JPH0827281B2 - Ｄｎａの簡易検出法 - Google Patents
Ｄｎａの簡易検出法Info
- Publication number
- JPH0827281B2 JPH0827281B2 JP62142157A JP14215787A JPH0827281B2 JP H0827281 B2 JPH0827281 B2 JP H0827281B2 JP 62142157 A JP62142157 A JP 62142157A JP 14215787 A JP14215787 A JP 14215787A JP H0827281 B2 JPH0827281 B2 JP H0827281B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- detecting
- labeled
- fluorescence
- compound
- Prior art date
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はDNAの簡易検出法に関する。更に詳しくは、
標識DNAを用いるDNAの簡易検出法に関する。
標識DNAを用いるDNAの簡易検出法に関する。
〔従来の技術〕及び〔発明が解決しようとする問題点〕 分子生物学や遺伝子工学の分野で、目的とするDNA断
片あるいはそのDNAを含んだ菌体を検出することは、欠
かすことが出来ない重要な手法である。
片あるいはそのDNAを含んだ菌体を検出することは、欠
かすことが出来ない重要な手法である。
そのために、予め標識となるDNAを種々の方法で標識
し、それをプローブ（釣り針）として、多種のDNAが混
在しているものとの間でハイブリッドを形成させ（ハイ
ブリダイゼーション）、そのプローブと相補するもの、
すなわち同種のDNAを釣り上げる方法がとられている。
菌体の場合は、同種のDNAを含む菌体を釣り上げること
になる。
し、それをプローブ（釣り針）として、多種のDNAが混
在しているものとの間でハイブリッドを形成させ（ハイ
ブリダイゼーション）、そのプローブと相補するもの、
すなわち同種のDNAを釣り上げる方法がとられている。
菌体の場合は、同種のDNAを含む菌体を釣り上げること
になる。
DNAの標識法としては、放射性同位元素（RI）を用い
る方法が感度も良く多く使われているが、その安全性や
廃棄の問題から、設備上及び使用上の制限も多い。
る方法が感度も良く多く使われているが、その安全性や
廃棄の問題から、設備上及び使用上の制限も多い。
そこで最近では、非放射性の標識として、DNAを修飾
して抗原抗体反応によりある種の酵素を結合させ、発色
基質により検出する方法、あるいは数段の化学反応によ
り発色基質をつけ、それによる検出方法等が行われてい
るが、いずれの場合も工程が数段に及び煩雑さを伴う。
して抗原抗体反応によりある種の酵素を結合させ、発色
基質により検出する方法、あるいは数段の化学反応によ
り発色基質をつけ、それによる検出方法等が行われてい
るが、いずれの場合も工程が数段に及び煩雑さを伴う。
そこで本発明者は、上記問題点を解決するため鋭意検
討を行った結果、蛍光色素化合物を用いてDNAを標識す
ることを見出し、本発明に至った。
討を行った結果、蛍光色素化合物を用いてDNAを標識す
ることを見出し、本発明に至った。
従って、本発明はDNAの簡易検出法に係り、このDNAの
簡易検出法は、標識DNAをプローブとして用い、検出さ
るべきDNAとの間にハイブリッドを形成させた後に検出
を行うDNAの検出法において、標識DNAとして、スペーサ
ー化合物を介して蛍光色素化合物をイオン結合させたDN
Aを用い、蛍光により検出を行うことを特徴とする。
簡易検出法は、標識DNAをプローブとして用い、検出さ
るべきDNAとの間にハイブリッドを形成させた後に検出
を行うDNAの検出法において、標識DNAとして、スペーサ
ー化合物を介して蛍光色素化合物をイオン結合させたDN
Aを用い、蛍光により検出を行うことを特徴とする。
蛍光色素化合物をDNAの末端に直接結合させた場合、
得られた標識DNAの感度に懸念が残るので、スペーサー
を介してDNAのリン酸基部分にイオン結合で結合させ、
それをプローブとして目的のDNAを検出する。
得られた標識DNAの感度に懸念が残るので、スペーサー
を介してDNAのリン酸基部分にイオン結合で結合させ、
それをプローブとして目的のDNAを検出する。
スペーサーとしては、アミノ基含有４級アンモニウム
塩が用いられ、例えば一般式 で表わされるもの、具体的には２−アミノエチルトリメ
チルアンモニウムクロライド（AETA）などが用いられ
る。
塩が用いられ、例えば一般式 で表わされるもの、具体的には２−アミノエチルトリメ
チルアンモニウムクロライド（AETA）などが用いられ
る。
蛍光色素化合物としては、次式 で表わされるフルオレセインイソチオシアネート（FIT
C）の様なアミノ基指向性のイソチオシアネート基含有
化合物が用いられる。
C）の様なアミノ基指向性のイソチオシアネート基含有
化合物が用いられる。
スペーサーと蛍光色素化合物とは、pH9.0以上のアル
カリ側で、室温下、１時間位で容易に反応し、次式の蛍
光標識FITC−AETAとなる。
カリ側で、室温下、１時間位で容易に反応し、次式の蛍
光標識FITC−AETAとなる。
（式中、Ｆは前記式（２）におけるフルオレセイン部分
を表す） この蛍光標識を、標識となるDNAと室温で約半日間pH
約8.0付近に保持しつつ混合すると、DNAのリン酸基とイ
オン結合を起こし、標識DNAを生成する。
を表す） この蛍光標識を、標識となるDNAと室温で約半日間pH
約8.0付近に保持しつつ混合すると、DNAのリン酸基とイ
オン結合を起こし、標識DNAを生成する。
目的とするDNAの検出は、通常のサザンハイブリダイ
ゼーションあるいはコロニーハイブリダイゼーションを
行った後、蛍光による検出、一般には蛍光顕微鏡で蛍光
を発しているものを選んで行われる。
ゼーションあるいはコロニーハイブリダイゼーションを
行った後、蛍光による検出、一般には蛍光顕微鏡で蛍光
を発しているものを選んで行われる。
FITCの場合、励起波長（490nm）と蛍光波長（520nm）
が近いので、390nmの光をあてて観察する。
が近いので、390nmの光をあてて観察する。
FITC以外のイソチオシアネート基含有蛍光色素化合物
としては、次式 で表わされるテトラメチル ローダミン イソチオシア
ネート（TRITC）等が挙げられる。
としては、次式 で表わされるテトラメチル ローダミン イソチオシア
ネート（TRITC）等が挙げられる。
〔発明の効果〕 イソシアネート基含有蛍光色素化合物をアミノ基含有
４級アンモニウム塩化合物スペーサーを介してイオン結
合法でDNAに結合させ、標識DNAとして用いることによ
り、目的のDNAの検出の工程が簡略化され、多数検体を
簡便に検出することが出来る。
４級アンモニウム塩化合物スペーサーを介してイオン結
合法でDNAに結合させ、標識DNAとして用いることによ
り、目的のDNAの検出の工程が簡略化され、多数検体を
簡便に検出することが出来る。
大腸菌pBR322由来の、プラスミドpEH5（9.1 Kb.TcR）
の塩基配列の分った部分について合成オリゴヌクレオチ
ドによる変異を与えた。変異を与えられたプラスミドを
選択するために、サンプルをCaCl2法により大腸菌に形
質転換し、プレート上にコロニーを形成させた。
の塩基配列の分った部分について合成オリゴヌクレオチ
ドによる変異を与えた。変異を与えられたプラスミドを
選択するために、サンプルをCaCl2法により大腸菌に形
質転換し、プレート上にコロニーを形成させた。
標識DNAとして、変異を与えた合成オリゴヌクレオチ
ドに前記式（３）のFITC−AETAで標識した。
ドに前記式（３）のFITC−AETAで標識した。
合成オリゴヌクレオチド中の、リン酸基８〜10個当
り、FITC1個となるように、FITC−AETAを用いた。
り、FITC1個となるように、FITC−AETAを用いた。
この標識DNAをプローブとして、コロニーハイブリダ
イゼーションを常法により行った後、蛍光顕微鏡で検出
し、光っているコロニーを選んだ。それらのコロニーか
らプラスミドを抽出し、塩基配列を調べたところ変異が
与えられていることが分った。
イゼーションを常法により行った後、蛍光顕微鏡で検出
し、光っているコロニーを選んだ。それらのコロニーか
らプラスミドを抽出し、塩基配列を調べたところ変異が
与えられていることが分った。
Claims (2)
- 【請求項１】標識DNAをプローブとして用い、検出さる
べきDNAとの間にハイブリッドを形成させた後に検出を
行うDNAの検出法において、標識DNAとして、スペーサー
化合物としてのアミノ基含有４級アンモニウム塩化合物
を介してイソシアネート基含有蛍光色素化合物をイオン
結合させたDNAを用い、蛍光により検出を行うことを特
徴とするDNAの簡易検出法。 - 【請求項２】蛍光による検出が蛍光顕微鏡を用いて行わ
れる特許請求の範囲第１項記載のDNAの簡易検出法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62142157A JPH0827281B2 (ja) | 1987-06-09 | 1987-06-09 | Ｄｎａの簡易検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62142157A JPH0827281B2 (ja) | 1987-06-09 | 1987-06-09 | Ｄｎａの簡易検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS63307362A JPS63307362A (ja) | 1988-12-15 |
| JPH0827281B2 true JPH0827281B2 (ja) | 1996-03-21 |
Family
ID=15308688
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62142157A Expired - Lifetime JPH0827281B2 (ja) | 1987-06-09 | 1987-06-09 | Ｄｎａの簡易検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0827281B2 (ja) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4489165A (en) * | 1983-01-24 | 1984-12-18 | Becton Dickinson And Company | Chromogenic tracers for use in an assay |
| EP0187332B1 (en) * | 1985-01-10 | 1989-02-01 | Molecular Diagnostics, Inc. | Photochemical method of labelling nucleic acids for detection in hybridization assays |
-
1987
- 1987-06-09 JP JP62142157A patent/JPH0827281B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS63307362A (ja) | 1988-12-15 |
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