JPH08290A - リポソ―ム分散液中のエンドトキシンの測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 リポソ―ム分散液中のエンドトキシンの量を
簡便でかつ正確に測定する方法を提供する。 【構成】 リポソ―ム分散液中のエンドトキシンの量を
合成基質法により測定する方法において、リポソ―ム分
散液の脂質濃度を４．０ｇ／ｄｌ以下に調整し、この調
整試料について反応試薬を添加して処理した吸光度：Ａ
ｂｓ（処理試料）、水を添加して処理した吸光度：Ａｂ
ｓ（未処理試料）と、ブランクの吸光度：Ａｂｓ（ブラ
ンク）および標準液の吸光度：Ａｂｓ（標準液）を測定
し、これらの測定値を用いて、リポソ―ム分散液中のエ
ンドトキシンの濃度（Ｃ）を、Ｃ＝Ｅｔ×｛〔Ａｂｓ
（処理試料）−Ａｂｓ（未処理試料）−Ａｂｓ（ブラン
ク）〕／〔Ａｂｓ（標準液）−Ａｂｓ（ブランク）〕｝
（ただし、Ｅｔ＝標準液のエンドトキシンの濃度）とし
て、算出する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、リポソ―ム分散液中の
エンドトキシンを定量する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】リポソ―ム中に薬物を含ませてなるリポ
ソ―ム製剤は、近年、ドラツグ・デリバリ―・システム
のひとつとして、医薬品メ―カ―において開発されてい
る。リポソ―ム製剤の投与方法としては、現在静脈投与
が主流であるが、静脈投与を行う場合、製剤中のエンド
トキシンの量が大きな問題となるため、日本薬局方では
製剤中のエンドトキシンの量を規制している。このた
め、製剤中のエンドトキシンを除去する方法とともに、
製剤中のエンドトキシンの量を測定する方法が必要とさ
れている。

【０００３】エンドトキシンの測定方法としては、カブ
トガニ血球抽出物を用いたゲル化法と合成基質法のふた
つが挙げられ、その反応試薬につきすでにキツト化され
て、数社から市販されている。たとえば、ゲル化法とし
ては、プレゲル（Ｓ）〔生化学工業（株）〕やリムルス
（ＨＳ）テスト・ワコ―〔和光純薬（株）〕など、合成
基質法としては、エンドスペシ―やエンドトキシンテス
ト−Ｄ〔いずれも生化学工業（株）〕などを挙げること
ができる。

【０００４】ゲル化法は、エンドトキシンとカブトガニ
の血球抽出成分であるライセ―トが反応してできるゲル
を特定の指標とするものであるが、反応および測定時の
振動に影響されやすく、また定量精度も低い。合成基質
法は、比色定量を行うので、ゲル化法の数倍以上の感度
で定量ができるすぐれた方法である。

【０００５】合成基質法を概説すると、試料にカブトガ
ニのライセ―トおよび発色合成基質（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−
Ａｒｇ−ｐＮＡ）から構成されている一定濃度の反応試
薬を一定量添加する。試料中にエンドトキシンが存在す
ると、連鎖反応が起き、最終的にｐＮＡ、つまりパラニ
トロアニリンが遊離する。このｐＮＡを直接比色定量す
るか、あるいはジアゾカツプリング反応試薬を添加し
て、生じたアゾ色素について、一定波長での吸光度を測
定する。

【０００６】この測定吸光度を、Ａｂｓ（処理試料）と
する。また同時に、水に既知量（通常４０〜７０ｐｇ／
ｍｌ）のエンドトキシンを含ませた標準液および減菌水
を用意し、これらに試料と同様の処理操作を行つて、一
定波長での吸光度を測定し、これら吸光度を、Ａｂｓ
（標準液）、Ａｂｓ（ブランク）とする。これらの測定
値を用いて、検体（試料）中のエンドトキシンの濃度
（Ｃ）を、下記の式にしたがつて、算出するものであ
る。

【０００７】しかしながら、上記の合成基質法により、
リポソ―ム分散液中のエンドトキシンの量を測定する場
合、式によつて求める従来法では、リポソ―ム分散液
の濁度によつて比色定量が困難である。また、特開平５
−２３００８３号公報には、リポソ―ム分散液における
リン脂質中のエンドトキシンの測定方法として、リン脂
質と水とを遠心分離により分離し、水相に移行したエン
ドトキシンの量を測定する方法が開示されているが、こ
の方法は、操作がやや煩雑であり、遠心分離によるリン
脂質と水の分離も不確かである。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来の
問題点を解決し、リポソ―ム分散液中のエンドトキシン
の量を簡便でかつ正確に測定する方法を提供することを
目的としている。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するため、鋭意研究した結果、リポソ―ム分散
液中のエンドトキシンの量を合成基質法により測定する
にあたり、上記分散液の脂質濃度をできるだけ薄くし、
かつ分散液に反応試薬を添加し処理したときの吸光度に
加えて、分散液に減菌水だけを添加し処理した、いわゆ
る未処理分散液の吸光度をも測定し、上記処理分散液の
吸光度から上記未処理分散液の吸光度を減ずる補正操作
を行うことにより、上記分散液の濁度の問題が回避され
て、リポソ―ム分散液からなる検体中のエンドトキシン
の量を簡便でかつ正確に測定できることを見い出し、本
発明を完成するに至つた。

【００１０】すなわち、本発明は、リポソ―ム分散液中
のエンドドキシンの量を合成基質法によつて測定する方
法において、リポソ―ム分散液を脂質濃度が４．０ｇ／
ｄｌ以下となるように調整し、この調整試料について下
記二種の吸光度と、さらに下記のブランクおよび標準液
の吸光度とを測定し、 Ａｂｓ（処理試料） ：試料に反応試薬を添加して処理
したものの一定波長での吸光度 Ａｂｓ（未処理試料）：試料に反応試薬と同量の水を添
加して処理したものの一定波長での吸光度 Ａｂｓ（ブランク） ：減菌水に反応試薬を添加して処
理したものの一定波長での吸光度 Ａｂｓ（標準液） ：既知量のエンドトキシンを含む
水を標準液とし、これに反応試薬を添加して処理したも
のの一定波長での吸光度 これらの測定値を用いて、リポソ―ム分散液からなる検
体中のエンドトキシンの濃度（Ｃ）を、下記の式： にしたがつて、算出することを特徴とするリポソ―ム分
散液中のエンドトキシンの測定方法に係るものである。

【００１１】本発明においては、まず、リポソ―ム分散
液の脂質濃度を、４．０ｇ／ｄｌ以下、好ましくは０．
５〜３．０ｇ／ｄｌに調整する。これは、脂質濃度が
４．０ｇ／ｄｌを超えると、反応試薬を添加し処理した
ことによつて生じるエンドトキシン由来の吸光度に対し
て、リポソ―ム分散液自体の吸光度が大きくなるため、
エンドトキシンの測定値に誤差が生じやすくなるためで
ある。

【００１２】つぎに、このように調整したリポソ―ム分
散液より、一定量のふたつの試料を分取し、その一方に
反応試薬を添加してインキユベ―ト（定温処理）し、こ
のように処理したものについて一定波長での吸光度を測
定する。また、他方には反応試薬を添加する代わりに反
応試薬と同量の水を添加してインキユベ―トしたのち、
上記と同様にその吸光度を測定する。さらに、ブランク
として、減菌水に反応試薬を添加してインキユベ―トし
たのち、上記と同様にその吸光度を測定する。また、既
知量の、通常は濃度４０〜７０ｐｇ／ｍｌ程度のエンド
トキシンを含ませた水を標準液とし、これに反応試薬を
添加してインキユベ―トしたのち、上記と同様にその吸
光度を測定する。

【００１３】これらの吸光度を、上記の順に、Ａｂｓ
（処理試料）、Ａｂｓ（未処理試料）、Ａｂｓ（ブラン
ク）、Ａｂｓ（標準液）とし、これらの測定値を、前記
の式にあてはめることにより、リポソ―ム分散液から
なる検体中のエンドトキシンの量が算出される。これに
よると、従来のような遠心分離による分離操作を一切必
要としないので、操作が非常に簡便であり、また、後記
の実施例に示すように、その測定値は極めて正確であつ
て、再現性にもすぐれている。

【００１４】本発明に用いられる反応試薬は、カブトガ
ニのライセ―トおよび発色合成基質（Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−
Ａｒｇ−ｐＮＡ）から構成されたものであり、その濃度
および量は、検体中のエンドトキシンが反応するに十分
な一定濃度および一定量が適宜選択される。この反応試
薬を添加してインキユベ―トする時間は、とくに限定さ
れないが、通常は２０〜４０分程度とするのがよい。

【００１５】吸光度の測定は、ａ）インキユベ―トによ
りエンドトキシンと反応試薬との反応で生成するｐＮＡ
を直接測定する方法と、ｂ）上記のｐＮＡにジアゾカツ
プリング試薬を添加して反応させ、生成するアゾ色素を
測定する方法とがあり、そのいずれを選択してもよい。
前者のａ法では、測定波長として３８０〜４２０ｎｍの
範囲を選択でき、とくに４０５ｎｍの波長で測定するの
が好ましい。また、後者のｂ法では、測定波長として５
３０〜５６０ｎｍの範囲を選択でき、とくに５４５ｎｍ
の波長で測定するのが好ましい。

【００１６】なお、このようにして測定，算出されるエ
ンドトキシンの濃度が、２．０ｐｇ／ｍｌ以下であつた
ときは、Ｎ．Ｄ（検出不可）とし、また、３００ｐｇ／
ｍｌ以上となつたときは、その検体をさらに希釈して、
再度上記と同様の操作にて測定，算出するようにするの
が望ましい。

【００１７】

【発明の効果】本発明によれば、従来の遠心分離のよう
な面倒な処理操作を要することなく、リポソ―ム分散液
中のエンドトキシンの量を簡便でかつ高い精度で測定で
き、リポソ―ム製剤などの医薬品分野に利用することが
できる。

【００１８】

【実施例】つぎに、本発明の実施例を記載して、より具
体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例にのみ
限定されるものではない。

【００１９】実施例１ ジミリストイルホスフアチジルコリン（以下、ＤＭＰＣ
という）を精製して、エンドトキシンを完全に除去し、
脂質組成がＤＭＰＣ／コレステロ―ル／ミリスチン酸＝
７／７／２であるリポソ―ム分散液を調製した。限外ろ
過膜を用いて、精製を繰り返して、エンドトキシンをさ
らに除去したのち、脂質濃度が１．０ｇ／ｄｌになるよ
うに調整した。この分散液に、既知量のエンドトキシン
を、エンドトキシンの濃度が各々５．５ｐｇ／ｍｌ、１
１．０ｐｇ／ｍｌ、１６．５ｐｇ／ｍｌ、２２．０ｐｇ
／ｍｌとなるように添加した。

【００２０】これらの分散液を、各々１００μｌずつ、
ふたつの試験管に採取し、その一方には、エンドスペシ
―〔生化学工業（株）〕の操作法にしたがつて、反応試
薬１００μｌを添加し、３７℃で３０分間インキユベ―
トを行つて反応を進行させ、遊離したｐＮＡにさらにジ
アゾカツプリング反応試薬を添加し、生じたアゾ色素を
波長５４５ｎｍで吸光度を測定した。この吸光度を、Ａ
ｂｓ（処理試料）とした。他方には、反応試薬の代わり
に、減菌水１００μｌを添加したのち、上記と同様の処
理操作を行つて、波長５４５ｎｍで吸光度を測定し、こ
れをＡｂｓ（未処理試料）とした。これらの各吸光度
を、表１に示した。

【００２１】別に、減菌水１００μｌと、減菌水に４４
ｐｇ／ｍｌ濃度のエンドトキシンを含ませた標準液１０
０μｌに対し、上記と同様の処理操作を行つて、波長５
４５ｎｍで吸光度を測定したところ、Ａｂｓ（ブラン
ク）＝０．００６、Ａｂｓ（標準液）＝０．８８７であ
つた。これらの吸光度と、前記試料溶液の吸光度から、
式にしたがつて、各リポソ―ム分散液からなる検体中
のエンドトキシンの濃度（Ｃ）を算出した結果は、表１
に併記されるとおりであつた。

【００２２】

【表１】

【００２３】この表１の結果から明らかなように、本発
明の測定方法によれば、あらかじめ調製したリポソ―ム
分散液中の既知量のエンドトキシンを、ほぼ正確に測
定，算出できるものであることがわかる。この結果は、
Ａｂｓ（処理試料）からＡｂｓ（未処理試料）を減ずる
補正操作を行うことにより、リポソ―ム分散液自体によ
る吸光度への悪影響が回避されたことによるものと思わ
れる。

【００２４】このことは、下記の参考例として示す、減
菌水に対して実施例１と同様に既知量のエンドトキシン
を添加した各溶液に関し、実施例１と同様の操作法にて
処理したものについて測定した吸光度Ａｂｓ（処理試
料）と、実施例１におけるＡｂｓ（処理試料）からＡｂ
ｓ（未処理試料）を減じた吸光度の値とが、後記の表２
に示すように、ほぼ一致していることからも明らかであ
る。

【００２５】参考例 減菌蒸留水に既知量のエンドトキシンを添加して、エン
ドトキシンの濃度が各々５．５ｐｇ／ｍｌ、１１．０ｐ
ｇ／ｍｌ、１６．５ｐｇ／ｍｌ、２２．０ｐｇ／ｍｌと
なるように調整した。これらの溶液を各々１００μｌず
つ採取し、これらに、エンドスペシ―〔生化学工業
（株）〕の操作法にしたがつて、反応試薬１００μｌを
添加し、３７℃で３０分間インキユベ―トを行つて反応
を進行させ、遊離したｐＮＡにさらにジアゾカツプリン
グ反応試薬を添加し、生じたアゾ色素を波長５４５ｎｍ
で吸光度を測定した。

【００２６】

【表２】

【００２７】比較例１ 実施例１において、既知量のエンドトキシンを添加した
各分散液について、反応試薬を添加して処理したものの
吸光度のみ、つまりＡｂｓ（処理試料）のみを測定し
た。この測定値と、Ａｂｓ（ブランク）およびＡｂｓ
（標準液）とから、式にしたがつて、各リポソ―ム分
散液からなる検体中のエンドトキシンの濃度（Ｃ）を算
出した。結果は、下記の表３に示されるとおり、既知量
に比べ、かなり差異があることが判明した。

【００２８】

【表３】

【００２９】実施例２ 実施例１のリポソ―ム分散液を限外ろ過膜を用いて濃縮
し、脂質濃度が２．０ｇ／ｄｌになるように調整した。
この分散液に、既知量のエンドトキシンを、エンドトキ
シンの濃度が各々５．５ｐｇ／ｍｌ、１１．０ｐｇ／ｍ
ｌ、１６．５ｐｇ／ｍｌ、２２．０ｐｇ／ｍｌとなるよ
うに添加した。

【００３０】これらの分散液について、実施例１と同様
の操作により、Ａｂｓ（処理試料）とＡｂｓ（未処理試
料）とを測定した。これらの吸光度と、実施例１で測定
したＡｂｓ（ブランク）＝０．００６、Ａｂｓ（標準
液）＝０．８８７とから、式にしたがい、各リポソ―
ム分散液からなる検体中のエンドトキシンの濃度（Ｃ）
を算出した。結果を、分散液の吸光度とともに、下記の
表４に示した。

【００３１】

【表４】

【００３２】比較例２ 実施例２において、既知量のエンドトキシンを添加した
各分散液について、反応試薬を添加して処理したものの
吸光度のみ、つまりＡｂｓ（処理試料）のみを測定し
た。この測定値と、Ａｂｓ（ブランク）およびＡｂｓ
（標準液）とから、式にしたがつて、各リポソ―ム分
散液からなる検体中のエンドトキシンの濃度（Ｃ）を算
出した。結果を、下記の表５に示した。

【００３３】

【表５】

【００３４】上記の表４および表５から明らかなよう
に、本発明の実施例２の測定方法によれば、前記の実施
例１の場合と同様に、あらかじめ調製したリポソ―ム分
散液中の既知量のエンドトキシンを、ほぼ正確に測定，
算出できるが、比較例２の測定方法では、既知量に比
べ、かなり差異があることがわかる。

【００３５】実施例３ 未精製のリン脂質：ジパルミトイルホスフアチジルコリ
ン（以下、ＤＰＰＣという）を、脂質濃度が２．５ｇ／
ｄｌになるように、減菌水を用いて調整し、これをボル
テツクスミキサ―により撹拌したのち、３０分間超音波
処理を行つて、リポソ―ム分散液を調製した。

【００３６】この分散液について、実施例１と同様の操
作により、Ａｂｓ（処理試料）とＡｂｓ（未処理試料）
を測定したところ、Ａｂｓ（処理試料）は０．８５６で
あり、Ａｂｓ（未処理試料）は０．４２０であつた。こ
の吸光度と、実施例１と同様にして測定したＡｂｓ（ブ
ランク）＝０．００６、Ａｂｓ（標準液）＝０．８８７
〔エンドトキシン濃度４４ｐｇ／ｍｌ〕とから、式に
したがつて、上記のリポソ―ム分散液からなる検体中の
エンドトキシンの濃度（Ｃ）を算出したところ、２１．
２ｐｇ／ｍｌであつた。

【００３７】比較例３ 実施例３と同じリン脂質：ＤＰＰＣを用いて、特開平５
−２３００８３号公報に開示の方法にしたがい、リン脂
質中のエンドトキシンの量を測定した。まず、実施例３
と同様の方法にて、リポソ―ム分散液を調製した。この
分散液につき、５，０００ｒｐｍで３０分間の遠心分離
を行い、リン脂質を分離して得た水を、１００μｌ採取
し、この試料について、実施例１と同様の操作で、Ａｂ
ｓ（処理試料）を測定したところ、０．４１６であつ
た。

【００３８】この吸光度と、実施例１と同様にして測定
したＡｂｓ（ブランク）＝０．００６、Ａｂｓ（標準
液）＝０．８８７〔エンドトキシン濃度４４ｐｇ／ｍ
ｌ〕とから、式にしたがい、上記のリポソ―ム分散液
からなる検体中のエンドトキシンの濃度（Ｃ）を算出し
たところ、２０．５ｐｇ／ｍｌであつた。この値は、実
施例３の結果に近いものであつたが、上記の遠心分離は
面倒であり、エンドトキシン量の簡易的な測定方法とは
いえなかつた。

【００３９】比較例４ 実施例３において、リポソ―ム分散液について、反応試
薬を添加して処理したものの吸光度のみ、つまりＡｂｓ
（処理試料）のみを測定した。この測定値と、実施例１
と同様にして測定したＡｂｓ（ブランク）およびＡｂｓ
（標準液）とから、式にしたがつて、リポソ―ム分散
液からなる検体中のエンドトキシンの濃度（Ｃ）を算出
した。結果は、３２．７ｐｇ／ｍｌであり、実施例３お
よび比較例３の結果とはかなり差異があることが判明し
た。

【００４０】比較例５ 実施例３で用いたリン脂質：ＤＰＰＣを精製し、エンド
トキシンを除去したのち、リポソ―ム分散液を調製し、
脂質濃度が４．５ｇ／ｄｌになるように、減菌水を用い
て調整した。この分散液に、既知量のエンドトキシン
を、エンドトキシンの濃度が各々５．５ｐｇ／ｍｌ、１
１．０ｐｇ／ｍｌ、１６．５ｐｇ／ｍｌ、２２．０ｐｇ
／ｍｌとなるように添加した。

【００４１】これらの分散液について、実施例１と同様
の操作により、Ａｂｓ（処理試料）とＡｂｓ（未処理試
料）とを測定した。これらの吸光度と、実施例１で測定
したＡｂｓ（ブランク）＝０．００６、Ａｂｓ（標準
液）＝０．８８７とから、式にしたがい、各リポソ―
ム分散液からなる検体中のエンドトキシンの濃度（Ｃ）
を算出した。結果を、分散液の吸光度とともに、下記の
表６に示した。

【００４２】

【表６】

【００４３】上記の表６の結果からも明らかなように、
リポソ―ム分散液における脂質濃度が４．０ｇ／ｄｌを
超える高い濃度になると、リポソ―ム分散液自体の吸光
度が大きくなつてくるために、エンドトキシンの測定値
に誤差が生じやすくなり、正確さに欠けてくるものであ
ることがわかる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 リポソ―ム分散液中のエンドドキシンの
   量を合成基質法によつて測定する方法において、リポソ
   ―ム分散液を脂質濃度が４．０ｇ／ｄｌ以下となるよう
   に調整し、この調整試料について下記二種の吸光度と、
   さらに下記のブランクおよび標準液の吸光度とを測定
   し、 Ａｂｓ（処理試料） ：試料に反応試薬を添加して処理
   したものの一定波長での吸光度 Ａｂｓ（未処理試料）：試料に反応試薬と同量の水を添
   加して処理したものの一定波長での吸光度 Ａｂｓ（ブランク） ：減菌水に反応試薬を添加して処
   理したものの一定波長での吸光度 Ａｂｓ（標準液） ：既知量のエンドトキシンを含む
   水を標準液とし、これに反応試薬を添加して処理したも
   のの一定波長での吸光度 これらの測定値を用いて、リポソ―ム分散液からなる検
   体中のエンドトキシンの濃度（Ｃ）を、下記の式： にしたがつて、算出することを特徴とするリポソ―ム分
   散液中のエンドトキシンの測定方法。