JPH08325266A - 新規なキニジン誘導体 - Google Patents
新規なキニジン誘導体Info
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- JPH08325266A JPH08325266A JP8135464A JP13546496A JPH08325266A JP H08325266 A JPH08325266 A JP H08325266A JP 8135464 A JP8135464 A JP 8135464A JP 13546496 A JP13546496 A JP 13546496A JP H08325266 A JPH08325266 A JP H08325266A
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 新規なキニジン誘導体を提供すること。
【解決手段】 式：
【化１】
〔式中、Ｌは直鎖又は分枝鎖、飽和又は不飽和のいずれ
でもよく、ヘテロ原子０〜３個を含むことができるＣ1
−Ｃ10炭化水素連結基であり；Ｆはアミノ、カルボキシ
ル、スルフヒドリル、イミノ及びマレイミドから成る群
から選択される官能基である〕で示される化合物。
でもよく、ヘテロ原子０〜３個を含むことができるＣ1
−Ｃ10炭化水素連結基であり；Ｆはアミノ、カルボキシ
ル、スルフヒドリル、イミノ及びマレイミドから成る群
から選択される官能基である〕で示される化合物。
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】本発明は血清中のキニジンの
定量に用いる試薬に関する。特に、本発明は新規なキニ
ジン誘導体を用いる改良された蛍光偏光イムノアッセイ
と、このようなアッセイにおける試薬としての、前記新
規な誘導体から得られる、新規なハプテン、抗体及びト
レーサーとに関する。
定量に用いる試薬に関する。特に、本発明は新規なキニ
ジン誘導体を用いる改良された蛍光偏光イムノアッセイ
と、このようなアッセイにおける試薬としての、前記新
規な誘導体から得られる、新規なハプテン、抗体及びト
レーサーとに関する。
【０００２】
【従来の技術】キニジンは心臓不整脈の治療のために一
般に処方される薬剤であり、したがって患者の血液中の
その濃度は重要であり、その投与中に細心に監視され
る。１．５〜５ｍｇ／ｍｌの血清キニジンレベルが、キ
ニジン代謝物並びにキニジンを測定する、非特異的方法
論に基づく治療法として報告されている〔Ｐｈｙｓｉｃ
ｉａｎ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，４６版，Ｍｏ
ｎｔｖａｌｅ，Ｎ．Ｊ．；Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏ
ｍｉｃ Ｄａｔａ；１９９３：６８８〜６８９〕。キニ
ジンは治療的監視の効力が実証された最初の抗不整脈剤
であった。キニジンの治療濃度範囲は非常に狭く、過剰
投与量による有害な影響は心臓疾患の症状によく似るこ
とがある。治療血清レベルに達するために必要な投与量
は薬物の処方（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）、患者の年
齢、心臓障害の重症度と性質、及び薬物の吸収と代謝の
個人的多様性に依存する。したがって、血清キニジンレ
ベルの監視は、個々の患者に対する薬物投与量の判定に
おいて医師をガイドする直接の根拠を与える。
般に処方される薬剤であり、したがって患者の血液中の
その濃度は重要であり、その投与中に細心に監視され
る。１．５〜５ｍｇ／ｍｌの血清キニジンレベルが、キ
ニジン代謝物並びにキニジンを測定する、非特異的方法
論に基づく治療法として報告されている〔Ｐｈｙｓｉｃ
ｉａｎ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，４６版，Ｍｏ
ｎｔｖａｌｅ，Ｎ．Ｊ．；Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｃｏｎｏ
ｍｉｃ Ｄａｔａ；１９９３：６８８〜６８９〕。キニ
ジンは治療的監視の効力が実証された最初の抗不整脈剤
であった。キニジンの治療濃度範囲は非常に狭く、過剰
投与量による有害な影響は心臓疾患の症状によく似るこ
とがある。治療血清レベルに達するために必要な投与量
は薬物の処方（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）、患者の年
齢、心臓障害の重症度と性質、及び薬物の吸収と代謝の
個人的多様性に依存する。したがって、血清キニジンレ
ベルの監視は、個々の患者に対する薬物投与量の判定に
おいて医師をガイドする直接の根拠を与える。
【０００３】血清サンプル中のキニジンレベルは競合結
合イムノアッセイによって測定することができる。試験
サンプル中の、例えば薬物キニジンのような、分析物
（リガンドとも呼ぶ）の濃度を測定するための競合結合
イムノアッセイは、試験サンプル中のリガンドと標識試
薬（トレーサーと呼ぶ）との、リガンドとトレーサーと
に対して特異的な抗体上の限られた数の受容体結合部位
に関する競合に基づく。サンプル中のリガンドの濃度が
抗体と特異的に結合するトレーサー量を決定する。生成
されるトレーサー−抗体コンジュゲートの量を定量測定
することができ、この量は試験サンプル中のリガンド量
に反比例する。
合イムノアッセイによって測定することができる。試験
サンプル中の、例えば薬物キニジンのような、分析物
（リガンドとも呼ぶ）の濃度を測定するための競合結合
イムノアッセイは、試験サンプル中のリガンドと標識試
薬（トレーサーと呼ぶ）との、リガンドとトレーサーと
に対して特異的な抗体上の限られた数の受容体結合部位
に関する競合に基づく。サンプル中のリガンドの濃度が
抗体と特異的に結合するトレーサー量を決定する。生成
されるトレーサー−抗体コンジュゲートの量を定量測定
することができ、この量は試験サンプル中のリガンド量
に反比例する。
【０００４】蛍光偏光（ＦＰ）は競合結合イムノアッセ
イにおいて生成されるトレーサー−抗体コンジュゲート
の量を測定するための定量手段を与える。一般に、蛍光
偏光法は、蛍光標識化合物が直線偏光（ｌｉｎｅａｒｌ
ｙ ｐｏｌａｒｉｚｅｄ ｌｉｇｈｔ）によって励起さ
れたときにその回転速度に反比例する偏光度を有する蛍
光を放射するという原理に基づく。例えば蛍光標識を有
するトレーサー−抗体コンジュゲートのような分子は直
線偏光によって励起されるときに、蛍光団（ｆｌｕｏｒ
ｏｐｈｏｒｅ）が吸光時と発光時との間で回転を制限さ
れるので、放射光線は非常に偏光した状態である。“遊
離の”トレーサー化合物（すなわち、抗体に結合せず）
が直線偏光によって励起されるときには、その回転が対
応するトレーサー−抗体コンジュゲートよりも非常に迅
速になり、分子はよりランダムに配向するので、放射光
線は偏光解消する。
イにおいて生成されるトレーサー−抗体コンジュゲート
の量を測定するための定量手段を与える。一般に、蛍光
偏光法は、蛍光標識化合物が直線偏光（ｌｉｎｅａｒｌ
ｙ ｐｏｌａｒｉｚｅｄ ｌｉｇｈｔ）によって励起さ
れたときにその回転速度に反比例する偏光度を有する蛍
光を放射するという原理に基づく。例えば蛍光標識を有
するトレーサー−抗体コンジュゲートのような分子は直
線偏光によって励起されるときに、蛍光団（ｆｌｕｏｒ
ｏｐｈｏｒｅ）が吸光時と発光時との間で回転を制限さ
れるので、放射光線は非常に偏光した状態である。“遊
離の”トレーサー化合物（すなわち、抗体に結合せず）
が直線偏光によって励起されるときには、その回転が対
応するトレーサー−抗体コンジュゲートよりも非常に迅
速になり、分子はよりランダムに配向するので、放射光
線は偏光解消する。
【０００５】蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）で
は、蛍光偏光はリガンド又は薬物濃度の再現可能な関数
であり、したがって、治療的薬物監視の目的のための血
清中の薬物濃度の定量測定に適する。トレーサーと、被
測定薬物（例えば、キニジン）に特異的な抗体を含む血
清と、薬物を含まない患者血清とを一緒に混合すると、
トレーサーの大部分は抗体に結合する。この結果、結合
したトレーサーを４８９ｎｍにおいて偏光によって励起
すると、５２０ｎｍにおける放射光線は非常に偏光した
状態である。しかし、薬物が患者血清中に存在する場合
には、この薬物が抗体への結合に関してトレーサーと競
合する。したがって、トレーサーの多くが未結合に留ま
り、放射光線は偏光解消する。
は、蛍光偏光はリガンド又は薬物濃度の再現可能な関数
であり、したがって、治療的薬物監視の目的のための血
清中の薬物濃度の定量測定に適する。トレーサーと、被
測定薬物（例えば、キニジン）に特異的な抗体を含む血
清と、薬物を含まない患者血清とを一緒に混合すると、
トレーサーの大部分は抗体に結合する。この結果、結合
したトレーサーを４８９ｎｍにおいて偏光によって励起
すると、５２０ｎｍにおける放射光線は非常に偏光した
状態である。しかし、薬物が患者血清中に存在する場合
には、この薬物が抗体への結合に関してトレーサーと競
合する。したがって、トレーサーの多くが未結合に留ま
り、放射光線は偏光解消する。
【０００６】本発明によるＦＰＩＡは自動化ＦＰＩＡ又
は手動ＦＰＩＡのいずれでもよい。ＦＰＩＡを自動化Ｃ
ＯＢＡＳ ＦＡＲＡ ＩＩ（登録商標）化学系（ＣＯＢ
ＡＳＦＰアッセイ系，Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ
ｃｓ社，米国，ニュージャージー州，ソマービル）で実
施して、特異的抗体に対するフルオレセイン標識薬物
（トレーサー）の結合を測定することが好ましい〔Ｄａ
ｎｄｌｉｋｅｒとＦｅｉｇｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．５，２９９，１９６
１〕。
は手動ＦＰＩＡのいずれでもよい。ＦＰＩＡを自動化Ｃ
ＯＢＡＳ ＦＡＲＡ ＩＩ（登録商標）化学系（ＣＯＢ
ＡＳＦＰアッセイ系，Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉ
ｃｓ社，米国，ニュージャージー州，ソマービル）で実
施して、特異的抗体に対するフルオレセイン標識薬物
（トレーサー）の結合を測定することが好ましい〔Ｄａ
ｎｄｌｉｋｅｒとＦｅｉｇｅｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉ
ｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．５，２９９，１９６
１〕。
【０００７】ＣＯＢＡＳ ＦＰアッセイ系はフルオレセ
イン標識トレーサーと、抗体と、ヒト血清中の既知量の
薬物（例えば、キニジン）を含むキャリブレーターとの
相互作用から生ずる蛍光偏光を測定する。測定値から、
薬物濃度をミリ偏光単位（ｍＰ）に関連づける曲線を作
成する。薬物濃度測定の正確さは標準曲線の動的範囲
（ｄｙｎａｍｉｃ ｓｐａｎ）と溶液中のトレーサーの
相対的強度（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）
とに関連する。トレーサーの最大量が血清中の薬物の不
存在下で抗体に結合するときに、ｍＰ単位での最大偏光
が測定される。“範囲（ｓｐａｎ）”（“動的曲線範
囲”としても知られる）は抗体に結合したトレーサーに
よって生じた最小ミリ偏光単位と最大ミリ偏光単位との
差を示す。大きい範囲はトレーサー性能の良好な精度と
感度とを表す。“強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）”はバッ
クグラウンド蛍光の強度を越える蛍光シグナルの強度の
尺度である。トレーサーの強度は試薬の寿命を通して一
定であることが好ましい。遊離トレーサーは光線を偏光
解消して、２０〜７５ｍＰを生ずる。良好な動的範囲は
１５０〜２５０ｍＰの範囲である。
イン標識トレーサーと、抗体と、ヒト血清中の既知量の
薬物（例えば、キニジン）を含むキャリブレーターとの
相互作用から生ずる蛍光偏光を測定する。測定値から、
薬物濃度をミリ偏光単位（ｍＰ）に関連づける曲線を作
成する。薬物濃度測定の正確さは標準曲線の動的範囲
（ｄｙｎａｍｉｃ ｓｐａｎ）と溶液中のトレーサーの
相対的強度（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）
とに関連する。トレーサーの最大量が血清中の薬物の不
存在下で抗体に結合するときに、ｍＰ単位での最大偏光
が測定される。“範囲（ｓｐａｎ）”（“動的曲線範
囲”としても知られる）は抗体に結合したトレーサーに
よって生じた最小ミリ偏光単位と最大ミリ偏光単位との
差を示す。大きい範囲はトレーサー性能の良好な精度と
感度とを表す。“強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）”はバッ
クグラウンド蛍光の強度を越える蛍光シグナルの強度の
尺度である。トレーサーの強度は試薬の寿命を通して一
定であることが好ましい。遊離トレーサーは光線を偏光
解消して、２０〜７５ｍＰを生ずる。良好な動的範囲は
１５０〜２５０ｍＰの範囲である。
【０００８】次に、トレーサーと、抗体と、患者血清と
をキャリブレーション曲線を得たと同じ条件下で相互作
用させる。このようにして得られたｍＰ単位は、このア
ッセイにおけるキャリブレーション曲線との比較によっ
て、患者血清中の薬物レベルに正確に相関することがで
きる。
をキャリブレーション曲線を得たと同じ条件下で相互作
用させる。このようにして得られたｍＰ単位は、このア
ッセイにおけるキャリブレーション曲線との比較によっ
て、患者血清中の薬物レベルに正確に相関することがで
きる。
【０００９】知られているフルオレセイン標識キニジン
化合物は、例えば、５−アミノフルオレセイン標識キニ
ジン（米国特許第４，５８５，８６２号を参照）、ＤＴ
ＡＦ標識キニジン（米国特許第４，４２０，５６８号を
参照）、β−ガラクトシルーウンベリフェロン標識キニ
ジン（ヨーロッパ特許公開公報第８７５６４号を参
照）、及び酵素標識キニジン（ＰＣＴ特許公開公報第８
５／００６０５号を参照）である。しかし、これらの化
合物の幾つかは、加水分解を受け易く、トレーサーの貯
蔵寿命を短縮する種類の結合、例えば、キニジンのＣ−
９位置から誘導されるキニジントレーサー中のカルバメ
ートエステル結合及びＯ−トリアジニルエーテル結合を
含む〔米国特許第４，４２０，５６８号及び第４，５８
５，８６２号を参照〕。
化合物は、例えば、５−アミノフルオレセイン標識キニ
ジン（米国特許第４，５８５，８６２号を参照）、ＤＴ
ＡＦ標識キニジン（米国特許第４，４２０，５６８号を
参照）、β−ガラクトシルーウンベリフェロン標識キニ
ジン（ヨーロッパ特許公開公報第８７５６４号を参
照）、及び酵素標識キニジン（ＰＣＴ特許公開公報第８
５／００６０５号を参照）である。しかし、これらの化
合物の幾つかは、加水分解を受け易く、トレーサーの貯
蔵寿命を短縮する種類の結合、例えば、キニジンのＣ−
９位置から誘導されるキニジントレーサー中のカルバメ
ートエステル結合及びＯ−トリアジニルエーテル結合を
含む〔米国特許第４，４２０，５６８号及び第４，５８
５，８６２号を参照〕。
【００１０】キニジン分子のＣ−６位置からキニジン誘
導体を製造する方法は、Ｎ−スクシンイミジル３−（２
−ピリイルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を用い
る酵素標識キニジンの製造に関しては述べられているが
〔ＰＣＴ特許公開公報第８５／００６０５号を参照〕、
フルオレセイン標識キニジンの製造に関しては述べられ
ていない。この方法はキニクリジン分子中のＣ−６位置
からジアルキル化生成物を製造するが、この生成物は、
キニクリジン環の正電荷のために、加水分解による開裂
を受け易い不安定なトレーサーを生じる。
導体を製造する方法は、Ｎ−スクシンイミジル３−（２
−ピリイルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を用い
る酵素標識キニジンの製造に関しては述べられているが
〔ＰＣＴ特許公開公報第８５／００６０５号を参照〕、
フルオレセイン標識キニジンの製造に関しては述べられ
ていない。この方法はキニクリジン分子中のＣ−６位置
からジアルキル化生成物を製造するが、この生成物は、
キニクリジン環の正電荷のために、加水分解による開裂
を受け易い不安定なトレーサーを生じる。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】それ故、キニジン分子
のもっぱらＣ−６位置において置換した、安定なキニジ
ン誘導体を提供することが、本発明の目的である。フル
オレセイン分子とキニジン誘導体との間にアミド結合を
有する６−置換キニジン誘導体に由来する安定なフルオ
レセイントレーサーを提供することが、本発明の他の目
的である。
のもっぱらＣ−６位置において置換した、安定なキニジ
ン誘導体を提供することが、本発明の目的である。フル
オレセイン分子とキニジン誘導体との間にアミド結合を
有する６−置換キニジン誘導体に由来する安定なフルオ
レセイントレーサーを提供することが、本発明の他の目
的である。
【００１２】本発明の他の目的は、体液サンプル中のキ
ニジンを定量するための改良蛍光イムノアッセイ用の、
キニジン誘導体に由来する試薬（例えば、抗体）を提供
することである。
ニジンを定量するための改良蛍光イムノアッセイ用の、
キニジン誘導体に由来する試薬（例えば、抗体）を提供
することである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】さらに詳しくは、本発明
は式：
は式：
【化１１】 〔式中、Ｌは直鎖又は分枝鎖、飽和又は不飽和のいずれ
でもよく、ヘテロ原子０〜３個を含むことができるＣ1
−Ｃ10炭化水素連結基であり；Ｆはアミノ、カルボキシ
ル、スルフヒドリル、イミノ及びマレイミドから成る群
から選択される官能基である〕で示される、新規なキニ
ジン誘導体に関する。
でもよく、ヘテロ原子０〜３個を含むことができるＣ1
−Ｃ10炭化水素連結基であり；Ｆはアミノ、カルボキシ
ル、スルフヒドリル、イミノ及びマレイミドから成る群
から選択される官能基である〕で示される、新規なキニ
ジン誘導体に関する。
【００１４】式Ｉ化合物は標識キニジントレーサーの製
造に有用であるばかりでなく、免疫原の製造におけるハ
プテンとしても有用である。本発明はまた、本発明の新
規なキニジン誘導体に対して産生される抗体にも関す
る。本発明はさらに、改良蛍光偏光イムノアッセイを実
施するための、本発明の試薬を含むキットに関する。以
下の図面を参照することによって、本発明はさらに容易
に理解されるであろう。化合物後ろの数字は図面に示す
数字と一致する。
造に有用であるばかりでなく、免疫原の製造におけるハ
プテンとしても有用である。本発明はまた、本発明の新
規なキニジン誘導体に対して産生される抗体にも関す
る。本発明はさらに、改良蛍光偏光イムノアッセイを実
施するための、本発明の試薬を含むキットに関する。以
下の図面を参照することによって、本発明はさらに容易
に理解されるであろう。化合物後ろの数字は図面に示す
数字と一致する。
【００１５】“連結基（ｌｉｎｋｉｎｇ ｇｒｏｕ
ｐ）”及び“官能基”なる用語は当業者に明白である
〔例えば、米国特許第４，１６０，０１６号を参照のこ
と〕。好ましくは、Ｌは炭素数１〜５、特に炭素数３の
炭化水素基である。炭素原子は不飽和であることが好ま
しく、不飽和基は例えばフェニルのような１個以上の芳
香族基を含む。ヘテロ原子は好ましくはＯ、Ｎ及びＳを
含む。Ｆは最も好ましくはカルボキシル又はアミノであ
る。
ｐ）”及び“官能基”なる用語は当業者に明白である
〔例えば、米国特許第４，１６０，０１６号を参照のこ
と〕。好ましくは、Ｌは炭素数１〜５、特に炭素数３の
炭化水素基である。炭素原子は不飽和であることが好ま
しく、不飽和基は例えばフェニルのような１個以上の芳
香族基を含む。ヘテロ原子は好ましくはＯ、Ｎ及びＳを
含む。Ｆは最も好ましくはカルボキシル又はアミノであ
る。
【００１６】本発明の新規なキニジン誘導体はキニジン
及びキニジン誘導体に対する抗体を産生するためのハプ
テンとして及び、体液サンプル中のキニジンを検出する
ための蛍光偏光アッセイに用いるためのトレーサーを形
成するためにデテクター分子に結合する中間体として用
いられる。
及びキニジン誘導体に対する抗体を産生するためのハプ
テンとして及び、体液サンプル中のキニジンを検出する
ための蛍光偏光アッセイに用いるためのトレーサーを形
成するためにデテクター分子に結合する中間体として用
いられる。
【００１７】本発明はさらに、キニジン誘導ハプテンを
提供する。ハプテンは、ＦＰＩＡに用いるための、例え
ばキニジン誘導体のような、化合物に対する抗体を産生
させるために試験（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）動物に免疫
応答を誘出することができる化合物である。キニジンＦ
ＰＩＡに用いる抗体はキニジンに特異的であり、例えば
キニンのような（以下に示す）キニジン類似化合物と反
応しないことが好ましい。本発明の好ましい免疫原の製
造に用いるハプテンはキニジン分子のＣ−６位置におい
て誘導体化される。
提供する。ハプテンは、ＦＰＩＡに用いるための、例え
ばキニジン誘導体のような、化合物に対する抗体を産生
させるために試験（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）動物に免疫
応答を誘出することができる化合物である。キニジンＦ
ＰＩＡに用いる抗体はキニジンに特異的であり、例えば
キニンのような（以下に示す）キニジン類似化合物と反
応しないことが好ましい。本発明の好ましい免疫原の製
造に用いるハプテンはキニジン分子のＣ−６位置におい
て誘導体化される。
【化１２】
【００１８】キニジンのＣ−６位置の酸素原子にアルキ
ル基を結合させて、スペーサーを導入する。本発明のハ
プテン及び他のキニジン誘導体の製造に用いるアルキル
化試薬の好ましい量は１モル当量であり、最も好ましい
量は１モル当量未満である。ハプテンを用いて、抗体応
答を誘出するための免疫原、ハプテン−タンパク質キャ
リヤー分子のコンジュゲートを製造する。免疫原キャリ
ヤー分子は宿主動物に免疫応答を独立的に誘出すること
ができ、本発明のキニジン誘導体にカップリングするこ
とができるマクロ分子である。適当な免疫原キャリヤー
分子は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリ
ムペット（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｈｅｔ）ヘモシア
ニン（ＫＬＨ）、ポリペプチド及びウシチログロブリン
（ＢＴＧ）を含むタンパク質キャリヤーである。
ル基を結合させて、スペーサーを導入する。本発明のハ
プテン及び他のキニジン誘導体の製造に用いるアルキル
化試薬の好ましい量は１モル当量であり、最も好ましい
量は１モル当量未満である。ハプテンを用いて、抗体応
答を誘出するための免疫原、ハプテン−タンパク質キャ
リヤー分子のコンジュゲートを製造する。免疫原キャリ
ヤー分子は宿主動物に免疫応答を独立的に誘出すること
ができ、本発明のキニジン誘導体にカップリングするこ
とができるマクロ分子である。適当な免疫原キャリヤー
分子は、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリ
ムペット（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｈｅｔ）ヘモシア
ニン（ＫＬＨ）、ポリペプチド及びウシチログロブリン
（ＢＴＧ）を含むタンパク質キャリヤーである。
【００１９】本発明の免疫原の構造は、下記式：
【化１３】 〔式中、ＬとＦは上記で定義した通りであり；Ｙは免疫
原キャリヤー分子（例えば、タンパク質）、多糖（例え
ば、デキストラン若しくはオリゴ糖）、又は天然に生成
する若しくは合成のポリアミノカルボン酸（例えば、ポ
リリシン若しくはポリグリシン）である〕で示される。
原キャリヤー分子（例えば、タンパク質）、多糖（例え
ば、デキストラン若しくはオリゴ糖）、又は天然に生成
する若しくは合成のポリアミノカルボン酸（例えば、ポ
リリシン若しくはポリグリシン）である〕で示される。
【００２０】本発明の好ましい免疫原では、Ｌは炭素数
３の炭化水素基であり、Ｆはアミノ又はカルボキシルで
あり、Ｙはタンパク質である。本発明の特に好ましい免
疫原は、式：
３の炭化水素基であり、Ｆはアミノ又はカルボキシルで
あり、Ｙはタンパク質である。本発明の特に好ましい免
疫原は、式：
【化１４】 〔式中、Ｚはタンパク質キャリヤーである〕で示され
る。Ｚはアルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、
キーホールリムペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシチ
ログロブリン（ＢＴＧ）、卵オボアルブミン、ウシ−γ
−グロブリン、例えばグラミシジンのような小天然ポリ
ペプチド、及び種々な合成ポリペプチドを含むことがで
きる。Ｚは好ましくは、ＢＴＧ又はポリペプチド グラ
ナマイシンから選択される。本発明の好ましい免疫原は
官能基Ｆとしてイミノ基を含み、タンパク質キャリヤー
ＺとしてＢＴＧを含む。抗体の産生のために好ましい宿
主動物はマウスを含む。
る。Ｚはアルブミン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、
キーホールリムペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシチ
ログロブリン（ＢＴＧ）、卵オボアルブミン、ウシ−γ
−グロブリン、例えばグラミシジンのような小天然ポリ
ペプチド、及び種々な合成ポリペプチドを含むことがで
きる。Ｚは好ましくは、ＢＴＧ又はポリペプチド グラ
ナマイシンから選択される。本発明の好ましい免疫原は
官能基Ｆとしてイミノ基を含み、タンパク質キャリヤー
ＺとしてＢＴＧを含む。抗体の産生のために好ましい宿
主動物はマウスを含む。
【００２１】好ましいキニジン免疫原は、Ｌが炭素数３
の炭化水素基である一置換イミデートエステルを含むハ
プテンから製造される。本発明のキニジン免疫原の製造
方法を図１に示し、実施例１、２、３及び７において詳
述する。第１工程では、既知方法〔Ｌ．Ｄ．Ｓｍａｌｌ
等，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２２巻，１０１４〜１０１
６頁，１９７９を参照〕によってキニジンを脱メチル化
して、６−ヒドロキシシンコニン（１）を得る。第２工
程では、６−ヒドロキシキニジン（１）をアルキル化し
て、（９Ｓ）−４−〔（９−ヒドロキシシンコナン−
６’イル）オキシ〕ブタンニトリル（２）にする。使用
可能なアルキル化剤は４−ブロモブチロニトリル、クロ
ロアセトニトリル、３−クロロプロピオニトリル、及び
３−（ブロモメチル）ベンゾニトリルを含む。Ｌが炭素
数４未満である誘導体の製造は実施例４、５及び１２に
記載し；Ｌがフェニルを含む誘導体の製造は実施例６に
記載する。
の炭化水素基である一置換イミデートエステルを含むハ
プテンから製造される。本発明のキニジン免疫原の製造
方法を図１に示し、実施例１、２、３及び７において詳
述する。第１工程では、既知方法〔Ｌ．Ｄ．Ｓｍａｌｌ
等，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２２巻，１０１４〜１０１
６頁，１９７９を参照〕によってキニジンを脱メチル化
して、６−ヒドロキシシンコニン（１）を得る。第２工
程では、６−ヒドロキシキニジン（１）をアルキル化し
て、（９Ｓ）−４−〔（９−ヒドロキシシンコナン−
６’イル）オキシ〕ブタンニトリル（２）にする。使用
可能なアルキル化剤は４−ブロモブチロニトリル、クロ
ロアセトニトリル、３−クロロプロピオニトリル、及び
３−（ブロモメチル）ベンゾニトリルを含む。Ｌが炭素
数４未満である誘導体の製造は実施例４、５及び１２に
記載し；Ｌがフェニルを含む誘導体の製造は実施例６に
記載する。
【００２２】アルキル化剤の好ましい使用量は、例えば
４−ブロモブチロニトリルの１モル当量である。最も好
ましくは、０．９モル当量のアルキル化剤を用いる。化
合物（２）は、好ましいモノクローナル抗体Ｑ６−６Ｃ
５（ＭｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ５）を得るために用いられる
本発明の好ましい化合物である。
４−ブロモブチロニトリルの１モル当量である。最も好
ましくは、０．９モル当量のアルキル化剤を用いる。化
合物（２）は、好ましいモノクローナル抗体Ｑ６−６Ｃ
５（ＭｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ５）を得るために用いられる
本発明の好ましい化合物である。
【００２３】これに反して、１モル当量を越えるアルキ
ル化剤の使用は、以下に示すような、二置換キニジン誘
導体を生じる：
ル化剤の使用は、以下に示すような、二置換キニジン誘
導体を生じる：
【化１５】
【００２４】アルキル化剤２モル当量を用いる、上記好
ましくない化合物、（Ｓ）−８−エテニル−２−〔ヒド
ロキシ−６−（２−エトキシ−２−オキソエトキシ）−
４−キノリニルメチル〕−１−（２−エトキシ−２−オ
キソエチル）アゾニアビシクロ〔２．２．２〕オクタン
ヨージド（１５）及び（９Ｓ）−１−（３−カルボキシ
プロピル）−６’−（３−カルボキシプロポキシ）シン
コニウムクロリド（１６）の合成は、実施例９及び１０
に述べる。
ましくない化合物、（Ｓ）−８−エテニル−２−〔ヒド
ロキシ−６−（２−エトキシ−２−オキソエトキシ）−
４−キノリニルメチル〕−１−（２−エトキシ−２−オ
キソエチル）アゾニアビシクロ〔２．２．２〕オクタン
ヨージド（１５）及び（９Ｓ）−１−（３−カルボキシ
プロピル）−６’−（３−カルボキシプロポキシ）シン
コニウムクロリド（１６）の合成は、実施例９及び１０
に述べる。
【００２５】免疫原製造の第３工程では、ハプテンをタ
ンパク質にその後にカップリングさせるために、ハプテ
ン上のニトリルをイミデートエステルに転化させる。例
えばジメチルスベルイミデート二塩酸塩（Ｐｉｅｒｃ
ｅ）のような架橋剤を用いる、タンパク質へのカップリ
ングにイミデートエステル含有分子を用いることは公知
である。しかし、この架橋剤の使用はタンパク質の重合
を生じて、ハプテンコンジュゲートの沈殿を惹起する可
能性がある。アミジンを形成する、イミデートエステル
とアミンとの反応も公知である。しかし、本発明では、
最も効果的なタンパク質カップリングのためにハプテン
上に直接、一官能化（ｍｏｎｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉ
ｚｅｄ）活性基（すなわち、イミデートエステル）を有
することが好ましい。
ンパク質にその後にカップリングさせるために、ハプテ
ン上のニトリルをイミデートエステルに転化させる。例
えばジメチルスベルイミデート二塩酸塩（Ｐｉｅｒｃ
ｅ）のような架橋剤を用いる、タンパク質へのカップリ
ングにイミデートエステル含有分子を用いることは公知
である。しかし、この架橋剤の使用はタンパク質の重合
を生じて、ハプテンコンジュゲートの沈殿を惹起する可
能性がある。アミジンを形成する、イミデートエステル
とアミンとの反応も公知である。しかし、本発明では、
最も効果的なタンパク質カップリングのためにハプテン
上に直接、一官能化（ｍｏｎｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉ
ｚｅｄ）活性基（すなわち、イミデートエステル）を有
することが好ましい。
【００２６】コカイン免疫原の製造には、コカインの一
官能化イミデートエステル誘導体が用いられている（米
国特許第４，０４５，４２０号を参照）。メタノール中
のナトリウムメトキシドを用いて、タンパク質カップリ
ングのためにニトリルをイミデートエステル含有ベンゾ
イルエクゴニンに転化させている。しかし、この方法
は、分子上のＣ−９ヒドロキシ基の存在が形成されるや
否やイミデートエステルと交差反応しうるために、本発
明のキニジン免疫原の製造に適さない。
官能化イミデートエステル誘導体が用いられている（米
国特許第４，０４５，４２０号を参照）。メタノール中
のナトリウムメトキシドを用いて、タンパク質カップリ
ングのためにニトリルをイミデートエステル含有ベンゾ
イルエクゴニンに転化させている。しかし、この方法
は、分子上のＣ−９ヒドロキシ基の存在が形成されるや
否やイミデートエステルと交差反応しうるために、本発
明のキニジン免疫原の製造に適さない。
【００２７】それ故、本発明の好ましい免疫原製造方法
は酸触媒反応による方法である。メタノール中において
ニトリルをＨＣｌによって処理することによって、イミ
デートエステルを得る。得られたイミデートエステルは
分子上のアミノ基と塩酸塩を形成する。イミデートエス
テルは、その製造直後に、タンパク質カップリングに用
いることが好ましい。好ましい実施態様では、化合物
（２）をメタノール中の塩酸ガスによって処理して、
（９Ｓ）−４−〔（９−ヒドロキシシンコナン−６’−
イル）ブタンイミド酸メチルエステル（３）を形成す
る。
は酸触媒反応による方法である。メタノール中において
ニトリルをＨＣｌによって処理することによって、イミ
デートエステルを得る。得られたイミデートエステルは
分子上のアミノ基と塩酸塩を形成する。イミデートエス
テルは、その製造直後に、タンパク質カップリングに用
いることが好ましい。好ましい実施態様では、化合物
（２）をメタノール中の塩酸ガスによって処理して、
（９Ｓ）−４−〔（９−ヒドロキシシンコナン−６’−
イル）ブタンイミド酸メチルエステル（３）を形成す
る。
【００２８】キニジンハプテンの代替え製造方法は、官
能基Ｆがカルボキシルであるハプテンコンジュゲートの
形成を含む。典型的に、カルボジイミドを用いた、カル
ボキシル基とアミンとの直接カップリングが用いられ
る。シンコニンのヒドロキシル基にアルキル化剤を結合
させる（実施例１２を参照）。ＤＣＣ（ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド）とＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミド）とを用いて、ヒドロキシルにおいてカルボキシ
末端を活性化させて、活性エステルを形成する。この活
性基を比較的緩和な反応条件下でタンパク質キャリヤー
にカップリングさせる（米国特許第５，１０１，０１５
号及び第４，３２９，２８１号を参照）。
能基Ｆがカルボキシルであるハプテンコンジュゲートの
形成を含む。典型的に、カルボジイミドを用いた、カル
ボキシル基とアミンとの直接カップリングが用いられ
る。シンコニンのヒドロキシル基にアルキル化剤を結合
させる（実施例１２を参照）。ＤＣＣ（ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド）とＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミド）とを用いて、ヒドロキシルにおいてカルボキシ
末端を活性化させて、活性エステルを形成する。この活
性基を比較的緩和な反応条件下でタンパク質キャリヤー
にカップリングさせる（米国特許第５，１０１，０１５
号及び第４，３２９，２８１号を参照）。
【００２９】選択的にチオールと反応して、チオエーテ
ル結合コンジュゲートを形成することが知られているス
ルフヒドリル反応性マレイミド−又はα−ハロアセトア
ミド−リンカーも広く用いられている。官能基Ｆがマレ
イミド基であるハプテンコンジュゲートはスルフヒドリ
ル基含有タンパク質と結合することができる（実施例１
８を参照）。他のスルフヒドリル残基含有分子との効果
的なカップリングのために、アミンをマレイミド誘導体
と反応させる。マレイミド−ＮＨＳ活性エステル化合物
は、例えばスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣ
Ｃ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル（ＭＢＳ）、スクシンイミジル４−
（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）及
びこれらの誘導体のような二官能性リンカーとして商業
的に入手可能である。
ル結合コンジュゲートを形成することが知られているス
ルフヒドリル反応性マレイミド−又はα−ハロアセトア
ミド−リンカーも広く用いられている。官能基Ｆがマレ
イミド基であるハプテンコンジュゲートはスルフヒドリ
ル基含有タンパク質と結合することができる（実施例１
８を参照）。他のスルフヒドリル残基含有分子との効果
的なカップリングのために、アミンをマレイミド誘導体
と反応させる。マレイミド−ＮＨＳ活性エステル化合物
は、例えばスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣ
Ｃ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミドエステル（ＭＢＳ）、スクシンイミジル４−
（ｐ−マレイミドフェニル）ブチレート（ＳＭＰＢ）及
びこれらの誘導体のような二官能性リンカーとして商業
的に入手可能である。
【００３０】ハプテンとタンパク質とを一緒に結合させ
て、ジスルフィド含有コンジュゲートを形成するため
に、例えばＳＰＤＰのような、二官能性リンカーを用い
ることもできる。しかし、チオエーテル結合コンジュゲ
ート又はジスルフィド結合コンジュゲートのいずれの製
造も多段階方法であり、カルボキシル基のタンパク質へ
のカップリングがより直接的な方法である。
て、ジスルフィド含有コンジュゲートを形成するため
に、例えばＳＰＤＰのような、二官能性リンカーを用い
ることもできる。しかし、チオエーテル結合コンジュゲ
ート又はジスルフィド結合コンジュゲートのいずれの製
造も多段階方法であり、カルボキシル基のタンパク質へ
のカップリングがより直接的な方法である。
【００３１】本発明のキニジン免疫原を用いて、例え
ば、新規なモノクローナル抗体 ＭｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ
５及びポリクローナル抗体Ｐ７９６のような、ポリクロ
ーナル抗体とモノクローナル抗体とを形成した。本発明
の新規なトレーサー（以下で説明）と共に新規なモノク
ローナル抗体を用いて、キニジンの検出と定量のための
改良イムノアッセイを得る。本発明の好ましい抗体の交
差反応性は、下記キニジン代謝産物化合物に対する下記
％：キニジン−Ｎ−オキシド １３．５％；３−Ｓ−ヒ
ドロキシキニジン１１％；２’−オキソキニジン ３
％；及びＯ−デスメチルキニジン ４３．５％を越える
べきではなく、動的曲線範囲は少なくとも１５０ｍＰ、
好ましくは少なくとも１９０ｍＰである。
ば、新規なモノクローナル抗体 ＭｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ
５及びポリクローナル抗体Ｐ７９６のような、ポリクロ
ーナル抗体とモノクローナル抗体とを形成した。本発明
の新規なトレーサー（以下で説明）と共に新規なモノク
ローナル抗体を用いて、キニジンの検出と定量のための
改良イムノアッセイを得る。本発明の好ましい抗体の交
差反応性は、下記キニジン代謝産物化合物に対する下記
％：キニジン−Ｎ−オキシド １３．５％；３−Ｓ−ヒ
ドロキシキニジン１１％；２’−オキソキニジン ３
％；及びＯ−デスメチルキニジン ４３．５％を越える
べきではなく、動的曲線範囲は少なくとも１５０ｍＰ、
好ましくは少なくとも１９０ｍＰである。
【００３２】本発明の新規なトレーサーとの結合におけ
る効率を測定するために、抗体を試験した。図５はＦＰ
ＩＡにおける本発明のトレーサー（７）に対するポリク
ローナル抗体の使用とモノクローナル抗体の使用との比
較を示す。両方の抗体はトレーサーとの結合を示す。曲
線は、モノクローナル抗体が大きい動的範囲を有し、そ
のため、ＦＰＩＡにおいて大きい感度を有することを実
証する。
る効率を測定するために、抗体を試験した。図５はＦＰ
ＩＡにおける本発明のトレーサー（７）に対するポリク
ローナル抗体の使用とモノクローナル抗体の使用との比
較を示す。両方の抗体はトレーサーとの結合を示す。曲
線は、モノクローナル抗体が大きい動的範囲を有し、そ
のため、ＦＰＩＡにおいて大きい感度を有することを実
証する。
【００３３】表１はＦＰＩＡにおいて測定した、キニン
を含めた種々なキニジン代謝産物に対するＭｏＡｂ Ｑ
６−６Ｃ５の交差反応性を示す。キニンとの交差反応性
は重要でないことが示される、それ故、キニンはキニジ
ンアッセイの性能を妨害しない。ＭｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ
５は代謝産物に対して低い交差反応性（ジヒドロキニジ
ンを例外とする）を示すので、血清中のキニジンを監視
するための正確で、高度に特異的な方法を提供する。実
施例２２に述べたような、アッセイプロトコールを用い
て、これらの結果を得た。
を含めた種々なキニジン代謝産物に対するＭｏＡｂ Ｑ
６−６Ｃ５の交差反応性を示す。キニンとの交差反応性
は重要でないことが示される、それ故、キニンはキニジ
ンアッセイの性能を妨害しない。ＭｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ
５は代謝産物に対して低い交差反応性（ジヒドロキニジ
ンを例外とする）を示すので、血清中のキニジンを監視
するための正確で、高度に特異的な方法を提供する。実
施例２２に述べたような、アッセイプロトコールを用い
て、これらの結果を得た。
【００３４】
【表１】 表１ ＦＰＩＡによって測定した、キニジンの種々な代謝産物に対する交差反応性 添加した MoAbQ6-6C5 と トレーサー1４を ＴＤｘ 試験化合物 トレーサー７とを用い 用いた現在の の濃度 た新しいキット キット試験化合物 （μｇ／ｍｌ） 交差反応性％ 交差反応性％ 交差反応性％ キニジン−Ｎ １０ １３．５ ３０．５ ３１．９ −オキシド １００ ４．９ 高い ７．２ ３−Ｓ−ヒドロ １０ １１ ２１ １８．８ キシキニジン １００ ３．７ ４．３ ５．３ ２’−オキソ １０ ３ ２０ ３．３ キニジン １００ １ ３．７ １．１ ５００ ０．５３ １．５５ ０．５８ １０００ ０．３５ 高い ０．３９ Ｏ−デスメチル １ ５５ ５５ ２０６ キニジン １０ ４３．５ ４６．５ ６０．３ ジヒドロ １０ Ｈ ６７ ７９ キニジン ５ １６０ ７６ ８８ ２．５ １５６ ７６ ９６ １０，１１− １０ １ １４．５ ３．９ ジヒドロキニ １００ １．７ ３．２ １．８ ジンジオール キニン １０ ＜０．１ 試験せず １００ ＜０．１ ＜０．１ ０．８ １０００ ＜０．１ 試験せず
【００３５】本発明はまた、蛍光偏光イムノアッセイに
用いるための新規なキニジン誘導フルオレセイン標識ト
レーサーを提供する。フルオレセイン化合物は技術上周
知であり〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐｕｂ
ｌｉｃａｔｉｏｎ、オレゴン州，オイゲン；Ｂｉｏｃｏ
ｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１９２，３，
４３０〜４３１，１９９２；米国特許第４，６６８，６
４０号〕、フルオレセイン標識キニジン、例えば、５−
アミノフルオレセイン標識キニジン（米国特許第４，５
８５，８６２号を参照）、ＤＴＡＦ標識キニジン（米国
特許第４，４２０，５６８号を参照）、β−ガラクトシ
ルーウンベリフェロン標識キニジン（ヨーロッパ特許公
開公報第８７５６４号を参照）、及び酵素標識キニジン
（ＰＣＴ特許公開公報第８５／００６０５号を参照）を
製造するために用いられている。
用いるための新規なキニジン誘導フルオレセイン標識ト
レーサーを提供する。フルオレセイン化合物は技術上周
知であり〔Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐｕｂ
ｌｉｃａｔｉｏｎ、オレゴン州，オイゲン；Ｂｉｏｃｏ
ｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１１９２，３，
４３０〜４３１，１９９２；米国特許第４，６６８，６
４０号〕、フルオレセイン標識キニジン、例えば、５−
アミノフルオレセイン標識キニジン（米国特許第４，５
８５，８６２号を参照）、ＤＴＡＦ標識キニジン（米国
特許第４，４２０，５６８号を参照）、β−ガラクトシ
ルーウンベリフェロン標識キニジン（ヨーロッパ特許公
開公報第８７５６４号を参照）、及び酵素標識キニジン
（ＰＣＴ特許公開公報第８５／００６０５号を参照）を
製造するために用いられている。
【００３６】公知のフルオレセイン標識キニジンはキニ
ジン分子のＣ−９位置から誘導され、カルバメートエス
テル及びＯ−トリアジニルエーテルのリンカーアームを
含む（米国特許第４，４２０，５６８号及び第４，５８
５，８６２号を参照）。しかし、これらの種類の公知結
合は加水分解を受け易く、そのため、本発明のフルオレ
セイントレーサーの製造に適さない。
ジン分子のＣ−９位置から誘導され、カルバメートエス
テル及びＯ−トリアジニルエーテルのリンカーアームを
含む（米国特許第４，４２０，５６８号及び第４，５８
５，８６２号を参照）。しかし、これらの種類の公知結
合は加水分解を受け易く、そのため、本発明のフルオレ
セイントレーサーの製造に適さない。
【００３７】商業的に入手可能な、他のフルオレセイン
標識トレーサー、（（３’，６’−ジヒドロキシ−３−
オキソスピロ（イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−
（９Ｈ）キサンテン−５−イル）アミノ）−２−オキソ
エチル）−２−（ヒドロキシ（６−（２−エトキシ−２
−オキソエトキシ）−４−キノリンイル）メチル）−１
−アゾニアビシクロ（２．２．２）オクタンクロリド塩
酸塩（１４）は、キヌクリジン環上に正の電荷を有し
（以下に示す）、化合物の不安定性を惹起する。
標識トレーサー、（（３’，６’−ジヒドロキシ−３−
オキソスピロ（イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−
（９Ｈ）キサンテン−５−イル）アミノ）−２−オキソ
エチル）−２−（ヒドロキシ（６−（２−エトキシ−２
−オキソエトキシ）−４−キノリンイル）メチル）−１
−アゾニアビシクロ（２．２．２）オクタンクロリド塩
酸塩（１４）は、キヌクリジン環上に正の電荷を有し
（以下に示す）、化合物の不安定性を惹起する。
【化１６】
【００３８】本発明の蛍光偏光トレーサーの構造は式：
【化１７】 〔式中、ＬとＦは既述した通りであり；Ｘは化学発光団
（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｐｈｏｒｅ）（例えば、ルシ
フェリン、ウンベリフェロン及びナフタレン−１，２−
ジカルボン酸ヒドラジド）（米国特許第４，３３１，８
０８号）；エネルギー供与体分子（例えば、以下で定義
するようなフルオレセイン“Ｑ”又はＴｅｘａｓ Ｒｅ
ｄ）；及び放射能標識基（例えば、 125Ｉ−チラミン及
び例えばメチルヨージド又はアミノ酸のような14Ｃ−標
識化合物）から成る群から選択されるデテクター分子で
ある〕で示される。好ましくは、Ｌは炭素数３の炭化水
素基であり、ＸはフルオレセインＱである。
（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｏｐｈｏｒｅ）（例えば、ルシ
フェリン、ウンベリフェロン及びナフタレン−１，２−
ジカルボン酸ヒドラジド）（米国特許第４，３３１，８
０８号）；エネルギー供与体分子（例えば、以下で定義
するようなフルオレセイン“Ｑ”又はＴｅｘａｓ Ｒｅ
ｄ）；及び放射能標識基（例えば、 125Ｉ−チラミン及
び例えばメチルヨージド又はアミノ酸のような14Ｃ−標
識化合物）から成る群から選択されるデテクター分子で
ある〕で示される。好ましくは、Ｌは炭素数３の炭化水
素基であり、ＸはフルオレセインＱである。
【００３９】本発明の好ましいトレーサーは、式：
【化１８】 〔式中、Ｆはアミノ又はカルボキシルから選択され、Ｑ
は例えば、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボ
キシフルオレセイン、５−アミノフルオレセイン、６−
アミノフルオレセイン、５−フルオレセインイソチオシ
アネート、６−フルオレセインイソチオシアネート、
４’−アミノメチルフルオレセイン、５−アミノメチル
フルオレセイン、及びアミノフルオレセイン誘導体（例
えば、グリシン化フルオレセイン）のような蛍光放射化
合物である〕で示される。アミノメチルフルオレセイン
及びカルボキシフルオレセインが最も好ましい。
は例えば、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボ
キシフルオレセイン、５−アミノフルオレセイン、６−
アミノフルオレセイン、５−フルオレセインイソチオシ
アネート、６−フルオレセインイソチオシアネート、
４’−アミノメチルフルオレセイン、５−アミノメチル
フルオレセイン、及びアミノフルオレセイン誘導体（例
えば、グリシン化フルオレセイン）のような蛍光放射化
合物である〕で示される。アミノメチルフルオレセイン
及びカルボキシフルオレセインが最も好ましい。
【００４０】基Ｑは多様な商業的に入手可能なデテクタ
ー分子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社，オレゴ
ン州，オイゲン）から選択することができ、技術上周知
の方法によってキニジン誘導体に結合させて、種々なア
ッセイフォーマット（ａｓｓａｙ ｆｏｒｍａｔ）に有
用な試薬を形成する。フルオレセインの他に、例えば放
射能標識又は化学発光デテクター分子（例えば、チラミ
ン）のようなデテクター分子も用いることができる。
ー分子（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社，オレゴ
ン州，オイゲン）から選択することができ、技術上周知
の方法によってキニジン誘導体に結合させて、種々なア
ッセイフォーマット（ａｓｓａｙ ｆｏｒｍａｔ）に有
用な試薬を形成する。フルオレセインの他に、例えば放
射能標識又は化学発光デテクター分子（例えば、チラミ
ン）のようなデテクター分子も用いることができる。
【００４１】図２は、本発明の最も好ましい、新規なＦ
Ｐトレーサー、すなわち、（９Ｓ）−Ｎ−〔（３’，
６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ〔イソベンゾフ
ラン−１（３Ｈ），９’−〔９Ｈ〕−キサンテン〕−５
イル）メチル〕−４−〔（９−ヒドロキシシンコナン−
６’−イル）オキシ〕ブタミド（７）の製造方法を説明
する。このトレーサーの合成は実施例１１〜１３におい
て説明する。
Ｐトレーサー、すなわち、（９Ｓ）−Ｎ−〔（３’，
６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ〔イソベンゾフ
ラン−１（３Ｈ），９’−〔９Ｈ〕−キサンテン〕−５
イル）メチル〕−４−〔（９−ヒドロキシシンコナン−
６’−イル）オキシ〕ブタミド（７）の製造方法を説明
する。このトレーサーの合成は実施例１１〜１３におい
て説明する。
【００４２】ハプテンに関する、本発明のトレーサーの
合成の第１工程は、好ましくは１モル当量以下のアルキ
ル化剤を用いる６−ヒドロキシキニジンのアルキル化で
ある。この第１工程は、１モル当量のエチル ４−ブロ
モブチレートを用いる、最も好ましくは０．９モル当量
のエチル ４−ブロモブチレートを用いる、（９Ｓ）−
４−〔（９−ヒドロキシシンコナン−６’−イル）オキ
シブタン酸エチルエステル（５）への６−ヒドロキシキ
ニジン（１）のアルキル化である。アルキル化生成物
（５）を加水分解して、対応する酸、（９Ｓ）−４−
〔（９−ヒドロキシシンコナン−６’−イル）オキシブ
タン酸（６）を得る。文献で周知の方法を用いて、この
酸を活性化して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを形成
する。この活性化エステルをピリジンの存在下で５−ア
ミノメチルフルオレセインとカップリングさせて、好ま
しいキニジントレーサー、（９Ｓ）−Ｎ−〔（３’，
６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ〔イソベンゾフ
ラン−１（３Ｈ），９’−〔９Ｈ〕キサンテン〕−５イ
ル）メチル〕−４−〔（９−ヒドロキシシンコナン−
６’−イル）オキシ〕ブタミド（７）を得る。
合成の第１工程は、好ましくは１モル当量以下のアルキ
ル化剤を用いる６−ヒドロキシキニジンのアルキル化で
ある。この第１工程は、１モル当量のエチル ４−ブロ
モブチレートを用いる、最も好ましくは０．９モル当量
のエチル ４−ブロモブチレートを用いる、（９Ｓ）−
４−〔（９−ヒドロキシシンコナン−６’−イル）オキ
シブタン酸エチルエステル（５）への６−ヒドロキシキ
ニジン（１）のアルキル化である。アルキル化生成物
（５）を加水分解して、対応する酸、（９Ｓ）−４−
〔（９−ヒドロキシシンコナン−６’−イル）オキシブ
タン酸（６）を得る。文献で周知の方法を用いて、この
酸を活性化して、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを形成
する。この活性化エステルをピリジンの存在下で５−ア
ミノメチルフルオレセインとカップリングさせて、好ま
しいキニジントレーサー、（９Ｓ）−Ｎ−〔（３’，
６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ〔イソベンゾフ
ラン−１（３Ｈ），９’−〔９Ｈ〕キサンテン〕−５イ
ル）メチル〕−４−〔（９−ヒドロキシシンコナン−
６’−イル）オキシ〕ブタミド（７）を得る。
【００４３】トレーサー中の抗原部分と蛍光部分との結
合は、新規なハプテン構造におけるように、アミジン結
合であることができる。しかし、トレーサー中の抗原の
キニジン部分とフルオレセイン部分との結合は、免疫原
の製造に用いられるアミジン結合とは異なることが好ま
しい。トレーサーの形成に用いる結合はアミド、尿素、
チオ尿素、アミジン、エーテル及びチオエーテルを含む
ことができる。本発明のトレーサーのために好ましい結
合は、トレーサーにより大きな安定性を与えるアミド結
合である。
合は、新規なハプテン構造におけるように、アミジン結
合であることができる。しかし、トレーサー中の抗原の
キニジン部分とフルオレセイン部分との結合は、免疫原
の製造に用いられるアミジン結合とは異なることが好ま
しい。トレーサーの形成に用いる結合はアミド、尿素、
チオ尿素、アミジン、エーテル及びチオエーテルを含む
ことができる。本発明のトレーサーのために好ましい結
合は、トレーサーにより大きな安定性を与えるアミド結
合である。
【００４４】新規なトレーサー、（９Ｓ）−Ｎ−
〔（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ〔イ
ソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−〔９Ｈ〕キサンテ
ン〕−５イル）メチル〕−４−〔（９−ヒドロキシシン
コナン−６’−イル）オキシ〕ブタミド（７）は分子上
に中性電荷（ｎｅｕｔｒａｌ ｃｈａｒｇｅ）を有する
が、これとは対照的に、既知トレーサー（１４）はキヌ
クリジン環上に正電荷を有する。新規なトレーサーは図
８に示すように３７℃において非常に安定であり、これ
はＦＰＩＡアッセイにおけるトレーサーの性能にとって
重要な性質である。４５℃において４週間実施した促進
安定性試験は、曲線範囲の欠損がないことを実証した
（図７）。Ｃ−６トレーサーもＭｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ５
と共に良好に機能した。このトレーサー−抗体対は大き
な動的曲線範囲（２０４ｍＰ）を示し、図６に示すよう
に、既知トレーサー化合物（１４）（１５１ｍＰ）に比
べて分析物の測定における良好な精度と感度とを実証し
た。
〔（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ〔イ
ソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−〔９Ｈ〕キサンテ
ン〕−５イル）メチル〕−４−〔（９−ヒドロキシシン
コナン−６’−イル）オキシ〕ブタミド（７）は分子上
に中性電荷（ｎｅｕｔｒａｌ ｃｈａｒｇｅ）を有する
が、これとは対照的に、既知トレーサー（１４）はキヌ
クリジン環上に正電荷を有する。新規なトレーサーは図
８に示すように３７℃において非常に安定であり、これ
はＦＰＩＡアッセイにおけるトレーサーの性能にとって
重要な性質である。４５℃において４週間実施した促進
安定性試験は、曲線範囲の欠損がないことを実証した
（図７）。Ｃ−６トレーサーもＭｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ５
と共に良好に機能した。このトレーサー−抗体対は大き
な動的曲線範囲（２０４ｍＰ）を示し、図６に示すよう
に、既知トレーサー化合物（１４）（１５１ｍＰ）に比
べて分析物の測定における良好な精度と感度とを実証し
た。
【００４５】図９は、本発明の新規なＣ−６トレーサー
（７）／ＭｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ５対と、キニジンに対す
る商業的に入手可能なＦＰＩＡキット（ＴＤｘ，Ａｂｂ
ｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からのトレーサー
／抗体対とのＦＰＩＡにおける性能の比較を示す。図９
に示す標準曲線は、本発明のトレーサー（７）がＴＤｘ
アッセイによって得られるよりも大きい動的範囲を有す
ることを実証し、それ故、キニジン測定における良好な
精度と感度とを実証する。
（７）／ＭｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ５対と、キニジンに対す
る商業的に入手可能なＦＰＩＡキット（ＴＤｘ，Ａｂｂ
ｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）からのトレーサー
／抗体対とのＦＰＩＡにおける性能の比較を示す。図９
に示す標準曲線は、本発明のトレーサー（７）がＴＤｘ
アッセイによって得られるよりも大きい動的範囲を有す
ることを実証し、それ故、キニジン測定における良好な
精度と感度とを実証する。
【００４６】キニジン分子上の代替え位置（例えば、Ｃ
−９位置）から合成されるトレーサーを製造することが
できる。図３はＣ−９トレーサー、（９Ｓ）−〔２−
〔〔（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ
〔イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−〔９Ｈ〕パン
テオン〕−５−イル）メチルアミノ〕−２−オキソエチ
ル〕カルバミン酸６’−メトキシシンコナン−９−イル
エステル（１０）の製造方法を説明する。キニジンを室
温においてエチルイソシアナトアセテートによって処理
し、カルバメートエステル（８）を得る。このエステル
（８）を加水分解して、対応する酸（９）を得る。酸
（９）をジシクロヘキシルカルボジイミドとＮ−ヒドロ
キシスクシンイミドとの反応によって活性エステルに転
化した後に、ピリジン中での５−アミノメチルフルオレ
セインとのカップリングによってＣ−９キニジントレー
サー（１０）を得る。この合成は実施例１４〜１６にお
いてさらに詳述する。
−９位置）から合成されるトレーサーを製造することが
できる。図３はＣ−９トレーサー、（９Ｓ）−〔２−
〔〔（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ
〔イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−〔９Ｈ〕パン
テオン〕−５−イル）メチルアミノ〕−２−オキソエチ
ル〕カルバミン酸６’−メトキシシンコナン−９−イル
エステル（１０）の製造方法を説明する。キニジンを室
温においてエチルイソシアナトアセテートによって処理
し、カルバメートエステル（８）を得る。このエステル
（８）を加水分解して、対応する酸（９）を得る。酸
（９）をジシクロヘキシルカルボジイミドとＮ−ヒドロ
キシスクシンイミドとの反応によって活性エステルに転
化した後に、ピリジン中での５−アミノメチルフルオレ
セインとのカップリングによってＣ−９キニジントレー
サー（１０）を得る。この合成は実施例１４〜１６にお
いてさらに詳述する。
【００４７】しかし、ＦＰイムノアッセイにおいて試験
した場合に、Ｃ−９（１０）トレーサーは好ましいキニ
ジン抗体ＭｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ５に結合しなかった。表
２はＣ−６トレーサー及びＣ−９トレーサーへのモノク
ローナル抗体ＭｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ５の結合能力を実証
する。この結合能力は、ｍＰ単位で表示される、抗原−
抗体複合体によって偏光が保持される程度として表現さ
れる。以下の表２が示すように、１：２０タイター（ｔ
ｉｔｅｒ）までのＭｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ５の濃度上昇は
Ｃ−９トレーサーに影響を及ぼさず、したがって、抗体
へのトレーサーの結合は生じず、標準曲線を作成するこ
とはできなかった。これに比べて、Ｃ−６位置から誘導
されたトレーサーはモノクローナル抗体への良好な結合
と、高度な偏光が保持されることを示した。
した場合に、Ｃ−９（１０）トレーサーは好ましいキニ
ジン抗体ＭｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ５に結合しなかった。表
２はＣ−６トレーサー及びＣ−９トレーサーへのモノク
ローナル抗体ＭｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ５の結合能力を実証
する。この結合能力は、ｍＰ単位で表示される、抗原−
抗体複合体によって偏光が保持される程度として表現さ
れる。以下の表２が示すように、１：２０タイター（ｔ
ｉｔｅｒ）までのＭｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ５の濃度上昇は
Ｃ−９トレーサーに影響を及ぼさず、したがって、抗体
へのトレーサーの結合は生じず、標準曲線を作成するこ
とはできなかった。これに比べて、Ｃ−６位置から誘導
されたトレーサーはモノクローナル抗体への良好な結合
と、高度な偏光が保持されることを示した。
【００４８】
【表２】 表２ ＭｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ５に対するＣ−６（７）トレーサー対Ｃ−９（１０）ＦＰ トレーサーの比較 ＭｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ５ （Ｃ−９トレーサー） （Ｃ−９トレーサー） タイター １：２０ ２８．６ｍＰ １：４０ ２５．３ｍＰ １：５２５ − ２４０ｍＰ １：５５０ − ２３８ｍＰ
【００４９】表２の結果によって実証されるように、抗
体とトレーサーとの両方が、キニジン分子のＣ−６位置
から誘導された化合物から製造されることがＦＰＩＡの
性能にとって重要である。アミノメチルフルオレセイン
以外のフルオレセイン分子も本発明の新規なキニジン蛍
光偏光トレーサーの製造に用いることができる。５−カ
ルボキシフルオレセインの使用が他のＦＰＩＡにおいて
実証されている（米国特許第４，６６８，６４０号を参
照）。しかし、アミノリンカーアームを導入して、キニ
ジンをカルボキシフルオレセインに効果的に結合させる
ために、キニジンの大幅な修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ）が必要である。Ｃ−６位置からのカルボキシフル
オレセイン標識キニジン誘導体の製造方法は発表されて
いない。
体とトレーサーとの両方が、キニジン分子のＣ−６位置
から誘導された化合物から製造されることがＦＰＩＡの
性能にとって重要である。アミノメチルフルオレセイン
以外のフルオレセイン分子も本発明の新規なキニジン蛍
光偏光トレーサーの製造に用いることができる。５−カ
ルボキシフルオレセインの使用が他のＦＰＩＡにおいて
実証されている（米国特許第４，６６８，６４０号を参
照）。しかし、アミノリンカーアームを導入して、キニ
ジンをカルボキシフルオレセインに効果的に結合させる
ために、キニジンの大幅な修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉ
ｏｎ）が必要である。Ｃ−６位置からのカルボキシフル
オレセイン標識キニジン誘導体の製造方法は発表されて
いない。
【００５０】本発明の好ましいカルボキシフルオレセイ
ントレーサーは、次式を有する：
ントレーサーは、次式を有する：
【化１９】
【００５１】図４は、（９Ｓ）−３’，６’−ジヒドロ
キシ−Ｎ−〔３−〔（９−ヒドロキシシンコナン−６’
−イル）オキシ〕プロピル〕−３−オキソスピロ〔イソ
ベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−〔９Ｈ〕キサンテ
ン〕−５−カルボキサミド（１３）の一般的な製造方法
を示し、実施例１７〜１９は化合物の合成を述べる。Ｍ
ｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ５の製造に用いた同じキニジン免疫
原から誘導したポリクローナル抗体Ｐ７９６と共に、Ｆ
ＰＩＡに用いたカルボキシフルオレセイントレーサー
（１３）は良好な動的範囲（例えば、＞１５０ｍＰ）を
示した。表３に示すデータは、カルボキシフルオレセイ
ントレーサーが３７℃において安定であり、このアッセ
イにおいて良好に機能することを実証する。
キシ−Ｎ−〔３−〔（９−ヒドロキシシンコナン−６’
−イル）オキシ〕プロピル〕−３−オキソスピロ〔イソ
ベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−〔９Ｈ〕キサンテ
ン〕−５−カルボキサミド（１３）の一般的な製造方法
を示し、実施例１７〜１９は化合物の合成を述べる。Ｍ
ｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ５の製造に用いた同じキニジン免疫
原から誘導したポリクローナル抗体Ｐ７９６と共に、Ｆ
ＰＩＡに用いたカルボキシフルオレセイントレーサー
（１３）は良好な動的範囲（例えば、＞１５０ｍＰ）を
示した。表３に示すデータは、カルボキシフルオレセイ
ントレーサーが３７℃において安定であり、このアッセ
イにおいて良好に機能することを実証する。
【００５２】
【表３】 表３ キニジンポリクローナル抗体とカルボキシトレーサー（１３）の 安定性（ｍＰ単位） ３７℃ ３７℃ ３７℃ μｇ／ｍｌ ０日目 １週間 ４週間 ６週間 ０ ２３９．４ ２３６．９ ２３４．９ ２３２．４ ０．５ ２２９．８ ２１４．７ ２０７．８ ２００．７ １ １９８ １８１．２ １７１ １６８．９ ２ １３１．４ １１９．８ １１５．５ １１８．２ ４ ９５．６ ９３ ９４．３ ９４．５ ８ ７７．３ ７７．１ ７８．５ ７９．４
【００５３】例えば血清のような、体液サンプル中のキ
ニジン量を測定するためのイムノアッセイキットに、本
発明の新規なトレーサーと抗体を用いることができる。
好ましい実施態様では、自動化ＣＯＢＡＳ ＦＡＲＡＩ
Ｉ（登録商標）化学系（ＣＯＢＡＳ ＦＰアッセイ系，
Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社，米国，ニュー
ジャージー州，ソマービル）でのイムノアッセイの実施
に、このキットを用いる。ヒト血清中のキニジン濃度を
測定するための蛍光偏光イムノアッセイの実施キット
は、式ＩＶのトレーサー化合物（例えば、化合物（７）
又は（１３））と、例えば、式ＩＩ化合物から得られた
ＭｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ５のような抗体とを含む。
ニジン量を測定するためのイムノアッセイキットに、本
発明の新規なトレーサーと抗体を用いることができる。
好ましい実施態様では、自動化ＣＯＢＡＳ ＦＡＲＡＩ
Ｉ（登録商標）化学系（ＣＯＢＡＳ ＦＰアッセイ系，
Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社，米国，ニュー
ジャージー州，ソマービル）でのイムノアッセイの実施
に、このキットを用いる。ヒト血清中のキニジン濃度を
測定するための蛍光偏光イムノアッセイの実施キット
は、式ＩＶのトレーサー化合物（例えば、化合物（７）
又は（１３））と、例えば、式ＩＩ化合物から得られた
ＭｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ５のような抗体とを含む。
【００５４】下記実施例は、本発明の新規なキニジン誘
導体の合成と、蛍光偏光イムノアッセイ系へのこれらの
化合物の使用とを説明する。見出しと実施例１〜１９と
における化合物の数の指示は、図１〜４に示す構造式を
意味する。
導体の合成と、蛍光偏光イムノアッセイ系へのこれらの
化合物の使用とを説明する。見出しと実施例１〜１９と
における化合物の数の指示は、図１〜４に示す構造式を
意味する。
【００５５】本発明の免疫原、（９Ｓ）−４−〔（９−
ヒドロキシシンコナン−６’−イル）オキシ〕−１−イ
ミノブチル−〔ＢＴＧ〕（４）の合成の中間体と最終生
成物との化学構造を図１に示す。本発明のトレーサー、
（９Ｓ）−Ｎ−〔（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オ
キソスピロ〔イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−
〔９Ｈ〕キサンテン〕−５イル）メチル〕−４−〔（９
−ヒドロキシシンコナン−６’−イル）オキシ〕ブタミ
ド（７）の合成の中間体と最終生成物との化学構造を図
２に示す。比較用Ｃ−９トレーサー、（９Ｓ）−〔２−
〔〔（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ
〔イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−〔９Ｈ〕パン
テオン〕−５−イル）メチルアミノ〕−２−オキソエチ
ル〕カルバミン酸６’−メトキシシンコナン−９−イル
エステル（１０）の合成の中間体と最終生成物との化学
構造を図３に示す。本発明のトレーサー、（９Ｓ）−
３’，６’−ジヒドロキシ−Ｎ−〔３−〔（９−ヒドロ
キシシンコナン−６’−イル）オキシ〕プロピル〕−３
−オキソスピロ〔イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’
−〔９Ｈ〕キサンテン〕−５−カルボキサミド（１３）
の合成の中間体と最終生成物との化学構造を図４に示
す。
ヒドロキシシンコナン−６’−イル）オキシ〕−１−イ
ミノブチル−〔ＢＴＧ〕（４）の合成の中間体と最終生
成物との化学構造を図１に示す。本発明のトレーサー、
（９Ｓ）−Ｎ−〔（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オ
キソスピロ〔イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−
〔９Ｈ〕キサンテン〕−５イル）メチル〕−４−〔（９
−ヒドロキシシンコナン−６’−イル）オキシ〕ブタミ
ド（７）の合成の中間体と最終生成物との化学構造を図
２に示す。比較用Ｃ−９トレーサー、（９Ｓ）−〔２−
〔〔（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ
〔イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−〔９Ｈ〕パン
テオン〕−５−イル）メチルアミノ〕−２−オキソエチ
ル〕カルバミン酸６’−メトキシシンコナン−９−イル
エステル（１０）の合成の中間体と最終生成物との化学
構造を図３に示す。本発明のトレーサー、（９Ｓ）−
３’，６’−ジヒドロキシ−Ｎ−〔３−〔（９−ヒドロ
キシシンコナン−６’−イル）オキシ〕プロピル〕−３
−オキソスピロ〔イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’
−〔９Ｈ〕キサンテン〕−５−カルボキサミド（１３）
の合成の中間体と最終生成物との化学構造を図４に示
す。
【００５６】
【実施例】実施例１ ６−ヒドロキシシンコニン（１）の製造 アルゴン雰囲気下で、冷却管（ｃｏｎｄｅｎｓｅｒ）を
備えた１リットル−三つ口丸底フラスコにキニジン（９
７％、Ａｌｄｒｉｃｈ）（５．０ｇ，１５．４ｍｍｏ
ｌ）と、ジクロロメタン（５００ｍｌ）とを装入した。
フラスコ中の溶液を−７８℃に冷却した。この冷却した
溶液に、ジクロロメタン中１．０Ｍ三臭化ホウ素（６１
ｍｌ，６１ｍｍｏｌ）を４５分間にわたって、徐々に加
えた。この反応混合物を２．５時間にわたって室温にま
で温度上昇させ、１時間還流加熱した。反応フラスコを
−２０℃に冷却し、１０％水酸化ナトリウム水溶液１１
５ｍｌを徐々に加えた。この添加中に、反応混合物の温
度を０℃に維持し、激しく撹拌した。混合物を２リット
ル−分液ロートに移した。フラスコ中に残留する残渣を
１０％水酸化ナトリウム（５ｍｌ）とジクロロメタン
（２０ｍｌ）との混合物を用いて分液ロートに移した。
若干のガム状黄色半固体を含む、分液ロート中の混合物
を１０分間、激しく振とうし、水層を有機相から徐々に
分離させた。有機層を廃棄し、水相をジクロロメタン
（１００ｍｌ）によって洗浄し、０℃に冷却した。水相
に、濃塩酸（ＨＣｌ）（１２．５ｍｌ）を加えた。この
溶液のこのｐＨを濃水酸化アンモニウムによってｐＨ１
０に調節した。得られた混合物をクロロホルム（１２ｘ
２５０ｍｌ）によって抽出し、無水硫酸ナトリウムによ
って乾燥させ、濃縮して、６−ヒドロキシシンコニン
（１）（３．１ｇ）を得た。母液の水層をｎ−ブタノー
ル（２ｘ２００ｍｌ）によって抽出して、さらに１．０
ｇを得て、６−ヒドロキシシンコニン（１）の４．１ｇ
の総収量（１３．２ｍｍｏｌ，８６％）を得た。ＭＳ、
ＩＲ及びＮＭＲデータによって化合物を同定した。
備えた１リットル−三つ口丸底フラスコにキニジン（９
７％、Ａｌｄｒｉｃｈ）（５．０ｇ，１５．４ｍｍｏ
ｌ）と、ジクロロメタン（５００ｍｌ）とを装入した。
フラスコ中の溶液を−７８℃に冷却した。この冷却した
溶液に、ジクロロメタン中１．０Ｍ三臭化ホウ素（６１
ｍｌ，６１ｍｍｏｌ）を４５分間にわたって、徐々に加
えた。この反応混合物を２．５時間にわたって室温にま
で温度上昇させ、１時間還流加熱した。反応フラスコを
−２０℃に冷却し、１０％水酸化ナトリウム水溶液１１
５ｍｌを徐々に加えた。この添加中に、反応混合物の温
度を０℃に維持し、激しく撹拌した。混合物を２リット
ル−分液ロートに移した。フラスコ中に残留する残渣を
１０％水酸化ナトリウム（５ｍｌ）とジクロロメタン
（２０ｍｌ）との混合物を用いて分液ロートに移した。
若干のガム状黄色半固体を含む、分液ロート中の混合物
を１０分間、激しく振とうし、水層を有機相から徐々に
分離させた。有機層を廃棄し、水相をジクロロメタン
（１００ｍｌ）によって洗浄し、０℃に冷却した。水相
に、濃塩酸（ＨＣｌ）（１２．５ｍｌ）を加えた。この
溶液のこのｐＨを濃水酸化アンモニウムによってｐＨ１
０に調節した。得られた混合物をクロロホルム（１２ｘ
２５０ｍｌ）によって抽出し、無水硫酸ナトリウムによ
って乾燥させ、濃縮して、６−ヒドロキシシンコニン
（１）（３．１ｇ）を得た。母液の水層をｎ−ブタノー
ル（２ｘ２００ｍｌ）によって抽出して、さらに１．０
ｇを得て、６−ヒドロキシシンコニン（１）の４．１ｇ
の総収量（１３．２ｍｍｏｌ，８６％）を得た。ＭＳ、
ＩＲ及びＮＭＲデータによって化合物を同定した。
【００５７】実施例２ （９Ｓ）−４−〔（９−ヒドロキシシンコナン−６’−
イル）オキシ〕ブタンニトリル（２）の製造 無水アセトン（炭酸カリウム上で乾燥かつ蒸留したも
の）（２５ｍｌ）と無水ジメチルホルムアミド（５ｍ
ｌ）中の６−ヒドロキシシンコナン（１）（４００ｍ
ｇ，１．２ｍｍｏｌ）の溶液に、無水炭酸カリウム（２
６７ｍｇ，１．９３ｍｍｏｌ）を加え、次に４−ブロモ
ブチロニトリル（１２９ｍｌ，０．８７ｍｍｏｌ）と触
媒量（３ｍｇ）の１８−クラウン−６とを加えた。この
反応混合物を１８時間還流加熱し、冷却し、濾過した。
濾液を減圧下で濃縮し、クロロホルム（２００ｍｌ）中
に再溶解した。有機層を５％水酸化ナトリウム水溶液
（２ｘ５０ｍｌ）によって洗浄し、ブラインによって洗
浄し、無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥させ、（９
Ｓ）−４−〔（９−ヒドロキシシンコナン−６’−イ
ル）オキシ〕ブタンニトリル（２）（３１０ｍｇ，０．
８２ｍｍｏｌ，６６％）を淡黄色固体として得た。Ｍ
Ｓ、ＩＲ及びＮＭＲデータによって化合物を同定した。
イル）オキシ〕ブタンニトリル（２）の製造 無水アセトン（炭酸カリウム上で乾燥かつ蒸留したも
の）（２５ｍｌ）と無水ジメチルホルムアミド（５ｍ
ｌ）中の６−ヒドロキシシンコナン（１）（４００ｍ
ｇ，１．２ｍｍｏｌ）の溶液に、無水炭酸カリウム（２
６７ｍｇ，１．９３ｍｍｏｌ）を加え、次に４−ブロモ
ブチロニトリル（１２９ｍｌ，０．８７ｍｍｏｌ）と触
媒量（３ｍｇ）の１８−クラウン−６とを加えた。この
反応混合物を１８時間還流加熱し、冷却し、濾過した。
濾液を減圧下で濃縮し、クロロホルム（２００ｍｌ）中
に再溶解した。有機層を５％水酸化ナトリウム水溶液
（２ｘ５０ｍｌ）によって洗浄し、ブラインによって洗
浄し、無水硫酸マグネシウムを用いて乾燥させ、（９
Ｓ）−４−〔（９−ヒドロキシシンコナン−６’−イ
ル）オキシ〕ブタンニトリル（２）（３１０ｍｇ，０．
８２ｍｍｏｌ，６６％）を淡黄色固体として得た。Ｍ
Ｓ、ＩＲ及びＮＭＲデータによって化合物を同定した。
【００５８】実施例３ （９Ｓ）−４−（９−ヒドロキシシンコナン−６’−イ
ル）ブタンイミド酸メチルエステル（３）の製造 −１０℃の無水メタノール（５ｍｌ）中の（９Ｓ）−４
−〔（９−ヒドロキシシンコナン−６’−イル）オキ
シ〕ブタンニトリル（２）（２００ｍｇ，０．５２ｍｍ
ｏｌ）の溶液に通して、塩酸ガスを１５分間バブルさせ
た。反応混合物に蓋をして（ｓｔｏｐｐｅｒｅｄ）、４
℃において４日間放置し、乾固するまで濃縮し、（９
Ｓ）−４−（９−ヒドロキシシンコナン−６’−イル）
ブタンイミド酸メチルエステル（３）（２２０ｍｇ，
０．４９ｍｍｏｌ，９３％）を固体として得た。ＨＮＭ
Ｒは、（９Ｓ）−４−（９−ヒドロキシシンコナン−
６’−イル）ブタンイミド酸メチルエステル（３）の純
度が７５％であり、残りの２５％が加水分解された化合
物であることを実証した。
ル）ブタンイミド酸メチルエステル（３）の製造 −１０℃の無水メタノール（５ｍｌ）中の（９Ｓ）−４
−〔（９−ヒドロキシシンコナン−６’−イル）オキ
シ〕ブタンニトリル（２）（２００ｍｇ，０．５２ｍｍ
ｏｌ）の溶液に通して、塩酸ガスを１５分間バブルさせ
た。反応混合物に蓋をして（ｓｔｏｐｐｅｒｅｄ）、４
℃において４日間放置し、乾固するまで濃縮し、（９
Ｓ）−４−（９−ヒドロキシシンコナン−６’−イル）
ブタンイミド酸メチルエステル（３）（２２０ｍｇ，
０．４９ｍｍｏｌ，９３％）を固体として得た。ＨＮＭ
Ｒは、（９Ｓ）−４−（９−ヒドロキシシンコナン−
６’−イル）ブタンイミド酸メチルエステル（３）の純
度が７５％であり、残りの２５％が加水分解された化合
物であることを実証した。
【００５９】実施例４ ９（Ｓ）−６’−シアノメチルオキシシンコナン−９−
オール（Ｌ＝１Ｃ）の製造 ６−ヒドロキシシンコニン（１）（０．５ｇ，１．５９
ｍｍｏｌ）と乾燥ＤＭＳＯ（５ｍｌ）との溶液に、ｎ−
ブチルリチウム（２．０ｍｌ，１．６Ｍ／ヘキサン，Ａ
ｌｄｒｉｃｈ）を０．５時間にわたって徐々に加える。
反応フラスコを氷浴中で冷却してから、クロロアセトニ
トリル（９６ｍｇ，１．２７ｍｍｏｌ）で処理する。反
応混合物の温度を２時間にわたって室温に上昇させ、混
合物を室温において１時間撹拌する。反応混合物を脱イ
オン水（２５ｍｌ）と酢酸エチル（５ｍｌ）中に注入
し、この間に生成物の一部は溶解する（ｏｉｌ ｏｕ
ｔ）。ジクロロメタン（１００ｍｌ）を加えて、油状生
成物を溶解させ、２層を得る。不均質な褐色混合物を減
圧下で濃縮し、有機溶媒を除去し、この間に生成物が析
出される。混合物を冷蔵庫中で一晩放置する。沈殿を回
収し、ＥＴＯＡｃで洗浄し、乳白色固体（０．４ｇ）を
得る。
オール（Ｌ＝１Ｃ）の製造 ６−ヒドロキシシンコニン（１）（０．５ｇ，１．５９
ｍｍｏｌ）と乾燥ＤＭＳＯ（５ｍｌ）との溶液に、ｎ−
ブチルリチウム（２．０ｍｌ，１．６Ｍ／ヘキサン，Ａ
ｌｄｒｉｃｈ）を０．５時間にわたって徐々に加える。
反応フラスコを氷浴中で冷却してから、クロロアセトニ
トリル（９６ｍｇ，１．２７ｍｍｏｌ）で処理する。反
応混合物の温度を２時間にわたって室温に上昇させ、混
合物を室温において１時間撹拌する。反応混合物を脱イ
オン水（２５ｍｌ）と酢酸エチル（５ｍｌ）中に注入
し、この間に生成物の一部は溶解する（ｏｉｌ ｏｕ
ｔ）。ジクロロメタン（１００ｍｌ）を加えて、油状生
成物を溶解させ、２層を得る。不均質な褐色混合物を減
圧下で濃縮し、有機溶媒を除去し、この間に生成物が析
出される。混合物を冷蔵庫中で一晩放置する。沈殿を回
収し、ＥＴＯＡｃで洗浄し、乳白色固体（０．４ｇ）を
得る。
【００６０】実施例５ ６’−シアノエチルオキシシンコニン（Ｌ＝２Ｃ）の製
造 無水アセトン（炭酸カリウム上で乾燥かつ蒸留したも
の）（２５ｍｌ）と無水ジメチルホルムアミド（５ｍ
ｌ）中の６−ヒドロキシシンコニン（１）（０．５ｇ，
１．５９ｍｍｏｌ）の溶液に、無水炭酸カリウム（０．
３２９ｇ，２．３９ｍｍｏｌ）を加え、次に３−クロロ
プロピオニトリル（Ａｌｄｒｉｃｈ）（０．１４２ｇ，
１．５９ｍｍｏｌ）と１８−クラウン−６（３ｍｇ）と
を加える。この反応混合物を１８時間還流加熱し、冷却
し、濾過する。濾液を減圧下で濃縮し、クロロホルム
（２００ｍｌ）中に再溶解する。有機層を５％水酸化ナ
トリウム水溶液（２ｘ５０ｍｌ）によって洗浄し、ブラ
インによって洗浄し、無水硫酸マグネシウムを用いて乾
燥させ、６’−シアノエチルオキシシンコニン（０．４
１５ｇ，１．１３ｍｍｏｌ，７１％）を淡黄色固体とし
て得る。
造 無水アセトン（炭酸カリウム上で乾燥かつ蒸留したも
の）（２５ｍｌ）と無水ジメチルホルムアミド（５ｍ
ｌ）中の６−ヒドロキシシンコニン（１）（０．５ｇ，
１．５９ｍｍｏｌ）の溶液に、無水炭酸カリウム（０．
３２９ｇ，２．３９ｍｍｏｌ）を加え、次に３−クロロ
プロピオニトリル（Ａｌｄｒｉｃｈ）（０．１４２ｇ，
１．５９ｍｍｏｌ）と１８−クラウン−６（３ｍｇ）と
を加える。この反応混合物を１８時間還流加熱し、冷却
し、濾過する。濾液を減圧下で濃縮し、クロロホルム
（２００ｍｌ）中に再溶解する。有機層を５％水酸化ナ
トリウム水溶液（２ｘ５０ｍｌ）によって洗浄し、ブラ
インによって洗浄し、無水硫酸マグネシウムを用いて乾
燥させ、６’−シアノエチルオキシシンコニン（０．４
１５ｇ，１．１３ｍｍｏｌ，７１％）を淡黄色固体とし
て得る。
【００６１】実施例６ （９Ｓ）−６’−（３−シアノベンジルオキシ）シンコ
ナン−９−オール（Ｌ＝ベンジル）の製造 無水アセトン（炭酸カリウム上で乾燥かつ蒸留したも
の）（２５ｍｌ）と無水ジメチルホルムアミド（８ｍ
ｌ）中の６−ヒドロキシシンコニン（１）（０．６ｇ，
１．９１ｍｍｏｌ）の溶液に、無水炭酸カリウム（０．
５１６ｇ，２．８７ｍｍｏｌ）を加え、次に３−（ブロ
モメチル）ベンゾニトリル（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ）
（０．３２９ｇ，１．９１ｍｍｏｌ）と１８−クラウン
−６（４ｍｇ）とを加える。この反応混合物を１８時間
還流加熱し、冷却し、濾過する。濾液を減圧下で濃縮
し、クロロホルム（２００ｍｌ）中に再溶解する。有機
層を５％水酸化ナトリウム水溶液（２ｘ５０ｍｌ）によ
って洗浄し、ブラインによって洗浄し、無水硫酸マグネ
シウムを用いて乾燥させ、（９Ｓ）−６’−（３−シア
ノベンジルオキシ）シンコナン−９−オール（０．６４
７ｇ，１．５１ｍｍｏｌ，７９％）を淡乳白色固体とし
て得る。
ナン−９−オール（Ｌ＝ベンジル）の製造 無水アセトン（炭酸カリウム上で乾燥かつ蒸留したも
の）（２５ｍｌ）と無水ジメチルホルムアミド（８ｍ
ｌ）中の６−ヒドロキシシンコニン（１）（０．６ｇ，
１．９１ｍｍｏｌ）の溶液に、無水炭酸カリウム（０．
５１６ｇ，２．８７ｍｍｏｌ）を加え、次に３−（ブロ
モメチル）ベンゾニトリル（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ）
（０．３２９ｇ，１．９１ｍｍｏｌ）と１８−クラウン
−６（４ｍｇ）とを加える。この反応混合物を１８時間
還流加熱し、冷却し、濾過する。濾液を減圧下で濃縮
し、クロロホルム（２００ｍｌ）中に再溶解する。有機
層を５％水酸化ナトリウム水溶液（２ｘ５０ｍｌ）によ
って洗浄し、ブラインによって洗浄し、無水硫酸マグネ
シウムを用いて乾燥させ、（９Ｓ）−６’−（３−シア
ノベンジルオキシ）シンコナン−９−オール（０．６４
７ｇ，１．５１ｍｍｏｌ，７９％）を淡乳白色固体とし
て得る。
【００６２】実施例７ キニジン免疫原（９Ｓ）−４−〔（９−ヒドロキシシン
コナン−６’−イル）オキシ〕−１−イミノブチル−
〔ＢＴＧ〕（４）の製造 乾燥ＤＭＳＯ（１ｍｌ）中の化合物（９Ｓ）−４−（９
−ヒドロキシシンコナン−６’−イル）ブタンイミド酸
メチルエステル（３）（１６６ｍｇ）の新たに調製した
溶液を、ウシチオグロブリン（ＢＴＧ）（７００ｍｇ）
を含む、ＤＭＳＯ（５５．５ｍｌ）と０．１Ｍリン酸カ
リウム（ＫＰｉ）ｐＨ７．５（３：１）の溶液混合物に
迅速に加えた。この反応混合物を４℃において一晩撹拌
した。得られたコンジュゲートを透析管（５０，０００
ＭＷカットオフ）に入れ、ＤＭＳＯ／５０ｍＭ ＫＰｉ
（ｐＨ７．５）３：１混合物と、ＤＭＳＯ／５０ｍＭ
ＫＰｉ（ｐＨ７．５）１：１混合物と、ＤＭＳＯ／５０
ｍＭ ＫＰｉ（ｐＨ７．５）１：３混合物との中で透析
し、５０ｍＭ ＫＰｉ緩衝剤（ｐＨ７．５）中で２回透
析した。このコンジュゲートを取り出し、無菌濾過し
て、タンパク質アッセイ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕ
ｅ）によって測定して、６．５ｍｇ／ｍｌの溶液（１１
０ｍｌ）を得た。残留リシン残基がトリニトロベンゼン
スルホン酸（ＴＮＢＳ）と反応する能力（ａｂｉｌｉｔ
ｙ）によって、このコンジュゲートのリシン修飾度を測
定した。得られた黄色複合体を次に４２０ｎｍにおいて
測定した。結果は、キニジン免疫原中の有効リシン（ａ
ｖａｉｌａｂｌｅ ｌｙｓｉｎｅ）の６３％が修飾され
ていることを実証した。この物質を動物免疫化に用い
た。
コナン−６’−イル）オキシ〕−１−イミノブチル−
〔ＢＴＧ〕（４）の製造 乾燥ＤＭＳＯ（１ｍｌ）中の化合物（９Ｓ）−４−（９
−ヒドロキシシンコナン−６’−イル）ブタンイミド酸
メチルエステル（３）（１６６ｍｇ）の新たに調製した
溶液を、ウシチオグロブリン（ＢＴＧ）（７００ｍｇ）
を含む、ＤＭＳＯ（５５．５ｍｌ）と０．１Ｍリン酸カ
リウム（ＫＰｉ）ｐＨ７．５（３：１）の溶液混合物に
迅速に加えた。この反応混合物を４℃において一晩撹拌
した。得られたコンジュゲートを透析管（５０，０００
ＭＷカットオフ）に入れ、ＤＭＳＯ／５０ｍＭ ＫＰｉ
（ｐＨ７．５）３：１混合物と、ＤＭＳＯ／５０ｍＭ
ＫＰｉ（ｐＨ７．５）１：１混合物と、ＤＭＳＯ／５０
ｍＭ ＫＰｉ（ｐＨ７．５）１：３混合物との中で透析
し、５０ｍＭ ＫＰｉ緩衝剤（ｐＨ７．５）中で２回透
析した。このコンジュゲートを取り出し、無菌濾過し
て、タンパク質アッセイ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕ
ｅ）によって測定して、６．５ｍｇ／ｍｌの溶液（１１
０ｍｌ）を得た。残留リシン残基がトリニトロベンゼン
スルホン酸（ＴＮＢＳ）と反応する能力（ａｂｉｌｉｔ
ｙ）によって、このコンジュゲートのリシン修飾度を測
定した。得られた黄色複合体を次に４２０ｎｍにおいて
測定した。結果は、キニジン免疫原中の有効リシン（ａ
ｖａｉｌａｂｌｅ ｌｙｓｉｎｅ）の６３％が修飾され
ていることを実証した。この物質を動物免疫化に用い
た。
【００６３】実施例８ キニジン免疫原（９Ｓ）−４−〔（９−ヒドロキシシン
コナン−６’−イル）オキシ〕−１−イミノブチル−
〔ＢＳＡ〕の製造 ＤＭＳＯ（５７ｍｌ）を含むＢＳＡ（０．１Ｍ ＫＰｉ
ｐＨ７．５（１９ｍｌ）中の１．２ｇ）の溶液に、
（９Ｓ）−４−（９−ヒドロキシシンコナン−６’−イ
ル）ブタンイミド酸メチルエステル（３）（乾燥ＤＭＳ
Ｏ（１ｍｌ）中の２３ｍｇ）の新たに調製した溶液を迅
速に加えた。この反応を４℃において一晩撹拌した。得
られたコンジュゲートを透析管（１０，０００ＭＷカッ
トオフ）に入れ、ＤＭＳＯ／５０ｍＭ ＫＰｉ（ｐＨ
７．５）３：１混合物と、ＤＭＳＯ／５０ｍＭ ＫＰｉ
（ｐＨ７．５）１：１混合物と、ＤＭＳＯ／５０ｍＭ
ＫＰｉ（ｐＨ７．５）１：３混合物との中で透析し、５
０ｍＭ ＫＰｉ緩衝剤（ｐＨ７．５）中で２回透析し
た。このコンジュゲートを取り出し、無菌濾過して、タ
ンパク質アッセイ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ）に
よって測定して、１０．２ｍｇ／ｍｌの溶液（１１５ｍ
ｌ）を得た。この物質はＥＬＩＳＡによる抗体スクリー
ニングのためにコンジュゲート−キャプチャー（ｃｏｎ
ｊｕｇａｔｅ−ｃａｐｔｕｒｅ）として役立った。
コナン−６’−イル）オキシ〕−１−イミノブチル−
〔ＢＳＡ〕の製造 ＤＭＳＯ（５７ｍｌ）を含むＢＳＡ（０．１Ｍ ＫＰｉ
ｐＨ７．５（１９ｍｌ）中の１．２ｇ）の溶液に、
（９Ｓ）−４−（９−ヒドロキシシンコナン−６’−イ
ル）ブタンイミド酸メチルエステル（３）（乾燥ＤＭＳ
Ｏ（１ｍｌ）中の２３ｍｇ）の新たに調製した溶液を迅
速に加えた。この反応を４℃において一晩撹拌した。得
られたコンジュゲートを透析管（１０，０００ＭＷカッ
トオフ）に入れ、ＤＭＳＯ／５０ｍＭ ＫＰｉ（ｐＨ
７．５）３：１混合物と、ＤＭＳＯ／５０ｍＭ ＫＰｉ
（ｐＨ７．５）１：１混合物と、ＤＭＳＯ／５０ｍＭ
ＫＰｉ（ｐＨ７．５）１：３混合物との中で透析し、５
０ｍＭ ＫＰｉ緩衝剤（ｐＨ７．５）中で２回透析し
た。このコンジュゲートを取り出し、無菌濾過して、タ
ンパク質アッセイ（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ）に
よって測定して、１０．２ｍｇ／ｍｌの溶液（１１５ｍ
ｌ）を得た。この物質はＥＬＩＳＡによる抗体スクリー
ニングのためにコンジュゲート−キャプチャー（ｃｏｎ
ｊｕｇａｔｅ−ｃａｐｔｕｒｅ）として役立った。
【００６４】実施例９ 二置換キニジン誘導体（Ｓ）−８−エテニル−２−〔ヒ
ドロキシ−６−（２−エトキシ−２−オキソエトキシ）
−４−キノリニルメチル〕−１−（２−エトキシ−２−
オキソエチル）アゾニアビシクロ〔２．２．２〕オクタ
ンヨージド（１５）の製造 マグネチックスターラーを備えた１リットル−三つ口丸
底フラスコに、６−ヒドロキシシンコニン（１）（２．
０ｇ，６．４４ｍｍｏｌ）と、モレキュラーシーブ上で
予め乾燥させたＤＭＳＯ（１０ｍｌ）とを装入した。撹
拌した溶液に、ｎ−ブチルリチウム（２．８ｍｌ（７．
０ｍｍｏｌ），２．５Ｍ／ヘキサン，Ａｌｄｒｉｃｈ）
を０．５時間にわたって、非常にゆっくり加えた。反応
フラスコを氷−水浴によって冷却してから、ヨード酢酸
エチル（１６ｍｌ，１３．５７ｍｍｏｌ）によって処理
した。温度を２時間にわたって室温に上昇させ、混合物
を室温において１時間撹拌した。反応混合物を脱イオン
水（６５ｍｌ）と酢酸エチル（１５ｍｌ）中に注入し、
この間に生成物の一部は溶解した。ジクロロメタン（１
００ｍｌ）を加えて、油状生成物を溶解させ、２層を得
た。不均質な褐色混合物を減圧下で濃縮し、有機溶媒を
除去し、この間に生成物が析出された。混合物を冷蔵庫
中で一晩放置した。沈殿を回収し、酢酸エチルで洗浄
し、（Ｓ）−８−エテニル−２−〔ヒドロキシ−６−
（２−エトキシ−２−オキソエトキシ）−４−キノリニ
ルメチル〕−１−（２−エトキシ−２−オキソエチル）
アゾニアビシクロ〔２．２．２〕オクタンヨージド（１
５）（１．６ｇ，４１％）を乳白色固体として得た。Ｎ
ＭＲ、ＩＲ及びＭＳデータによって、化合物を同定し
た。
ドロキシ−６−（２−エトキシ−２−オキソエトキシ）
−４−キノリニルメチル〕−１−（２−エトキシ−２−
オキソエチル）アゾニアビシクロ〔２．２．２〕オクタ
ンヨージド（１５）の製造 マグネチックスターラーを備えた１リットル−三つ口丸
底フラスコに、６−ヒドロキシシンコニン（１）（２．
０ｇ，６．４４ｍｍｏｌ）と、モレキュラーシーブ上で
予め乾燥させたＤＭＳＯ（１０ｍｌ）とを装入した。撹
拌した溶液に、ｎ−ブチルリチウム（２．８ｍｌ（７．
０ｍｍｏｌ），２．５Ｍ／ヘキサン，Ａｌｄｒｉｃｈ）
を０．５時間にわたって、非常にゆっくり加えた。反応
フラスコを氷−水浴によって冷却してから、ヨード酢酸
エチル（１６ｍｌ，１３．５７ｍｍｏｌ）によって処理
した。温度を２時間にわたって室温に上昇させ、混合物
を室温において１時間撹拌した。反応混合物を脱イオン
水（６５ｍｌ）と酢酸エチル（１５ｍｌ）中に注入し、
この間に生成物の一部は溶解した。ジクロロメタン（１
００ｍｌ）を加えて、油状生成物を溶解させ、２層を得
た。不均質な褐色混合物を減圧下で濃縮し、有機溶媒を
除去し、この間に生成物が析出された。混合物を冷蔵庫
中で一晩放置した。沈殿を回収し、酢酸エチルで洗浄
し、（Ｓ）−８−エテニル−２−〔ヒドロキシ−６−
（２−エトキシ−２−オキソエトキシ）−４−キノリニ
ルメチル〕−１−（２−エトキシ−２−オキソエチル）
アゾニアビシクロ〔２．２．２〕オクタンヨージド（１
５）（１．６ｇ，４１％）を乳白色固体として得た。Ｎ
ＭＲ、ＩＲ及びＭＳデータによって、化合物を同定し
た。
【００６５】実施例１０ 二置換キニジン誘導体（９Ｓ）−１−（３−カルボキシ
プロピル）−６’−（３−カルボキシプロポキシ）シン
コニウムクロリド（１６）の製造 乾燥アセトン（炭酸カリウム上で乾燥かつ蒸留したも
の）（７５ｍｌ）とジメチルホルムアミド（２５ｍｌ，
Ａｌｄｒｉｃｈ，９９％）中の（１）（２．７ｇ，８．
７ｍｍｏｌ）の溶液に、無水炭酸カリウム（２．５ｇ，
１８．１ｍｍｏｌ）を加え、次にエチル−４−ブロモブ
チレート（２．４９ｍｌ，１７．４ｍｍｏｌ）と１８−
クラウン−６（２５ｍｇ）とを加えた。この反応混合物
を１８時間還流加熱し、冷却し、濾過し、濾液を減圧下
で濃縮した。残渣を溶離剤として酢酸エチル：メタノー
ル：水：アセトン（６：１：１：１）の混合物を用いる
シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、
ジエチルエステル（２．７ｇ）を褐色油状物として得
た。この油状物をメタノール（１５０ｍｌ）中の炭酸カ
リウム（１．４ｇ）によって処理し、２０時間還流加熱
した。反応混合物を濃縮し、水（１５ｍｌ）中に再溶解
した。得られた溶液を１Ｎ ＨＣｌによってｐＨ５に調
節した。これを減圧濃縮し、褐色残渣を分取薄層クロマ
トグラフィーによって酢酸エチル：メタノール：水
（８：１：１）の混合物を用いて精製して、二酸（１
６）（２．３４ｇ，５１％）を乳白色粉末として得た。
ＮＭＲ、ＩＲ及びＭＳデータによって、化合物を同定し
た。
プロピル）−６’−（３−カルボキシプロポキシ）シン
コニウムクロリド（１６）の製造 乾燥アセトン（炭酸カリウム上で乾燥かつ蒸留したも
の）（７５ｍｌ）とジメチルホルムアミド（２５ｍｌ，
Ａｌｄｒｉｃｈ，９９％）中の（１）（２．７ｇ，８．
７ｍｍｏｌ）の溶液に、無水炭酸カリウム（２．５ｇ，
１８．１ｍｍｏｌ）を加え、次にエチル−４−ブロモブ
チレート（２．４９ｍｌ，１７．４ｍｍｏｌ）と１８−
クラウン−６（２５ｍｇ）とを加えた。この反応混合物
を１８時間還流加熱し、冷却し、濾過し、濾液を減圧下
で濃縮した。残渣を溶離剤として酢酸エチル：メタノー
ル：水：アセトン（６：１：１：１）の混合物を用いる
シリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製し、
ジエチルエステル（２．７ｇ）を褐色油状物として得
た。この油状物をメタノール（１５０ｍｌ）中の炭酸カ
リウム（１．４ｇ）によって処理し、２０時間還流加熱
した。反応混合物を濃縮し、水（１５ｍｌ）中に再溶解
した。得られた溶液を１Ｎ ＨＣｌによってｐＨ５に調
節した。これを減圧濃縮し、褐色残渣を分取薄層クロマ
トグラフィーによって酢酸エチル：メタノール：水
（８：１：１）の混合物を用いて精製して、二酸（１
６）（２．３４ｇ，５１％）を乳白色粉末として得た。
ＮＭＲ、ＩＲ及びＭＳデータによって、化合物を同定し
た。
【００６６】実施例１１ （９Ｓ）−４−（９−ヒドロキシシンコナン−６’−イ
ル）オキシブタン酸エチルエステル（５）の製造 乾燥ジメチルホルムアミド（６ｍｌ，Ａｌｄｒｉｃｈ，
９９％）中の（１）（２５０ｍｇ，０．８０ｍｍｏｌ）
の溶液に、無水炭酸カリウム（１１０ｍｇ，０．８０ｍ
ｍｏｌ）を加え、次にエチル−４−ブロモブチレート
（１０９ｍｌ，０．７５ｍｍｏｌ）と触媒量（４ｍｇ）
の１８−クラウン−６とを加えた。この反応混合物を１
２０℃において２時間加熱し、冷却し、減圧下に置い
て、ジメチルホルムアミドを除去した。残渣にジクロロ
メタン（５０ｍｌ）を加え、混合物を濾過した。濾液を
５％水酸化ナトリウム（２ｘ２５ｍｌ）とブラインとに
よって洗浄し、乾燥させ（無水硫酸ナトリウム）、濃縮
した。残渣を分取薄層クロマトグラフィーによって酢酸
エチル：メタノール：水：濃水酸化アンモニウム（６：
１：１：１）の混合物を溶離剤として用いて精製して、
（５）（１６０ｍｇ，０．３７ｍｍｏｌ，４５％）を褐
色油状物として得た。ＭＳ、ＩＲ及びＮＭＲデータによ
って、化合物を同定した。
ル）オキシブタン酸エチルエステル（５）の製造 乾燥ジメチルホルムアミド（６ｍｌ，Ａｌｄｒｉｃｈ，
９９％）中の（１）（２５０ｍｇ，０．８０ｍｍｏｌ）
の溶液に、無水炭酸カリウム（１１０ｍｇ，０．８０ｍ
ｍｏｌ）を加え、次にエチル−４−ブロモブチレート
（１０９ｍｌ，０．７５ｍｍｏｌ）と触媒量（４ｍｇ）
の１８−クラウン−６とを加えた。この反応混合物を１
２０℃において２時間加熱し、冷却し、減圧下に置い
て、ジメチルホルムアミドを除去した。残渣にジクロロ
メタン（５０ｍｌ）を加え、混合物を濾過した。濾液を
５％水酸化ナトリウム（２ｘ２５ｍｌ）とブラインとに
よって洗浄し、乾燥させ（無水硫酸ナトリウム）、濃縮
した。残渣を分取薄層クロマトグラフィーによって酢酸
エチル：メタノール：水：濃水酸化アンモニウム（６：
１：１：１）の混合物を溶離剤として用いて精製して、
（５）（１６０ｍｇ，０．３７ｍｍｏｌ，４５％）を褐
色油状物として得た。ＭＳ、ＩＲ及びＮＭＲデータによ
って、化合物を同定した。
【００６７】実施例１２ （９Ｓ）−４−（９−ヒドロキシシンコナン−６’−イ
ル）オキシブタン酸（６）の製造 メタノール（３５ｍｌ）中の（５）（１５０ｍｇ，０．
３５ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（８０ｍｇ）との混合物
を２０時間還流加熱した。この反応混合物を濃縮し、水
（１５ｍｌ）中に再溶解した。得られた溶液を１Ｎ Ｈ
Ｃｌの添加によってｐＨ５に調節した。これを減圧濃縮
し、褐色残渣を分取薄層クロマトグラフィーによって酢
酸エチル：メタノール：水（８：１：１）の混合物を用
いて精製して、（６）（８５ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ，
６１％）を乳白色粉末として得た。ＭＳ、ＩＲ及びＮＭ
Ｒデータによって、化合物を同定した。
ル）オキシブタン酸（６）の製造 メタノール（３５ｍｌ）中の（５）（１５０ｍｇ，０．
３５ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（８０ｍｇ）との混合物
を２０時間還流加熱した。この反応混合物を濃縮し、水
（１５ｍｌ）中に再溶解した。得られた溶液を１Ｎ Ｈ
Ｃｌの添加によってｐＨ５に調節した。これを減圧濃縮
し、褐色残渣を分取薄層クロマトグラフィーによって酢
酸エチル：メタノール：水（８：１：１）の混合物を用
いて精製して、（６）（８５ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ，
６１％）を乳白色粉末として得た。ＭＳ、ＩＲ及びＮＭ
Ｒデータによって、化合物を同定した。
【００６８】実施例１３ 本発明のトレーサー、（９Ｓ）−Ｎ−〔３’，６’−ジ
ヒドロキシ−３−オキソスピロ〔イソベンゾフラン−１
（３Ｈ），９’−〔９Ｈ〕キサンテン〕−５−イル）メ
チル〕−４−〔（９−ヒドロキシシンコナン−６’−イ
ル）オキシ〕ブタミド（７）の製造 （６）（５０ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）に、ジメチルホ
ルムアミド（５ｍｌ）を加えた。０℃に冷却した後に、
得られた溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（３
０ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシン
イミド（２５ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）とを加えた。こ
の混合物を４℃において４８時間撹拌させ、わきに置い
た。別のフラスコに、５−アミノメチルフルオレセイン
塩酸塩（６０ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）とピリジン（３
ｍｌ）とを室温において加えた。ピリジン塩酸塩の沈殿
が直ちに出現した。この懸濁液に、予め調製したＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミド溶液を滴加した。この混合物を
室温において４日間撹拌させてから、減圧濃縮した。残
渣を分取薄層クロマトグラフィー（シリカ，２ｍｍ）に
よって、溶離剤として酢酸エチル：メタノール（９：
１）の混合物を用いて精製した。得られた橙色生成物は
不純物の存在を示し、薄層クロマトグラフィー（シリ
カ，０．２５ｍｍ）によって、クロロホルム：メタノー
ル（５：１）の混合物を用いて再精製して、本発明のト
レーサー（７）（２４ｍｇ，０．０３２ｍｍｏｌ，２６
％）を得た。ＭＳ、ＩＲ及びＮＭＲデータによって、化
合物を同定した。
ヒドロキシ−３−オキソスピロ〔イソベンゾフラン−１
（３Ｈ），９’−〔９Ｈ〕キサンテン〕−５−イル）メ
チル〕−４−〔（９−ヒドロキシシンコナン−６’−イ
ル）オキシ〕ブタミド（７）の製造 （６）（５０ｍｇ，０．１２ｍｍｏｌ）に、ジメチルホ
ルムアミド（５ｍｌ）を加えた。０℃に冷却した後に、
得られた溶液に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（３
０ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）とＮ−ヒドロキシスクシン
イミド（２５ｍｇ，０．２１ｍｍｏｌ）とを加えた。こ
の混合物を４℃において４８時間撹拌させ、わきに置い
た。別のフラスコに、５−アミノメチルフルオレセイン
塩酸塩（６０ｍｇ，０．１５ｍｍｏｌ）とピリジン（３
ｍｌ）とを室温において加えた。ピリジン塩酸塩の沈殿
が直ちに出現した。この懸濁液に、予め調製したＮ−ヒ
ドロキシスクシンイミド溶液を滴加した。この混合物を
室温において４日間撹拌させてから、減圧濃縮した。残
渣を分取薄層クロマトグラフィー（シリカ，２ｍｍ）に
よって、溶離剤として酢酸エチル：メタノール（９：
１）の混合物を用いて精製した。得られた橙色生成物は
不純物の存在を示し、薄層クロマトグラフィー（シリ
カ，０．２５ｍｍ）によって、クロロホルム：メタノー
ル（５：１）の混合物を用いて再精製して、本発明のト
レーサー（７）（２４ｍｇ，０．０３２ｍｍｏｌ，２６
％）を得た。ＭＳ、ＩＲ及びＮＭＲデータによって、化
合物を同定した。
【００６９】実施例１４ （９Ｓ）−〔〔〔（６’−メトキシシンコナン−９−イ
ル）オキシ〕カルボニル〕アミノ〕酢酸エチルエステル
（８）の製造 乾燥ジクロロメタン（５ｍｌ）中のキニジン（２００ｍ
ｇ，０．６１ｍｍｏｌ）の溶液に、エチルイソシアナト
アセテート（７４ｍｌ，０．６５ｍｍｏｌ）を加えた。
混合物を室温において電磁気的に１８時間撹拌させ、減
圧濃縮した。残渣を分取薄層クロマトグラフィー（シリ
カ，２ｍｍ）によって、溶離剤として酢酸エチル：メタ
ノール（９：１）の混合物を用いて精製して、（８）
（１３０ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ，４６％）を得た。Ｍ
Ｓ、ＩＲ及びＮＭＲデータによって、この化合物を同定
した。
ル）オキシ〕カルボニル〕アミノ〕酢酸エチルエステル
（８）の製造 乾燥ジクロロメタン（５ｍｌ）中のキニジン（２００ｍ
ｇ，０．６１ｍｍｏｌ）の溶液に、エチルイソシアナト
アセテート（７４ｍｌ，０．６５ｍｍｏｌ）を加えた。
混合物を室温において電磁気的に１８時間撹拌させ、減
圧濃縮した。残渣を分取薄層クロマトグラフィー（シリ
カ，２ｍｍ）によって、溶離剤として酢酸エチル：メタ
ノール（９：１）の混合物を用いて精製して、（８）
（１３０ｍｇ，０．２８ｍｍｏｌ，４６％）を得た。Ｍ
Ｓ、ＩＲ及びＮＭＲデータによって、この化合物を同定
した。
【００７０】実施例１５ （９Ｓ）−〔〔〔（６’−メトキシシンコナン−９−イ
ル）オキシ〕カルボニル〕アミノ〕酢酸（９）の製造 メタノール（２ｍｌ）中の（８）（１２０ｍｇ，０．２
６ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（２００ｍｇ）と
水（０．５ｍｌ）とを加えた。混合物を２時間還流加熱
し、室温に冷却した。反応混合物を濾過し、濾液を濃縮
して、メタノールを除去した。残渣を水（２ｍｌ）に再
溶解し、ｐＨ７になるまで、この溶液に１Ｎ ＨＣｌを
滴加した。この水溶液を濃縮し、メタノール（１００ｍ
ｌ）を加え、濾過した。濾液を濃縮し、（９）（９５ｍ
ｇ，０．２２ｍｍｏｌ，８５％）を得た。
ル）オキシ〕カルボニル〕アミノ〕酢酸（９）の製造 メタノール（２ｍｌ）中の（８）（１２０ｍｇ，０．２
６ｍｍｏｌ）の溶液に、炭酸カリウム（２００ｍｇ）と
水（０．５ｍｌ）とを加えた。混合物を２時間還流加熱
し、室温に冷却した。反応混合物を濾過し、濾液を濃縮
して、メタノールを除去した。残渣を水（２ｍｌ）に再
溶解し、ｐＨ７になるまで、この溶液に１Ｎ ＨＣｌを
滴加した。この水溶液を濃縮し、メタノール（１００ｍ
ｌ）を加え、濾過した。濾液を濃縮し、（９）（９５ｍ
ｇ，０．２２ｍｍｏｌ，８５％）を得た。
【００７１】実施例１６ 比較用Ｃ−９トレーサー、（９Ｓ）−〔２−
〔〔（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ
〔イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−〔９Ｈ〕パン
テオン〕−５−イル）メチルアミノ〕−２−オキソエチ
ル〕カルバミン酸 ６’−メトキシシンコナン−９−イ
ルエステル（１０）の製造 ジメチルホルムアミド（０．５ｍｌ）中の（９）（２６
ｍｇ，０．０６１ｍｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却した。
この溶液に、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカル
ボジイミド）（２０ｍｇ，０．０９６ｍｍｏｌ）とＮ−
ヒドロキシスクシンイミド（１６ｍｇ，０．０１３９ｍ
ｍｏｌ）とを加えた。この反応混合物を４℃において２
０時間撹拌し、わきに置いた。別のフラスコに、５−ア
ミノメチルフルオレセイン塩酸塩（３０ｍｇ，０．０７
５ｍｍｏｌ）と無水ピリジン（３ｍｌ）とを加えた。ピ
リジン塩酸塩の沈殿が形成された。この懸濁液に、予め
（現場で）調製したＮ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル溶液を滴加した。この混合物を室温において４８時
間撹拌させてから、減圧濃縮した。残渣を分取薄層クロ
マトグラフィー（シリカ，２ｍｍ）に供給した。このプ
レートを溶離剤としてのクロロホルム：メタノール
（８：２）の混合物を用いて展開させた。得られた黄色
生成物を上記溶離剤を用いて再精製し、比較用Ｃ−９ト
レーサー（１０）（１１ｍｇ，０．０１４ｍｍｏｌ，２
４％）を橙色固体として得た。ＭＳ、ＩＲ及びＮＭＲデ
ータによって、化合物を同定した。
〔〔（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ
〔イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−〔９Ｈ〕パン
テオン〕−５−イル）メチルアミノ〕−２−オキソエチ
ル〕カルバミン酸 ６’−メトキシシンコナン−９−イ
ルエステル（１０）の製造 ジメチルホルムアミド（０．５ｍｌ）中の（９）（２６
ｍｇ，０．０６１ｍｍｏｌ）の溶液を０℃に冷却した。
この溶液に、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカル
ボジイミド）（２０ｍｇ，０．０９６ｍｍｏｌ）とＮ−
ヒドロキシスクシンイミド（１６ｍｇ，０．０１３９ｍ
ｍｏｌ）とを加えた。この反応混合物を４℃において２
０時間撹拌し、わきに置いた。別のフラスコに、５−ア
ミノメチルフルオレセイン塩酸塩（３０ｍｇ，０．０７
５ｍｍｏｌ）と無水ピリジン（３ｍｌ）とを加えた。ピ
リジン塩酸塩の沈殿が形成された。この懸濁液に、予め
（現場で）調製したＮ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル溶液を滴加した。この混合物を室温において４８時
間撹拌させてから、減圧濃縮した。残渣を分取薄層クロ
マトグラフィー（シリカ，２ｍｍ）に供給した。このプ
レートを溶離剤としてのクロロホルム：メタノール
（８：２）の混合物を用いて展開させた。得られた黄色
生成物を上記溶離剤を用いて再精製し、比較用Ｃ−９ト
レーサー（１０）（１１ｍｇ，０．０１４ｍｍｏｌ，２
４％）を橙色固体として得た。ＭＳ、ＩＲ及びＮＭＲデ
ータによって、化合物を同定した。
【００７２】実施例１７ （９Ｓ）−２−〔３−〔（９−ヒドロキシシンコナン−
６’−イル）オキシ〕プロピル〕−１Ｈ−イソインドー
ル−１，３（２Ｈ）−ジオン（１１）の製造 乾燥アセトン（７５ｍｌ）中の６−ヒドロキシシンコニ
ン（１）（２．５ｇ，８．０６ｍｍｏｌ）と、Ｎ−（３
−ブロモプロピル）フタルイミド（２．１６ｇ，８．０
６ｍｍｏｌ）と、無水炭酸カリウム（１．３ｇ，９．４
ｍｍｏｌ）と、１８−クラウン−６（５ｍｇ）との混合
物をアルゴン雰囲気下で１６時間還流させた。反応を室
温に冷却し、メタノール（３０ｍｌ）を加えて、均質な
溶液にした。得られた溶液を濃縮し、残渣をシリカゲル
カラムクロマトグラフィーによって、溶離剤としてクロ
ロホルム中５％メタノールを用いて部分的に精製した。
この生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによ
って、クロロホルム中１０％メタノールを用いて再精製
して、（１１）（１．０８ｇ，２．１７ｍｍｏｌ，２７
％）を乳白色固体として得た。ＭＳ、ＩＲ及びＮＭＲデ
ータによって、化合物を同定した。
６’−イル）オキシ〕プロピル〕−１Ｈ−イソインドー
ル−１，３（２Ｈ）−ジオン（１１）の製造 乾燥アセトン（７５ｍｌ）中の６−ヒドロキシシンコニ
ン（１）（２．５ｇ，８．０６ｍｍｏｌ）と、Ｎ−（３
−ブロモプロピル）フタルイミド（２．１６ｇ，８．０
６ｍｍｏｌ）と、無水炭酸カリウム（１．３ｇ，９．４
ｍｍｏｌ）と、１８−クラウン−６（５ｍｇ）との混合
物をアルゴン雰囲気下で１６時間還流させた。反応を室
温に冷却し、メタノール（３０ｍｌ）を加えて、均質な
溶液にした。得られた溶液を濃縮し、残渣をシリカゲル
カラムクロマトグラフィーによって、溶離剤としてクロ
ロホルム中５％メタノールを用いて部分的に精製した。
この生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーによ
って、クロロホルム中１０％メタノールを用いて再精製
して、（１１）（１．０８ｇ，２．１７ｍｍｏｌ，２７
％）を乳白色固体として得た。ＭＳ、ＩＲ及びＮＭＲデ
ータによって、化合物を同定した。
【００７３】実施例１８ （９Ｓ）−６’−（３−アミノプロポキシ）シンコニナ
ン−９−オール（１２）の製造 キニジンプロピルフタルイミド（１１）（３００ｍｇ，
０．６０ｍｍｏｌ）に、メチルアミンガスによって飽和
されたメタノール中のメチルアミン（２ｍｌ）を加え
た。反応フラスコに蓋をして、混合物を室温において１
６時間撹拌させた。反応混合物のアリコートを薄層クロ
マトグラフィー（ジクロロメタン中１０％メタノール）
によって監視し、出発物質の完全な消失を実証した。反
応混合物を濃縮し、残渣をジクロロメタン（３０ｍｌ）
中に再溶解させた。有機層を等量の水によって２回抽出
した。水性部分を濃縮して、（１２）（１２４ｍｇ，
０．３３ｍｍｏｌ，５６％）を透明な油状物として得
た。ＭＳ、ＩＲ及びＮＭＲデータによって、化合物を同
定した。
ン−９−オール（１２）の製造 キニジンプロピルフタルイミド（１１）（３００ｍｇ，
０．６０ｍｍｏｌ）に、メチルアミンガスによって飽和
されたメタノール中のメチルアミン（２ｍｌ）を加え
た。反応フラスコに蓋をして、混合物を室温において１
６時間撹拌させた。反応混合物のアリコートを薄層クロ
マトグラフィー（ジクロロメタン中１０％メタノール）
によって監視し、出発物質の完全な消失を実証した。反
応混合物を濃縮し、残渣をジクロロメタン（３０ｍｌ）
中に再溶解させた。有機層を等量の水によって２回抽出
した。水性部分を濃縮して、（１２）（１２４ｍｇ，
０．３３ｍｍｏｌ，５６％）を透明な油状物として得
た。ＭＳ、ＩＲ及びＮＭＲデータによって、化合物を同
定した。
【００７４】実施例１９ 本発明のトレーサー、（９Ｓ）−３’，６’−ジヒドロ
キシ−Ｎ−〔３−〔（９−ヒドロキシシンコナン−６’
−イル）オキシ〕プロピル〕−３−オキソスピロ〔イソ
ベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−〔９Ｈ〕キサンテ
ン〕−５−カルボキサミド（１３）の製造 乾燥ピリジン（２．５ｍｌ）中のキニジンプロピルアミ
ン（１２）（３６ｍｇ，０．０９７ｍｍｏｌ）と５−カ
ルボキシフルオレセインＮ−ヒドロキシスクシンイミド
エステル（３７ｍｇ，０．０９８ｍｍｏｌ）との混合物
を、アルゴン雰囲気下、室温において電磁気的に（ｍａ
ｇｎｅｔｉｃａｌｌｙ）３日間撹拌させた。反応を薄層
クロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール：水
（８：１：１））によって監視し、この監視は出発物質
のかなりの量（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｑｕａｎｔｉ
ｔｙ）の存在を実証した。次に、これをアルゴン雰囲気
下、４０〜４５℃において３日間加熱した。混合物を室
温に冷却して、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラム
クロマトグラフィーによって、溶離剤として酢酸エチ
ル：メタノール：水（８：１：１）を用いて精製して、
（１３）（４ｍｇ，５．５ｘ１０-3ｍｍｏｌ，５．６
％）を橙色固体として得た。ＭＳ、ＩＲ及びＮＭＲデー
タによって、化合物を同定した。
キシ−Ｎ−〔３−〔（９−ヒドロキシシンコナン−６’
−イル）オキシ〕プロピル〕−３−オキソスピロ〔イソ
ベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−〔９Ｈ〕キサンテ
ン〕−５−カルボキサミド（１３）の製造 乾燥ピリジン（２．５ｍｌ）中のキニジンプロピルアミ
ン（１２）（３６ｍｇ，０．０９７ｍｍｏｌ）と５−カ
ルボキシフルオレセインＮ−ヒドロキシスクシンイミド
エステル（３７ｍｇ，０．０９８ｍｍｏｌ）との混合物
を、アルゴン雰囲気下、室温において電磁気的に（ｍａ
ｇｎｅｔｉｃａｌｌｙ）３日間撹拌させた。反応を薄層
クロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール：水
（８：１：１））によって監視し、この監視は出発物質
のかなりの量（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｑｕａｎｔｉ
ｔｙ）の存在を実証した。次に、これをアルゴン雰囲気
下、４０〜４５℃において３日間加熱した。混合物を室
温に冷却して、減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカラム
クロマトグラフィーによって、溶離剤として酢酸エチ
ル：メタノール：水（８：１：１）を用いて精製して、
（１３）（４ｍｇ，５．５ｘ１０-3ｍｍｏｌ，５．６
％）を橙色固体として得た。ＭＳ、ＩＲ及びＮＭＲデー
タによって、化合物を同定した。
【００７５】実施例２０ ポリクローナル抗体Ｐ７９６の産生 ポリクローナル抗体を産生するために、ヒツジとヤギに
各免疫原（１ｍｇ）を注入した。完全Ｆｒｅｕｎｄ Ａ
ｄｊｕｖａｎｔを用いた第１回免疫化は動物の背中全体
に実施した多数回の注入から構成された。１週間後に、
免疫原（１ｍｇ）と不完全Ｆｒｅｕｎｄ Ａｄｊｕｖａ
ｎｔとを含む第２回免疫化を注入した。第３週間目と第
４週間目にも注入を繰り返した。その後に、動物に１か
月に１回免疫原（３ｍｇ）の注入を繰り返した。６か月
後に、動物から採血し、血液を凝固させ、凝血を約３０
００ｒｐｍにおいて１５〜２０分間遠心分離し、血清を
デカンテーションによって分離した。
各免疫原（１ｍｇ）を注入した。完全Ｆｒｅｕｎｄ Ａ
ｄｊｕｖａｎｔを用いた第１回免疫化は動物の背中全体
に実施した多数回の注入から構成された。１週間後に、
免疫原（１ｍｇ）と不完全Ｆｒｅｕｎｄ Ａｄｊｕｖａ
ｎｔとを含む第２回免疫化を注入した。第３週間目と第
４週間目にも注入を繰り返した。その後に、動物に１か
月に１回免疫原（３ｍｇ）の注入を繰り返した。６か月
後に、動物から採血し、血液を凝固させ、凝血を約３０
００ｒｐｍにおいて１５〜２０分間遠心分離し、血清を
デカンテーションによって分離した。
【００７６】実施例２１ モノクローナル抗体ＭｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ５の産生 モノクローナル抗体を産生するために、キニジンの免疫
原を雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに注入した。第１回免疫化は
完全Ｆｒｅｕｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔを含み、第２回免
疫化は不完全Ｆｒｅｕｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔを含有し
た。免疫化マウスからの脾臓細胞に、ＫｏｈｌｅｒとＭ
ｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５〜４９
７（１９７５）の改良方法に従って、ポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）の存在下でＮＳＯ骨髄腫細胞を４：１
の比で融合させた（ｆｕｓｅｄ）。モノクローナル抗体
（ＭｏＡｂ）を含む、ハイブリドーマ細胞培養の上清を
ＢＳＡ被覆プレートを用いるＥＬＩＳＡ法によってスク
リーニングして、アルカリホスファターゼにコンジュゲ
ートしたウサギ抗マウス Ｉｇによって検出した。モノ
クローナル抗体Ｑ６−６Ｃ５の最終選択は、ＥＬＩＳＡ
とその後のＦＰＩＡアッセイ系での分析とによって実施
した。
原を雌Ｂａｌｂ／ｃマウスに注入した。第１回免疫化は
完全Ｆｒｅｕｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔを含み、第２回免
疫化は不完全Ｆｒｅｕｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔを含有し
た。免疫化マウスからの脾臓細胞に、ＫｏｈｌｅｒとＭ
ｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２５６，４９５〜４９
７（１９７５）の改良方法に従って、ポリエチレングリ
コール（ＰＥＧ）の存在下でＮＳＯ骨髄腫細胞を４：１
の比で融合させた（ｆｕｓｅｄ）。モノクローナル抗体
（ＭｏＡｂ）を含む、ハイブリドーマ細胞培養の上清を
ＢＳＡ被覆プレートを用いるＥＬＩＳＡ法によってスク
リーニングして、アルカリホスファターゼにコンジュゲ
ートしたウサギ抗マウス Ｉｇによって検出した。モノ
クローナル抗体Ｑ６−６Ｃ５の最終選択は、ＥＬＩＳＡ
とその後のＦＰＩＡアッセイ系での分析とによって実施
した。
【００７７】実施例２２ 蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ） この出願に記載する、キニジンの蛍光偏光測定に合わせ
て形成された自動化ＣＯＢＡＳ ＦＡＲＡ ＩＩ（登録
商標）分析計（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ社，米国，ニュージャージー州，ソマービ
ル）において下記分析試薬とプロトコールとを用いた。
て形成された自動化ＣＯＢＡＳ ＦＡＲＡ ＩＩ（登録
商標）分析計（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｓ
ｙｓｔｅｍｓ社，米国，ニュージャージー州，ソマービ
ル）において下記分析試薬とプロトコールとを用いた。
【００７８】Ｉ．モノクローナルアッセイのための試薬
製剤 ａ．トレーサー試薬 ５０ｍＭ ＡＣＥＳ（Ｎ−２−アセトアミド−２−アミ
ノエタンスルホン酸），，ｐＨ６．５ ０．０１％（ｗ／ｖ）ウシ−γ−グロブリン ０．０９％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム トレーサー濃度：６ｘ１０-7Ｍ ｂ．モノクローナル抗体試薬 ０．１Ｍ リン酸塩，ｐＨ７．５ １５０ｍＭ 塩化ナトリウム ０．０９％アジ化ナトリウム ０．０５％ウシ血清アルブミン 抗体希釈：抗体緩衝剤中で１：５５０ ｃ．キニジンキャリブレータ 処理済み正常ヒト血清中の０，０．５，１，２，４，及
び８μｇ／ｍｌのキニジン、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０
９％アジ化ナトリウムを含む。 ｄ．サンプル希釈剤：Ｃｏｂａｓ ＦＰ Ｓａｍｐｌｅ
Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ，コード４４２６
８
製剤 ａ．トレーサー試薬 ５０ｍＭ ＡＣＥＳ（Ｎ−２−アセトアミド−２−アミ
ノエタンスルホン酸），，ｐＨ６．５ ０．０１％（ｗ／ｖ）ウシ−γ−グロブリン ０．０９％（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム トレーサー濃度：６ｘ１０-7Ｍ ｂ．モノクローナル抗体試薬 ０．１Ｍ リン酸塩，ｐＨ７．５ １５０ｍＭ 塩化ナトリウム ０．０９％アジ化ナトリウム ０．０５％ウシ血清アルブミン 抗体希釈：抗体緩衝剤中で１：５５０ ｃ．キニジンキャリブレータ 処理済み正常ヒト血清中の０，０．５，１，２，４，及
び８μｇ／ｍｌのキニジン、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０
９％アジ化ナトリウムを含む。 ｄ．サンプル希釈剤：Ｃｏｂａｓ ＦＰ Ｓａｍｐｌｅ
Ｄｉｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ，コード４４２６
８
【００７９】ＩＩ．アッセイプロトコール サンプル（２．６μｌ）にサンプル希釈剤（２３．４μ
ｌ）を混合する。抗体試薬（２００μｌ）を加え、バッ
クグラウンドを読み取る。トレーサー試薬（３０μｌ）
を加える。３０秒間インキュベートする。５２０ｎｍに
おいて蛍光偏光を読み取る。
ｌ）を混合する。抗体試薬（２００μｌ）を加え、バッ
クグラウンドを読み取る。トレーサー試薬（３０μｌ）
を加える。３０秒間インキュベートする。５２０ｎｍに
おいて蛍光偏光を読み取る。
【図１】本発明による免疫原、（９Ｓ）−４−〔（９−
ヒドロキシシンコナン−６’−イル）オキシ〕−１−イ
ミノブチルー〔ＢＴＧ〕（４）の合成に関係する出発物
質及び中間体の式。
ヒドロキシシンコナン−６’−イル）オキシ〕−１−イ
ミノブチルー〔ＢＴＧ〕（４）の合成に関係する出発物
質及び中間体の式。
【図２】本発明によるトレーサー、（９Ｓ）−Ｎ−
〔（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ〔イ
ソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−〔９Ｈ〕キサンテ
ン〕−５−イル）メチル〕−４−〔（９−ヒドロキシシ
ンコナン−６’−イル）オキシ〕ブタミド（７）の合成
に関係する出発物質及び中間体の式。
〔（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ〔イ
ソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−〔９Ｈ〕キサンテ
ン〕−５−イル）メチル〕−４−〔（９−ヒドロキシシ
ンコナン−６’−イル）オキシ〕ブタミド（７）の合成
に関係する出発物質及び中間体の式。
【図３】比較用Ｃ−９トレーサー、（９Ｓ）−〔２−
〔〔（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ
〔イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−〔９Ｈ〕パン
テオン〕−５−イル）メチルアミノ〕−２−オキソエチ
ル〕カルバミン酸 ６’−メトキシシンコナン−９−イ
ル）エステル（１０）の合成に関係する出発物質及び中
間体の式。
〔〔（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ
〔イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−〔９Ｈ〕パン
テオン〕−５−イル）メチルアミノ〕−２−オキソエチ
ル〕カルバミン酸 ６’−メトキシシンコナン−９−イ
ル）エステル（１０）の合成に関係する出発物質及び中
間体の式。
【図４】本発明によるトレーサー、（９Ｓ）−３’，
６’−ジヒドロキシ−Ｎ−〔３−（９−ヒドロキシシン
コナン−６’−イル）オキシ〕プロピル〕−３−オキソ
スピロ〔イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−〔９
Ｈ〕キサンテン〕−５−カルボキサミド（１３）の合成
に関係する出発物質及び中間体の式。
６’−ジヒドロキシ−Ｎ−〔３−（９−ヒドロキシシン
コナン−６’−イル）オキシ〕プロピル〕−３−オキソ
スピロ〔イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−〔９
Ｈ〕キサンテン〕−５−カルボキサミド（１３）の合成
に関係する出発物質及び中間体の式。
【図５】トレーサー、（９Ｓ）−Ｎ−〔（３’，６’−
ジヒドロキシ−３−オキソスピロ〔イソベンゾフラン−
１（３Ｈ），９’−〔９Ｈ〕キサンテン〕−５−イル）
メチル〕−４−〔（９−ヒドロキシシンコナン−６’−
イル）オキシ〕ブタミド（７）に結合する、モノクロー
ナル抗体ＭｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ５とポリクローナル抗体
７９６との比較試験を示す図。
ジヒドロキシ−３−オキソスピロ〔イソベンゾフラン−
１（３Ｈ），９’−〔９Ｈ〕キサンテン〕−５−イル）
メチル〕−４−〔（９−ヒドロキシシンコナン−６’−
イル）オキシ〕ブタミド（７）に結合する、モノクロー
ナル抗体ＭｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ５とポリクローナル抗体
７９６との比較試験を示す図。
【図６】商業的に入手可能なトレーサー、（２（Ｓ）−
エクソ，シン）−８−エテニル−１−（２−（（３’，
６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ（イソベンゾフ
ラン−１（３Ｈ），９’−（９Ｈ）キサンテン−５−イ
ル）アミノ）−２−オキソエチル）−２−（ヒドロキシ
（６−（２−エトキシ−２−オキソエトキシ）−４−キ
ノリンイル）メチル）−１−アゾニアビシクロ（２．
２．２）オクタンクロリド塩酸塩（１４）と、本発明に
よるトレーサー、（９Ｓ）−Ｎ−〔（３’，６’−ジヒ
ドロキシ−３−オキソスピロ〔イソベンゾフラン−１
（３Ｈ），９’−〔９Ｈ〕キサンテン〕−５−イル）メ
チル〕−４−〔（９−ヒドロキシシンコナン−６’−イ
ル）オキシ〕ブタミド（７）とによる、モノクローナル
抗体ＭｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ５の比較試験を示す図。
エクソ，シン）−８−エテニル−１−（２−（（３’，
６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ（イソベンゾフ
ラン−１（３Ｈ），９’−（９Ｈ）キサンテン−５−イ
ル）アミノ）−２−オキソエチル）−２−（ヒドロキシ
（６−（２−エトキシ−２−オキソエトキシ）−４−キ
ノリンイル）メチル）−１−アゾニアビシクロ（２．
２．２）オクタンクロリド塩酸塩（１４）と、本発明に
よるトレーサー、（９Ｓ）−Ｎ−〔（３’，６’−ジヒ
ドロキシ−３−オキソスピロ〔イソベンゾフラン−１
（３Ｈ），９’−〔９Ｈ〕キサンテン〕−５−イル）メ
チル〕−４−〔（９−ヒドロキシシンコナン−６’−イ
ル）オキシ〕ブタミド（７）とによる、モノクローナル
抗体ＭｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ５の比較試験を示す図。
【図７】４５℃においてインキュベートしたトレーサ
ー、（９Ｓ）−Ｎ−〔（３’，６’−ジヒドロキシ−３
−オキソスピロ〔イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’
−〔９Ｈ〕キサンテン〕−５−イル）メチル〕−４−
〔（９−ヒドロキシシンコナン−６’−イル）オキシ〕
ブタミド（７）の安定性を示す図。
ー、（９Ｓ）−Ｎ−〔（３’，６’−ジヒドロキシ−３
−オキソスピロ〔イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’
−〔９Ｈ〕キサンテン〕−５−イル）メチル〕−４−
〔（９−ヒドロキシシンコナン−６’−イル）オキシ〕
ブタミド（７）の安定性を示す図。
【図８】３７℃においてインキュベートしたトレーサ
ー、（９Ｓ）−Ｎ−〔（３’，６’−ジヒドロキシ−３
−オキソスピロ〔イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’
−〔９Ｈ〕キサンテン〕−５−イル）メチル〕−４−
〔（９−ヒドロキシシンコナン−６’−イル）オキシ〕
ブタミド（７）の安定性を示す図。
ー、（９Ｓ）−Ｎ−〔（３’，６’−ジヒドロキシ−３
−オキソスピロ〔イソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’
−〔９Ｈ〕キサンテン〕−５−イル）メチル〕−４−
〔（９−ヒドロキシシンコナン−６’−イル）オキシ〕
ブタミド（７）の安定性を示す図。
【図９】本発明によるトレーサー、（９Ｓ）−Ｎ−
〔（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ〔イ
ソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−〔９Ｈ〕キサンテ
ン〕−５−イル）メチル〕−４−〔（９−ヒドロキシシ
ンコナン−６’−イル）オキシ〕ブタミド（７）と、Ｍ
ｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ５と、商業的に入手可能な試薬系と
を用いるＦＰＩＡにおける動的範囲の比較を示す図。
〔（３’，６’−ジヒドロキシ−３−オキソスピロ〔イ
ソベンゾフラン−１（３Ｈ），９’−〔９Ｈ〕キサンテ
ン〕−５−イル）メチル〕−４−〔（９−ヒドロキシシ
ンコナン−６’−イル）オキシ〕ブタミド（７）と、Ｍ
ｏＡｂ Ｑ６−６Ｃ５と、商業的に入手可能な試薬系と
を用いるＦＰＩＡにおける動的範囲の比較を示す図。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｋ 14/76 8517−4Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/76 14/765 8517−4Ｈ 14/765 14/77 8517−4Ｈ 14/77 16/44 8517−4Ｈ 16/44 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ (72)発明者 キャスリン サラ シュヴェンツァー アメリカ合衆国ペンシルバニア州ヤードリ ー，アップルウッド サークル 1557 (72)発明者 ロバート サンドロ ウ アメリカ合衆国ニュージャージー州ウエス ト オレンジ，ラルフ ロード 25
Claims (23)
- 【請求項１】 式： 【化１】 〔式中、Ｌは直鎖又は分枝鎖、飽和又は不飽和のいずれ
でもよく、ヘテロ原子０〜３個を含むことができるＣ1
−Ｃ10炭化水素連結基であり；Ｆはアミノ、カルボキシ
ル、スルフヒドリル、イミノ及びマレイミドから成る群
から選択される官能基である〕で示される化合物。 - 【請求項２】 Ｌが炭素数１〜５の炭化水素基である、
請求項１記載の化合物。 - 【請求項３】 Ｌが不飽和である、請求項１又は２に記
載の化合物。 - 【請求項４】 Ｌが１個以上の芳香族基を含む、請求項
１記載の化合物。 - 【請求項５】 ＬがＯ、Ｎ及びＳから成る群から選択さ
れる１〜３個のヘテロ原子を含む、請求項１〜４のいず
れかに記載の化合物。 - 【請求項６】 Ｌが炭素数３であり、Ｆがカルボキシル
又はアミノから選択される、請求項１〜５のいずれかに
記載の化合物。 - 【請求項７】 式： 【化２】 〔式中、ＬとＦは請求項１〜６のいずれかで定義された
とおりであり；Ｙはタンパク質、多糖、及び天然に発生
する若しくは合成のポリアミノカルボン酸から成る群か
ら選択される免疫原キャリヤー分子である〕で示される
化合物。 - 【請求項８】 Ｌが炭素数３の炭化水素基であり；Ｆが
アミノ又はカルボキシルであり；Ｙがタンパク質であ
る、請求項７記載の化合物。 - 【請求項９】 式： 【化３】 〔式中、Ｚはアルブミン、ウシ血清アルブミン、キーホ
ールリムペットヘモシアニン、ウシチログロブリン（Ｂ
ＴＧ）、卵オボアルブミン、ウシγ−グロブリン又はポ
リペプチドから選択される〕で示される化合物。 - 【請求項１０】 ＺがＢＴＧ又はポリペプチドグラミシ
ジンから選択される請求項９記載の化合物。 - 【請求項１１】 宿主動物に、ＺがＢＴＧである式ＩＩ
Ｉの免疫原を接種することによって産生され、下記キニ
ジン代謝産物化合物に対して一定の％：キニジン−Ｎ−
オキシド １３．５％；３−Ｓ−ヒドロキシキニジン
１１％；２’−オキソキニジン ３％；及びＯ−デスメ
チルキニジン ４３．５％を越えない交差反応性を有
し；少なくとも１５０ｍＰの動的曲線範囲を有する、キ
ニジンに特異的な抗体。 - 【請求項１２】 動的曲線範囲が少なくとも１９０ｍＰ
である請求項１１記載の抗体。 - 【請求項１３】 式： 【化４】 〔式中、ＬとＦは請求項１〜６のいずれかで定義された
とおりであり；Ｘは化学発光団、エネルギー供与体分
子、及び放射能標識基から成る群から選択されるデテク
ター分子である〕で示される化合物。 - 【請求項１４】 Ｘがルシフェリン、ウンベリフェロン
又はナフタレン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジドから
選択される化学発光団である、請求項１３記載の化合
物。 - 【請求項１５】 Ｘが 125Ｉ−チラミン及び14Ｃ−標識
メチルヨージド又はアミノ酸から選択される放射能標識
基である、請求項１３記載の化合物。 - 【請求項１６】 ＸがフルオレセインＱ又はテキサスレ
ッドから選択されるエネルギー供与体分子である、請求
項１３記載の化合物。 - 【請求項１７】 ＸがフルオレセインＱであり、Ｌが炭
素数３の炭化水素基である、請求項１６記載の化合物。 - 【請求項１８】 式： 【化５】 〔式中、Ｆはアミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、
イミノ及びマレイミドから選択される官能基であり；Ｑ
は５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフル
オレセイン、５−アミノフルオレセイン、６−アミノフ
ルオレセイン、５−フルオレセインイソチオシアネー
ト、６−フルオレセインイソチオシアネート、４’−ア
ミノメチルフルオレセイン、５−アミノメチルフルオレ
セイン、及びアミノフルオレセイン誘導体から選択され
る蛍光放射化合物である〕で示される請求項１３記載の
化合物。 - 【請求項１９】 Ｆはカルボキシル又はアミノから選択
される請求項１８記載の化合物。 - 【請求項２０】 式： 【化６】 で示される蛍光偏光トレーサー。
- 【請求項２１】 体液サンプル中のキニジン濃度を測定
するための蛍光偏光イムノアッセイの実施キットであっ
て、式： 【化７】 〔式中、ＬとＦは請求項１で定義した通りであり；Ｘは
化学発光団、エネルギー供与体分子及び放射能標識基か
ら成る群から選択されるデテクター分子である〕で示さ
れるトレーサー化合物と；式： 【化８】 〔式中、ＬとＦは請求項１で定義した通りであり；Ｙは
タンパク質、多糖、及び天然に発生する若しくは合成の
ポリアミノカルボン酸から成る群から選択される免疫原
キャリヤー分子である〕で示される化合物から得られる
抗体とを含み；前記抗体が下記特徴：下記キニジン代謝
産物化合物の各々に対して一定％：キニジン−Ｎ−オキ
シド １３．５％；３−Ｓ−ヒドロキシキニジン １１
％；２’−オキソキニジン ３％；及びＯ−デスメチル
キニジン ４３．５％を越えない交差反応性と、少なく
とも１５０ｍＰの動的曲線範囲とを有する前記キット。 - 【請求項２２】 式： 【化９】 〔式中、ＺはＢＴＧである〕で示される免疫原を宿主動
物に接種することによって産生される、キニジンに特異
的な抗体を含み、前記抗体が下記特徴：キニジン代謝産
物に対して下記のような交差反応性：キニジン−Ｎ−オ
キシド １３．５％；３−Ｓ−ヒドロキシキニジン １
１％；２’−オキソキニジン ３％；及びＯ−デスメチ
ルキニジン ４３．５％と、少なくとも１９０ｍＰの動
的曲線範囲とを有する、請求項２１記載のキット。 - 【請求項２３】 式： 【化１０】 で示されるトレーサーを含む、請求項２１又は２２に記
載のキット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US08/452,742 US5741715A (en) | 1995-05-30 | 1995-05-30 | Quinidine immunoassay and reagents |
| US452742 | 1995-05-30 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08325266A true JPH08325266A (ja) | 1996-12-10 |
Family
ID=23797741
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8135464A Pending JPH08325266A (ja) | 1995-05-30 | 1996-05-29 | 新規なキニジン誘導体 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5741715A (ja) |
| EP (1) | EP0745602A1 (ja) |
| JP (1) | JPH08325266A (ja) |
| CA (1) | CA2176417A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| JP2000502450A (ja) * | 1995-12-22 | 2000-02-29 | アボツト・ラボラトリーズ | 蛍光偏光免疫アッセイによる診断法 |
| US7745142B2 (en) * | 1997-09-15 | 2010-06-29 | Molecular Devices Corporation | Molecular modification assays |
| US7632651B2 (en) * | 1997-09-15 | 2009-12-15 | Mds Analytical Technologies (Us) Inc. | Molecular modification assays |
| US20050227294A1 (en) * | 1997-09-15 | 2005-10-13 | Molecular Devices Corporation | Molecular modification assays involving lipids |
| FR2810034B1 (fr) * | 2000-05-23 | 2002-12-20 | Rhodia Chimie Sa | Ammoniums porteurs d'un fluor electrophile, reactif en contenant, procede les mettant en oeuvre et procede de synthese pour les obtenir |
| US6653456B2 (en) | 2001-07-31 | 2003-11-25 | Roche Diagnostics Corporation | Site-specific aminoglycoside derivatives and their use in immunodiagnostic assays |
| US6821744B2 (en) | 2002-10-29 | 2004-11-23 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Method, assay, and kit for quantifying HIV protease inhibitors |
| US7910661B2 (en) | 2003-01-06 | 2011-03-22 | Nektar Therapeutics | Thiol-selective water-soluble polymer derivatives |
| EP1697534B1 (en) | 2003-12-01 | 2010-06-02 | Life Technologies Corporation | Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same |
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|---|---|---|---|---|
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-
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