおよび卒中後の急性肺
炎、乾癬、皮膚炎、ＡＲＤＳ（成人呼吸窮迫症候群）な
らびに外科的侵襲（たとえば血管形成術）後に生じる再
狭窄がある。
【０００９】したがって、極めて有望な治療開始点は、
様々な投与形態での四糖ＳＬｅＸ／Ａまたはそれらのア
ンタゴニストとしての修飾構造を有する類似物質の使
用、すなわち、過剰な白血球の接着の調節または抑制の
ためおよび上記疾患の緩和または治療のためのそれらの
使用にある。
【００１０】ＳＬｅＸの構造を有する天然リガンドはす
でに動物実験において、Ｐ−セレクチン依存性肺傷害
（M.S.Mulliganら，Nature 1993, 364, 149）、および
心筋再循環傷害（M.Buerkeら，J．Clin．Invest. 1994,
93, 1140）に用いられ成功している。急性の肺炎に対
する最初の臨床試験では、その化合物を、患者あたり１
日に１〜２ｇの用量で投与する必要があった〔The 2nd
Glycotechnology Meeting/CHI in La Jolla/USA, 1994
年5月16〜18日におけるCytel Corp./La Jolla(CA.)の情
報〕。活性化合物のこの高い用量は，既に知られている
セレクチン受容体に対する天然のＳＬｅＸ／Ａリガンド
の弱い親和性と一致する。すなわちＳＬｅＸは、すべて
の既知のインビトロ試験システムにおいて、セレクチン
受容体への細胞接着を、ＩＣ50＝１〜３mMの範囲の比較
的高い濃度でのみ阻害する。
【００１１】一方、一部の論文には、リガンドの構造的
改変によってさらに強力に結合するアンタゴニストを得
る努力が報告されている。しかしながら、現在までに、
フコースおよびノイラミン酸単位の改変は構造活性相関
に重要と考えられていた（B.K.Brandleyら、Glycobiolo
gy 1993, 3, 633およびM.Yoshidaら、GlycoconjugateJ.
1993, 10, 3）が、阻害値の有意な改善は達成されなか
った。グルコサミン単位の改変でのみ（ＧｌｃＮＡｃの
グルコースによる置換ならびにＧｌｃＮＡｃの２位にお
けるアジドおよびアミノ基置換）、Ｅ−セレクチン受容
体に対するアフィニティーの有意な上昇が達成できた。
全く新たな合成によって製造できるこれらの化合物のＩ
Ｃ50データは、ＨＬ−６０およびＵ−９３７細胞のＥ−
セレクチンとの接着の阻害に関して0.12mM（ＳＬｅＸの
場合の1.2〜2.0mMに対して）である。しかしながら、欠
点は、＞５mMでのＬ−およびＰ−セレクチンへの結合が
著しく損なわれることである（Dasguptaら、5/94のLa J
ollaにおける会議でのGlycomed Inc.の発表）。
【００１２】天然の生理学的条件を逆転させて、可溶性
の受容体構築体、Ｅ−セレクチン−ＩｇＧ（内皮細胞上
での自然の状況に匹敵すると思われる固定化型での相当
する受容体構築体に代えて）が固定化リガンドに結合し
て潜在的なインヒビターにより置換される他のインビト
ロ試験システム、すなわちＥ−セレクチン−ＩｇＧ／固
定化ＢＳＡ−ＳＬｅＡシステムでは、２位が脱アシル化
されたＮ−アセチルグルコサミンを有するリガンドにつ
いて３６倍高いアフィニティーが見出された。
【００１３】この人工的試験システムとインビボ条件す
なわち、天然のリガンドＳＬｅＸ／Ａを発現する細胞の
接着の阻害との類似性の限界は別にしても、この結果は
Ｐ−セレクチン受容体に対して約１mMのインヒビター濃
度で弱い阻害作用しか認められなかった（R.M.Nelson
ら、J.Clin．Invest. 1993, 91, 1157）ことからＥ−セ
レクチン受容体に限定して考慮されるべきである。
【００１４】修飾されたＳＬｅＸ／Ａ構造のセレクチン
への結合アフィニティーに関する先行技術は、Pharmaco
chem．Libr. 1993, 20（Trends in Drug Research）33-
40頁に言及されている。
【００１５】ラクトースおよびラクトサミン基本構造か
ら主として誘導され、とくにセレクチンアンタゴニスト
として使用できる可能性があるＳＬｅＸ／Ａ構造型の修
飾リガンドが、いくつかの特許出願特に国際特許公報、 WO 91/19501、WO 91/19502、 WO 92/02527、 WO 93/10796、 WO 94/00477、 WO 92/18610、WO 92/09293、 WO 92/07572、 WO 92/16640、 WO 92/19632、 WO 93/17033、WO 93/23031、 WO 92/22301、 WO 92/22563、 WO 92/22564、 WO 92/22565、WO 92/22661、 WO 92/22662、 WO 93/24505、 WO 93/24506 に記載されている。
【００１６】Ｅ−セレクチンおよびＰ−セレクチン受容
体に対してインビトロで明らかに改善されたアフィニテ
ィーを有するＳＬｅＸ／Ａ誘導体または類似体はまだ報
告されていない。しかしながら、注目すべきことは、多
価リガンドが１価のリガンドに比べて高い結合アフィニ
ティーを有することである。たとえば、酵素的に製造さ
れた複合九糖は、多分２価のリガンドとして、モノマー
のＳＬｅＸリガンドよりも５倍強く（ＩＣ50＝０.４m
M）Ｅ−セレクチンに結合する。しかし、さらに厳密に
解析すれば、この値は説得力のある多価効果を示すもで
はないといえる。リガンドあたりで計算されたＩＣ50値
が実際にわずか０.８mMであることを考慮すると、有意
な改善は現実には達成されてはいなかったのである（S.
A.DeFreesら、J．Am．Chem．Soc. 1993, 115, 7549）。
【００１７】ＳＬｅＸ／Ａリガンドの多重提示のさらに
他の可能性としては、(共)重合可能な側鎖の導入あるい
は適当なＳＬｅＸ前駆体の多重官能性ポリマーへの結合
がある。第一の変法では、人工的ポリマー接合体たとえ
ばポリアクリルアミドに到達するが、これらは生理学的
に非許容性のために医薬としては不適当である。文献で
はこの操作がルイスＸ三糖のポリアクリルアミド接合体
について報告されている（S.-I.Nishimuraら、Macromol
ecules 1994, 27, 157）。この方法はＳＬｅＸ、ＳＬｅ
Ａまたシアル酸が硫酸で置換された類縁体にも適用でき
る（E.Nifantev, Glycotechnology Meeting in La Joll
a, 1994 年5月16〜18日における講演)。
【００１８】ＳＬｅＸ誘導体を反応性ポリマーと反応さ
せて、多重官能性、生物適合性かつ生理学的許容性を有
するポリマー接合体を与える第二の変法は、ＥＰ ０ ６
０１４１７に記載されている。この公報には、炭水化物
ポリマー接合体に関する先行技術の詳細についても言及
されている。
【００１９】これらの炭水化物ポリマー接合体の医薬と
しての利用に際しての固有の欠点はこのタイプの活性化
合物の重合性にある。すなわち、各合成バッチ毎に分子
量分布が異なりポリマーに結合した炭水化物リガンドの
コーティング密度が変動する新しいタイプの生成物が得
られることである。
【００２０】ＷＯ ９４／００４７7には、遊離のオリゴ
糖として存在する構造タイプ（１）のリガンド（すなわ
ちＲ1＝ＯＨ）のペプチドまたはタンパク質とのオキシ
ム付加物の還元アミノ化による多価化合物の製造が提案
されている。しかしながら、この方法には、ＳＬｅＸリ
ガンドが還元末端における第一の炭水化物単位（Ｇｌｃ
ＮＡｃまたはＧｌｃ）の環の開裂によって著しく修飾さ
れるという重大な欠点がある。さらに、ポリマー接合体
に関して述べたように、不正確な定義しかできない、特
徴を特定し得ない混合物が予想されることである。これ
は、ＷＯ ９４／００４７７に仮定として記載された例
の中で明白に示されている。すなわち、１０,０００倍
過剰（１ミリモル）の有用なオリゴ糖を用い、分析規模
の０.１マイクロモルのＬｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓトリペ
プチドでのトリペプチドＬｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓへのカ
ップリングが提案されている。分析的な分離過程の実施
後、１、２および３価の炭水化物複合体が予期されるこ
とにより、質量スペクトルを用いた分析の可能性が述べ
られているのである。
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】したがって、明確な実
験式と特定の分子量を有し、受容体アフィニティーが明
らかに高い低分子化合物が望まれる。特に以上述べたす
べての要求に合致ししかも効率的な合成方法により製造
規模（グラム単位）で製造できる化合物が望ましい。
【００２２】本発明の目的は、低分子量の炭水化物受容
体ブロッカー、それらの簡単な製造方法、および以上で
述べた要求に合致するこれらから製造される医薬を提供
することにある。
【００２３】この目的は本発明によれば、好ましくはＳ
ＬｅＸ／Ａ構造によりモノおよびトリ官能性前駆体に対
して数工程、高収率で実施できるオリゴ糖の簡単なカッ
プリングによって達成され、新規な複合炭水化物が得ら
れる。有用なオリゴ糖成分は化学量論的にまたは活性基
あたり１〜10モル％の小過剰を、好ましくは非保護の形
態で使用できる。
【００２４】驚くべきことに、本発明による３価の複合
炭水化物の合成経路では、２価の副生成物が少量形成す
るのみで、それは所望の主生成物から容易に分離でき
る。
【００２５】さらに驚くべきことに、この新規な複合体
は式（Ｉ）の天然のリガンドよりもＥ−およびＰ−セレ
クチンに強く結合するとの所見が得られている。本発明
の化合物のアゴニストおよびアンタゴニスト作用は、過
剰な細胞−細胞接着によって特徴づけられる疾患の予
防、治療および診断に使用できる。
【００２６】
【課題を解決するための手段】本発明はしたがって，式
Ｉ Ｚ−Ｙ−(ＣＨ2)n−〔ＮＨ(ＣＯ)〕p−Ｒ2 Ｉ 〔式中、Ｚは、分岐型四糖であり、Ｙは、酸素またはＮ
Ｈ(ＣＯ)であり、Ｒ2は、アミノ酸もしくは６個までの
アミノ酸のオリゴペプチド基、脂肪族もしくは脂環式単
位から形成される親油性基、脂肪族および異項環単位の
組合せ、またはトリフェニルメタン染料であり、Ｙが酸
素である場合には、ｐは１であり、ｎは２〜１０の整数
であり、ＹがＮＨ(ＣＯ)でｐが０の場合にはｎは０〜１
０の整数であり、ＹがＮＨ(ＣＯ)でｐが１の場合にはｎ
は１〜１０の整数である〕の化合物に関する。分岐型四
糖Ｚは、好ましくはシアリル−ルイスＸまたはシアリル
−ルイスＡである。
【００２７】Ｒ2は好ましくは式（ＩＡ）
【化１３】 （式中、ｍは０〜１０の整数であり、ｐとｑは０または
１である。ただし、ｍ＝０の場合は、ｐまたはｑのいず
れかは０である）の基である。
【００２８】化合物（Ｉ）（Ｒ2＝１Ａ）のこれらの好
ましい実施態様は次式（II）によって与えられる。
【化１４】
【００２９】本発明はまた、化合物（Ｉ）を製造するに
あたり、式（III）の化合物 Ｚ−Ｏ−(ＣＨ2)n−ＮＨ2 III 式（IV）の化合物 Ｚ−ＮＨ2 IV または式（Ｖ）の化合物 Ｚ−ＮＨ(ＣＯ)−(ＣＨ2)n−ＮＨ2 Ｖ （式中、Ｚおよびｎは上述の意味を有する）を式（VI）
の化合物 Ｘ(ＣＯ)Ｒ2 VI （式中、Ｘはヒドロキシルまたはカルボキシル活性化離
脱基であり、Ｒ2は上述の意味を有し、前駆体（III）、
（IV）または（Ｖ）の分岐型四糖Ｚは場合により保護の
形態で使用されるが、好ましくは非保護の形態で用いら
れる）と反応させることを特徴とする方法に関する。化
合物（IV）中のＸは、Ｏ−スクシンイミジル基であるこ
とが好ましい。この反応に用いられる溶媒は好ましくは
ピリジンまたはＮ,Ｎ−ジメチルホルムアミドである。
【００３０】式（Ｉ）において分岐型四糖Ｚがシアリル
−ルイスＸまたはシアリル−ルイスＡである化合物の製
造に際しては、前駆体（III）、（IV）または（Ｖ）の
四糖残基Ｚ中のシアル酸残基はラクトンの形態で存在す
るのが有利である。
【００３１】式（II）の化合物の製造には、前駆体（V
I）中のＲ2は式（ＩＢ）
【化１５】 の基が適当であり、また式（VII）の化合物
【化１６】 が適当な前駆体として使用できる、変数ｍおよびｑは既
に定義した意味を有する。
【００３２】本発明はまた、式（Ｉ）の化合物および、
必要に応じて医薬補助剤を含有する医薬に関する。
【００３３】式（Ｉ）の化合物は特に、細胞−細胞接着
の増大によって起こる疾患の予防または治療用の医薬の
製造に使用できる。
【００３４】式（Ｉ）の化合物はさらに、細胞−細胞接
着の増大を伴う疾患の診断用組成物の製造および合成ワ
クチンの製造に適している。
【００３５】
【発明の実施の形態】以下に本発明を詳細に、特に好ま
しい実施態様について説明する。 Ｏ−グリコシド結合（Ｙ＝Ｏ）を有する化合物（Ｉ）の
合成 式（Ｉ） Ｚ−Ｙ−(ＣＨ2)n−〔ＮＨ(ＣＯ)〕p−Ｒ2 Ｉ 〔式中、好ましくはＳＬｅＸまたはＳＬｅＡ構造を含む
炭水化物リガンドＺは、Ｏ−グリコシド結合によって連
結し（すなわちＹ＝Ｏ）、所望により脂肪族スペーサー
鎖(ＣＨ2)nを介してアミノ酸、ペプチド、またはさらに
親油性の基Ｒ2に結合する〕の化合物は、文献既知の式
（III）の前駆体から、簡単な方法で場合により式(VI)
の試薬を二次的官能基を保護して直接カップリングし、
ついで保護基を除去して製造することができる。
【００３６】オリゴ糖前駆体(III)の適当な合成例は、E
P 0 601 117および Angew. Chem. 19（予定)、1994（印
刷中）にｎ＝６（ヘキサノールアミンスペーサー）の化
合物について、また、J. Carbohydr. Chem. 1993, 1, 1
203（ｎ＝２およびｎ＝８）ならびにJ. Carbohydr. Che
m. 1994, 13, 641（シアリル−ルイスＡ型）に見出され
る。最後から２つ目に挙げた刊行物に述べられている化
合物では、アミノ官能基は、本技術分野の熟練者にはよ
く知られた方法により、アジド前駆体の還元によって導
入することができる。したがって、所望の最終生成物
（Ｉ）のさらに高い水溶性と生物学的利用性を目的に式
(III)の化合物のスペーサー鎖(ＣＨ2)n中のすべての第
三のメチレン単位を酸素原子によって置換することが同
様に可能である。
【００３７】適当なアシル成分（VI）は脂肪族または脂
環式カルボン酸およびアミノ酸，ならびに６個までのア
ミノ酸を有し、Ｎ末端とアミノおよびカルボキシ側鎖官
能基は保護され、前駆体（III）の第一級アミノ官能基
と反応してアミド結合を形成できる遊離酸官能基をもつ
ペプチド（Ｘ＝ＯＨ）である。ＸがＯＨである適当な化
合物（VI）の選択に関しては、アミノ官能基の高い反応
性と良好な接近性のためにほとんど制限はない。ペプチ
ド結合の連結には、反応溶液中で酸官能基をたとえばカ
ルボジイミドで活性化するペプチド合成の慣用方法が使
用できる。慣用の方法は、“Principles of Peptide Sy
nthesis"，M．Bodanszky, ２版，1993,Springer-Verlag
にすべて収集されている。
【００３８】しかしながら、ＳＬｅＸおよびＳＬｅＡ構
造を有する炭水化物単位中には遊離の酸官能基および多
数のヒドロキシル基が存在するため、これらの方法は副
反応の可能性がありあまり適当ではない。好ましい実施
態様においては、非保護炭水化物前駆体（III、IV、
Ｖ）を、一義的な反応経過を保証するために純粋な活性
エステル（VI）と反応させる。
【００３９】市販品またはM．Bodanszkyによるペプチド
合成についてのテキスト（前出）に引用された方法で製
造できる適当な活性エステルの例には、ペンタフルオロ
フェニルエステル（Ｘ＝ペンタフルオロフェノキシ）、
２,４−ジニトロフェニルエステル（Ｘ＝２,４−ジニト
ロフェノキシ）およびＯ−アシル化置換ヒドロキシルア
ミンたとえばとくに好ましい実施態様において用いられ
るＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｘ＝ＯＳ
ｕ）がある。
【００４０】非保護炭水化物前駆体たとえばIII（IVお
よびＶでも同様に）の反応の実施に際してとくに困難な
点は、より強度に疎水性の活性エステル（VI）に比較し
て上記化合物の高い親水性であり、これが慣用の有機溶
媒、水性システムまたは溶媒混合物中での反応成分の効
率的な反応を妨害する。本発明の実施態様においては、
反応は０〜１００℃、好ましくは１５〜３５℃の室温周
辺の温度で、ＤＭＦ、ジメチルスルホキシドまたはピリ
ジン中、好ましくはピリジン中で行われる。
【００４１】ピリジン中にはわずかしか溶けなくても、
適当な希釈度でよく攪拌すれば１〜２４時間で反応を完
結させるのに十分溶解する非保護化合物（III）を反応
させるのが好ましい。水分子の除去によって型通り形成
できるラクトイドＳＬｅＸおよびＳＬｅＡ化合物がとく
に好ましい。これらの化合物は前駆体の合成の一連の経
路の最後に保護基の除去後、位置異性体混合物として得
られる（例：J．Chem．Soc.，Chem．Commun．1991，87
0）。これらのＳＬｅＸ／Ａは、有機溶媒とくにピリジ
ンに実質的により溶解し易く、したがって本発明の合成
方法に理想的な前駆体であることがわかった。シアリル
酸の遊離カルボキシル基はついで最終合成工程において
ラクトン基から緩和な塩基性加水分解下に簡単に遊離さ
せることができる。
【００４２】生成物（Ｉ）のペプチド基Ｒ2に存在する
さらに他の保護基は、慣用の方法、たとえば、エステル
またはエーテル中のベンジル基は接触水素化によって、
アミンのＦＭＯＣ保護基は緩和な塩基性加水分解で除去
される。これらの方法はたとえば、Bodanszkyによるテ
キスト（前出）および“Protective Group in OrganicS
ynthesis"（Th．W．Greene, J．Wiley & Sons, 1981）
に記載されている。
【００４３】強い酸性条件たとえば塩酸またはトリフル
オロ酢酸で除去しなければならない保護基は、これらの
化合物が酸に感受性であるため適当でない。最終化合物
は、溶媒の除去およびクロマトグラフィー方法たとえば
ＨＰＬＣまたはＦＰＬＣ、好ましくは、たとえばBiogel
（登録商標）のような支持相上ゲル透過クロマトグラフ
ィーまたはSephadex（登録商標）上、水もしくは水／ア
ルコール混合物を用いたクロマトグラフィーにより単離
精製される。化合物は、シリカゲル上薄層クロマトグラ
フィー、電気スプレーまたはＦＡＢマススペクトル、核
磁気共鳴スペクトルおよびセレクチン受容体への細胞接
着の阻害を試験する生物学的アッセイ系により特徴づけ
られる。
【００４４】Ｎ−グリコシド結合（Ｙ＝ＮＨＣＯ）を有
する化合物（Ｉ）の合成 式（Ｉ） Ｚ−Ｙ−(ＣＨ2)n−〔ＮＨ(ＣＯ)〕p−Ｒ2 Ｉ 〔式中、好ましくはＳＬｅＸまたはＳＬｅＡ構造を有す
る炭水化物リガンドＺはＮ−グリコシドとしてアシル化
され、Ｙはアミド基ＮＨ(ＣＯ)、ｐは０、ｎは０であ
る〕の化合物は上述の方法と全く同様にして、βグリコ
シルアミン（IV）から化合物（VI）でアシル化すること
によって製造される。グリコシルアミン前駆体（IV）は
原理的にはＳＬｅＸまたはＳＬｅＡから既知方法に従い
遊離糖のアンモニア分解によって、たとえば化合物（１
ｘ）または（１ａ）を、遊離の糖に慣用される方法で水
中炭酸水素アンモニウムと反応させることにより製造で
きる（Glycoconjugate J. 1993, 10, 227および EP 0 4
13 675）。
【００４５】ＥＰ ０ ４１３ ６７５にはまた、この方
法で製造されたグリコシルアミンのクロロ酢酸誘導体に
よるアシル化、およびそれをさらに、とくに分析への適
用のためにリンカーおよび蛍光原の基と反応させる方法
が記載されている。アシル化は微量規模において著しく
大過剰（５モル過剰）の試剤を用いて行われる。これは
式（IV）および（VI）の有用な成分による製造的合成
で、グラム規模の生成物（Ｉ）を得る限りにおいて適当
ではあるが、遊離のグリコシルアミンが水性反応媒体お
よび水／ＤＭＦ混合物中で不安定なため、大規模な合成
には不適当である。
【００４６】グリコシルアミン（IV）のアシル化の好ま
しい実施態様においては、ＳＬｅＸまたはＳＬｅＡ構造
を有するオリゴ糖の場合によっては保護された前駆体が
用いられる。その合成は、ＳＬｅＸ−グリコシルアミン
前駆体を例としてスキーム１〜３に示し、実施例に詳細
に記載する。すなわち、選択的に保護されたＮ−アセチ
ルグルコサミン化合物（３）をチオグリコシドドナー
（２）を用いてフコシル化して（４）を得る。この二糖
（４）をＴＨＦ中ナトリウムシアノボロヒドリド／塩酸
（Garegg法）で還元すると中間生成物（５）が得られ、
これからドナー（６）によるガラクトシル化およびZemp
len法による脱アシル化後に三糖（７）が得られる（ス
キーム１）。
【００４７】
【化１７】
【００４８】三糖（７）から、チオグリコシド法による
シアル酸ドナー（８）との反応およびナトリウムメトキ
シドでのエステル交換により、メチルエステル（１０）
と４′−ラクトン（９）の混合物が形成される。両化合
物とも同一操作によりさらに最終生成物に変換できる。
反応式２によれば、四糖ラクトン（９）はラネーニッケ
ルを用いてアノマーアジド基が選択的に還元され、部分
的に保護されたグリコシルアミン（１１）が得られる．
化合物（１１）はシアリル−ルイスＸコンフィギュレー
ションで四糖リガンドを含有する式（IV）の部分保護前
駆体の例を示すものである。別法として、ベンジル保護
基はさらに、パラジウム／水素を用いて還元的に除去す
ることもできる。いずれの場合も、β−コンフィギュレ
ーションのアミノ基は選択的にアシル化可能な形態で形
成される。
【００４９】
【化１８】
【００５０】しかしながら、本発明の好ましい実施態様
における部分保護グリコシルアミンの使用の第一の変法
には、反応成分（VI）による以後のアシル化に際し、た
とえばピリジン、ジクロロメタン、ジメチルホルムアミ
ド（ＤＭＦ）、アセトニトリル，テトラヒドロフラン
（ＴＨＦ）またはそれらの混合物のような有機溶媒中で
匹敵する疎水性を有する化合物を使用できるという利点
がある。スキーム３による例では、トリペプチドＧｌｙ
−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（１２）のＺ−保護スクシンイミドエ
ステルを部分保護グリコシルアミン（１１）とジメチル
ホルムアミド／ジクロロメタン混合物中で反応させてグ
リコペプチド（１３）を得、これから保護基を還元的に
除去して式（Ｉ）の最終生成物の４′−ラクトイド型
（１４）が得られる。シアル酸上に遊離のカルボキシル
官能基を有する四糖グリコペプチド、この例での最終化
合物（Ｉ−１）は、ラクトン環の希塩基水溶液たとえば
０.１〜０.０１Ｎ水酸化ナトリウム溶液による穏やかな
加水分解、ついで酸性化によって得られる。
【００５１】
【化１９】
【００５２】シアリル−ルイスＡコンフィギュレーショ
ンを有する化合物（Ｉ）は上述の方法と全く同様にして
得られる。すなわち、この構造型の化合物は、Ｎ−アセ
チルグルコサミン単位の３および４位の側腕の付加にお
けるグリコシル化成分の交換によって形成される。すな
わち、スキーム１〜２と同様、最初に遊離の３位にガラ
クトシル化を行い、ついでベンジリデンアセタールの還
元開裂後に遊離の４位にフコシル化を行う。以後の合成
は（Ｉ−１）について記載した方法と全く同様に進行す
る。
【００５３】スクシンイミド活性化エステル（Ｉ；Ｘ＝
ＯＳｕ）を介する式（VI）の化合物のグリコシルアミン
（IV）へのカップリングはこの場合も本発明の好ましい
実施態様である。この反応の唯一の二次成分は必然的に
得られるＮ−ヒドロキシスクシンイミドである。他には
さらに試剤または活性化剤は必要としないことから、最
終生成物は、静止クロマトグラフィー相たとえばBiogel
（登録商標）を通し溶出液として水を用い、またはSeph
adex（登録商標）もしくは同種の材料上溶出液として水
もしくは水と有機溶媒の混合物を用いて、単純なろ過で
精製できる。式（IV）および（VI）の反応成分は化学量
論的にまたは、それぞれの場合で多量に利用できる方の
成分を１〜１０モル％過剰に使用する。それぞれの過剰
成分は上述のクロマトグラフィー過程ののちに分離され
る。
【００５４】スクシンイミドエステル（VI）は単離され
た形態（Ｘ＝ＯＳｕ）で得ることもできるし、またはカ
ルボン酸（VI，Ｘ＝ＯＨ）から市販の試薬ＴＳＴＵ〔テ
トラフルオロホウ酸Ｏ−(Ｎ−スクシンイミジル)−Ｎ,
Ｎ,Ｎ′,Ｎ′−テトラメチルウロニウム〕を使用し、も
しくはペプチド合成でよく知られたその他の方法（引用
文献：M．Bodanszky参照）によりインシトゥで得ること
もできる。すなわちカルボン酸からインシトゥで製造さ
れるＨＯＢＴエステル（ＨＯＢＴ＝1-ヒドロキシベンゾ
トリアゾリル）または化学的に不安定なグリコシルアミ
ンのアシル化に特別に開発された他の特殊方法も使用で
きる。 後者の例には３−アシル−５−メチル−１,３,
４−チアジアゾール−２(３Ｈ)−チオン（J．Carbohyd
r．Chem．1994，13，737）がある。
【００５５】生成物（Ｉ）および（II）の合成のための
本発明による好ましいスクシンイミドエステル法におい
ては、遊離のグリコシルアミンのアシル化のためのたと
えばＨＢＴＵ法（Glycoconjugate J．1993，10，227）
のような文献既知の方法と異なり、四糖前駆体（II
I）、（IV）および（Ｖ）は遊離シアル酸の形態でも使
用できる。しかしながら、好ましくは、ラクトン型で存
在する化合物が使用される。
【００５６】５〜２５個のアミノ酸からなるペプチドの
非保護グリコシルアミンへのカップリングについての米
国特許第５,２８０,１１３号に記載され請求された方法
は、シアル酸含有グリコシルアミン（IV）には適用でき
ない。すなわち、カルボン酸（VI、Ｘ＝ＯＨ）のたとえ
ばＨＢＴＵ／ＨＯＢＴによる活性化は、また必然的にシ
アル酸の活性化、したがって異なる反応経過をも招来す
る。
【００５７】生成物の特徴づけは、上に式（Ｉ）のＯ−
グリコシドについて述べたのと同一の方法で実施され
る。
【００５８】式（Ｉ）において、ＳＬｅＸまたはＳＬｅ
Ａ構造を有するリガンドが同様にＮグリコシドとしてア
シル化された形態（Ｙ＝ＮＨＣＯ）で存在するが、ｐは
１で、(ＣＨ2)nはｎ＝１〜１０個の炭素原子の脂肪族ス
ペーサー鎖である化合物は、式（Ｖ）の適当な前駆体の
アシル化によって、前駆体（III）から製造できる化合
物（Ｉ）の場合（上記参照）と全く同様に製造される。
【００５９】式（Ｖ）の前駆体については、前駆体（I
V）から上述の相当する方法を用い、Ｎ末端が保護され
た末端アミノカルボン酸またはそれらの活性化エステル
でのアシル化にって製造される。適当な末端アミノカル
ボン酸の例にはグリシン（ｎ＝１）および６アミノカプ
ロン酸（ｎ＝６）がある。Ｎ末端アミノ基の適当な保護
基には加水素分解で除去可能なアジドおよびベンジルオ
キシカルボニル（Ｚ）保護基、ならびに緩和な塩基性条
件下に除去できるトリフルオロアセチルおよびフルオレ
ニルメトキシカルボニル保護基（ＦＭＯＣ）がある。す
なわちＳｕＯ(ＣＯ)(ＣＨ2)6ＮＨ−Ｚを用い、たとえば
スキーム３に記載の合成順序と同様にしてｎ＝６の化合
物（V）がＺ保護基の除去後に得られる。
【００６０】複合炭水化物（Ｉ）の合成のための本発明
の方法は、その好ましい実施態様において、アミノ官能
化炭水化物前駆体（III、IVまたはＶ）の、化合物（V
I、Ｘ＝ＯＳｕ）との反応を包含し、その利点は、すべ
てそれらのＯＳｕエステルに変換可能な遊離のカルボン
酸官能基を有する極めて多様なカルボン酸、アミノ酸お
よびペプチドを使用できることである。
【００６１】表１および２ならびにスキーム４には、こ
の方法で得られる化合物の例を示す。これらの化合物は
本発明および基Ｒ2の様々な変化によって与えられるそ
の応用を例示するものである。化合物（Ｉ）はまた、特
にセレクチン受容体に対する高いアフィニティーを特徴
とする。
【００６２】
【表１】
【００６３】
【表２】
【００６４】
【化２０】
【００６５】アミノ官能化炭水化物前駆体（III）、（I
V）または（Ｖ）からの新規な親油性オリゴ糖リガンド
を合成する本発明の方法のさらに他の変法には、式（V
I）の活性エステルに代えて反応性カルボキシル成分と
して適当なイソシアネートまたはイソチオシアネートの
付加がある。この場合、式（Ｉ）の生成物はアミド結合
ではなく（チオ）尿素結合、ＮＨ(ＣＯ)ＮＨまたはＮＨ
(ＣＳ)ＮＨで形成され、これによるセレクチン受容体に
対するアフィニティーの差はほとんどない。この例には
式（III−１）の前駆体と市販の試薬フルオレセインイ
ソチオシアネートのピリジン溶媒中での反応によるスキ
ーム４に示す（Ｉ−１６）の合成がある。
【００６６】グラム規模で容易に合成できる蛍光原化合
物（１−１６）は、シアリル−ルイスＡコンフィギュレ
ーションを有する相当する前駆体から全く同様に得られ
る化合物とともに、細胞接着のインビトロおよびインビ
ボ研究にとくに著しく適している。これらの化合物は、
それらのスペーサーの至適な長さのため、蛍光原染料が
柔軟性のない短いグリシルスペーサーを介してオリゴ糖
にカップリングした市販の、Oxford Glycosystem社の化
合物（型録番号Ｆ−０２０２６およびＦ−０２０２８）
より適している。（I−１６）中のより柔軟なスペーサ
ーにより比較的大きな染料分子の妨害効果をもたない炭
水化物リガンドが得られる。これは、遊離シアリル−ル
イスＸ四糖（ＩＣ50値１〜２mM）に比較して、（Ｉ−１
６）におけるさらに明白に改善されたＩＣ50データ（表
４）から明らかである。
【００６７】糖複合体（１−２）は抗接着ペプチド配列
Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａを含有し、これはさら
にインテグリンたとえば糖タンパク質ＧＰ IIｂ／IIIａ
に対する結合部位としても機能できる。ペプチドＡｒｇ
−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｌａそれ自体はセレクチンには結
合しない。
【００６８】４個までのシアリル−ルイスＸリガンドが
結合しているビオチン糖複合体（Ｉ−１１）はアビジン
およびストレプトアビジンとの付加化合物を形成する。
【００６９】糖複合体（Ｉ−１２）は、走化性ペプチド
Ｎ-ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（ｆＭＬＰ）の
構造要素を含有し、インビボにおいて好中球のローリン
グの低下に関連して相乗効果が期待される（Blood 199
3, 82, 1165-1174）。
【００７０】糖複合体（Ｉ−１３）および（Ｉ−１４）
はＰａｍ3Ｃｙｓ(Ｓｅｒ)型のリポペプチドワクチンの
構造要素を含有する。ペプチドとは異なり、この構造要
素を有するリポペプチドは、細胞膜を通して急速に輸送
され、ついで細胞質中にインターナライズされることに
より、抗原刺激に対する一次免疫応答を生じる。この過
程がマクロファージの活性化および抗原特異的免疫応答
を招来する。
【００７１】タンパク質に対するＴ細胞誘導免疫応答は
腫瘍研究において既知の機構であるが、この場合の炭水
化物の役割については何もわかっていない。この過程に
おける必須条件はＭＨＣタンパク質に結合するペプチド
の提示である、ＷＯ ９３／２１９４８には、腫瘍関連
炭水化物抗原に対するＴ細胞誘導免疫の発生のための、
ＭＨＣ−１結合ペプチドおよび免疫原炭水化物リガンド
を含有する免疫原複合体が提案されている。
【００７２】一方、合成ワクチンの可能性として、ＭＨ
Ｃ機構とは独立に誘導されることも可能なシアリル−ル
イスＸ抗原に対する特異的免疫応答が化合物（Ｉ−１
３）および（Ｉ−１４）から期待される。同じことが、
同様の方法で得られシアリル−ルイスＡリガンド構造を
有する化合物にもいえる。マクロ分子キャリアーやアジ
ュバントによらない炎症性疾患および自己免疫疾患で
は、利用可能な抗原リガンド数の減少により間接的に、
免疫応答は白血球接着減少および浸潤の低下を招くこと
ができるものと考えられる。
【００７３】この考え方は、J．Am．Chem．Soc. 1994,
116巻, 395頁に初めて報告された合成低分子量リポペプ
チド腫瘍抗原接合体を用いる抗腫瘍療法における既知の
戦略の拡張である．そこで使用されたＴｎ抗原型の糖複
合体に比較して、本発明の化合物（Ｉ−１３）および
（Ｉ−１４）はそのより大きい炭水化物構造のため免疫
応答の誘導により適している。Ｔ細胞の関与による免疫
応答の増強も同様に期待できる。
【００７４】化合物（II）の合成 式（Ｉ） Ｚ−Ｙ−(ＣＨ2)n−〔ＮＨ(ＣＯ)〕p−Ｒ2 Ｉ においてＲ2が式（ＩＡ）
【化２１】 の基である化合物は以下の式（II）
【化２２】 の化合物を与える。
【００７５】化合物（II）において、好ましくはＳＬｅ
ＸおよびＳＬｅＡ構造を有する３個の炭水化物リガンド
ＺがＮ−グリコシドまたはＯ−グリコシド型にアシル化
され、さらに所望によりアミド結合を介して骨格化合物
４−（２−カルボキシエチル）−４−ニトロヘプタン二
酸（VII−１、Ｘ＝ＯＨ、ｍ＝ｑ＝０）にカップリング
した脂肪族スペーサー鎖(ＣＨ)nおよび(ＣＨ)mによって
伸長されていてもよい化合物は、式（III）、（IV）ま
たは（Ｖ）の化合物を化合物（VII−１）または式（VI
I）
【化２３】 の鎖延長誘導体とそれぞれ３回反応させることによって
製造される。
【００７６】基本的には１価の炭水化物構造を有する化
合物（Ｉ）の合成に用いられる方法はこの場合もアミド
結合の連結に使用できる。しかしながら、式（VII）の
化合物の３価の性質によりこの場合はかろうじて分離で
きる１、２および３価の生成物の混合物が得られる。グ
ラム単位の量の特定の３価の生成物（II）を容易に製造
できる本発明の好ましい実施態様においては、市販のト
リカルボン酸（VII−１）から以下の例に例示するよう
に合成される新規な（これまで記載されたことのない）
トリス−ＯＳｕエステル（VII、Ｘ＝ＯＳｕ）が用いら
れる（Ｓｕ＝スクシンイミジル基）。
【００７７】
【化２４】
【００７８】この方法で製造される化合物（II）の例を
表３に示す、たとえば化合物（II−１）は、（VII−
２）とＳＬｅＸコンフィギュレーションを有する化合物
（IV）の少なくとも３当量との反応によって得られる。
化合物（II−２）はｎ＝６の前駆体（III）から同様の
方法で形成される。化合物（II−３）はたとえば（VII
−５）とＳＬｅＸコンフィギュレーションを有する化合
物（IV）から得られる。
【００７９】
【表３】
【００８０】化合物（III）、（IV）もしくは（Ｖ）か
ら誘導される３価の生成物は、スペーサー鎖たとえば前
駆体（VII−１）への連結、ついで示したように（II
I）、（IV）もしくは（Ｖ）とのカップリングにより、
または別法として合成順序を変えて、アミノ基が保護さ
れたアミノ酸を最初に（III）、（IV）もしくは（Ｖ）
とカップリングさせついでこの中間体をアミノ基の脱保
護後に骨格化合物（VII）のトリス−ＯＳｕエステルに
３回付加することにより製造できる。最初の方法の方
が，より高価な化合物（III）、（IV）または（Ｖ）を
最終工程でのみ使用するので好ましい。
【００８１】化合物（II）の合成の実施、生成物の精
製、およびそれらの特性の分析は１価の化合物（Ｉ）に
ついての記載と全く同様にして行われる。（VII）の反
応基あたり、化合物（III）、（IV）または（Ｖ）を高
々１〜１０モル％過剰に使用する。
【００８２】化合物（II）に存在するニトロ基は、本技
術分野の熟練者によく知られた方法により、たとえばラ
ネーニッケルと水素を用いて、アミノ基に還元できる。
アミノ基を含有する同一の最終化合物は、基本的には市
販の化合物、４−（２−カルボキシエチル）−４−アミ
ノヘプタン二酸から出発して製造することもできる。し
かしながら、このためには、適当なアミノ保護基の導入
による回り道を選択しなければならない。この場合、塩
基性でまたは加水素分解により除去できるアミノ保護基
のみが適当である。酸加水分解で除去できるＢｏｃ保護
基では、これらの条件下にフコースも同時に除去される
ので、式（II）に相当する（ニトロ基に代えてアミノ基
を有する）生成物は決して得られない。
【００８３】化合物（II）型の多価化合物における合成
の概念は、３価の糖複合体に限定されるものではない。
さらに多価の糖複合体、たとえば４価の化合物は、同様
の方法で相当するオリゴカルボン酸たとえば、２,２′
−ビス（２−カルボキシエチル）ペンタン二酸から、同
様にとくに好ましくはそれらのＮ−ヒドロキシスクシン
イミドエステルを経由して製造できる。
【００８４】本発明の化合物（Ｉ）および（II）の細胞
接着インヒビターとしての性質、およびそれらの治療お
よび診断的使用 式（Ｉ）および（II）の化合物は薬理学的に活性な物質
として、とくに細胞−細胞接着の亢進によって起こる疾
患の予防および治療に活性な化合物として適している。
本発明の化合物はとくに、セレクチン受容体によって仲
介される細胞接着の阻害に改善された効果を示す。
【００８５】炭水化物複合体はインビボにおける適用に
際して不利な副作用を示してはならない。すなわち、静
脈内投与の場合には、たとえば溶血性や望ましくない免
疫原性は避けねばならない。血栓の形成を排除するため
に、凝血カスケードの酵素を活性化してはならない。
【００８６】本発明の炭水化物複合体およびそれらの生
理学的に許容できる塩はそれらの有用な薬理学的性質に
より哺乳類動物とくにヒトの治療剤としての使用に極め
て適している。この医薬は、炎症過程の関与とともに進
行する疾患とくに心筋梗塞および虚血、梗塞後症候群、
成人ショック肺、敗血症ショック、卒中、急性および慢
性の臓器拒絶、血管炎、皮膚の炎症性疾患、慢性関節リ
ウマチ、血管形成術後再狭窄ならびに腫瘍の転移の予防
および／または治療にとくに適している。
【００８７】本発明の医薬は一般的に、静脈内、経口も
しくは非経口的に、または移植により投与されるが、原
理的には経直腸的適用も可能である。適当な固体または
液体医薬製剤形態はたとえば、顆粒剤、粉末剤、錠剤、
コーティング錠剤、（マイクロ）カプセル剤、坐剤、シ
ロップ剤、乳化剤、懸濁剤、エーロゾル剤、アンプル中
に封入した滴剤または注射用溶液、および活性化合物の
放出を延長させた製剤であり、それらの製造には賦形剤
ならびに添加剤および／または補助剤、たとえば崩壊
剤、結合剤、コーティング剤、膨潤剤、グライダントも
しくは滑沢剤、賦香剤、甘味剤、または可溶化剤が慣用
的に使用される。頻繁に用いられる賦形剤または補助剤
としては、たとえば炭酸マグネシウム、二酸化チタン、
ラクトース、マンニトールおよび他の糖、タルク、乳汁
タンパク質、ゼラチン、デンプン、ビタミン、セルロー
スおよびその誘導体、動物および植物性油、ポリエチレ
ングリコール、ならびに溶媒たとえば滅菌水、アルコー
ル、グリセロールおよび多価アルコールを挙げることが
できる。医薬製剤は用量単位で製造し投与することが好
ましい。固体用量単位の場合には、錠剤、カプセル剤お
よび坐剤とすることが好ましい。
【００８８】患者の処置に際しては、化合物の効果、投
与経路、疾患の性質および重症度、ならびに患者の年齢
および体重に応じて、１日用量を変動させる必要があ
る。しかしながら、ある種の環境下にはより高いまたは
低い用量が適当な場合もある。１日用量は、１個の用量
単位もしくは数個の小用量単位形態として１回投与およ
び適当な間隔を置いて分割用量の多重投与のいずれによ
っても投与できる。投与される１日用量はさらに、疾患
の過程で発現される受容体の数にも依存する。疾患の初
期段階では細胞表面にはわずかな受容体しか発現しない
と考えられ、したがって投与される１日用量は重症の患
者の場合よりも低くされる。本発明の医薬は、慣用の賦
形剤ならびに必要に応じて添加剤および／または補助剤
を用い、炭水化物複合体を適当な投与形態に導くことに
より製造される。
【００８９】組換え可溶性セレクチン融合タンパク質へ
の細胞接着に対する式（Ｉ）および（II）の炭水化物複
合体の作用の検討のための一次アッセイ セレクチンによる前骨髄細胞の細胞接着に対する本発明
化合物の阻害活性を測定するためのこれらのアッセイの
実施は、欧州特許出願公告ＥＰ ０ ６０１ ４１７に詳
細に記載されている。
【００９０】組換え可溶性セレクチン融合タンパク質へ
の細胞接着に対する炭水化物複合体の作用の検討のため
の一次アッセイ Ｅ−およびＰ−セレクチン（以前の命名法ではＥＬＡＭ
−1またはＧＭＰ−１４０）とそれらのリガンドの間の
相互作用に対する炭水化物複合体の効果を試験するため
に、それぞれこれらの相互作用の一方にのみ特異的なア
ッセイが用いられる。リガンドは前骨髄細胞ＨＬ−６０
上の表面構造としてそれらの天然の形態で供給される。
ＨＬ−６０細胞は極めて特異性の異なるリガンドおよび
接着分子を含有するので、アッセイの所望の特異性のみ
を結合成分によって生成させることが可能である。用い
られた結合成分はそれぞれＥ−またはＰ−セレクチンの
細胞質外ドメインから遺伝子操作で調製された可溶性融
合タンパク質およびＩｇＧ１サブクラスのヒト免疫グロ
ブリンの定常領域であった。
【００９１】Ｌ−セレクチン−ＩｇＧ１の調製 可溶性Ｌ−セレクチン−ＩｇＧ１融合タンパク質の調製
には、Walzら、１９９０によって報告された遺伝子構築
体“ＥＬＡＭ−Ｒｇ”を使用した。発現にはプラスミド
ＤＮＡをＤＥＡＥ−デキストラン法（Molecular Biolog
yMethods：Ausubel，F．M., Brent，R., Kingston，R．
E., Moore，D.D., Seidman，J．G.，Struhl，K. & Smit
h，J．A．1990, Current Protocols in MolecularBiolo
gy,JohnWiley, New York参照）によりＣＯＳ−７細胞
（ＡＴＣＣ）にトランスフェクトした。トランスフェク
ション後７日目に培養上清を回収し、遠心分離して細胞
および細胞フラグメントを除去し、２５mM ＨＥＰＥ
Ｓ、pH７.０、０.３mM ＰＭＳＦ、０.０２％ナトリウム
アジドに移し、＋４℃で保存した。Walz，G., Aruffo，
A., Kolanus，W., Bevilacqua，M. & Seed，B. 1990, R
ecogni-tion by ELAM-1 of the sialyl-Lex determinan
t on myeloid and tumor cells.Science 250, 1132-113
5。
【００９２】Ｐ−セレクチン−ＩｇＧ１の調製 可溶性Ｐ−セレクチン−ＩｇＧ１融合タンパク質の調製
には、Aruffoら、１９９１によって報告された遺伝子構
築体“ＣＤ６２Ｒｇ”を使用する。その他の操作はＡ１
に示したＬ−セレクチン−ＩｇＧ１の調製と同様であ
る。Aruffo，A., Kolanus，W. Walz,G., Fredman，P. &
Seed，B. 1991, CD62/P-Sele-ctin recognition of my
eloid and tumor cell sulfatides. Cell 67, 35-44。
【００９３】ＣＤ４−ＩｇＧ１の調製 可溶性ＣＤ４−ＩｇＧ１融合タンパク質の調製には、Ze
ttlemeisslら、１９９０によって報告された遺伝子構築
体“ＣＤ４：ＩｇＧ１ヒンジ”を使用する。その他の操
作はＡ１に示したＬ−セレクチン−ＩｇＧ１の調製と同
様である。Zettelmeissl，G., Gregersen，J.-P., Dupo
rt，J．M., Mehdi,S., Reiner，G. & Seed，B．1990．E
xpression and characterization of human CD4：Immun
oglobulinFusion Proteins. DNA and Cell Biology 9,
347-353。
【００９４】組換え可溶性接着分子に対するＨＬ60細胞
接着アッセイの実施 １．９６−ウエルのマイクロタイターテストプレート
（Nunc Maxisorb）を、５０mM Tris pH９.５中に希釈し
た（１＋１００）ヤギ抗−ヒトＩｇＧ抗体（Sigma）１
００μｌと室温で２時間インキュベートする。抗体溶液
の除去後、ＰＢＳで１回洗浄する。
【００９５】２．ウエル中にブロック緩衝液１５０μｌ
を加え室温で１時間放置する。ブロック緩衝液の組成は
０.１％ゼラチン、１％ＢＳＡ、５％ウシ血清、０.２mM
ＰＭＳＦ、０.０２％ナトリウムアジドである。ブロッ
ク緩衝液の除去後、ＰＢＳで１回洗う。
【００９６】３．適当にトランスフェクトして発現させ
たＣＯＳ細胞の細胞培養上清それぞれ１００μｌを、ピ
ペットでウエルに加える。インキュベーションは室温で
２時間行う。細胞培養上清を除去したのち、ＰＢＳで１
回洗浄する。
【００９７】４．ウエルに２０μｌの結合緩衝液を添加
する。結合緩衝液は５０mM ＨＥＰＥＳ、pH７.５、１０
０mM ＮａＣｌ、１mg／ml ＢＳＡ、２mM ＭｇＣｌ2、１
mMＣａＣｌ2、３mM ＭｎＣｌ2、０.０２％ナトリウム
アジド、０.２mM ＢＭＳＦの組成を有する。これに、試
験物質５μｌを加え、プレートを回して混合し、室温で
１０分間インキュベートする。
【００９８】５．ＨＬ−６０細胞２００,０００／mlを
含有する培養液５０mlを、３５０ｇで４分間遠心分離す
る。ペレットを１０mlのＲＰＭＩ １６４０に再懸濁し
て、細胞をもう一度遠心分離する。細胞の標識には、５
０μｇのＢＣＥＣＦ−ＡＭ（Molecular Probes）を５μ
ｌ無水ＤＭＳＯに溶解し、ついでＢＣＥＣＦ−ＡＭ／Ｄ
ＭＳＯ溶液に１.５mlのＲＰＭＩ １６４０を加える。こ
の溶液を用いて細胞を再懸濁し、３７℃で３０分間イン
キュベートする。３５０ｇで２分間遠心分離したのち、
標識された細胞ペレットを１１mlの結合緩衝液に再懸濁
し、再懸濁した細胞のアリコートをマイクロタイタープ
レートのウエルに１００μｌずつ分配する。プレートを
室温に１０分間放置して細胞をテストプレートの底に沈
降させる。この過程で細胞にはコーティングされたプラ
スチックに接着する機会がある。
【００９９】６．テストを停止させるには、プレートを
停止緩衝液（２５mM tris、 pH７.５；１２５mM ＮａＣ
ｌ；０.１％ＢＳＡ；２mM ＭｇＣｌ2；１mM ＣａＣ
ｌ2；３mM ＭｎＣｌ2；０.０２％ナトリウムアジド）に
４５°の角度で浸漬させる。逆さにして停止緩衝液をウ
エルから除去し、この操作をさらに２回反復する。
【０１００】７．ウエルに強固に接着したＢＣＥＣＦ−
ＡＭ標識細胞は、感度を４、励起波長４８０／２２０n
m、発光波長５３０／２５０nmにセットした細胞蛍光測
定装置（Millipore）中で測定する。このようにして得
られた、組換え可溶性接着分子Ｅ−セレクチンおよびＰ
−セレクチンへのＨＬ−６０細胞の接着の測定結果は表
４に示す。
【０１０１】
【表４】
【０１０２】その他の適当なアッセイシステムたとえば
刺激ヒト内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）、リンパ組織の凍結切
片への細胞接着、およびラットにおけるインビボでの白
血球接着の生体内顕微鏡による検討については、同様に
引用文献に詳細に記載されている。
【０１０３】驚くべきことにシアリル−ルイスＸまたは
シアリル−ルイスＡ構造を有する四糖に比較的大きい親
油性の基、アミノ酸、リポペプチドおよびペプチドを付
加させることによって得られた化合物が特に、明瞭に改
善された効果を示すことである（データについては表４
参照）。
【０１０４】
【実施例】以下の実施例は本発明をさらに例示するもの
である。実施例中、百分率は重量に関するものである。
液体の場合の混合比は特に指示のない限り容量に関する
ものである。
【０１０５】例１ （２,３,４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｌ−フコピラノ
シル）−（１→３）−２−アセトアミド−１−アジド−
４,６−Ｏ−ベンジリデン−１,２−ジデオキシ−β−Ｄ
−グルコピラノース（４）の合成（スキーム１）：２−
アセトアミド−１−アジド−４,６−Ｏ−ベンジリデン
−１,２−ジデオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース（３)
(３６.０ｇ、１０８mmol）、およびエチル２,３,４−ト
リ−Ｏ−ベンジル−１−チオ−β−Ｌ−フコピラノシド
（２）（６７.２ｇ、１４０mmol）をジクロロメタン／
ＤＭＦ（７００ml、１:１）中モレキュラーシーブ（３
Ａ）上で１時間攪拌する。テトラブチルアンモニウムブ
ロミド（６２.７ｇ、１９４mmol）および臭化銅(II)
（３８.６ｇ、１７３mmol）を加えたのち、混合物を室
温で１６時間攪拌する。これをシリカゲルを通して濾過
し、ジクロロメタン（１.５Ｌ）ですすぎ、飽和炭酸水
素ナトリウム溶液、ついで飽和食塩溶液によって洗浄す
る。真空中で溶媒を除去し、シリカゲル上カラムクロマ
トグラフィー（ｉ−ヘキサン／酢酸エチル４：１）に付
すと、二糖（４）（６８.０ｇ、９１％）が生成する。 〔α〕D 20＝−143.3°(1/CH2Cl2)；1H-NMR（300MHz，CD
Cl3）：δ＝0.88(d，3H，6-HFuc), 1.61(s，3H，NHAc),
5.05(d，1H，1-HFuc), 5.52(s，1H，CH-ベンジリデ
ン)，7.25-7.4(m，20H，ベンジル)
【０１０６】例２ （２,３,４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｌ−フコピラノ
シル）−（１→３）−２−アセトアミド−１−アジド−
６−Ｏ−ベンジル−１,２−ジデオキシ−β−Ｄ−グル
コピラノース（５）の合成（スキーム１）：化合物
（４）（６９.０ｇ、１００mmol）ならびにナトリウム
シアノボロヒドリド（６３.０ｇ、１.０mol）をテトラ
ヒドロフラン（１Ｌ）中モレキュラーシーブ（１２０
ｇ、４Ａ）を用いて室温で１時間攪拌する。薄層クロマ
トグラフィー（ＴＬＣ）でチェックしながら、エーテル
中塩酸溶液を初期の烈しい気体の発生が鎮まるまで注意
深く滴加すると、無色の沈殿が沈積する。ＴＬＣで注意
深くチェックしながら、付加的なナトリウムシアノボロ
ヒドリドおよびさらにエーテル中塩酸溶液を、ほぼ完全
に反応が達成されるまで導入する。混合物を炭酸水素ナ
トリウム溶液によって中和し、ジクロロメタンに取り、
飽和炭酸水素ナトリウム溶液、エタノールアミン（水中
５％）、ついで飽和食塩溶液で洗浄する。濃縮し、シリ
カゲル上でカラムクロマトグラフィー（トルエン／酢酸
エチル４：１）に付すと、二糖（５）（５３.０ｇ、７
６％）が無定形の固体として生成する。〔α〕D 20＝−8
3.9°(1/CH2Cl2)；1H-NMR（300MHz，CDCl3）: δ＝1.16
(d，3H，6-HFuc), 1.58(s，3H，NHAc), 4.95(d，1H，1-
HFuc), 7.1-7.6(m，20H，ベンジル)
【０１０７】例３ （６−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−
（１→４）−〔（２,３,４−トリ−Ｏ−ベンジル−α−
Ｌ−フコピラノシル）（１→３）〕−（１→３）−２−
アセトアミド−１−アジド−６−Ｏ−ベンジル−１,２
−ジデオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース（７）の合成
（スキーム１）：化合物（５）（２７.０ｇ、３５.９mm
ol）およびＯ−（２,３,４−トリ−Ｏ−アセチル−６−
Ｏ−ベンジル−α／β−ガラクトピラノシル）−トリク
ロロアセイミデート（６）（３０.８g、５３.８mmol）
の５００mlジクロロメタン中溶液を、モレキュラーシー
ブ（４Ａ）上で１時間攪拌する。この溶液に３時間を要
してＴＭＳＯＴｆ（７９７mg、３.６mmol）を滴加し、
ついで固体の炭酸水素ナトリウムで中和する。粗生成物
をジクロロメタン（１.５Ｌ）で処理し、飽和炭酸水素
ナトリウム溶液ついで飽和食塩溶液で洗浄する。ＭｇＳ
Ｏ4で乾燥し、真空中で濃縮し、粗生成物をメタノール
（１Ｌ）に溶解し、１０mlの０.１Ｍ ＮａＯＣＨ3メタ
ノール中溶液で処理する。室温で２時間攪拌したのち、
混合物をイオン交換樹脂〔Amberlite(登録商標)ＩＲ−
１２０〕で中和し、溶媒を真空中で除去する。ついでシ
リカゲル上カラムクロマトグラフィー（ＣＣ）に付す
（ジクロロメタン／メタノール４０：１）と化合物
（７）（１６.５ｇ、４６％）が無定形の固体として生
成する。 〔α〕D 20＝−88.3°(1/CH2Cl2)；1H-NMR（300MHz，CDC
l3）：δ＝1.14(d，3H，6-HFuc), 1.62(s，3H，NHAc),
5.14(d，1H，1-HFuc), 6.12(d，1H，NHAc), 7.1-7.5
(m，25H，ベンジル)
【０１０８】例４ （５−アセトアミド−３,５−ジデオキシ−Ｄ−グリセ
ロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシル）−（２
→３）−（６−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シル）−（１→４）−〔（２,３,４−トリ−Ｏ−ベンジ
ル−α−Ｌ−フコピラノシル）−（１→３）〕−２−ア
セトアミド−１−アジド−６−Ｏ−ベンジル−１,２−
ジデオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース−（１Nana→４
Gal）−ラクトン（９）の合成（スキーム２）：（７）
（１３.５ｇ、１３.４mmol）、メチルＳ−（メチル−５
−アセトアミド−２,４,７,８,９−ペンタ−Ｏ−アセチ
ル−３,５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト
−２−ノヌロピラノシド)（１２.６ｇ、２４.２mmo
l）、モレキュラーシーブ（３Ａ) およびＡｇＯＴｆ
（７.９３ｇ、３０.９mmol）のジクロロメタン／アセト
ニトリル（３６０ml、５：１）中溶液をメチルスルフェ
ニルブロミド（ＭＳＢ、１,２−ジクロロエタン３１ml
中、２７mmol）により−４０℃で処理する。−４０℃で
２時間攪拌したのち、混合物を炭酸水素ナトリウムで中
和し、濾過する。ジクロロメタン（５００ml）を加え、
混合物を飽和炭酸水素ナトリウム溶液ついで飽和食塩溶
液で洗浄し、ＭｇＳＯ4上で乾燥し、濾過し、真空中で
濃縮する。残留物をメタノール（３００ml）に溶解し、
メタノール中１Ｍのナトリウムメトキシド溶液で処理
し、室温で１時間攪拌する。これをAmberlite(登録商
標)ＩＲ−１２０で中和し、溶媒を真空中で除去する。
シリカゲル上カラムクロマトグラフィーに付すと（ジク
ロロメタン／メタノール２５：１→１０：１）、４′−
ラクトン（９）（７.２４ｇ、４２.２％）とメチルエス
テル（１０）およびラクトン（９）の混合物（６.０
ｇ）が生成する。 〔α〕D 20＝−77.5°(1/CH2Cl2)；1H-NMR（300MHz，CDC
l3）：δ＝1.05(d，3H，6-HFuc), 1.78(dd，1H，3-H
Nana), 1.95, 2.0(2s，6H，2NHAc), 2.48(dd，1H，3-H
Nana)，4.38(ddd，1H，4-HNana), 5.26, 5.32(2d，2H，
1-HFuc，4-HGal)，7.24-7.5(m，25H，ベンジル)
【０１０９】例５ Ｎ−（５−アセトアミド−３,５−ジデオキシ−Ｄ−グ
リセロ−α−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシル）−
（２→３）−（６−Ｏ−ベンジル−β−Ｄ−ガラクトピ
ラノシル）−（１→４）−〔（２,３,４−トリ−Ｏ−ベ
ンジル−α−Ｌ−フコピラノシル)−（１→３）〕−２
−アセトアミド−１−アミノ−６−Ｏ−ベンジル−１,
２−ジデオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース−（１Nana
→４Gal）−ラクトン（１１）の合成（スキーム２）：
ラクトン（９）（３００mg、０.２３５mmol）をイソプ
ロパノール（水中１０％、３０ml）に溶解し、３００mg
の中性ラネーニッケルを用いて常圧で水素化する。１時
間後に混合物を濾過し、濃縮する。アノマーアミン（１
１）（２７９mg、９５％）が無定形の固体として純粋な
形で得られ、その次の反応の直前に新たに調製する（さ
らに性質を調べることはしない）。
【０１１０】例６ トリス−スクシンイミドエステル（VII−２）の合成 ４−（２−カルボキシエチル）−４−ニトロヘプタン二
酸（１０.０ｇ、 ３６.１mmol）、Ｎ−エチルＮ′−ジメ
チルアミノプロピルカルボジイミド塩酸塩（ＤＥＣ）
（３１.１ｇ、１６２mmol）およびＮ−ヒドロキシスク
シンイミド（１８.７ｇ、１６２mmol）を２５０mlのジ
クロロメタンに懸濁し、室温で１２時間攪拌する。結晶
性の無色の生成物を濾過し、各回１００mlのジクロロメ
タンで２回洗浄し乾燥する。Ｃ22Ｈ24Ｎ4Ｏ14（568.
4）：収量17.7g（82.6％）。1 H-NMR（300MHz，DMSO-d6）：δ＝2.18(m，6H，CH2CH2C
=O)，2.80(s，12H，O=CCH2CH2C=O)
【０１１１】例７ トリス｛２−〔(Ｎ−（５−アセトアミド−３,５−ジデ
オキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラ
ノシレート)−（２→３）−(β−Ｄ−ガラクトピラノシ
ル)−（１→４）−〔(α−Ｌ−フコピラノシル）−（１
→３）〕−２−アセトアミド−１,２−ジデオキシ−β
−Ｄ−グルコピラノース〕アミドエチル｝ニトロメタン
（II−１）の合成（表３）：化合物（１１）（８９mg、
０.０７１mmol）と、VII（Ｚ＝ＯＳｕ、ｍ＝ｑ＝０）
（１０mg、０.０１９mmol）をＴＨＦ／ピリジン（２m
l、１：１）中において室温で一夜攪拌する。溶媒を真
空中で除去し、シリカゲル上カラムクロマトグラフィー
（ジクロロメタン／メタノール１０：１）に付すと、保
護されたトリマーＳＬｅＸラクトン（６８mg）が中間体
として得られ、これはさらに性質を調べることなく次反
応に使用する。この化合物をメタノール／ジオキサン
（４０ml、１０：１）に溶解し、Ｐｄ−活性炭（８４m
g）の添加後常圧下に２時間水素化する。濾過し、濃縮
し、メタノール／水（４０ml／１０ml）中１Ｍ水酸化ナ
トリウム（０.５ml）により１時間処理してラクトンを
開裂し、Amberlite(登録商標)ＩＲ−１２０で中和し、
溶媒を真空中で除去し、Biogel (登録商標)−Ｐ２上排
除クロマトグラフィーに付すと、実験式Ｃ103Ｈ168Ｎ10
Ｏ71（２６８２.５）が無色の粉末として得られる。収
量：４０mg（７８.５％） 〔α〕D 20＝−25.2°(1/水) ；1H-NMR（300MHz，D2O）:
δ＝1.05(d，3H，6-HF uc)，1.66(dd，1H，3-HNana), 1.
86, 1.90(2s，6H，2NHAc), 2.64(dd，1H，3-HN ana), 4.
36 (d，1H，1-HGal), 4.95, 4.98(2d，2H，1-HFuc，1-H
GlcNAc)；1C-NMR(75.4MHz，D2O)：δ＝177.9, 177.8, 1
77.0, 176.7(C=O), 104.5(1-CGal)，102.5(2-CNana), 1
01.5(1-CFuc), 95.7(C-NO2), 81.1, 79.9, 78.5, 78.2,
77.8, 75.8, 74.9, 74.8, 74.7, 74.5, 72.4, 72.1, 7
1.1, 71.0, 70.5, 70.2, 69.6, 65.5, 65.4, 64.4, 63.
2, 62.4, 57.5, 54.6, 42.7, 33.2, 33.0, 25.1, 24.9,
18.2；ESI（電気スプレーイオン化）：1364.1（M＋2N
a）2+
【０１１２】例８ ベンジルオキシカルボニル−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｎ−（５−アセトアミド−３,５−ジデオキシ−Ｄ−グ
リセロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシレート）−
（２→３）−（６−Ｏ−ベンジル−α−Ｌ−フコピラノ
シル）−（１→３）−２−アセトアミド−６−Ｏ−ベン
ジル−１,２−ジデオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース
−（１Nana→４Gal）−ラクトン(１３)の合成（スキー
ム３）：化合物（１１）（１３０mg、０.１０４mmol）
およびＺ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｕ（５２mg、
０.１２４mmol）をＤＭＦ／ジクロロメタン（２ml、
１：１）中に溶解する。２４時間後に溶媒を真空中で除
去する。シリカゲル上カラムクロマトグラフィー（ジク
ロロメタン／メタノール１０：１）に付すと実験式Ｃ 80
Ｈ96Ｎ6Ｏ26(1557.67)を有する保護された中間体（１
３）（９８mg、６０.５％）が無定形固体として得られ
る。1 H-NMR（300MHz，CD3OD）: δ＝0.99(d，3H，6-HFuc),
1.69(dd，1H，3-HNana), 1.80, 1.89(2s，6H，2NHAc),
2.39(dd，1H，3-HNana), 4.28(ddd，1H，4-HNa na), 4.9
6, 5.22(2d，2H，1-HFuc,4-HGal)
【０１１３】例９ Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｎ−（５−アセトアミド−
３,５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２
−ノヌロピラノシレート）−（２→３）−（β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル）−（１→４）−〔(α−Ｌ−フコピ
ラノシル）−（１→３）〕−２−アセトアミド−１,２
−ジデオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース−（１Nana→
４Gal)−ラクトン（１４）の合成（スキーム３）：化合
物（１３）（９０mg、０.０５９mmol）を、メタノール
／ジオキサン／酢酸（４０ml、２：２：１）に溶解し、
Ｐｄ−活性炭（５０mg）の添加後、常圧下に１６時間水
素化する。濾過したのち、溶媒を真空中で除去する。Bi
ogel(登録商標)−Ｐ２上排除クロマトグラフィーに付す
と、実験式Ｃ37Ｈ61Ｎ6Ｏ24（９７３.９）を有する化合
物（１４）が無定形の固体として得られる（４９mg、８
６％）。これはさらに性質を調べることなく直ちに使用
される。
【０１１４】例１０ Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｎ−（５−アセトアミド−
３,５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２
−ノヌロピラノシレート）−（２→３）−（β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル）−（１→４）−〔(α−Ｌ−フコピ
ラノシル）−（１→３)〕−２−アセトアミド−１,２−
ジデオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース（Ｉ−１）の合
成（スキーム３）：化合物（１４）（４５mg、０.０４
６mmol）を、メタノール／水（１０ml、１：１０）に溶
解する。水酸化ナトリウム溶液を用いてpHを９に調整
し、混合物を２０分間攪拌する。Amberlite(登録商標)
ＩＲ−１２０で中和し、濾過し、溶媒を真空中で除去
し、Biogel（登録商標）−Ｐ２上排除クロマトグラフィ
ーに付すと、実験式Ｃ37Ｈ62Ｎ6Ｏ25（９９０.９）を有
する化合物（Ｉ−１）（４３.３mg、９５％）が無色の
無定形の固体として得られる。
【０１１５】例１１ トリメチルエステル（VII−３）の合成：４−（２−カ
ルボキシエチル)−４−ニトロヘプタン二酸トリススク
シンイミドエステル（VII−２）（２.０ｇ、３.５mmo
l）、乾燥ピリジン５０ml、６−アミノヘキサン酸メチ
ルエステル（２.１１ｇ、１４.６mmol）およびトリエチ
ルアミン１.５mlを５０℃で５時間攪拌する。揮発性の
成分を真空中で留去し、残留物をさらに各回５０mlのト
ルエンを用いて２回濃縮する。粗生成物を酢酸エチルに
取り、飽和食塩溶液および飽和炭酸水素ナトリウム溶液
で洗浄する。生成物（VII−３）がシロップとして得ら
れ、これをさらに精製することなく次反応に使用する。
Ｃ31Ｈ54Ｎ4Ｏ11（６５８.８）。収量は１.９５ｇ（８
５％）である。1 H-NMR（300MHz，DMSO-d6）:δ＝1.10-1.60(m，18H，NH
CH2CH2CH2CH2CH2C=O),2.02(m，12H，CH2CH2-C=O), 2.30
(t，6H，CH2COOMe), 3.00(dt，6H，CH2NH), 2.57(s，9
H，Me), 7.85(t，3H，NH)
【０１１６】例１２ トリカルボキシル酸（VII−４）の合成：トリメチルエ
ステル（VII−３）（１.９５ｇ、２.９mmol）を、１０m
lのメタノールおよび４mlの１Ｍ ＮａＯＨとともに室温
で７２時間攪拌する。ＨＣｌでpH＝２の酸性としたの
ち、生成物をジエチルエーテルにより抽出し、乾燥する
と、シロップとして得られる。Ｃ28Ｈ48Ｎ4Ｏ11（６１
６.７）の収量：１.７ｇ（９３％）。1 H-NMR（300MHz，DMSO-d6）:δ＝1.10-1.60(m，18H，NH
CH2CH2CH2CH2CH2C=O),2.02(m，12H，CH2CH2-C=O), 2.19
(t，6H，CH2CO2H), 3.00(dt，6H，CH2NH), 7.85(t，3
H，NH)
【０１１７】例１３ トリス−スクシンイミドエステル（VII−５）の合成：
トリカルボキシル酸（VII−４）（２３５mg、０.３８mm
ol）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２１８mg、１.
９mmol）、およびジシクロヘキシルカルボジイミド（Ｄ
ＣＣ、２８１mg、１.４mmol）を１０mlのＴＨＦ中にお
いて室温で一夜攪拌する。尿素を分離したのち、濾液を
酢酸エチルに取り、冷却下に再度濾過する。水で洗浄
し、濃縮し乾燥すると、生成物が無色の固体として得ら
れる。Ｃ40Ｈ57Ｎ7Ｏ17（９０７.９）の収量は３２５mg
（９４％）である。1 H-NMR（300MHz，DMSO-d6）:δ＝1.15-1.70(m，18H，NH
CH2CH2CH2CH2), 2.02(m，12H，CH2CH2-C=O), 2.65(t，6
H，CH2CO2H), 2.80(s，12H，OSu), 3.00(dt，6H，CH2N
H), 7.86(t，3H，NH)
【０１１８】例１４ 保護ＲＧＤ−Ａｌａ−ＳＬｅＸ複合体の合成： 化合物（Ｉ−２）（表１）の前駆体としてのＺ−Ａｒｇ
(Ｚ２)−Ｇｌｙ−Ａｓｐ(−Ｏ−ベンジル)−Ａｌａ−Ｎ
−（５−アセトアミド−３,５−ジデオキシ−Ｄ−グリ
セロ−Ｄ−ガラクト−２−ノヌロピラノシレート）−
（２→３）−（β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−（１→
４）−〔(α−Ｌ−フコピラノシル）−（１→３）〕−
２−アセトアミド−１,２−ジデオキシ−β−Ｄ−グル
コピラノース−(１Nana→４Gal)−ラクトンの合成：化
合物（１１）（３００mg、０.２４mmol）およびＺ−Ａ
ｒｇ(Ｚ２)−Ｇｌｙ−Ａｓｐ(ＯＢｎ)−Ａｌａ−ＯＨ
（２７０mg、０.３mmol）をＤＭＦ（４ml）中に溶解す
る。１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（４１mg、０.
３mmol）、テトラフルオロホウ酸Ｏ−(１Ｈベンゾトト
リアゾール−１−イル）−Ｎ,Ｎ,Ｎ,Ｎ−テトラメチル
ウロニウム（２３１mg、０.７２mmol）およびＮ−エチ
ルジイソプロピルアミン（７８mg、０.６mmol）を順次
加え、ついで混合物を室温で１時間攪拌する。粗生成物
をジクロロメタン（３００ml）に取り、水ついで炭酸水
素ナトリウム水溶液で洗浄する。ＭｇＳＯ4で乾燥した
のち、真空中で溶媒を除去する。シリカゲル上中圧クロ
マトグラフィー（ジクロロメタン／メタノール１３：
１）に付すと、保護されたＲＥＧ−Ａｌａ−ＳＬｅＸ複
合体（３３５mg、６５％）が無定形の白色固体として得
られる。1 H-NMR（300MHz,CD3OD）: δ＝1.08(d，3H，6-HFuc),
1.3(d，3H，b-HAla), 1.78(dd，1H，3-HNana), 1.91,
2.0(2s，6H，2NHAc), 2.49(dd，1H，3-HNana)，2.79,
3.01(2dd，2H，b-HAsp), 4.46(d，1H，1-HGal), 5.3
(d，1H，1-HFuc)
【０１１９】例１５ Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｎ−（５−アセトアミド−
３,５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクト−２
−ノヌロピラノシレート）−（２→３）−（β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル）−（１→４）−〔(α−Ｌ−フコピ
ラノシル）−（１→３）〕−２−アセトアミド−１,２
−ジデオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース（Ｉ−２）の
合成（表１）：例１４からの保護された前駆体（１２５
mg、０.０５９mmol）を、メタノール／ジオキサン／酢
酸（４０ml、２：２：１）に溶解し、Ｐｄ−活性炭（１
２５mg）の添加後、１６時間常圧下に水素で水素化す
る。濾過したのち、溶媒を真空中で除去する。ラクトン
の開裂はメタノール／水（２０ml、１：１０）中、１Ｍ
水酸化ナトリウム溶液（０.５ml）を使用して、pH８.５
で行う。Amberlite(登録商標)ＩＲ−１２０で中和し、
濾過し、溶媒を真空中で除去し、Biogel(登録商標)−Ｐ
２上にて排除クロマトグラフィーに付すと、実験式Ｃ46
Ｈ78Ｎ10Ｏ28（１２１９.３１）を有する化合物（Ｉ−
２）（８４mg、５８％）が無色の無定形の固体として得
られる。1 H-NMR（300MHz, D2O）: δ＝1.18(d，3H, 6-HFuc), 1.
37(d，3H，b-HAla), 1.8(dd，1H，3-HNana), 1.99, 2.0
4(2s，6H，2NHAc)，2.6-2.9(3dd，3H, b-HAsp,b-HAsp,3
-HNana), 4.52(d，1H，1-HGal), 5.1(d，1H，1-HFuc)；
FAM-MS（高速原子衝撃）：1219.5(MH)+
【０１２０】例１６ ＳＬｅＸコンフィギュレーションを有する（Ｉ−５）の
合成（表１）：本化合物は、EP ０ ６０１ ４１７の操
作に従い得ることができる式Ｃ37Ｈ65Ｎ3Ｏ23（９１９.
９）のＳＬｅＸ四糖（III；ｎ＝６）（１８.５mg、０.
０２０mmol）から市販品を入手できる（Bachem）活性エ
ステルＺ−Ｇｌｕ（ＯＢｎ）ＯＮｐ（９.９mg、０.０２
０mmol）とピリジン（１５ml）中室温で、２４時間攪拌
することによって製造される。ＴＬＣ（ブタノール／ア
セトン／酢酸／水３５：３５：７：２３）でチェックす
ると、炭水化物出発原料と比較して親油性の高い、Ｒf
値０.７６（出発原料：Ｒf０.２１）の生成物が形成さ
れる。１mlに濃縮したのち生成物は３０mlの酢酸エチル
と攪拌して結晶化し、遠心分離によって単離する。攪拌
による結晶化および遠心分離をさらに２回反復する。粗
製の物質（１７mg）をBiogel（登録商標）カラム（１８
×１７０mm）上、水によって溶出し凍結乾燥する。化合
物Ｃ57Ｈ84Ｎ4Ｏ28（１２７３.３）の収量：１６.０mg
（６３％）。以下の反応については例１７参照。
【０１２１】例１７ ＳＬｅＸコンフィギュレーションを有する（Ｉ−６）の
合成（表１）：この化合物は上述の保護中間体（１６.
８mg、０.０１３mmol）からメタノール８ml中Ｐｄ−活
性炭で水素化して製造される。化合物Ｃ42Ｈ72Ｎ4Ｏ26
（１０４９.３）が得られる。ＦＡＢマススペクトル
（３−ニトロベンジルアルコール／ＮａＣｌ）：ｍ／ｅ
＝1049.3〔MH〕+，1073.3〔M＋H〕+。
【０１２２】例１８ ＳＬｅＸコンフィギュレーションを有する（Ｉ−７）の
合成（表１）：ＥＰ ０ ６０１ ４１７の操作に従い製
造される式Ｃ37Ｈ65Ｎ3Ｏ23（９１９.９）のＳＬｅＸ四
糖（III；ｎ＝６）（２３.９mg、０.０２６mmol）なら
びに無水コハク酸（２.６mg、０.０２６mmol）をピリジ
ン１０ml中１０℃で１２時間反応させる（ＴＬＣでチェ
ック）。濃縮後、生成物を水から凍結乾燥する。化合物
Ｃ41Ｈ69Ｎ3Ｏ26（１０１９.０３）の収量：２５.２mg
（９２％）。ＦＡＢマススペクトル（３−ニトロベンジ
ルアルコール）：ｍ／ｅ＝1018.4〔M−H〕-。
【０１２３】例１９ ＳＬｅＸ−Ｓｅｒ複合体（Ｉ−８）の合成（表１）：Ｅ
Ｐ ０ ６０１ ４１７記載の操作に従い製造される実験
式Ｃ37Ｈ63Ｎ3Ｏ22（９０１.９）のＳＬｅＸ四糖（II
I；ｎ＝６、ラクトン型１Nana→４Gal）（７０.０mg、
０.０７７mmol）とＺ−Ｓｅｒ(ＯＢn)−ＯＳｕ（３６.
０mg、０.０８４mmol）を、ピリジン２０ml中室温で２
０時間攪拌する（ＴＬＣチェック）。濃縮後、ラクトン
中間体をメタノール１０ml中１Ｎ ＮａＯＨを用いてpH
１２で加水分解する（ＴＬＣチェック）。酸性イオン交
換樹脂で中和したのち、濃縮し、Sephadex（登録商標）
ＬＨ−２０（３５×７０mm）上メタノールを用いてクロ
マトグラフィーに付す。化合物Ｃ55Ｈ82Ｎ4Ｏ27（１２
３１.３）が７８mg（９０.５％）の収量で得られ、ＳＬ
ｅＸ−Ｇｌｕ複合体について例１６に記載した方法と全
く同様に接触水素化して脱保護できる。すなわち５３mg
（０.０４３mmol）から遊離のＳＬｅＸ−Ｓｅｒ複合体
Ｃ40Ｈ70Ｎ4Ｏ25（１００７.０）が６２mg、ＳＬｅＸ四
糖（III；ｎ＝６、ラクトン型１Nana→４Gal）に基づい
て８０％の収率で得られる。
【０１２４】例２０ Ｐａｍ3Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−ＳＬｅＸ複合体（Ｉ−１４）
の合成（表２）：実験式Ｃ40Ｈ70Ｎ4Ｏ25の例１９に従
って製造されるＳＬｅＸ−Ｓｅｒ複合体（Ｉ−８）（２
０mg、０.０２mmol）を、Ｐａｍ3Ｃｙｓ−ＯＳｕ（３
０.２mg、０.０３mmol；Int．J．Peptide Protein Re
s．37，1991，46に従って製造）とピリジン５ml中室温
で２４時間反応させる。濃縮後、残留物をToyopearl
（登録商標）ＨＷ−４０上溶離剤としてメタノール／ジ
クロロメタン（１：１）を用いてクロマトグラフィーに
付すと実験式Ｃ94Ｈ171Ｎ5Ｏ31Ｓ（１８９９.４）のＰ
ａｍ3Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−ＳＬｅＸ複合体（Ｉ−１４）が
得られる。収量２５mg（６６％）。ＦＡＢ−ＭＳ（グリ
セロール、ＫＣｌ）：ｍ／ｅ＝１８９７.１。
【０１２５】セリン上にベンジル保護基をもつこの化合
物の誘導体は、実施１９からのＺ−およびベンジル保護
前駆体の水素化をＺ保護基の選択的除去後に終結させ
（ＴＬＣチェック）、中間体を上述の方法と同様にして
Ｐａｍ3Ｃｙｓ−ＯＳｕと反応させることにより全く同
様に得られる。実験式Ｃ101Ｈ177Ｎ5Ｏ31Ｓ（１９８９.
６）を有する（Ｉ−１４）のベンジル誘導体が得られ
る。 ＦＡＢ−ＭＳ（グリセロール、ＫＣｌ）：ｍ／ｅ＝198
8.1．1H-NMR（500MHz，CD3OD/CDCl3＝2/1）:δ＝0.90(3
t，9H，CH3-Pam), 1.17(d，3H，6-HFuc), 1.20-1.70
(m，約86H，CH2), 1.74(m，1H，3-HNana/ax), 1.96，2.
03(2s，6H，2NAc),2.20-2.40(m，6H，C14H29CH2COO),
2.68-2.91(m，3H，1×CH3Sおよび3-HNana/eq), 3.33
(m，2H，CH2CH2NHCO), 5.04(d，1H，1-HFuc), 5.18(m，
1H，C14H29CH2CO-OCH)，7.30(m，5H，Phe)。13C-NMR(12
5.7MHz, CD3OD/CDCl3＝2/1）: δ＝103.42, 101.82, 10
0.23, 99.41(1-CGal, 1-CGlcNAc, 2-CNana, 1-CFuc), 1
6.31(6-CF uc),14.37(16-C-Pam,3x)
【０１２６】例２１ ＳＬｅＸコンフィギュレーションを有する複合体（Ｉ−
９）の合成（表１）：ＥＰ ０ ６０１ ４１７の操作に
従い製造される式Ｃ37Ｈ65Ｎ3Ｏ23（９１９.９）のＳＬ
ｅＸ四糖（III；ｎ＝６）（２０.０mg、０.０２２mmo
l）をピリジン１０ml中に溶解して、スクシンイミジル
４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カ
ルボキシレート（ＳＭＣＣ、 Pierce）７.３mg(０.０２
２mmol）で処理する。室温で２０時間攪拌したのち（Ｔ
ＬＣでチェック）、生成物を酢酸エチルにより沈殿させ
て、遠心分離で単離する。酢酸エチルで洗浄したのち、
生成物を水に溶解し、滅菌濾過し、凍結乾燥する。実験
式Ｃ49Ｈ78Ｎ4Ｏ26（１１３９.１７）を有する化合物
（Ｉ−９）２０.３mg（８１％）が得られる。ＦＡＢ−
ＭＳ(３−ニトロベンジルアルコール)：ｍ／ｅ＝１１３
７.５〔Ｍ−Ｈ〕-。
【０１２７】ＥＰ ０ ６０１ ４１７記載の操作に従い
製造される実験式Ｃ37Ｈ63Ｎ3Ｏ22（９０１.９）のＳＬ
ｅＸ四糖（III；ｎ＝６、ラクトン型１Nana→４Gal）を
ピリジン中ＳＭＣＣと同様に反応させ、ラクトンを例１
９の記載と同様の方法でメタノール／水中水酸化ナトリ
ウムで開裂してマレイミド環を開き、酸性化し、生成物
をBiogel（登録商標）上クロマトグラフィーによって精
製すると式Ｃ49Ｈ80Ｎ 4Ｏ27（１１５７.１７）の加水分
解精製物が得られる。ＦＡＢ−ＭＳ（グリセロール、Ｋ
Ｃｌ）：ｍ／ｅ＝１１５５.６〔Ｍ−Ｈ〕-。電気スプレ
ーイオン化ＭＳ（ＥＳＩ、グリセロールマトリック
ス）：ｍ／ｅ＝1158〔Ｍ−Ｈ〕+，ｍ／ｅ＝１１８０
〔Ｍ＋Ｎａ〕+。この化合物は水溶液中でさらに徐々に
加水分解してマレイン酸が除去されて、Ｃ45Ｈ78Ｎ4Ｏ
24（１０５９.１２）が形成する。ＦＡＢ−ＭＳ（グリ
セロール）：ｍ／ｅ＝１０５７.６〔Ｍ−Ｈ〕-。
【０１２８】例２２ ＳＬｅＸコンフィギュレーションをもつ複合体（Ｉ−１
０）の合成（表１）：ＥＰ ０ ６０１ ４１７の操作に
従い製造される式Ｃ37Ｈ65Ｎ3Ｏ23（９１９.９）のＳＬ
ｅＸ四糖（III；ｎ＝６）（２１.３mg、０.０２３mmo
l）をピリジン１０ml中に溶解し、Ｎ−スクシンイミジ
ル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤ
Ｐ、 Pierce）７.２４mg(０.０２３mmol）で処理する。
室温で１６時間攪拌後（ＴＬＣでチェック）。生成物を
酢酸エチルを用いて沈殿させ遠心分離で単離する。酢酸
エチルで洗浄したのち生成物を水に溶解し、滅菌濾過
し、凍結乾燥する。実験式Ｃ45Ｈ72Ｎ4Ｏ24Ｓ2(１１１
７.２）を有する化合物（Ｉ−１０）２０.２mg（７８
％）が得られる。ＦＡＢ−ＭＳ（３−ニトロベンジルア
ルコール）：ｍ／ｅ＝１１１５.５〔Ｍ−Ｈ〕-。
【０１２９】例２３ ＳＬｅＸコンフィギュレーションをもつ複合体（Ｉ−１
１）の合成（表１）：ＥＰ ０ ６０１ ４１７の操作で
製造される式Ｃ37Ｈ65Ｎ3Ｏ23（９１９.９）のＳＬｅＸ
四糖（III；ｎ＝６）（２２.０mg、０.０２４mmol）を
ピリジン１０ml中に溶解し、ＮＨＳ−ビオチン（Pierc
e）８.２mg(０.０２４mmol）で処理する。室温で４８時
間攪拌したのち（ＴＬＣでチェック）、溶媒を真空中で
除去し、生成物をBiogel（登録商標）上で精製する。実
験式Ｃ47Ｈ79Ｎ5Ｏ25Ｓ(１１４６.２２）を有する化合
物（Ｉ−１１）２３mg（８３％）が得られる。ＦＡＢ−
ＭＳ（３−ニトロベンジルアルコール）：ｍ／ｅ＝１１
４４.４〔Ｍ−Ｈ〕-。
【０１３０】この化合物のストレプトアビジン複合体は
以下のようにして得られる。ストレプトアビジン（１０
mg、 PierceのNo．２１１２５）を５mlの水に溶解し、
１.５４mg（１.３４μmol）の（Ｉ−１１）で処理す
る。１時間後に、生成物をBiogel（登録商標）Ｐ２上で
精製する。凍結乾燥後、無色のＳＬｅＸ−ビオチン−ス
トレプトアビジン複合体１３.７mgが得られる。
【０１３１】例２４ ＳＬｅＸコンフィギュレーションをもつ複合体（Ｉ−1
2）の合成（表２）：Ｎ−ホルミル−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−
Ｐｈｅ−ＯＨ（１００mg、０.２３mmol）、Ｎ−ヒドロ
キシスクシンイミド（２９mg、０.２５mmol）、および
ジシクロヘキシルカルボジイミド（５２mg、０.２５mmo
l）を３mlのＤＭＦ中で１２時間攪拌する。真空中で濃
縮し、残留物を５mlのピリジン中に取り、ＥＰ ０ ６０
１ ４１７記載の操作に従い製造される実験式Ｃ37Ｈ63
Ｎ3Ｏ22（９０１.９）のＳＬｅＸ四糖（III；ｎ＝６、
ラクトン型１Nana→４Gal）（９０mg、０.０９９mmol）
およびジイソプロピルエチルアミン（０.５ml）で処理
する。
【０１３２】室温で１４時間攪拌したのち、ピリジンを
真空中で除去する。残留物を５mlのメタノールおよび水
１mlに溶解し、１ＮのＮａＯＨを用いてpH＝１１.５に
調整する。１時間後に、混合物を０.１ＮのＨＣｌで中
和し、生成物をToyopearl（登録商標）ＨＷ−４０／メ
タノール上で精製する。実験式Ｃ58Ｈ94Ｎ6Ｏ27Ｓ（１
３３９.４６）の生成物（Ｉ−１２）５６mg（４２％）
が得られる。 電気スプレーイオン化ＭＳ（ＥＳＩ、グリセロールマト
リックス）：ｍ／ｅ＝1361.6〔M＋Na〕+。1 H-NMR（500MHz，CD3OD）: δ＝0.85, 0.91(2d，6H，CH
3-Leu)，1.16(d，3H，6-HFuc), 1.73(m，1H，3-HNana),
1.95，2.00(2s，6H，2NAc), 2.08(s，3H，CH3S), 2.50
(m，CH2S), 2.87(m，1H，3-HNana ), 3.29(m，2H，CH2C
H2NHCO)，4.04(m，1H，3-HGal), 5.05(d，1H，1-HFuc),
7.22(m，5H，Phe), 8.10(s，1H，NHCHO)
【０１３３】例２５ Ｐａｍ3Ｃｙｓ−ＳＬｅＸ複合体（Ｉ−１３）の合成
（表２）:ＥＰ ０ ６０１ ４１７の操作に従い製造され
る式Ｃ37Ｈ65Ｎ3Ｏ23（９１９.９）のＳＬｅＸ四糖（II
I；ｎ＝６）（３８mg、０.０４１mmol）をピリジン１０
ml中、Ｐａｍ3Ｃｙｓ−ＯＳｕ（６０.４mg、０.０６mmo
l；Int．J．Peptide Protein Res. 37, 1991, 46）と室
温で２４時間反応させる。濃縮後、生成物をToyopearl
（登録商標）ＨＷ−４０上ジクロロメタン／メタノール
（１：１）を用いて精製する。実験式Ｃ91Ｈ166Ｎ4Ｏ29
Ｓ（１８１２.３９）のＰａｍ3Ｃｙｓ−ＳＬｅＸ複合体
（Ｉ−１３）が得られる。収量：４０mg（５４％）。Ｆ
ＡＢ−ＭＳ（グリセロール）：ｍ／ｅ＝１８１２.４
〔ＭＨ〕+。
【０１３４】例２６ Ｐａｍ3Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＳＬｅＸ複合体（II
−１７）の合成 ５０mg（０.０４８mmol）のＰａｍ3Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ｇ
ｌｙ−ＯＨ（Int．J．Peptide Protein Res. 37, 1991,
46）から実施２４に記載の方法と同様にしてＯＳｕエ
ステルを調製して、５mlのピリジン中、ＥＰ ０ ６０１
４１７の操作に従って製造される式Ｃ37Ｈ65Ｎ3Ｏ
23（９１９.９）のＳＬｅＸ四糖（III；ｎ＝６）３０mg
（０.０３３mol）と６５℃で３０分間反応させる。濃縮
したのち、生成物をToyopearl（登録商標）ＨＷ−４０
上溶出液としてジクロロメタン／メタノール（１：１）
を用いてクロマトグラフィーに付す。実験式Ｃ96Ｈ174
Ｎ6Ｏ 31Ｓ（１９４０.５）の化合物（Ｉ−１７）が得ら
れる。収量：３７mg（５８％）。ＦＡＢ−ＭＳ（グリセ
ロール）：ｍ／ｅ＝１９３８.１〔Ｍ−Ｈ〕-。
【０１３５】例２７ ＳＬｅＸコンフィギュレーションを有するビタミンＡ複
合体（Ｉ−１５）の合成（表２）：ビタミンＡ酸（７
９.５mg、０.２６５mmol）を、ＨＯＳｕ（３３.５mg、
０.２９２mmol）およびＤＣＣ（５７mg、０.２７８mmo
l）と、５mlのジクロロメタンと１mlのＴＨＦ中で１２
時間反応させた（ＴＬＣチェック）。濾液を濃縮し乾燥
する。粗生成物のＯＳｕエステルの収量は１１７mgであ
る。この粗製の生成物（２４mg、０.０６mmol）を、Ｅ
Ｐ ０ ６０１ ４１７の手順に従って製造される実験式
Ｃ37Ｈ63Ｎ3Ｏ22（９０１.９）のＳＬｅＸ四糖（III；
ｎ＝６、ラクトン型１Nana→４Gal）５４mg（０.０５７
mmol）およびジイソプロピルエチレンアミン（０.５m
l）とピリジン５ml中アルゴン下、室温で１６時間、次
いで４０℃で８時間反応させる。この溶液を濃縮したの
ち、生成物をジクロロメタンから攪拌しながら結晶化さ
せ、濾過する。固体を水３mlに溶解し、０.１ＮのＮａ
ＯＨを用いてpH＝１１.５に調整する。２時間攪拌した
のち、混合物を中和し、生成物をEurosil Bioselect
（登録商標）−１００ ＲＰ−１８（２５０×２０mm）
上、２０〜６０％アセトニトリル／水を用いた分取用Ｈ
ＰＬＣによって精製する。実験式Ｃ57Ｈ91Ｎ3Ｏ24（１
２０２.４）を有する（Ｉ−１５）２９mg（４２％）が
得られる。電気スプレーイオン化ＭＳ（ＥＳＩ、グリセ
ロールマトリックス）：ｍ／ｅ＝１２０３〔ＭＨ〕+。
第二の成分として酸化された種が検出された：ｍ／ｅ＝
１２１９、１２３５。1 H-NMR（300MHz, CD3OD）: δ＝1.02(s，6H，2CH3), 1.
15(d，3H,6-HFuc), 1.72(s，3H，CH3), 1.95, 2.00(2
s，6H，2NAc), 1.98(s，3H，CH3), 2.29(s，3H，CH3),
2.87(dd，1H，3-HNana/eq), 3.20(m，2H，CH2CH2NHCO),
4.41, 4.51(2d,各1H，1-HGal,1-HGlcNAc), 5.05(d，1
H，1-HFuc), 6.05-6.40(m, 約5H，CH=), 6.05(dd，J=11
Hz，J=15Hz，1H，CH=)
【０１３６】例２８ フルオレセイン複合体（Ｉ−１６）の合成（表３）：Ｅ
Ｐ ０ ６０１ ４１７の手順に従い製造されるＳＬｅＸ
四糖（III；ｎ＝６、ラクトン型１Nana→４Gal：Ｃ37Ｈ
63Ｎ3Ｏ22＝９０１.９）１.３０ｇ（１.４４mmol）およ
びフルオレセインイソチオシアネート（Fluka No. 4695
1）０.５７ｇ（１.４６mmol）を、ピリジン１８０ml中
室温で２０時間攪拌する。濃縮乾固したのち残留物を水
３mlに溶解し、０.１ＮのＮａＯＨを用いてpH＝１２に
調整し、室温で１時間攪拌したのちに、ＨＣｌ／水によ
って中和する。生成物をBiogel（登録商標）Ｐ２上にお
いて精製する。収量：１.６７ｇ（８８.６％）、固体
（橙色）。 実験式Ｃ58Ｈ76Ｎ4Ｏ28Ｓ（１３０９.３）。ＦＡＢ−Ｍ
Ｓ（グリセロール／メタノール）：ｍ／ｅ＝１３０９.
０〔ＭＨ〕+、１３３０.８〔Ｍ＋Ｎａ〕+。
【０１３７】例２９ ３価化合物（II−２）の合成（表３） ＥＰ ０ ６０１ ４１７の手順に従い製造されるＳＬｅ
Ｘ四糖（III；ｎ＝６、ラクトン型１Nana→４Gal：Ｃ37
Ｈ63Ｎ3Ｏ22＝９０１.９）３０mg（０.０３３mmol）、
および例６に従って製造されるトリススクシンイミド
（VII−２）５.４mg（０.０１mmol）をピリジン７ml
中、６０℃で７時間攪拌する。濃縮したのち、残留物を
水３mlに溶解し、１ＮのＮａＯＨを用いてpH＝１２に調
整し、１時間後に酸性イオン交換樹脂を用いて中和し、
生成物をBiogel（登録商標）Ｐ４／水で精製する。実験
式：Ｃ121Ｈ204Ｎ10Ｏ74（２９８３.０）の化合物（II
−２）２４mg（８４％）が無色粉末として得られる。電
気スプレーイオン化ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｅ＝９９３.
３〔Ｍ−３Ｈ〕3-、１４９０.４〔Ｍ−２Ｈ〕2-。1 H-NMR（500MHz, D2O）: δ＝1.17(d，3H，J＝6.5Hz，6
-HFuc), 1.28-1.38(m，4H，NCH2CH2CH2CH2CH2CH2O)，1.
45-1.59(m，4H，NCH2CH2CH2CH2CH2CH2O), 1.80(pseudo-
t，J＝12Hz，1H，3-HNana/ax), 2.02, 2.04(2s，6H，2N
Ac), 2.20-2.30(m，4H，CH2CH2CNO2), 2.77(dd，1H，J
＝4.5Hz，J＝12.5Hz，3-HNana/eq), 3.16(t，2H，J＝6.
5Hz，CH2CH2NHCO), 3.53(dd，1H，J＝7.5Hz，J＝9.5H
z，2-HGal), 4.09(dd，1H，J＝3.0Hz, J＝9.5Hz，3-H
Gal), 4.53(2d，2H，1-HGal，1-HGlc NAc), 4.83(m，1
H，H-5Fuc), 5.11(d，1H，J＝4.0Hz，1-HFuc)13 C-NMR(125.7MHz，D2O):δ＝175.06, 174.14, 174.12,
173.93(C=O), 101.66(1-CGal), 101.01(1-CGlcNAc), 9
9.70(2-CNana), 98.65(1-CFuc), 75.68，75.29，74.92,
74.89(3-CGal，5-CGlcNAc，3-CGlcNAc，5-CGal), 73.3
9, 72.94(4-CGl cNAc,6-CNana), 71.94，71.88(4-CFuc,8
-CNana), 70.52(スペーサーCH2O)，69.30，69.22(2-C
Gal，3-CFuc), 68.36，68.14(4-CNana，7-CNana)，67.7
5, 67.34，66.71(2-CFuc，4-CGal，5-CFuc), 62.62(9-C
Nana)，61.51(6-CGal), 59.70(6-CG lcNAc), 55.17(2-C
GlcNAc), 51.73(5-CNana)，39.81, 39.46(スペーサーCH
2NH,3-CNana), 30.64, 30.18〔C(NO2)CH2CH2〕, 28.55,
28.25, 25.75, 24.78(NCH2CH2CH2CH2CH2CH2O), 22.3
1, 22.07(NAc), 15.31(6-CFuc)
【０１３８】例３０ ３価化合物（II−３）の合成（表３）：EP 0 601 417の
手順に従い製造されるＳＬｅＸ四糖（III；ｎ＝６、ラ
クトン型１Nana→４Gal：Ｃ37Ｈ63Ｎ3Ｏ22＝９０１.
９）９８mg（０.１０８mmol）、および例１３に従って
製造されるトリススクシンイミド（VII−５）３０mg
（０.０３３mmol）を、ピリジン10ml中、６０℃で１０
時間攪拌する。濃縮したのち、残留物を水１０mlに溶解
し（白濁溶液）、１ＮのＮａＯＨを用いてpH＝１２に調
整し、１時間後に酸性イオン交換樹脂を用いて中和し、
生成物をBiogel（登録商標）Ｐ４／水で精製する。実験
式：Ｃ139Ｈ237Ｎ13Ｏ77（３３２２.４）の化合物（II
−２）１７mg（VII−５に基づいて１５％、四糖に基づ
いて１４％）が無色の粉末として得られる。電気スプレ
ーイオン化ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｅ＝１１０６.５〔Ｍ
−３Ｈ〕3-、平均分子量２４２０を示す２価化合物はＭ
Ｓで痕跡しか認められない：ｍ／ｅ＝８０５.８〔Ｍ−
３Ｈ〕3-。1 H-NMR（500MHz, D2O）: δ＝1.13(d，3H，J＝6.5Hz，6
-HFuc), 1.22-1.33(m，6H，NCH2CH2CH2CH2CH2CH2Oおよ
びNHCOCH2CH2CH2CH2CH2CO), 1.40-1.60(m，8H，NCH2CH2
CH2CH2CH2CH2OおよびNHCOCH2CH2CH2CH2CH2CO), 1.75(ps
eudo-t, J＝12Hz，1H，3-HNana/ax), 1.97, 1.99(2s，6
H，2NAc), 2.15-2.27(m，6H，CH2CH2CNO2およびCH2CH2C
H2CONH), 2.74(dd，1H，J＝4.5Hz，J＝12.5Hz，3-H
Nana/eq)，3.13(2t，4H，J＝6.5Hz，2×CH2NHCO), 4.04
(dd，1H，J＝3.0Hz，J＝9.5Hz，3-HG al), 4.48(2d，2
H，1-HGal, 1-HGlcNAc), 4.78(m，1H，H-5Fuc), 5.07
(d，1H，J＝4.0Hz，1-HFuc)13 C-NMR(125.7MHz,D2O):δ＝176.50, 174.92, 173.97,
173.90, 173.79(CO)，101.52(1-CGal), 100.88(1-C
GlcNAc), 99.56(2-CNana), 98.51(1-CFuc), 93.39(CN
O2), 75.55, 75.16, 74.79, 74.76(3-CGal，5-
CGlcNAc，3-CGlcNAc，5-CGal), 73.25, 72.81(4-C
GlcNAc，6-CNana), 71.95, 71.80(4-CFuc，8-CNana), 7
0.36(スペーサーCH2O), 69.42, 69.17, 68.21, 68.01,
67.62, 67.21, 66.58(2-CGal，3-CFuc，4-CNana,7-C
Nana，2-CFuc，4-CGal，5-CFuc), 62.49(9-CNana), 61.
38, 59.56(6-CGal，6-CGlcNAc), 55.75(2-CGlcNAc), 5
1.60(5-CNana)，39.67, 39.17, 39.12(2×スペーサーCH
2NH，3-CNana), 35.58(OC6H12NH-COCH2), 30.55およびN
HCOCH2CH2CH2CH2CH2CO), 22.17, 21.93(NAc), 30.06〔C
(NO2)CH2CH2〕, 28.45, 28.26, 27.79, 25.64, 25.40，
24.99, 24.68(NCH2CH2CH2CH2CH2CH2O), 15.18(6-CFuc)
【０１３９】例３１ 白血球接着−インビボ活性の試験：炎症過程および他の
サイトカイン活性化条件においては、白血球遊走による
組織破壊または微小循環の遮断が重大な役割を果してい
る。その後の疾患過程に重要な初期相は血流内とくに前
および後毛細血管領域における白血球の活性化である。
白血球が血液の軸流を離れたのち、血管の内壁すなわち
血管内皮に対する白血球の最初の付着がこの場合に起こ
る。それに続くすべての白血球の作用、すなわち血管壁
を通しての能動的遊走およびその後の組織内での定方向
遊走が以後の反応である〔Harlan，J.M.，Leucocyte-en
dothelial interaction（白血球−内皮相互作用）、Blo
od 65，513-525，1985〕。
【０１４０】この受容体によって誘発される白血球と内
皮細胞の相互作用は、炎症過程の初期の徴候と考えられ
る。既に生理学的に発現されている接着分子に加えて、
炎症メディエーター（ロイコトリエン、ＰＡＦ）および
サイトカイン（ＴＮＦ−α、インターロイキン）の作用
下、接着分子の一時的に緩徐な大量発現が細胞上に起こ
る。それらは現在では３群に分けられている。すなわ
ち、１．免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリー、
２．インテグリンおよび３．セレクチンである。接着は
Ｉｇ遺伝子スーパーファミリーの分子およびタンパク質
−タンパク質間結合に起こるが、セレクチン間の協力に
よるレクチン−炭水化物の結合が支配的である〔Spring
er, T.A., Adhesion receptors of the immune system
(免疫系の接着受容体)。Nature 346, 425-434，1990; H
uges，G., Cell adhesion molecules-thekey to a univ
ersal panacea (細胞接着分子−普遍的な万能薬への
鍵)。Scrips Magazine 6, 30-33, 1993；Springer, T.
A., Traffic signals for lymphocyterecirculation an
d leucocyte emigration；The multistep paradigm (リ
ンパ球再循環および白血球遊走のための胸腺依存シグナ
ル)。Cell 76，301-314，1994〕。
【０１４１】方法：白血球の誘導された接着は、生体内
顕微鏡検査技術を用いラットの腸間膜で定量される〔At
herton A. & Born G.V.R., Quantitative investigatio
ns of theadhesiveness of circulating polymorphnucl
ear leucocytes to blood vesselwalls(血管壁への循環
多形核白血球の接着の定量的検討)。J．Physiol. 222,
447-474，1972；Seiffge，D.，Methoden zur Untersuch
ung der Rezeptor-vermitteltenInteraktion zwischen
Leukozyten und Endothelzellen im Entzuendungs-gesc
hehen in Ersatz-und Ergaenzungsmethoden zu Tierver
suchen in der biomedizinischen Forschung（炎症現象
における白血球と内皮細胞間の受容体誘発相互作用の検
討方法。生物医学的研究における動物実験のための置換
および代替方法）Schoeffl, H.等(編), Springer, 1955
(印刷中)〕。長期麻酔は、吸入エーテル麻酔下にウレタ
ン（１.２５mg／kg体重）の筋肉内注射によって開始す
る。血管（物質の注射には大腿静脈、血圧の測定には頸
動脈）を露出させたのち、それらの中にカテーテルを結
紮する。こののちに、相当する透明な組織（腸間膜）を
文献既知の標準方法に従って遊離させ、顕微鏡のステー
ジ上に配置し、３７℃の温液体パラフィンによりコート
する〔Menger，M.D. & Lehr，H.，A scope and perspec
tives of intravital microscopy-bridge over from in
vitro to in vivo(インビトロからインビボへ生体内顕
微鏡の架け橋の範囲と展望)、Immunology Today 14, 51
9-522, 1933〕。試験物質の動物への投与は静脈内に実
施する（１０mg／kg）。血球の接着の実験的増大は、試
験物質投与から１５分後に、リポ多糖(ＬＰＳ、１５mg
／kg）の全身的な投与によるサイトカインの活性化によ
って誘導される〔Foster S.J.，McCormick L.M., Ntolo
si B.A. & Campbell D., Production of TNF-α by LPS
-stimulated murine，rat and human blood and its ph
armacological modulation(ＬＰＳ刺激マウス、ラット
およびヒト血液によるＴＮＦ−αの産生ならびにその薬
理学的調節), Agents and Actions 38, C77-C79,1993,
18.01.1995〕。この方法で生じる内皮への白血球の接着
の増大は直接生体内顕微鏡によりまたは蛍光染料の補助
によって定量される。測定操作はビデオカメラによって
記録し、ビデオテープに保存する。６０分間にわたっ
て、回転する白血球の数（すなわち、赤血球の流れより
遅いすべての可視回転白血球）および内皮に接着した
（５分を越える滞留時間の）白血球の数を１０分毎に測
定する。実験完了後、麻酔動物はＴ６１の全身投与によ
って覚醒させることなく苦痛を与えずに殺す。分析に
は、各場合８匹の処置動物を８匹の非処置動物（対照）
と比較する（百分率データ）。
【０１４２】化合物II−２、II−１、Ｉ−２、Ｉ−９な
らびにＩ−９およびＩ−１４の誘導体についての結果を
図１に示す。
【図面の簡単な説明】
【図１】白血球の接着−インビボ活性の試験（例３１）
の結果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 31/70 ＡＤＳ Ａ６１Ｋ 31/70 ＡＤＳ ＡＥＤ ＡＥＤ 38/00 ＡＤＵ 39/00 ＡＢＧＡ 39/00 ＡＢＧ Ｃ０７Ｈ 15/04 Ｅ Ｃ０７Ｈ 15/04 8517−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 5/09 Ｃ０７Ｋ 5/09 8517−4Ｈ 5/11 5/11 8517−4Ｈ 14/78 14/78 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＤＵ (72)発明者 ウルリツヒ・シユプレンガルト ドイツ連邦共和国デー−51126マインツ. ミユールタールシユトラーセ17 (72)発明者 エカルト・バールトニク ドイツ連邦共和国デー−65205ヴイースバ ーデン．カールスルーアーシユトラーセ８ (72)発明者 デイルク・ザイフゲ ドイツ連邦共和国デー−55246マインツ− コストハイム．コストハイマーラントシユ トラーセ11 (72)発明者 ホルスト・クンツ ドイツ連邦共和国デー−55127マインツ. ゲマインデホール50

Claims (28)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 式Ｉ Ｚ−Ｙ−(ＣＨ2)n−〔ＮＨ(ＣＯ)〕p−Ｒ2 Ｉ 〔式中、 Ｚは、分岐型四糖であり、 Ｙは、酸素またはＮＨ(ＣＯ)であり、 Ｒ2は、アミノ酸もしくは６個までのアミノ酸のオリゴ
    ペプチド残基、脂肪族もしくは脂環式単位から形成され
    る親油性残基、脂肪族および異項環単位の組合せまたは
    トリフェニルメタン染料であり、 Ｙが酸素である場合には、ｐは１であり、ｎは２〜１０
    の整数であり、 ＹがＮＨ(ＣＯ)でｐが０の場合にはｎは０〜１０の整数
    であり、 ＹがＮＨ(ＣＯ)でｐが１の場合にはｎは１〜１０の整数
    である〕の化合物。
  2. 【請求項２】 Ｒ2が式ＩＡ 【化１】 （式中、 ｍは０〜１０の整数であり、 ｐとｑは０または１である。ただし、ｍ＝０の場合は、
    ｐまたはｑのいずれかは０である）の基である請求項１
    に記載の化合物。
  3. 【請求項３】 Ｒ2が−ＣＨ2ＮＨ(ＣＯ)ＣＨ2ＮＨ2であ
    る請求項１に記載の化合物。
  4. 【請求項４】 Ｒ2が−ＣＨ〔(Ｓ)−ＣＨ3〕ＮＨＣＯＣ
    Ｈ〔(Ｓ)−ＣＨ2ＣＯ2Ｈ〕ＮＨＣＯＣＨ2ＮＨＣＯＣＨ
    〔(Ｓ)−(ＣＨ2)3ＮＨ(Ｃ＝ＮＨ)ＮＨ2〕ＮＨ2である請
    求項１に記載の化合物。
  5. 【請求項５】 Ｒ2が、−(ＣＨ2)6−ＮＨ2である請求項
    １に記載の化合物。
  6. 【請求項６】 Ｒ2が、−ＣＨ(ＮＨ2)−(ＣＨ2)2−ＣＯ
    ＯＨである請求項１に記載の化合物。
  7. 【請求項７】 Ｒ2が、−(ＣＨ2)2−ＣＯＯＨである請
    求項１に記載の化合物。
  8. 【請求項８】 Ｒ2が、−ＣＨ(ＮＨＺ)ＣＨ2ＯＢｎ（式
    中、Ｚはベンジルオキシカルボニルであり、Ｂｎはベン
    ジルである）である請求項１に記載の化合物。
  9. 【請求項９】 Ｙが酸素であり、ｎが６であり、ｐが１
    であり、Ｒ2が 【化２】 である請求項１に記載の化合物。
  10. 【請求項１０】 Ｙが酸素であり、ｎが６であり、ｐが
    １であり、Ｒ2が 【化３】 である請求項１に記載の化合物。
  11. 【請求項１１】 Ｙが酸素であり、ｎが６であり、ｐが
    １であり、Ｒ2が 【化４】 である請求項１に記載の化合物。
  12. 【請求項１２】 Ｙが酸素であり、ｎが６であり、ｐが
    １であり、Ｒ2が 【化５】 である請求項１に記載の化合物。
  13. 【請求項１３】 Ｙが酸素であり、ｎが６であり、ｐが
    １であり、Ｒ2が 【化６】 である請求項１に記載の化合物。
  14. 【請求項１４】 Ｙが酸素であり、ｎが６であり、ｐが
    １であり、Ｒ2が 【化７】 である請求項１に記載の化合物。
  15. 【請求項１５】 Ｙが酸素であり、ｎが６であり、ｐが
    １であり、Ｒ2が 【化８】 である請求項１に記載の化合物。
  16. 【請求項１６】 Ｙが酸素であり、ｎが６であり、ｐが
    １であり、Ｒ2が 【化９】 である請求項１に記載の化合物。
  17. 【請求項１７】 Ｚがシアリル−ルイスＸである請求項
    １〜１６の１項に記載の化合物。
  18. 【請求項１８】 Ｚがシアリル−ルイスＡである請求項
    １〜１６の１項に記載の化合物。
  19. 【請求項１９】 式IIIの化合物 Ｚ−Ｏ−(ＣＨ2)n−ＮＨ2 III、 式IVの化合物 Ｚ−ＮＨ2 IV または式Ｖの化合物 Ｚ−ＮＨ(ＣＯ)−(ＣＨ2)n−ＮＨ2 Ｖ （式中、Ｚおよびｎは上述の意味を有する）を式VI Ｘ(ＣＯ)Ｒ2 VI （式中、 Ｘはヒドロキシルまたはカルボキシル活性化離脱基であ
    り、 Ｒ2は上述の意味を有し、 前駆体III、IVまたはＶの分岐型四糖Ｚは場合により保
    護の形態で使用されるが、好ましくは非保護の形態で用
    いられる）の化合物と反応させることからなる請求項１
    〜１８の１項に記載の化合物を製造する方法。
  20. 【請求項２０】 化合物IV中のＸが、Ｏ−スクシンイミ
    ジル基である請求項１９に記載の方法。
  21. 【請求項２１】 ピリジンが溶媒として用いられる請求
    項１９または２０に記載の方法。
  22. 【請求項２２】 Ｎ,Ｎ−ジメチルホルムアミドが溶媒
    として用いられる請求項１９または２０に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前駆体III、IVまたはＶの四糖残基Ｚ
    中のシアル酸がラクトンの形態で存在する請求項１７ま
    たは１８に記載の化合物を製造する請求項１９〜２２の
    １項に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 化合物VI中のＲ2が式ＩＢ 【化１０】 （式中、変数ｍおよびｑは請求項４に定義した意味をも
    つ）の基である、請求項２に記載の化合物を製造する請
    求項１９〜２３の１項に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 請求項１〜１８の１項に記載の化合物
    および、必要に応じて医薬補助剤を含有する医薬。
  26. 【請求項２６】 細胞−細胞接着の増大によって生じる
    疾患の予防または治療用医薬の製造のための請求項１〜
    １８の１項に記載の化合物の使用。
  27. 【請求項２７】 細胞−細胞接着の増大を伴う疾患の診
    断用組成物の製造のための請求項１〜１８の１項に記載
    の化合物の使用。
  28. 【請求項２８】 合成ワクチンの製造のための請求項１
    〜１８の１項に記載の化合物の使用。
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