JPH08308563A - Ｔリンパ球を試験管内で活性化する方法 - Google Patents

Ｔリンパ球を試験管内で活性化する方法

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JPH08308563A
JPH08308563A JP8117260A JP11726096A JPH08308563A JP H08308563 A JPH08308563 A JP H08308563A JP 8117260 A JP8117260 A JP 8117260A JP 11726096 A JP11726096 A JP 11726096A JP H08308563 A JPH08308563 A JP H08308563A
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ロック フー シュー
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ザーリング ジョイス
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 エイズウイルスに特異性のＴリンパ球を試験
管内で活性化する方法を提供する。 【解決手段】 患者またはエイズウイルスエピトープに
暴露された組織適合性供血者から分離したリンパ球を試
験管内でエイズウイルスエピトープに暴露して、エイズ
ウイルスに特異性のＴリンパ球を活性化することを含む
Ｔリンパ球を試験管内で活性化する方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はエイズ（ＡＩＤＳ）
ウイルスに感染した患者の処置における養子免疫療法
（adoptive immunotherapy) の方法を指向し、エイズウ
イルスに対する免疫応答を仲介するＴ細胞の試験管内活
性化、これらのＴ細胞の膨張（expansion)を含み、それ
が次いで患者に接種され、エイズウイルス感染細胞を特
異的に指向する細胞仲介免疫応答が患者に移入される。
本発明は分離、試験管内活性化、免疫特異性の実証、活
性化したリンパ球の膨張および投与に備え、それはエイ
ズウイルス抗原に対する生体内Ｔ細胞免疫応答の仲介に
使用できる。本発明の方法は患者または免疫系がエイズ
ウイルス抗原（類）に暴露された組織適合性供血者から
のリンパ球の分離および該リンパ球のエイズウイルス関
連エピトープ類に対する暴露による試験管内活性化を含
む。エイズウイルス抗原類に対し反応性のＴリンパ球の
膨張およびエイズウイルス関連障害を患う患者中へのＴ
細胞の接種が免疫療法の有用な形態を提供するであろ
う。
【０００２】
【従来の技術】
（2.１）エイズウイルス 後天性免疫不全症候群（エイズ）は主に患者の細胞仲介
免疫応答の損傷に起因する重大な免疫不全により確認さ
れる疾患である〔ゴットリーブ（Gottlieb, M.) ほか、
１９８１、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・
メディシン（N.Engl.J.Med.)、３０５：１４２５；マス
ール（Masur, J.)ほか、１９８１、ニュー・イングラン
ド・ジャーナル・オブ・メディシン（N.Engl.J.Med.)、
３０５：１４３１）。疾患の２つの臨床的現出：（ａ）
慢性リンパ節障害、白血球減少および疾患が進行すると
２から0.１またはそれ以下に移動する正常な末梢ヘルパ
ーとサプレッサーＴリンパ球との比（ＯＫＴ４：ＯＫＴ
８）の逆転を生ずる末梢血ヘルパー細胞（ＯＫＴ４細
胞）の定量的低下により確認されるリンパ節障害症候群
といわれる前駆期、並びに（ｂ）ＯＫＴ４細胞の低下お
よび正常なＯＫＴ４：ＯＫＴ８比の逆転、絶対リンパ球
減少、並びに主にニューモシスティス・カリニ（Pneumo
cystis carnii)による反復性日和見感染により確認され
るエイズといわれる免疫不全状態、が認められ、この後
者の期は多くの場合に遂には死に関連づけられる。患者
の一定の亜集団はリンパ腫およびカポジ肉腫の高い発生
率を有する。現在該疾患に対する治療法がない。
【０００３】疫学的データ並びに該疾患を得た患者の型
に関連する情報は親密接触により伝達される感染性因子
が該疾患の原因であるかもしれないことを示唆した。そ
の後３つのグループが、エイズの原因因子がヘルパーＴ
リンパ球に対する指向性を有するレトロウイルスである
強固な証拠を提供した。これらのグループは （ａ）ガロウ（R.C.Gallo)および共同研究者はナショナ
ル・インスティチュート・オブ・ヘルス（National Ins
titute of Health) でエイズおよびプレエイズの患者か
ら細胞変性レトロウイルス（ＨＴＬＶ III) を分離する
ことができた〔ガロウ（Gallo, R.C.)ほか、１９８４、
サイエンス（Science)、２２４：５００；ポポビック
（Popovic, M.)ほか、１９８４、サイエンス（Scienc
e)、２２４：４９７〕。彼らはまたエイズの患者の血清
中にＨＴＬＶ IIIに対する抗体を検出した。 （ｂ）モンタニール（L.Montagnier) および共同研究者
はパスツール研究所で頚部リンパ節障害を示し、エーズ
に対するおそれのあった患者からＴリンパ指向性レトロ
ウイルス（ＬＡＶ）を分離した〔バレ・シノウシ（Barr
e-Sinoussi, F.）ほか、１９８３、サイエンス（Scienc
e)、２２０：８６８〕。このグループはまたエイズ患者
の血清中のＬＡＶに対する抗体を示すことができた〔カ
リサンスラマン（Kalysansraman, V.S.)ほか、１９８
４、サイエンス（Science)、２２５：３２１〕。さら
に、彼らはエイズを生じた供血者から血液を受けた後で
エイズを生じた患者のリンパ球からＬＡＶを分離するこ
とができた〔フェオリノ（Feorino, P.M.)ほか、１９８
４、サイエンス（Science)、２２５：６９〕。 （ｃ）レビイ（J.Levy) および共同研究者はエイズの患
者の末梢単核細胞から感染性レトロウイルス（エイズ関
連レトロウイルスまたはＡＲＶと称される）を分離した
〔レビイ（Levy, J.A.) 、１９８４、サイエンス（Scie
nce)、２２５：８４０〕。 である。
【０００４】３つのウイルスはすべて独立に分離された
けれども、それらはすべておそらく同じレトロウイルス
サブグループに属し〔レビー(Levy)ほか、１９８４、サ
イエンス（Science)、２２５：８４０）、ここに一団と
してＬＡＶ／ＨＴＬＶ IIIとして示される。レトロウイ
ルスの一般的構造はウイルスが細胞出芽の過程中に得る
脂質含有エンベロープにより囲まれたリボ核タンパク質
コアの構造である。ウイルスのエンコードする糖タンパ
ク質がエンベロープ内に包埋され、外方へ突出する。こ
れがウイルスの宿主範囲を決定し、感受性細胞の表面上
の特異レセプターと反応する。中和性抗体はエンベロー
プ糖タンパク質に結合し、細胞の表面上のレセプターと
のそれらの相互作用を遮断すると思われる〔「腫瘍ウイ
ルスの分子生物学（The Molecular Biology of Tumor V
iruses) 」、ジョン・トーズ（John Tooze) 編、１９７
３、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー
（Cold Spring Harbor Laboratory)、５３４〜５３５
頁；「ＲＮＡ腫瘍ウイルス（RNA Tumor Viruses)」、ワ
イスほか（R.Weiss, N.Teich, H.Varmus and J.Coffin)
編、１９８２、コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリ（Cold Spring Harbor Laboratory)、２２６〜２
２７頁および２３６〜２３７頁〕。ＬＡＶ／ＨＴＬＶ I
IIの特定事例においてＴリンパ球のサブセット上に存在
するＴ４抗原がウイルスに対するレセプターまたはレセ
プターの一部分である証拠が存在する〔ダルグライシュ
（Dalgleish, A.G.)ほか、１９８４、ネーチャ（Natur
e) 、３１２：７６３；クラツマン（Klatzmann, D.)ほ
か、１９８４、ネーチャ（Nature) 、３１２：７６
７〕。ＬＡＶ／ＨＴＬＶ IIIのＲＮＡゲノムはgag 遺伝
子を含み、それがウイルスの内部構造タンパク質（コア
タンパク質）をコードし、ウイルス群特異性抗原ウイル
ス粒子関連逆転写酵素をコードするpol 遺伝子、および
ウイルス糖タンパク質をコードするenv 遺伝子を規定す
る。他の領域例えばsor および３′−orf は読取り枠を
含むゲノムの領域を示し、これらの領域の機能は現在知
られていない。
【０００５】（2.２）レトロウイルス抗原に対する細胞
仲介免疫 レトロウイルスに対するＴ細胞の抗原特異性に関してほ
とんど知られていない。しかし、フレンド・アンド・モ
ロニー（Friend and Moloney) マウス白血病ウイルス
（ＭｕＬＶ) のエンベロープ糖タンパク質、gp７０、は
ＭｕＬＶ免疫マウスＴ細胞により認識されることが報告
された〔マチス（Matis, L.A.)ほか、１９８５、ジャー
ナル・オブ・イムノロジー（J.Immunol.) 、１３５：７
０３〜７０５；フライヤー（Flyer, D.C.)ほか、１９８
３、ネーチャー（Nature) 、３０５：８１５〜８１
８〕。プラータ（Plata)ほか〔アブストラクト、コミュ
ニケーション（Communicaton) 、１６１：５２７ｋ、エ
イズに関する国際会議（International Conference on
AIDS) 、１９８６年６月２３〜２５日、パリー、フラン
ス〕はマウスがトランスフェクションしたＭｕＬＶ誘導
腫瘍上に発現されたエンベロープまたはgag 抗原に対し
細胞毒性Ｔ細胞を発生できることを示した。ヒトＴリン
パ指向性ウイルスＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ）に感染した細胞
を指向するＴリンパ球が示された〔ミツヤ（Mitsuya,
H.)ほか、１９８３、ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンタル・メディシン（J.Exp.Med.) 、１５８：９９４〜
９９９〕が、しかし認識される抗原は報告されなかっ
た。
【０００６】（2.３）ウイルスを指向するＴ細胞の試験
管内活性化 抗体に加えて、Ｔ細胞仲介免疫が多く種々の外被ウイル
スにより起される疾患に対する耐性またはそれからの回
復に重要な役割を果たすことが示された。ウイルス感染
細胞を特異的に認識できるＴリンパ球はウイルス感染し
たかまたは免疫処置した動物のリンパ球をウイルス、ウ
イルスタンパク質、またはウイルスペプチドで刺激する
ことにより試験管内で生成させることができることを示
す若干の研究があった。マウスにおける例にはインフル
エンザウイルス〔ツビーリンク（Zweerink, H.J.) ほ
か、１９８０、ネーチャー（Nature) 、２６７：３５
１〕、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）〔ローマン（Lo
wman, M.J.P.) ほか、１９８０、インフェクション・ア
ンド・イミュニティー（Infec.Immun.) 、３０：４５
１〕、またはマウス白血病／肉腫ウイルス〔フェルナン
デズークルツ（Fernandez-Cruz, E.) ほか、１９７９、
ジャーナル・オブ・イムノロジー（J.Immunol.) 、１２
３：１７７２〕に感染した細胞を特異的に認識するＴリ
ンパ球が含まれる。そのような感作Ｔ細胞は、ウイルス
またはウイルス抗原による刺激に応答して増殖およびリ
ンフォカインの生成を生ずるＴ細胞の能力により測定し
て細胞障害活性（または細胞毒性Ｔリンパ球、ＣＴＬ、
として示される）および（または）Ｔヘルパー細胞活性
を有することが示された。試験管内活性化Ｔ細胞を実験
動物に接種したときに免疫療法に有用であることができ
る証拠はウイルス活性化したマウスＴ細胞またはＴ細胞
クローンを、インフルエンザ〔ルカチャ（Lukacher, A.
E.) ほか、１９８４、ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンタル・メディシン（J.Exp.Med)、１６０：８１４）、
リンパ球性脈絡骨髄膜炎ウイルス〔ビルネほか（Byrne,
J.R.and Oldstone, M.B.A.)、１９８４、ジャーナル・
オブ・ビロロジー（J.Virol)、５１：６８２〕、単純ヘ
ルペスウイルス（ＨＳＶ）〔ラーセン（Larsen, H.L.)
ほか、１９８４、ジャーナル・オブ・ビロロジー（J.Vi
rol.) 、５０：５６；セチ（Sethi, K.K.)ほか、１９８
３、ジャーナル・オブ・ビロロジー（J.Virol.) 、６
４：４４３〕またはマウス白血病ウイルス〔チーバー
（Cheever, M.A.)ほか、１９８６、ジャーナル・オブ・
エクスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.) 、１６
３：１１００〕のようなウイルスにより起される疾患ま
たは死に対する耐性を養子移入できる所見に基く。さら
に、インターロイキン２（ＩＬ−２）で非特異的に活性
化され、リンフォカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞と
して示されるマウスリンパ球は種々のマウス腫瘍からの
転移の除去に免疫療法的に有用であることが示された
〔ローゼンベルグ（Rosenberg, S.A.)、１９８５、J.Ma
tl.Cancer Dist.,７５：５９５；マズンダーほか（Mazu
mber, A. and Rosenberg, １９８４、ジャーナル・オブ
・エクスペリメンタル・メディシン（J.Exp.Med.) 、１
５９：２２５〕。
【０００７】ウイルスまたはウイルス抗原で末梢血リン
パ球（ＰＢＬ）を刺激することによりヒトのＴヘルパー
および（または）細胞毒性Ｔ細胞を活性化することもま
た可能であった。例えば、ＨＳＶ〔セチ（Sethi, K.K.)
ほか、１９８０、ネーチャー（Mature) 、２７０：５９
２；ヤスカワほか（Yasukawa, M.and Zarling, J.)、１
９８４、ジャーナル・オブ・イムノロジー（J.Immuno
l.) 、１３３：４２２〕またはインフルエンザウイルス
〔ビディソン（Biddison, E.W.) ほか、１９８１、ジャ
ーナル・オブ・イムノロジー（J.Immunol.) 、１２２：
６６０；マクマイクルほか（McMichael, A.J.and Askon
as, B.A.) 、１９７９、ユーロピアン・ジャーナル・オ
ブ・イムノロジー（Eur.J.Immunol)、５：７０５〕を特
異的に認識するヒトＴ細胞が試験管内で生成された。Ｈ
ＳＶ系において精製ＨＳＶ、クローン化し哺乳動物中に
発現されたＨＳＶ糖タンパク質、および個々のＨＳＶペ
プチドがＨＳＶ特異性ヒトＴ細胞を活性化することが報
告された〔ザーリング（Zarling, J.M.)ほか、１９８
６、ジャーナル・オブ・イムノロジー（J.Immunol.) 、
１３６：４６６９；デフレイタス（DeFritas, E.C.) ほ
か、１９８５、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Aca
d.Sci.)ＵＳＡ、８２：３４２５〕。試験管内感作ウイ
ルス特異性ヒトＴ細胞の使用は報告されなかったけれど
も、最近、ヒトＬＡＫ細胞が癌患者にＩＬ−２とともに
接種された後種々の腫瘍の退行を生ずることができるこ
とが報告された〔ローゼンベルグ（Rosenberg, S.A.)ほ
か、１９８５、ニュー・イングランド・ジャーナル・オ
ブ・メデイシン−（N.Eng.J.Med.) 、３１３：１４８
５〕。しかしＬＡＫ細胞はまた宿主病に対する移植片に
関連すると同様の副作用を生ずることができる。これら
の副作用は部分的には正常リンパ球が、癌細胞に加え
て、ＬＡＫ細胞により殺されることができる最近の観察
により説明することができる〔ソンデル（Sondel, P.
M.) ほか、１９８５、サイエンス（Science)、２２８：
１７８５〕。
【０００８】（2.3.１）組換え体ワクシニアウイルスに
よる研究 異質ウイルスの抗原を発現する組換え体ワクシニアウイ
ルスが実験動物中で異質ウイルスによる攻撃に対する耐
性を誘導することが認められた。例にはＨＳＶ糖タンパ
ク質（クレマー（Cremer, K.J.) ほか、１９８５、サイ
エンス（Science)、２２８：１９８５〕、狂犬病ウイル
ス表面抗原〔ブランコウ（Blancou, J.)ほか、１９８
６、ネーチャー（Nature) 、３２２：３７３〕、および
インフルエンザウイルス核タンパク質（スミス（Smith,
G.L.)ほか、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミー・オブサイエンス）ＵＳＡ、８０：７１
５５；ユーデル（Yewdell, J.W.)ほか、１９８５、プロ
シーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブサイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.)、ＵＳＡ、８
２：１７８５〕が含まれる。インフルエンザウイルス核
タンパク質を発現する組換え体ワクシニアウイルスは免
疫処置マウス中でインフルエンザウイルスに特異的なＴ
細胞仲介免疫を誘導することが報告された〔ベニンク
（Bennink, J.R.)ほか、１９８４、ネーチャー（Natur
e) 、３１１：５７８〕。さらに、インフルエンザウイ
ルス核タンパク質を発現する組換え体ワクシニアンウイ
ルスで感染した標的細胞を用いてインフルエンザウイル
ス核タンパク質がインフルエンザ血清反応陽性供血者か
らの細胞毒性Ｔ細胞により認識されることが示された
〔マクマイクル（McMichael, A.J.)ほか、１９８６、ジ
ャーナル・オブ・ゼネラル・ビロロジー（J.Gen.Viro
l.) ，６７：７１９〕。同様に我々は最近ＨＳＶ糖タン
パク質を発現する組換え体ワクシニアウイルスで感染し
たヒト標的細胞がＨＳＶに特異的なヒトＣＴＬクローン
により認識されることを認めた〔ザーリング（Zarling,
J.M.)ほか、１９８６、ジャーナル・オブ・ビロロジー
（J.Virol.) 、５９：５０６〕。我々はまたＨＳＶ糖タ
ンパク質を発現する組換え体ワクシニアウイルスで、Ｈ
ＳＶに感染したヒトのＢＰＬを刺激することによりＨＳ
Ｖ感染細胞に特異的なヒトＴ細胞クローンを生成させる
ことができた〔ザーリング（Zarling)ほか、ジャーナル
・オブ・ビロロジー（J.Virol.) 前掲〕。
【０００９】
【発明の概要】本発明はエイズ関連障害の養子免疫療法
においてＴリンパ球の試験管内活性化を用いる方法を指
向する。本発明のリンパ球はエイズまたはエイズ関連コ
ンプレックス（ＡＲＣ）患者自体および、エイズウイル
スによる自然暴露によるかまたはエイズウイルス関連エ
ピトープ類による接種により免疫されたＨＬＡ適合性供
血者を含み、それらに限定されないエイズウイルス抗原
に免疫系が暴露された個体から分離することができる。
該リンパ球はエイズウイルスのエピトープ（類）に関連
するペプチドまたはタンパク質に暴露することにより試
験内で刺激される。これらのエピトープは組換え体ベク
ター例えばウイルスを含む組成物中に、あるいは天然、
組換えまたは合成のいずれでも精製したタンパク質また
はペプチド中に含まれることができる。
【００１０】本発明は患者に接種する前に活性化したＴ
リンパ球、および細胞培養中の活性化したリンパ球の膨
張によりエイズウイルスエピトープ類に対する反応性の
実証に備える。エイズウイルス反応性Ｔ細胞による患者
の接種は他の治療規制例えばＩＬ−２、インターフェロ
ン、抗ＬＡＶ／ＨＴＬＶ III抗体、抗ウイルス薬、骨髄
移植などを伴うことができ、または伴わないことができ
る。非常に最近には、細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）および
リンフォカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞によるＬＡ
Ｖ／ＨＴＬＶ III感染リンパ球の溶解が記載された〔ケ
ーニッヒ（Koenig, S.) ほか、アブストラクト、コミュ
ニケーション（Communication)、２６：§３ａ、エイズ
に関する国際会議（International Conference on AID
S) 、１９８６年６月２３〜２５日、パリー、フラン
ス〕。エイズウイルス血清反応陽性固体中のＬＡＶ／Ｈ
ＴＬＶ III感染標的に対する細胞毒性の存在に対する証
拠が見出された。さらにクロウカ（Krowka) ほか〔アブ
ストラクト、コミュニケーション（Communication)３
０：Ｓ３ｅ、エイズに関する国際会議（International
Conference on AIDS) 、１９８６年６月２３〜２５日、
パリー、フランス〕は若干のエイズウイルス血清反応陽
性供血者末梢血リンパ球が組換え体エイズウイルス抗原
に応答して増殖および（または）ＩＬ−２の放出を生ず
る証拠を提供した。
【００１１】本発明によるエイズウイルス感染の免疫療
法に対するエイズウイルス特異性Ｔ細胞の使用の利点
は、これらのＴ細胞がウイルス感染細胞を認識するがし
かし正常細胞を認識しないことであろう。ＩＬ−２中の
ヒト細胞の連続成長を含め、哺乳動物細胞の大規模培養
に対する工学の最近の進歩〔フェダーほか（Feder, J.a
nd Tolbert, W.) 、１９８３、サイエンティフィック・
アメリカン（Sci.American) 、２４８：３６；アルトシ
ュラー（Artschuller, G.L.)ほか、１９８６、バイオテ
クノロジー・アンド・バイオエンジニアリング（Biotec
h.and Bioengineering) 、２８：６４６〕はエイズウイ
ルスに感染した固体を治療するための養子免疫治療法の
研究を可能にする。本発明の特定態様において、エイズ
ウイルスエンベロープ決定基を発現する組換え体ウイル
スで免疫処置したマカクおよびチンパンジーから分離し
たリンパ球、並びにエイズウイルスに対し血清反応陽性
である患者から得られたヒトリンパ球を試験管内でエイ
ズウイルスエンベロープエピトープ類および（または）
エイズウイルスエンベロープエピトープ類を発現する組
換え体ワクシニアウイルスに暴露して増殖を誘導した。
刺激されたマカクリンパ球は刺激後ＩＬ−２を生ずるＴ
細胞であると示された。さらにヘルパーまたは細胞障害
活性のＴ細胞がチンパンジー中に生成された。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明は患者に接種する前のリン
パ球のエイズウイルス関連エピトープ（類）による試験
管内活性化を含む、エイズウイルス感染患者の免疫療法
処置方法を指向する。活性化したＴ細胞を細胞培養中で
膨張させ、養子免疫療法の形態として単独または他の治
療規制と組合せてエイズウイルスに感染した患者に接種
する。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）がエイズウイルス感染
細胞を特異的に認識することができ、該ウイルスまたは
ウイルス感染細胞の除去に寄与することができるがしか
し正常細胞を除去しないようにそれを特異的に活性化す
る方法が記載される。そのように活性化したＰＢＬはそ
れらの効果を、ウイルス感染細胞に対する直接的殺作用
により、あるいは感染性ウイルスの生成を抑制でき、ま
た（または）他の細胞をウイルス感染細胞に対する殺作
用に対して活性化できるリンフォカインの生成により仲
介することができる。 本発明の方法は単に説明のために次の段階：（ａ）Ｔリ
ンパ球の分離、試験管内活性化、および膨張、（ｂ）特
異的細胞仲介免疫の誘導の実証、並びに（ｃ）活性化し
たＴ細胞の患者中への接種、に分けることができる。論
議を平明にするために、方法は主にエイズウイルスエン
ベロープ糖タンパク質を発現する組換え体ワクシニアウ
イルスの使用に関して論議される。しかし、同一方法は
異なるエイズウイルス関連エピトープ類例えばｇａｇタ
ンパク質を発現する他の組換え体ウイルスの使用、ある
いは他の組換えＤＮＡ工学によるかまたは化学合成によ
り生成したかあるいはウイルス粒子、患者の血液または
血清などから精製したペプチドまたはタンパク質の使用
のために類似の方法で適用することができる。
【００１３】（4.１）リンパ球の分離、活性化、および
膨張 試験管内活性化に用いるリンパ 球はエイズウイルスエ
ピトープ類を指向するＴリンパ球である。これらのＴ細
胞はエイズウイルス関連エピトープ類に暴露された、か
つヒト白血球抗原（類）（ＨＬＡ）に対し適合性である
個体から末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を分離することによ
り得ることができる。そのような適当な個体には患者自
身（エイズまたはエイズ関連コンプレックス、ＡＲＣ、
を有することができる）、あるいはエイズウイルスに対
する自然暴露により、またはエイズウイルス関連エピト
ープ類による接種によりエイズウイルス関連エピトープ
類に暴露されたＨＬＡ適合供血者が含まれる。本発明は
Ｔリンパ球の試験管内刺激におけるエイズウイルスのエ
ピトープ（類）に関連するペプチドまたはタンパク質の
使用を指向する。これらのペプチドまたはタンパク質に
は公知の種々の粒子によりエイズウイルス粒子、患者血
液、血清などから精製できる天然由来分子が含まれる。
例えば、ＬＡＶ／ＨＴＬＶ IIIエンベロープ糖タンパク
質は破壊ＬＡＶ／ＨＴＬＶ IIIからレンチル（lentil)
レクチンクロマトグラフィーにより精製することができ
る。他の可能な精製には他の型のクロマトグラフィー
（例えばイオン交換、アフィニティー、サイジングカラ
ム）、遠心分離、示差溶解度（differential solubilit
y)、免疫沈降および分取用電気泳動、またはタンパク質
の精製のための他の標準技術が含まれるが、しかしそれ
らに限定されない。刺激に用いるペプチドまたはタンパ
ク質はまた組換え体ウイルスまたは組換えＤＮＡ技術の
他の生成物から精製することができる。本発明に用いる
エイズウイルスエピトープ（類）に関連するペプチドま
たはタンパク質を宿主細胞発現ベクター系中に生成さ
せ、それから分離することができ、これらの系には例え
ば適当な組換え体ウイルスで感染した動物または昆虫細
胞培養；組換えプラスミド、コスミドまたはファージで
トランスフェクトした微生物例えば細菌；および組換え
体プラスミドで形質転換した酵母が含まれる。さらに、
エイズ関連エピトープ類を含む組換え体微生物自体を用
いることができる。これらの微生物はエピトープを含
み、その通常の状態で、あるいは他の細胞例えばマクロ
ファージによるかまたはエイズ関連エピトープを裸にす
るような処理（例えば変性剤、界面活性剤など）による
抗原処理後にそれがＴリンパ球に暴露されるであろう。
あるいはエイズウイルス関連エピトープ類を含むペプチ
ドおよびタンパク質を化学的に合成し、リンパ球の刺激
に用いることができる。本発明により使用できるエイズ
ウイルス関連エピトープ類の例には、同時係属米国特許
出願第７７９，９０９号（１９８５年９月２５日提
出）、第８４２，９８４号（１９８６年３月２７日提
出）および１９８６年９月９日提出の代理人整理番号５
６２４−０２６に相当する米国出願に開示されたものが
含まれるが、しかしそれらに限定されず、前記出願はこ
こに参照される。
【００１４】刺激したＴ細胞の増殖を増強する種々の公
知の方法を用いることができ、それは本発明の範囲にあ
る。例えばＴ細胞上のTp６７またはTp４４抗原を認識す
る抗体またはそれらの誘導分子は活性化したＴ細胞の増
殖を増大することが示され〔レドベター（Ledbetter,
J.A.)ほか、１９８５、ジャーナル・オブ・イムノロジ
ー（J.Immunol.) 、１３５；２３３１〕、試験管内活性
化中に増殖の増大に用いることができる。インターフェ
ロンは細胞障害性Ｔ細胞の生成を増大することが認めら
れ〔ザーリング（Zarling)ほか、１９７８、イムノロジ
ー（Immunology)、１２１：２００２〕、試験管内活性
化中にエイズウイルス感染細胞に対する細胞障害性Ｔ細
胞の生成の増大に用いることができる。
【００１５】次いで活性化したＴ細胞を細胞培養中で膨
張させることができる。この膨張はエイズウイルス関連
エピトープ類でＩＬ−２とともにまたはそれなしでＴ細
胞を繰返し刺激することにより、またはＩＬ−２単独を
含む培地中の成長により達成することができる。Ｔ細胞
培養の他の方法（例えば他のリンフォカイン、成長因
子、または他の生物活性分子とともに）もまた本発明の
範囲内にある。試験管内でＴ細胞の成長および維持を助
成することができるＴ細胞抗原例えばTp６７またはTp４
４抗原を規定する抗体または抗体フラグメント〔レドベ
ター（Ledbetter,J.A.)ほか、１９８５、ジャーナル・
オブ・イムノロジー（J.Immunol.) 、１３５：２３３
１〕の使用もまた本発明の範囲内にある。次にＰＢＬの
分離、活性化および膨張の一般法を主にエイズウイルス
エンベロープエピトープ類を含む組換え体ワクシニアウ
イルスの使用に関して詳記する。しかし本発明は前記の
ように種々の形態におけるエイズウイルス関連エピトー
プ類の使用に備え、これらの変動並びに公知の種々の操
作を適合させるための方法の変更および適応は本発明の
範囲内にある。
【００１６】ヘパリン化静脈血約２００mlを静脈穿刺に
より抜出し、ＰＢＬをフィコール・ハイパック勾配遠心
分離により分離し、供血者のリンパ球数に依存し約１〜
５×１０8 ＰＢＬを得る。ＰＢＬをリン酸塩緩衝食塩水
中で洗浄し、エイズ血清反応陰性供血者からのプールし
た熱不活性化正常ヒト血清１０％を含むＲＰＭＩ１６４
０培地中に約２×１０5 ／mlに懸濁させる、この培地は
「完全培地」として示される。細胞を７５０ml組織培養
フラスコに入れ、それにエイズウイルスエピトープを発
現する紫外（ＵＶ）線不活性化組換え体ウイルス例えば
エイズエピトープを発現する組換え体ワクシニアウイル
ス（ＵＶ線不活性化前１×１０6 〜１×１０7 プラーク
形成単位／ml）、あるいは一般に１〜１０μｇ／mlの範
囲のエイズウイルスエピトープ関連タンパク質またはペ
プチドを加える。６〜７日後、再び同濃度の組換え体ウ
イルス、タンパク質またはペプチドを用いてリンパ球を
刺激する。３日後遠心分離し、再に新鮮な完全培地中に
懸濁させ、それにエンドトキシンを含まない組換え体ヒ
トＩＬ−２（約１００単位のＩＬ−２毎ml）を加える。
次いで細胞を回転瓶に約２×１０5 細胞／mlに播種し、
回転瓶を0.５〜１回転毎分で連続的に回転する。細胞が
約１×１０6 ／mlの密度に達したとき再び細胞を２×１
０5 細胞／mlに播種する。あるいは完全培地中の約１〜
３×１０8 細胞をＩＬ−２とともに中空ファイバー細胞
培養系例えばアクシスト（Acusyst)Ｐ〔エンドトロニク
ス（Endotronics, Coon Rapids, Minnesota)製〕中に播
種し、その中でリンパ球を、ＩＬ−２を有する新鮮培地
中に連続的に浸す。
【００１７】回転瓶または中空ファイバー細胞培養系中
の細胞の全数が約１×１０10細胞に達するとそれをコニ
カルボトル中で遠心分離し、ペレットを、カルシウム、
マグネシウムまたはフェノールレッドを含まないハンク
ス均衡塩類溶液で２回洗浄する。次いで細胞を再び５％
正常ヒト血清アルブミンおよび７５，０００単位の組換
え体ヒトＩＬ−２を含む0.９％塩化ナトリウム２００ml
からなるインフュージョン培地中に懸濁させる。次いで
細胞懸濁液を無菌１１０メッシュを通して濾過し、フェ
ンウオル（Fenwall)トランスファーパックに入れる。細
胞の試料を、真菌、好気性および嫌気性菌、並びにマイ
コプラズマを含めて微生物の存在について試験する。細
胞の試料を、特異的免疫の誘導を実証するため、下記の
ように免疫学的試験のために保持する。
【００１８】4.２）エイズウイルス関連エピトープ類に
対する特異的細胞仲介免疫の実証 免疫療法に用いる前に、刺激したリンパ球をエイズウイ
ルス感染細胞に対する細胞仲介免疫反応性について試験
する。ＰＢＬを、エイズウイルス関連エピトープ（類）
を発現する組換え体ベクターあるいはそのようなエピト
ープ（類）を含むタンパク質またはペプチドによる刺激
後フルオレセインを結合したＴおよびＢ細胞抗原に対す
る単クローン性抗体を用いて免疫蛍光分析によりＴおよ
びＢ細胞マーカーの細胞表面発現に関して試験すること
ができる。そのような検定の例は後に（5.２）に記載さ
れる。公知Ｔ細胞マーカー例えばＣＤ４およびＣＤ８抗
原の発現が活性化したリンパ球のアイデンティティーを
Ｔ細胞として確認させる。
【００１９】次いで活性化したＴ細胞をエイズウイルス
エピトープ類に対する反応性について試験する。これは
特異的細胞仲介免疫の検定に対する技術に知られた若干
の方法のいずれかにより達成することができた。例え
ば、試験管内で患者の自己エイズウイルス感染細胞を殺
す刺激したＴ細胞の能力を測定する細胞毒性検定は、Ｌ
ＡＶ／ＨＴＬＶ III、エイズ関連エピトープ類発現組換
え体ワクシニアウイルス、親ワクシニアウイルスで感染
した51Ｃｒ標識細胞例えばフィトヘムグルチニン活性化
Ｔ細胞、および非感染標識細胞とともにリンパ球をイン
キュベートし、溶解による51Ｃｒ放出を測定することに
より達成することができる。そのような検定は既に記載
された〔例えばザーリング（Zarling, J.M.)ほか、１９
８６、ジャーナル・オブ・イムノロジー（J.Immunol.)
１３６：４６６９参照〕。活性化したＰＢＬはまた刺激
後 3Ｈチミジン取込みにより示されるその増殖能力の測
定により、および（または）外因性ＩＬ−２の非存在下
刺激したときのリンフォカイン例えばＩＬ−２またはイ
ンターフェロンを生ずる能力の測定によりＴヘルパー細
胞活性について試験することができた。そのような検定
の例は後に（5.１）、（5.３）、（６）および（７）中
の本発明の特定態様中に記載される。公知の特異細胞仲
介免疫の他の検定例えば白血球付着抑制検定〔トンプソ
ン（Thompson,D.M.P.)（編）、１９８２、「白血球付着
抑制試験による免疫状態の評価（Assessment of Immune
Status by the Leukocyto Adherence Inhibition Tes
t) 」、アカデミック・プレス（Academic Press, New Y
ork) 〕もまた使用することができる。
【００２０】（4.３）活性化したＴ細胞の患者中への接
種 下記操作は本発明の方法の部分の一般化した説明であ
る。技術的に知られた種々の操作を適合させる変更およ
び適用は本発明の範囲内にある。活性化したＴ細胞の接
種は好ましくは全身投与による。Ｔ細胞は静脈内に中心
静脈カテーテルを通してまたは大末梢静脈中へ投与する
ことができる。投与の他の方法（例えば動脈中への直接
注入）は本発明の範囲内である。約１×１０8 細胞を初
めに注入し、残部を次の数時間にわたり注入する。若干
の患者において、組換え体ヒトＩＬ−２を用いることが
でき、Ｔ細胞注入のときに始めて８時間毎に静脈内に注
入されよう。ＩＬ−２の注入は好ましくは、前に癌患者
に用いられたように10,000〜100,000 単位／kg体重の用
量であろう〔ロゼンベルグ（Rosenberg, S.A.)ほか、１
９８５、ニュー・イングランド・ジャーナル・オブ・メ
ディシン（N.Engl.J.Med.)、３１３；１４８５〕。ＩＬ
−２の注入は患者に許容されれば、活性化したＴ細胞の
注入後数日間続けられよう。活性化したＴ細胞の接種に
よる治療は単独で、あるいはＩＬ−２（前記のよう
に）、インターフェロン、エイズウイルス複製を抑制す
る薬剤またはエイズウイルスに対する単クローン性抗体
の投与、あるいは健康ＨＬＡ適合供与者からの骨髄移植
の投与を含み、しかしそれらに限定されない他の治療規
制とともに用いることができる。患者は血液およびリン
パ節中のウイルス抗原発現単核リンパの除去の証拠につ
いてモニターすることができ、リンパ節障害、日和見感
染の発生、カポジ肉腫並びに他のＡＲＣおよびエイズ関
連障害に対する長期臨床効果を追求することができる。
次の実施例において、エイズウイルスに暴露されたヒト
またはここに参照される同時係属親出願第779,909 号
（１９８５年９月２５日提出）；第842,984 号（１９８
６年３月２７日提出）；代理人整理番号５６２４−０２
６に相当する米国出願（１９８６年９月９日提出）中に
一層完全に記載された組成物で免疫処置した非ヒト霊長
動物から得られたＰＢＬを用いてＴ細胞の試験管内活性
化が実証された。
【００２１】（５）ＬＡＶ／ＨＴＬＶ IIIに特異的なマ
カクＴ細胞の試験管内活性化 本発明のこの実施態様において、ＬＡＶ／ＨＴＬＶ III
のエンベロープ糖タンパク質を発現する組換え体ウイル
スで免疫処置したカニクイザル（Macaca fasicularis)
（マカク）中のＬＡＶ／ＨＴＬＶに特異的なＴ細胞の試
験管中内活性化が記載される。 （5.１）接種したマカクの末梢血リンパ球はＬＡＶ／Ｈ
ＴＬＶ IIIによる刺激に応答して増殖する ８匹のマカクを、ＬＡＶ／ＨＴＬＶ IIIのエンベロープ
糖タンパク質ｇｐ４１およびｇｐ１１０を発現する組換
え体ワクシニアウイルス（ｖ−enV5）または単純ヘルペ
ス糖タンパク質Ｄ−１を発現するワクシニア組換え体ウ
イルス（ｖ−HSVgD1) で免疫処置した；前記組換え体ウ
イルスはともにワクシニアウイルスのＷＲ株で構築し
た。免疫処置は背の正中線上の局所乱切により組換え体
ウイルス２×１０7 または２×１０8 pfu(プラーク形成
単位）で皮内に達成し、次に１２週後７匹のマカクに第
２皮内免疫処置した。第２免疫処置の４週後に免疫処置
マカクのヘパリン化血液からフイコール・ハイパック遠
心分離により末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を分離した。Ｐ
ＢＬはまた非免疫処置マカク、およびｖ−env5で１回の
み接種したマカク８１から分離した。ＰＢＬを１０％熱
不活性化正常ヒト血清補足ＲＰＭＩ１６４０培地〔キブ
コ（GIBCO 、Grand Isle, NY) 製〕中に懸濁させた。最
終容積0.１mlの培地中１×１０5 ＰＢＬを丸底９６ウェ
ルプレートのウェルに入れた。各ウェルに、紫外（Ｕ
Ｖ）線不活性化ｖ−env5を含む0.１ml培地（ＵＶ不活性
化前１×１０6 pfu ／ml）またはＬＡＶ／ＨＴＬＶ III
感染ＣＥＭ細胞、ＨＬＡ ＤＡ陰性Ｔ細胞白血病系、の
上澄みからスクロース勾配遠心分離２サイクルにより精
製した非破壊ＬＡＶ／ＨＴＬＶ III（１μｇ／ml、約１
×１０5 ＴＣＩＤ50、５０％組織培養感染量）を加え
た。刺激の６日後、各ウェルのＰＢＬを１μＣＩ 3Ｈ−
ＴｄＲ（ 3Ｈチミジン、ニュー・イングランド・ニュク
リア（Nwe England Nuclear, Boston, MA)製〕で６時間
標識し、細胞を回収し、取込まれた 3Ｈ−ＴｄＲcpm を
液体シンチレーションカウンティングにより測定した。
結果は表Ｉに示される。取込まれた 3Ｈ−ＴｄＲcem に
ついて示した値は４反復ウェルの平均値である。刺激指
数は刺激された細胞に取込まれた 3Ｈ−ＴｄＲcpm を非
刺激細胞中に取込まれたcpm により除することにより計
算した。
【００２２】
【表１】 ──────────────────────────────────── 表Ｉ ＬＡＶ／ＨＴＬＶ IIIエンベロープ糖タンパク質発現ワクシニア組換え体ウイル スによる免疫処置後のマカクのＰＢＬのＬＡＶ／ＨＴＬＶ III誘導増殖応答 ＰＢＬ刺激に用いたウイルス マカク 免疫 なし ＬＡＶ／ＨＴＬＶ III Ｖ−env ５ 番号 処置 cpm* cpm* SI** cpm* SI** 67 v-env5 1,586 7,465 4.7 60,415 38.1 68 v-env5 2,245 9,075 4.0 28,638 12.8 74 v-env5 1,585 4,732 3.0 21,487 13.6 75 v-env5 581 8,645 14.9 37,847 14.1 76 v-env5 2,479 5,987 2.5 36,657 14.8 80 v-env5 1,077 13,922 12.9 24,752 23.0 81 v-env5 965 3,985 4.1 40,572 42.0 82 v-env5 2,581 8,580 3.3 46,847 18.1 73 V-HSVgD1 612 553 1.0- 56,217 91.9 26 なし 2,911 1,822 1.0- 2,240 1.0- 27 なし 1,228 1,072 1.0- 2,532 2.0 * 取込まれた 3Ｈ−ＴｄＲ、cpm **刺激指数 ────────────────────────────────────
【００２３】表Ｉに示されるように、ｖ−env ５で免疫
処置した８匹のマカクすべてのＰＢＬはＬＡＶ／ＨＴＬ
Ｖ IIIによる刺激の６日後に非刺激ＰＢＬより2.５〜１
4.９倍も多い 3Ｈチミジンを取込んだ。これらのすべて
のマカクおよびｖ−ＨＳＶｇＤ１組換え体ウイルスで免
疫処置したマカク７３のＰＢＬはｖ−env ５（表Ｉ）ま
たは親ワクシニアウイルスによる刺激後に非刺激ＰＢＬ
より１2.８〜９1.９倍も多い 3Ｈチミジンを取込んだ。
しかし、非免疫処置マカク２６および２７またはｖ−Ｈ
ＳＶｇＤ１免疫処置マカク７３のＰＢＬは種々の濃度の
ＬＡＶ／ＨＴＬＶ IIIによる刺激後第６日（表Ｉ）ある
いは第５日または第７日においてＬＡＶ／ＨＴＬＶ III
による刺激に応答して増殖をしなかった。従って、ｖ−
env ５による免疫処置はＬＡＶ／ＨＴＬＶ IIIに応答し
て増殖するＴ細胞を特異的に誘導する。
【００２４】（5.２）ｖ−env ５またはＬＡＶ／ＨＴＬ
Ｖ IIIにより活性化された末梢血リンパ球はＴ細胞であ
る。ｖ−env ５またはＬＡＶ／ＨＴＬＶ IIIにより活性
化されたＰＢＬがＴリンパ球を含むことを確認するため
に、ＬＡＶ／ＨＴＬＶ IIIまたはｖ−env ５で６日間刺
激した免疫処置マカクのＰＢＬを二色免疫蛍光法により
ＩＬ−２レセプター（活性化したＴ細胞および活性化し
たＢ細胞上に存在する）、ＣＤ４およびＣＤ８抗原（Ｔ
細胞上に存在する）、およびＣＤ２０（Ｂｐ３５）抗原
（Ｂ細胞上に存在する）について試験した。これは次の
操作により達成された：
【００２５】組換え体ワクシニアウイルスｖ−env ５で
免疫処置し、追加刺激した後マカク４７および８０から
分離したＰＢＬを培地単独中で培養するかあるいは前記
（5.１）に記載したようにｖ−env ５またはＬＡＶ／Ｈ
ＴＬＶ IIIで６日間刺激した。次いでＰＢＬを二色免疫
蛍光法により、先にマカクＰＢＬと反応することが認め
られた単クローン性抗体〔クラーク（Clark, E.A.)ほ
か、１９８３、イムノジネティックス（Immunogenetic
s) 、１８：５９９〜６１５〕を用いてインターロイキ
ンレセプター（ＩＬ−２Ｒ）、Ｔ細胞関連ＣＤ４および
ＣＤ８抗原、およびＢ細胞関連ＣＤ２０（Ｂｐ３５）抗
原の発現について試験した。ＰＢＬは、インターロイキ
ン２レセプター（ＩＬ−２Ｒ）に対するフイコエリトリ
ン結合単クローン性抗体２Ａ３〔ベクトン・ディキンソ
ン社（Becton-Dickinson, Inc., Mountain View, CA)
製〕およびＣＤ２０に対するフルオレセイン結合単クロ
ーン性抗体ＩＦ５〔クラーク（Clark, E.A.)ほか、１９
８５、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・ア
カデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.)Ｕ
ＳＡ、８２：１７６６〜１７７０〕〔ジネティック・シ
ステムズ社（Genetic Systems Corp., Seattle, WA)
製〕、ＣＤ８に対するＧ１０−１〔レドベター（Ledbet
ter, J.A.)ほか、１９８５、ジャーナル・オブ・イムノ
ロジー（J.Immunol.)、１３４：４２５０〜４２５４〕
（ジネティック・システムズ社（Genetic Systems Cor
p., Seattle, WA) 製〕、またはＣＤ４に対するＴ４ａ
〔オルト・ジアグノスティクス（Ortho Diagnostics, R
aritan, NJ) 製〕で同時に染色した。抗体は、改良ＦＡ
ＣＳ IV ソーター〔ベクトン・ディキンソン（Becton-D
ickinson,Mountain View, CA)製〕で流動微小蛍光測定
より分析したリンパ球上の滴定により予め決定した飽和
濃度で用いた。定量二色分析は先に詳記されたように行
なった〔レドベター（Ledbetter, J.A.)ほか、１９８
４、「免疫遺伝学および組織適合性の展望（Perspectiv
es in Immunogenetics and Histocompatibility)」、６
巻、リンパ球表面抗原（Lymphocyte Surface Antigens
〔ヘイドル（E.Heidl)編〕、アメリカン・ソサイエティ
ー・オブ・ヒストコンパティビリティー・アンド・イム
ノジネティクス（American Society of Histocompatibi
lity and Immunogenetics, New York)、１１９〜１２９
頁〕。フォワードおよびライトアングルスキャターゲー
トはリンパ芽球およ実質数の小リンパ球を含むようにセ
ットした。結果は表IIに示され、表示した値はＩＬ−２
Ｒ+ 全パーセントおよびＣＤ４、ＣＤ８またはＣＤ２０
（Ｂｐ３５）共発現（coexpressing) ＩＬ−２Ｒ+ 細胞
パーセントに対するものである。
【００２６】
【表２】 ──────────────────────────────────── 表II ＬＡＶ−ＨＴＬＶ IIIまたはＬＡＶ−ＨＴＬＶ IIIエンベロープ糖タンパク質発 現組換え体ワクシニアウイルス（ｖ−env ５）による刺激後の接種マカクからの ＰＢＬ上のＩＬ−２レセプターおよびＣＤ４、ＣＤ８またはＣＤ２０（Ｂｐ３５ ）抗原の発現 ──────────────────────────────────── マカク ＰＢＬ ＩＬ−２Ｒ+ 共発現ＩＬ−２Ｒ+ 細胞％ 細胞 ＣＤ２０番号 刺激 全％ ＣＤ４ ＣＤ８ （Ｂｐ３５） 74 ｖ−env5 ２7.７ ４8.６ ５2.２ 2.０ 80 ｖ−env5 ２5.６ ６2.４ ４0.０ ＮＴ 74 LAV/HTLV III １4.７ ５0.０ ５9.０ 1.９ 80 LAV/HTLV III １2.０ ５8.０ ３8.０ 1.５ 80 ウイルスなし 0.３ 0.３− 0.３− 0.３− ────────────────────────────────────
【００２７】表IIの結果はＩＬ−２レセプターを発現す
るウイルス刺激ＰＢＬのほとんどすべてがＣＤ４または
ＣＤ８抗原を共発現するが、単に1.５〜２％がＣＤ２０
（Ｂｐ３５）抗原を共発現することを示し、ｖ−env ５
またはＬＡＶ−ＨＴＬＶ III活性化したＰＢＬがＴ細胞
であることを示す。 （5.３）免疫処置マカクのＴ細胞はＬＡＶ／ＨＴＬＶ I
IIまたはｖ−env ５による刺激後にＩＬ−２を生ずる Ｔ細胞は抗原刺激後ＴおよびＢ細胞の分化および（また
は）増殖を促進することができるＩＬ−２含有リンフォ
カインを生成し、またエイズウイルスを含む種々のウイ
ルスに感染した細胞を溶解できるナチュラルキラー細胞
を活性化できる〔サントリ（Santoli, D.)ほか、１９７
８、ジャーナル・オブ・イムノロジー（J.Immunol.) 、
１２１：５２６；ヤスカワ（Yasukawa, M.and Zarling,
J.M.)、１９８３、ジャーナル・オブ・イムノロジー
（J.Immunol.) 、１３１：２０１１；ルセッチ（Ruscet
ti, F.W.) ほか、１９８６、ジャーナル・オブ・イムノ
ロジー）、１３６：３６１９〕。従って我々は免疫処置
マカクのＴ細胞がＬＡＶ／ＨＴＬＶ IIIによる刺激後に
ＩＬ−２を生ずるかどうかを求めた。
【００２８】ともにワクシニアウイルスのＷＰ株で構築
したｖ−env ５またはｖ−ＨＳＶｇＤ１による第２皮内
免疫処置の４週後にマカクのヘパリン化血液からＰＢＬ
を分離した（試験１）。試験２のためにｖ−env ５、ｖ
−ＨＳＶｇＤ１またはニューヨーク市衛生局（New York
City Board of Health)ワクチン株のウイルスで構築し
たｖ−env ５組換え体ウイルス（ｖ−env ５ＮＹ）２×
１０8 pfu による一次皮内免疫処置の４週後にマカクか
らＰＢＬを分離した。ＰＢＬを１０％熱不活性化正常ヒ
ト血清補足ＲＰＭＩ１６４０培地中に懸濁させ、２×１
０5 ＰＢＬを丸底９６ウェルプレートのウェルに入れ、
次にＵＶ線不活性化したｖ−env ５（ＵＶ線不活性化前
１×１０6 pfu ／ml）または精製ＬＡＶ／ＨＴＬＶ III
（１μg／ml）をウェルに加えた。刺激の２日後に反復
ウェルから上澄みを回収し、検定前に２４時間洗浄し、
ＩＬ−２を含まないＩＬ−２依存性ＣＴＬＬ−２細胞
〔ギリス（Dr.S.Gillis, Immunex Corp., Seattle, WA)
により提供された〕の増殖を支持するそれらの能力につ
いて試験した。上澄みとのインキュベーションの最後の
６時間中に細胞を 3Ｈ−ＴｄＲで標識し、細胞中への 3
Ｈ−ＴｄＲで取込みを測定した。上澄み中に存在するＩ
Ｌ−２活性の単位は、前に記載されたように（ギリス
（Gillis, S.) ほか、１９７８、ジャーナル・オブ・イ
ムノロジー（J.Immunol.) 、１２０：２０７７〕、ＣＴ
ＬＬ−２細胞の増殖に対する組換え体ヒトＩＬ−２の効
果の試験から得られた標準曲線〔ギリス（Dr.Gillis)に
より提供された〕から計算した。結果は表III に示され
る。
【００２９】
【表３】 ──────────────────────────────────── 表III ＬＡＶ／ＨＴＬＶ IIIまたはエイズウイルスエンベロープ糖タンパク質発現組換 え体ワクシニアウイルスによる刺激後の接種マカクのＰＢＬによるＩＬ−２の生 成 ──────────────────────────────────── ＩＬ−２（単位／ml） マカク 刺激ＰＢＬの上澄み番号 免疫処置 ウイルスなし ＬＡＶ／ＨＴＬＶ III ｖ−env ５ 試験 １： 67 ｖ−env5 ０ ２8.０ ９6.０ 68 ｖ−env5 ０ １6.０ １２4.０ 74 ｖ−env5 ０ 9.０ ５2.０ 73 ｖ−HSVgD1 ０ ０ １０8.０ 26 な し ０ ０ ０ 試験 ２： 03 ｖ−env5 ０ １4.４ ５5.８ 05 ｖ−env5NY ０ １6.８ ３3.３ 49 ｖ−env5NY ０ 7.１ ２6.７ 52 ｖ−env5NY ０ 2.４ ２7.６ 59 ｖ−HSVgD1 ０ ０ ２7.６ 26 な し ０ ０ ０ 27 な し ０ ０ ０ ────────────────────────────────────
【００３０】表III 中の試験１の結果はｖ−env ５で２
回免疫処置したマカクからのｖ−env ５またはＬＡＶ／
ＨＴＬＶ III刺激したＰＢＬの上澄みが、それらのＣＴ
ＬＬ−２細胞、（ＩＬ−２依存性細胞系）の増殖を誘導
する能力により示されるようにＩＬ−２を含有した。同
様に表III の試験２に示されるように、ＩＬ−２は、ｖ
−env ５で１回免疫処置したマカク０３から、およびヒ
トにおける痘瘡ワクチンとして使用された〔ネフ（Nef
f, J.M.) 、１９８５、ワクチン抗原のためのベクター
としてのワクシニアウイルス（Vaccinia Viruses as Ve
c tors for Vaccine Antigens)〔キナン（G.V.Quinnan,
Jr.編〕、エルスフィール（Elsevier, New Yrk)、６９
〜７６頁〕ニューヨーク市衛生局株のワクシニアウイル
スを用いて構築した類似の組換え体（ｖ−env ５ＮＹ）
で１回免疫処置した３マカクのすべてからのＬＡＶ／Ｈ
ＴＬＶ IIIまたはｖ−env ５刺激したＰＢＬの上澄み中
に検出された。対照的に、ワクシニアＨＳＶｇＤ１組換
え体ウイルスで免疫処置したマカク７３および５９のＰ
ＢＬはｖ−env ５で刺激した後にのみＩＬ−２を生じ、
ＬＡＶ／ＨＴＬＶ IIIで刺激した後には生じなかった
（表III)。非刺激マカク２６および２７はＬＡＶ／ＨＴ
ＬＶ IIIまたはｖ−env ５による刺激後に検出可能なＩ
Ｌ−２を生じなかった。主にヘルパー／インデューサー
活性を有するＴ細胞が抗原刺激後ＩＬ−２を生ずる〔モ
ラー（Moller, G.)(編) 、１９８０、イムノロジカル・
レビューズ（Immunol.Rev.) 、５１巻；モレッタ（More
tta, L.)ほか、１９８２、セミナーズ・イン・ヘマトロ
ジー（Semin. Hematol.)、１９：２７３〜２８４；レイ
ンヘルツほか（Reinherz, E.L. and Schlossman, S.
F.)、１９８０、セル（Cell) 、１９：８２１〜８２
７；モレッタ（Moretta, A.)、１９８５、ユーロピアン
・ジャーナル・オブ・イムノロジー（Eur.J.Immunol.)
、１５：１４８〜１５５〕ので、これらの結果は従っ
て、組換え体ウイルスで免疫処置したマカクのＬＡＶ／
ＨＴＬＶ IIIを認識するヘルパーＴ細胞の存在を示す。
ＬＡＶ／ＨＴＬＶ IIIエンベロープ抗原に対する抗体を
生ずるそれらのＢ細胞の分化における可能な役割に加え
て、これらのＩＬ−２を生ずるＴ細胞が、エフエクター
細胞例えばウイルス感染細胞を殺すことができる細胞毒
性Ｔリンパ球またはナチュラルキラー細胞の分化および
（または）膨張に関係することができる。
【００３１】表Ｉ、IIおよびIII に示された結果をまと
めると、ＬＡＶ／ＨＴＬＶ IIIエンベロープ糖タンパク
質を発現する組換え体ワクシニアウイルスによるマカク
の免疫処置がＬＡＶ／ＨＴＬＶ IIIに対するＴ細胞仲介
免疫応答を生じ、（ａ）ＬＡＶ／ＨＴＬＶ IIIによる刺
激に応答したＴ細胞の増殖、および（ｂ）ＬＡＴ／ＨＴ
ＬＶ IIIによる刺激に応答したＴ細胞によるＩＬ−２の
生成により示されるように、試験管内で活性化できるＴ
細胞を生ずることが示される。エンベロープ抗原が免疫
処置に用いた組換え体ワクシニアウイルスによりエンコ
ードされた唯一のＬＡＶ／ＨＴＬＶ III抗原であるの
で、この特定態様においてＬＡＶ／ＨＴＬＶ IIIによる
刺激後増殖し、ＩＬ−２を生ずるＴ細胞がＬＡＶ／ＨＴ
ＬＶ IIIエンベロープ抗原（類）を認識することが明ら
かである。組換え体ウイルスにより発現されたエンベロ
ープ抗原およびＬＡＶ／ＨＴＬＶ IIIにより発現された
ものが免疫学的に交差反応性であることも明らかであ
る。
【００３２】（６）実施例：ＬＡＶ／ＨＴＬＶ IIIに特
異的なチンパンジーＴ細胞の試験管内活性化 下記の試験はｖ−env ５ＮＹ接種チンパンジーのＰＢＬ
が試験管内でＬＡＶ／ＨＴＬＶ IIIまたはＬＡＶ／ＨＴ
ＬＶ IIIエンベロープ糖タンパク質による刺激に応答し
て増殖することを示す。ｖ−env ５ＮＹまたは単純ヘル
ペスウイルスＩ型糖タンパク質を発現する組換え体ワク
シニアウイルス（vHSVgD1)による二次皮内接種の４週後
にヘパリン化血液からフィコール・ハイパック遠心分離
によりＰＢＬを分離した。ＰＢＬを１０％熱不活性化正
常ヒト血清およびペニシリン／ストレプトマイシン補足
ＲＰＭＩ１６４０中で、９６ウェルプレートに１×１０
5 細胞／ウェルに播種した。次いで非破壊ＬＡＶ／ＨＴ
ＬＶ III（５μg ／ml）、精製ＬＡＶ／ＨＴＬＶ IIIか
らレンチルレクチンクロマトグラフィーにより分離した
ＬＡＶ／ＨＴＬＶ IIIエンベロープ糖タンパク質（１μ
g ／ml）、ＵＶ不活性化ＨＳＶ−１（ＵＶ不活性化前１
×１０5 pfu ／ml）、またはＵＶ不活性化ｖ−env ５Ｎ
Ｙ（ＵＶ不活性化前１×１０6 pfu ／ml）を反復ウェル
に加えた。５日後細胞中の 3Ｈチミジン取込みを液体シ
ンチレーションカウンティングにより測定した。結果は
表IVに示される。
【００３３】
【表４】 ──────────────────────────────────── 表IV 組換え体ワクシニアウイルスにより免疫処置したチンパンジーのＰＢＬの増殖応 答 cpm 刺激後の 3Ｈチミジンの取込み 免疫処置 ENV LAV/HTLV III ＵＶ不活性化 追加刺激後 抗原なし (1μg/ml) (5μg/ml) HSV−１ v-env5NY v-env5NY 124 3,626 54,685 50,197 5,967 105,840 149 2,257 21,178 8,938 3,347 137,857 v-HSVgD1 134 4,817 3,652 4,428 79,455 92,192 一次後** v-env5NY 216 170 13,702 18,772 1,965 39,950 72 1,552 25,245 34,252 2,162 82,167 v-HSVgD1 64 5,300 7,300 7,560 6,990 125,372 * 追加刺激後４週：１２４、１４９および１３４はチンパンジーの確認番号を 示す。 **一次免疫処理後８週：２１６、７２、６４はチンパンジーの確認番号を示す 。 ────────────────────────────────────
【００３４】すべてのチンパンジーからのＰＢＬはｖ−
env ５ＮＹによる刺激後高水準の 3Ｈチミジン取込みを
取込んだ（ワクシニアウイルスに対するＴ細胞応答に基
く）。表IVに示されるように、ｖ−env ５ＮＹで免疫処
置したすべてのチンパンジーのＰＢＬは、ｖ−HSVgD1免
疫処置チンパンジーのＰＢＬ（No. １３４およびNo.６
４）とは対照的にＬＡＶ／ＨＴＬＶ IIIおよびＬＡＶ／
ＨＴＬＶ IIIエンベロープ糖タンパク質（env)に対し著
しい増殖応答を示した。 （７）実施例：ＬＡＶ／ＨＴＬＶ IIIエンベロープ抗原
を指向する増殖および細胞障害活性を有するチンパンジ
ーＴ細胞クローンの試験管内生成 下記試験はｖ−env ５で刺激した後増殖するが親ワクシ
ニアウイルスでは増殖せず、ｖ−env ５で感染した51Ｃ
ｒ標識自己標的細胞を溶解するが親ワクシニアウイルス
では溶解しないＴ細胞クローンをｖ−env ５で免疫処置
したチンパンジーのＰＢＬから試験管内で生成できるこ
とを示す。ＰＢＬを精製エイズウイルスエンベロープ抗
原、（env 、１μg ／ml）で週間隔で２回刺激した。３
日後、刺激した細胞を９６ウェルプレートのウェルに限
界希釈法によりクローン化し、それに１０％脱レクチン
ＩＬ−２〔セルラー・プロダクツ（Cellular Products,
Buffalo, NY) 製〕含有完全培地中の５×１０4 Ｘ線照
射（２５００Ｒ）自己ＰＢＬ（およびＵＶ不活性化）を
加えた。クローンをｖ−env ５およびＩＬ−２含有培地
中のＸ線照射ＰＢＬによる毎週フィーディングにより膨
張させた。ｖ−env５およびワクシニアウイルスに対す
る増殖応答について試験するために、クローン化Ｔ細胞
を洗浄してＩＬ−２を除き、１×１０4 クローン化Ｔ細
胞を、ＩＬ−２を含まない培地中に５×１０4 のＸ線照
射自己ＰＢＬおよびｖ−env ５またはワクシニアウイル
ス（ＵＶ不活性化前１×１０6 pfu ／ml）を含む反復ウ
ェルに入れた。３日後に 3Ｈチミジンをウェルに加え、
６時間中に取込まれた 3Ｈチミジンを液体シンチレーシ
ョンカウンティングにより測定した。表Ｖ中の結果は４
クローンのすべてがｖ−env ５に応答して増殖するが、
親ワクシニアウイルスに応答しないことを示す。クロー
ン化細胞はまたｖ−env ５、ワクシニアウイルスで感染
したか、またはウイルスに感染しない51Ｃｒ標識自己リ
ンパ芽球様標的細胞を溶解するそれらの能力について、
２５：１のクローン化エフェクター細胞：標的細胞比を
用いて６時間51Ｃｒ放出検定で試験した。結果は表Ｖに
示される。クローン化細胞はｖ−env ５感染細胞を溶解
したが、しかし親ワクシニア感染または非感染細胞を溶
解せず、従ってそれらのエイズウイルスエンベロープ抗
原（類）に対する特異性を示す。
【００３５】
【表５】 ──────────────────────────────────── 表Ｖ ｖ−env ５免疫処置チンパンジー＃１２４からのクローン化Ｔ細胞の増殖および 細胞障害活性 刺激後の 3Ｈチミジン取込み、cpm クローン＃ 抗原なし ｖ−env ５ ワクシニア １ 5,317 33,907 8,272 ２ 4,997 15,225 6,342 ３ 1,090 9,080 2,910 ４ 4,607 13,050 5,392 感染標的細胞からの51Cr放出、％ クローン＃ ウイルスなし ｖ−env ５ ワクシニア １ −2.４ 20.2 −0.１ ２ −0.７ 7.0 −1.３ ３ −0.０ 11.0 1.０ ４ −0.１ 23.5 −3.２ ────────────────────────────────────
【００３６】（８）実施例：ｖ−env ５によるヒトＴ細
胞の試験管内活性化 下記試験はエイズウイルス血清反応陽性個体のＰＢＬが
試験管内でｖ−env ５による刺激に応答して増殖するこ
とを示す。ＰＢＬをフィコール・ハンパック遠心分離に
より分離し、１０％熱不活性化プール化正常ヒト血清を
含むＲＰＭＩ１６４０培地中に再び懸濁させた。次いで
0.１mlＰＢＬ（１×１０5 細胞）を４反復ウェルのそれ
ぞれに加え、次に0.１ml培地（抗原なし）、0.１ml紫外
線（ＵＶ）不活性化ｖ−env ５（ＵＶ不活性化前１０6
pfu/ml）または１×１０5 Ｘ線照射（２５００Ｒ）同種
ＰＢＬを加えた。６日後に 3Ｈチミジン（ 3Ｈ−Ｔｄ
Ｒ）をウェルに加え（0.５μＣｉ／ウェル）、６時間後
に細胞をマルチウェル回収装置により回収した。 3Ｈ−
ＴｄＲ取込みを液体シンチレーションカウンティングに
より測定した。刺激した細胞中に取込まれた 3Ｈ−Ｔｄ
Ｒcpm を非刺激細胞中に取込まれたcpm で除することに
より刺激指数（ＳＩ）を計算した。結果は表VIに示され
る。
【００３７】
【表６】 ──────────────────────────────────── 表VI エイズウイルス血清反応陽性および血清反応陰性固体のＴ細胞のワクシニアエン ベロープ組換え体ウイルスｖ−env ５誘導増殖応答 リンパ球刺激 血清＋または 抗原なし ｖ−env ５ 同種細胞 固体 血清− cpm* cpm* SI** cpm* SI** 試験１ 1333 ＋ 3,982 11,140 2.8 28,067 7.1 Y-1 ＋ 2,290 12,772 5.6 32,382 14.1 1 − 2,790 38,317 13.7 29,827 10.7 2 − 1,487 73,392 49.4 56,380 37.9 試験２ Y-1 ＋ 3,487 12,505 3.6 23,225 6.6 AB ＋ 1,470 5,720 3.9 4,470 3.0 試験３ RE ＋ 140 710 5.1 61,162 437.9 BM − 3,925 48,140 12.3 28,092 7.2 2331 ＋ 1,847 36,447 19.8 36,475 19.8 * 取込まれた 3Ｈチミジンcpm **刺激指数 ──────────────────────────────────── 表Ｖから見られるように、血清反応陽性および血清反応
陰性供血者のＰＢＬはともにｖ−env ５に応答して増殖
を示した。一般に血清反応陽性供血者からのＰＢＬは血
清反応陰性供血者より低い応答を示した。しかし、血清
反応陽性供血者のＰＢＬはかなりの応答を示し、活性化
Ｔ細胞はＩＬ−２含有細胞培養中で膨張することができ
る。
【００３８】（９）微生物の寄託 次の組換え体ウイルスはアメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション（American Type Culture Collectio
n, Rockville, MD)に寄託され、表示受託番号を指定さ
れた：組換え体ウイルス 受託番号 ｖ−env2 ATCC VR 2114 ｖ−env5 ATCC VR 2113 ｖ−env7 ATCC VR 2148 ｖ−env5NY ATCC VR 2149 ｖ−gag1NY ATCC VR 2150 Ac−gag1 ATCC VR 2147 Ac−env5 ATCC VR 2151 寄託態様は本発明の１観点の単なる例示として意図さ
れ、機能的に等しい任意の組換え体が本発明の範囲内で
使用できるので本発明は寄託した組換え体ウイルスによ
り範囲を限定すべきではない。実際にここに示し、記載
したものに加えて、本発明の種々の変更が前記記載から
当業者に明らかになろう。そのような変更は特許請求の
範囲内に属するものとする。

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 患者またはエイズウイルスエピトープに
    暴露された組織適合性供血者から分離したリンパ球を試
    験管内でエイズウイルスエピトープに暴露して、エイズ
    ウイルスに特異性のＴリンパ球を活性化すること、を含
    むＴリンパ球を試験管内で活性化する方法。
  2. 【請求項２】 更に、次の検定法： （ｉ）活性化したＴリンパ球をエイズウイルスに感染し
    た患者の放射性標識した標的細胞とともにインキュベー
    トし、放射性標識の放出が感染標的細胞の溶解の指標で
    ある細胞障害検定、および（ii）試験管内でエイズウイ
    ルスのエピトープによる刺激に応答して増殖および（ま
    たは）リンフォカインの生成を生ずる活性化したＴリン
    パ球の能力を測定する刺激検定、のいずれかにより活性
    化したＴリンパ球を選ぶことを含む請求項１記載の方
    法。
  3. 【請求項３】 エイズウイルスのエピトープがエンベロ
    ープエピトープを含む、請求項１または２記載の方法。
  4. 【請求項４】 エイズウイルスのエピトープが gagエピ
    トープを含む、請求項１または２記載の方法。
  5. 【請求項５】 活性化したＴリンパ球がエイズウイルス
    のエピトープに関連するペプチドに対する暴露により試
    験管内で活性化された、請求項１または２記載の方法。
  6. 【請求項６】 エイズウイルスのエピトープがエンベロ
    ープエピトープを含む、請求項５記載の方法。
  7. 【請求項７】 エイズウイルスのエピトープが gagエピ
    トープを含む、請求項５記載の方法。
  8. 【請求項８】 活性化したＴリンパ球がエイズウイルス
    のエピトープを発現する組換え体微生物に対する暴露に
    より試験管内で活性化された、請求項１または２記載の
    方法。
  9. 【請求項９】 エイズウイルスのエピトープがエンベロ
    ープエピトープを含む、請求項８記載の方法。
  10. 【請求項10】 エイズウイルスのエピトープが gagエピ
    トープを含む、請求項８記載の方法。
  11. 【請求項11】 組換え体微生物が組換え体ウイルスを含
    む、請求項８、９または10記載の方法。
  12. 【請求項12】 組換え体ウイルスが動物ウイルスを含
    む、請求項11記載の方法。
  13. 【請求項13】 動物ウイルスがワクシニアウイルスを含
    む、請求項12記載の方法。
  14. 【請求項14】 組換え体ウイルスが昆虫ウイルスを含
    む、請求項11記載の方法。
  15. 【請求項15】 昆虫ウイルスがバクロウイルスを含む、
    請求項14記載の方法。
  16. 【請求項16】 活性化したＴリンパ球が、ＡＴＣＣに寄
    託されて受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ２１３３を指定された
    ｖ− env５に対する暴露により活性化された、請求項１
    または２記載の方法。
  17. 【請求項17】 活性化したＴリンパ球が、ＡＴＣＣに寄
    託されて受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ２１４９を指定された
    ｖ− env５ＮＹに対する暴露により活性化された、請求
    項１または２記載の方法。
  18. 【請求項18】 活性化したＴリンパ球が、ＡＴＣＣに寄
    託されて受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ２１５０を指定された
    ｖ− gag１ＮＹに対する暴露により活性化された、請求
    項１または２記載の方法。
  19. 【請求項19】 活性化したＴリンパ球が、ＡＴＣＣに寄
    託されて受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ２１５１を指定された
    Ａｃ− env５に対する暴露により活性化された、請求項
    １または２記載の方法。
  20. 【請求項20】 活性化したＴリンパ球が、ＡＴＣＣに寄
    託されて受託番号ＡＴＣＣ ＶＲ２１４７を指定された
    Ａｃ− gag１に対する暴露により活性化された、請求項
    １または２記載の方法。
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