JPH08208691A - オリゴペプチド接合体 - Google Patents
オリゴペプチド接合体Info
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Abstract
(57)【要約】 (修正有)
【課題】 生理的液体、特に血液における骨Glaタン
パク質(BGP)の検出試薬の提供。 【解決手段】 hBGPに対する特異抗体に対して、h
BGPと競争することのできるオリゴペプチドであっ
て、以下のhBGPのアミノ酸配列 Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val (ただし、前記オリゴペプチドの末端配列が前記hBG
P配列の末端アミノ酸を含み、かつ、Phe、Tyr、
Glu又はGlaのいずれでもないアミノ酸は1個まで
しか置換できないという条件の下で、前記配列の3個ま
でのアミノ酸が他のアミノ酸に置き換えられて前記オリ
ゴペプチドを構成していてもよい)のアミノ酸10個から
16個までのアミノ酸配列を含んでなるオリゴペプチドを
hBGPについての診断分析において有用な検出可能な
シグナルを提供できる標識と接合せしめてなるが、ただ
し、前記オリゴペプチドがGly Phe Gln Glu Ala Tyr Ar
g Arg Phe Tyr Gly Pro Val から成り、且つ放射性沃素
標識されている場合を除く、前記オリゴペプチドの接合
体。
パク質(BGP)の検出試薬の提供。 【解決手段】 hBGPに対する特異抗体に対して、h
BGPと競争することのできるオリゴペプチドであっ
て、以下のhBGPのアミノ酸配列 Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val (ただし、前記オリゴペプチドの末端配列が前記hBG
P配列の末端アミノ酸を含み、かつ、Phe、Tyr、
Glu又はGlaのいずれでもないアミノ酸は1個まで
しか置換できないという条件の下で、前記配列の3個ま
でのアミノ酸が他のアミノ酸に置き換えられて前記オリ
ゴペプチドを構成していてもよい)のアミノ酸10個から
16個までのアミノ酸配列を含んでなるオリゴペプチドを
hBGPについての診断分析において有用な検出可能な
シグナルを提供できる標識と接合せしめてなるが、ただ
し、前記オリゴペプチドがGly Phe Gln Glu Ala Tyr Ar
g Arg Phe Tyr Gly Pro Val から成り、且つ放射性沃素
標識されている場合を除く、前記オリゴペプチドの接合
体。
Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明はオリゴペプチド接合
体に関する。骨Glaタンパク質(BGP)またはγ−
カルボキシグルタミン酸を含むタンパク質として以下に
参照するビタミンK依存性骨タンパク質に関して、増加
しつつある知見があり、感度の良い、特異性が増加した
分析が要求される。すなわち抗体が用いられる場合、興
味あるタンパク質に特異的である抗体および興味あるタ
ンパク質およびその部位、および他のタンパク質間の実
質的に異なる結合親和力をもつ、特に限定されたタンパ
ク質領域が必要である。結合親和力が大であれば、ある
ほど、すべての他の物が同一であるとき、分析の感度は
高くなる。
体に関する。骨Glaタンパク質(BGP)またはγ−
カルボキシグルタミン酸を含むタンパク質として以下に
参照するビタミンK依存性骨タンパク質に関して、増加
しつつある知見があり、感度の良い、特異性が増加した
分析が要求される。すなわち抗体が用いられる場合、興
味あるタンパク質に特異的である抗体および興味あるタ
ンパク質およびその部位、および他のタンパク質間の実
質的に異なる結合親和力をもつ、特に限定されたタンパ
ク質領域が必要である。結合親和力が大であれば、ある
ほど、すべての他の物が同一であるとき、分析の感度は
高くなる。
【0002】
【従来の技術】プライスらによって、文献の要約が米国
骨およびミネラル研究学会1979年6月に報告された。プ
ライスおよびニシモト、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7
7 巻:2234−2238ページ(1981)およびプライスら.、
J. Clin. Invest. 66 巻: 878−883 ページ(1980)
は、無傷BGP分子から誘導された標識および抗体を利
用するラジオイムノアッセイを記載している。デフトス
らは、(Calcif. Tissue Int. 、34巻: 121−124 ペー
ジ(1982))骨疾患の治療中、BGPにおける変化の臨
床的測定に付いて報告している。前述の参考文献におい
て、引用した文献にも注目すべきである。係属中米国特
許出願第 246,972号は、BGPに対するイムノアッセイ
における試薬として、少なくても20アミノ酸のBGPの
断片の使用を示唆する。
骨およびミネラル研究学会1979年6月に報告された。プ
ライスおよびニシモト、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 7
7 巻:2234−2238ページ(1981)およびプライスら.、
J. Clin. Invest. 66 巻: 878−883 ページ(1980)
は、無傷BGP分子から誘導された標識および抗体を利
用するラジオイムノアッセイを記載している。デフトス
らは、(Calcif. Tissue Int. 、34巻: 121−124 ペー
ジ(1982))骨疾患の治療中、BGPにおける変化の臨
床的測定に付いて報告している。前述の参考文献におい
て、引用した文献にも注目すべきである。係属中米国特
許出願第 246,972号は、BGPに対するイムノアッセイ
における試薬として、少なくても20アミノ酸のBGPの
断片の使用を示唆する。
【0003】
【課題を解決するための手段】本発明に従えば、hBG
Pに対する特異抗体に対して、hBGPと競争すること
のできるオリゴペプチドであって、以下のhBGPのア
ミノ酸配列 Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val (ただし、前記オリゴペプチドの末端配列が前記hBG
P配列の末端アミノ酸を含み、かつ、Phe、Tyr、
Glu又はGlaのいずれでもないアミノ酸は1個まで
しか置換できないという条件の下で、前記配列の3個ま
でのアミノ酸が他のアミノ酸に置き換えられて前記オリ
ゴペプチドを構成していてもよい)のアミノ酸10個から
16個までのアミノ酸配列を含んでなるオリゴペプチドを
hBGPについての診断分析において有用な検出可能な
シグナルを提供できる標識と接合せしめてなるオリゴペ
プチドの接合体が提供される。
Pに対する特異抗体に対して、hBGPと競争すること
のできるオリゴペプチドであって、以下のhBGPのア
ミノ酸配列 Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val (ただし、前記オリゴペプチドの末端配列が前記hBG
P配列の末端アミノ酸を含み、かつ、Phe、Tyr、
Glu又はGlaのいずれでもないアミノ酸は1個まで
しか置換できないという条件の下で、前記配列の3個ま
でのアミノ酸が他のアミノ酸に置き換えられて前記オリ
ゴペプチドを構成していてもよい)のアミノ酸10個から
16個までのアミノ酸配列を含んでなるオリゴペプチドを
hBGPについての診断分析において有用な検出可能な
シグナルを提供できる標識と接合せしめてなるオリゴペ
プチドの接合体が提供される。
【0004】本発明に使用するオリゴペプチドは、BG
Pに対して高度に特異抗体の調製用ハプテンとして用い
ることができる。特に、オリゴペプチドは、アミノ酸約
10〜16個からなり、天然に起こるPGBのような実質的
に同じアミノ酸もしくは同じアミノ酸配列をもつ。それ
らは、抗体調製のために用いられ、感度の良いイムノア
ッセイにおいて、標識化試薬として用いられる。
Pに対して高度に特異抗体の調製用ハプテンとして用い
ることができる。特に、オリゴペプチドは、アミノ酸約
10〜16個からなり、天然に起こるPGBのような実質的
に同じアミノ酸もしくは同じアミノ酸配列をもつ。それ
らは、抗体調製のために用いられ、感度の良いイムノア
ッセイにおいて、標識化試薬として用いられる。
【0005】新規オリゴペプチドは、生理学的液、特に
血液における骨Glaタンパク質の検出(前にビタミン
K依存性タンパク質として記載された、BGP)につい
ての試薬の調製および試薬としての使用に提供される。
血液における骨Glaタンパク質の検出(前にビタミン
K依存性タンパク質として記載された、BGP)につい
ての試薬の調製および試薬としての使用に提供される。
【0006】BGPの高血液レベルは、高骨転換によっ
て特徴づけられる疾患を示しうる。従って、血液におけ
るBGPの量および期間中BGPの濃度変化、特に骨疾
患に対する治療前および後、を検出できるように、定量
的方法でBGPを検出することを可能にせしめるのは重
要である。
て特徴づけられる疾患を示しうる。従って、血液におけ
るBGPの量および期間中BGPの濃度変化、特に骨疾
患に対する治療前および後、を検出できるように、定量
的方法でBGPを検出することを可能にせしめるのは重
要である。
【0007】この発明の化合物は、BGPの域として実
質的に同じまたは同じアミノ酸配列をもつオリゴペプチ
ドである。BGPの部分にのみよく似ているオリゴペプ
チドを得ることによって、抗体が得られ、BGPおよび
交差−反応性に似ておりその域、に非常に特異的であ
り、高い結合力価を提供する。
質的に同じまたは同じアミノ酸配列をもつオリゴペプチ
ドである。BGPの部分にのみよく似ているオリゴペプ
チドを得ることによって、抗体が得られ、BGPおよび
交差−反応性に似ておりその域、に非常に特異的であ
り、高い結合力価を提供する。
【0008】参考目的のために、ヒトBGP(hBG
P)の構造を示す。オリゴペプチドは、この分子の断片
として引用されうる。次にhBGPのアミノ酸配列を示
す。
P)の構造を示す。オリゴペプチドは、この分子の断片
として引用されうる。次にhBGPのアミノ酸配列を示
す。
【0009】 Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val 大部分、使用に見られるオリゴペプチドは、アミノ酸10
個から16個であり、もっと通常では、アミノ酸10個から
15個であり、好ましくは約12個から15個のアミノ酸であ
る。それらの断片をつないだオリゴペプチドを用いるこ
とが望ましいのであるが、配列は、通常アミノ酸断片1
−15;15−30;および35−49内にある。大部分、オリゴ
ペプチドは、hBGPの同一なアミノ酸配列をもち、し
かし特別な状況では、1つもしくはそれ以上のアミノ酸
が置換される。たとえば、芳香族アミノ酸が変化させら
れ、すなわちチロシンがフェニルアラニンによってまた
はその逆で、置換される。グルタミン酸もγ−カルボキ
シグルタミン酸で置換されうる。1つのアミノ酸は、オ
リゴペプチドの性質を変えるために異なったアミノ酸に
よって置換されうる。たとえば、チロシンは、酸化感受
性または、特別な連結グループ、特に活性なアゾ作用性
(官能基)をもつグループ、との接合を促進するための
逆置換を減少するためにフェニルアラニンによって置換
される。
個から16個であり、もっと通常では、アミノ酸10個から
15個であり、好ましくは約12個から15個のアミノ酸であ
る。それらの断片をつないだオリゴペプチドを用いるこ
とが望ましいのであるが、配列は、通常アミノ酸断片1
−15;15−30;および35−49内にある。大部分、オリゴ
ペプチドは、hBGPの同一なアミノ酸配列をもち、し
かし特別な状況では、1つもしくはそれ以上のアミノ酸
が置換される。たとえば、芳香族アミノ酸が変化させら
れ、すなわちチロシンがフェニルアラニンによってまた
はその逆で、置換される。グルタミン酸もγ−カルボキ
シグルタミン酸で置換されうる。1つのアミノ酸は、オ
リゴペプチドの性質を変えるために異なったアミノ酸に
よって置換されうる。たとえば、チロシンは、酸化感受
性または、特別な連結グループ、特に活性なアゾ作用性
(官能基)をもつグループ、との接合を促進するための
逆置換を減少するためにフェニルアラニンによって置換
される。
【0010】特に興味のあるのは、以下の5個のオリゴ
ペプチドであり、最後のオリゴペプチドは、特に興味が
ある:hBGP1-11または1-12、hBGP15-30 または
16-30 、およびhBGP37-49 。
ペプチドであり、最後のオリゴペプチドは、特に興味が
ある:hBGP1-11または1-12、hBGP15-30 または
16-30 、およびhBGP37-49 。
【0011】本発明のオリゴペプチドは、合成、メリフ
ィールド法を用いること、手動でまたは市販で手に入る
機械のようないろいろの方法で、合成される。調製され
るオリゴペプチドの方法は、本発明に重大ではなく、ど
のような好都合な方法を用いてもよい。
ィールド法を用いること、手動でまたは市販で手に入る
機械のようないろいろの方法で、合成される。調製され
るオリゴペプチドの方法は、本発明に重大ではなく、ど
のような好都合な方法を用いてもよい。
【0012】オリゴペプチドの目的に依存して、4個ま
でのアミノ酸は、通常3以上でなくしかし1以上でなく
変化させられ、フェニルアラニンより他のチロシンにま
たは反対に、またはγ−カルボキシ基についてのグルタ
ミン酸に変化する。二つの同様の構造の芳香族アミノ酸
は、交換され、そしていくつかの例では、置換は全体的
に異なるアミノ酸が含まれうる。実例となる変更には、
(Tyr15)hBGP15-30 、(Phe1,3 )hBGP
1-12、および(Tyr37,Phe42,46 )hBGP
37-49 、および(Tyr15,Glu21,24 )hBGP
15-30 が含まれる。
でのアミノ酸は、通常3以上でなくしかし1以上でなく
変化させられ、フェニルアラニンより他のチロシンにま
たは反対に、またはγ−カルボキシ基についてのグルタ
ミン酸に変化する。二つの同様の構造の芳香族アミノ酸
は、交換され、そしていくつかの例では、置換は全体的
に異なるアミノ酸が含まれうる。実例となる変更には、
(Tyr15)hBGP15-30 、(Phe1,3 )hBGP
1-12、および(Tyr37,Phe42,46 )hBGP
37-49 、および(Tyr15,Glu21,24 )hBGP
15-30 が含まれる。
【0013】なぜならば、本発明のオリゴペプチドは、
天然に存在するタンパク質よりも非常に小さく、容易に
合成方法によって合成される。このようにして、非常に
高収量の生成物が得られ、生理学的液体におけるBGP
を測定するための方法の展開でハプテンとして用いられ
る。更に、鎖における1つもしくはそれ以上のアミノ酸
は、置換され、望ましいエピトープ位特異性は、保た
れ、一方オリゴペプチドは、安定性、接合の容易、交差
反応性における減少および類似物のような変化した性質
を提供する。
天然に存在するタンパク質よりも非常に小さく、容易に
合成方法によって合成される。このようにして、非常に
高収量の生成物が得られ、生理学的液体におけるBGP
を測定するための方法の展開でハプテンとして用いられ
る。更に、鎖における1つもしくはそれ以上のアミノ酸
は、置換され、望ましいエピトープ位特異性は、保た
れ、一方オリゴペプチドは、安定性、接合の容易、交差
反応性における減少および類似物のような変化した性質
を提供する。
【0014】本発明のオリゴペプチドはハプテンとして
の使用が見られる。ハプテンは、抗体の産生のための接
合を提供する免疫原と接合しうるか;またはハプテン
は、適当な標識で標識され、BGPに対する分析におけ
るハプテンの分析の検出を可能にせしめる。
の使用が見られる。ハプテンは、抗体の産生のための接
合を提供する免疫原と接合しうるか;またはハプテン
は、適当な標識で標識され、BGPに対する分析におけ
るハプテンの分析の検出を可能にせしめる。
【0015】免疫原接合体を調製するにおいて、広範囲
にわたる方法が用いられる。免疫原およびオリゴペプチ
ドの両方での有用なアミノ酸に関して、グルタルアルデ
ヒドのような二作用性試薬を用いる。任意にもっと特異
な連結基として、カルボキシベンゼンジアゾスルフォネ
ート、パラ−マレイミド安息香酸、または他の慣例上連
結基のようなものが用いられる。
にわたる方法が用いられる。免疫原およびオリゴペプチ
ドの両方での有用なアミノ酸に関して、グルタルアルデ
ヒドのような二作用性試薬を用いる。任意にもっと特異
な連結基として、カルボキシベンゼンジアゾスルフォネ
ート、パラ−マレイミド安息香酸、または他の慣例上連
結基のようなものが用いられる。
【0016】特別な免疫原と同じく免疫原に接合するオ
リゴペプチドの特別な方法は、本発明にとって重要でな
い。いろいろの慣例的免疫原が用いられ、免疫原は、注
入された特別のホストに存在する。ありふれている免疫
原としては、牛血清アルブミン、牛ガンマグロブリン、
ウサギ血清アルブミン、キイホールリンペットヘモシア
ニンなどが含まれる。
リゴペプチドの特別な方法は、本発明にとって重要でな
い。いろいろの慣例的免疫原が用いられ、免疫原は、注
入された特別のホストに存在する。ありふれている免疫
原としては、牛血清アルブミン、牛ガンマグロブリン、
ウサギ血清アルブミン、キイホールリンペットヘモシア
ニンなどが含まれる。
【0017】望ましいポリクロナルもしくはモノクロナ
ルのいずれかに依存して、異なるホストが注入される。
モノクロナル抗体の調製のために、特に米国特許第 4,1
96,265号および同第 4,172,124号:コーラーおよびミル
スタイン、Nature(1975)、365巻: 495−479 ページ
およびケネット編集、モノクロナル抗体−ハイブリドー
マ:生物学的分析における新しい要素、プレナムプレ
ス.N.Y.1980を参照する。
ルのいずれかに依存して、異なるホストが注入される。
モノクロナル抗体の調製のために、特に米国特許第 4,1
96,265号および同第 4,172,124号:コーラーおよびミル
スタイン、Nature(1975)、365巻: 495−479 ページ
およびケネット編集、モノクロナル抗体−ハイブリドー
マ:生物学的分析における新しい要素、プレナムプレ
ス.N.Y.1980を参照する。
【0018】抗体に関連して、標識化ハプテンは、イム
ノアッセイに用いられる。広範囲にわたる標識として、
放射能核種酵素、螢光体、磁気粒子、安定な遊離ラジカ
ル、化学ルミネッセンス体などが用いられる。実例の標
識には、 125I、 3H、フルオレセイン、ダンシル、ロ
ダミン、アクリジン、ホースラデッシュパーオキシダー
ゼ、アミラーゼ、ライソザイム、グルコース−6−ホス
フェネートデヒドロゲナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、
などが含まれる。これらのいろいろの標識を用いる方法
は、米国特許 Re 29,169; Re 29,955; 3,654,090;
3,690,834; 3,817,837; 3,867,517; 3,935,074; 3,
975,511; 3,996,345;および 4,020,151号に見られ
る。これらの参照は、特許文献において報告されたイム
ノアッセイの広範囲の多様性の例証のみである。
ノアッセイに用いられる。広範囲にわたる標識として、
放射能核種酵素、螢光体、磁気粒子、安定な遊離ラジカ
ル、化学ルミネッセンス体などが用いられる。実例の標
識には、 125I、 3H、フルオレセイン、ダンシル、ロ
ダミン、アクリジン、ホースラデッシュパーオキシダー
ゼ、アミラーゼ、ライソザイム、グルコース−6−ホス
フェネートデヒドロゲナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、
などが含まれる。これらのいろいろの標識を用いる方法
は、米国特許 Re 29,169; Re 29,955; 3,654,090;
3,690,834; 3,817,837; 3,867,517; 3,935,074; 3,
975,511; 3,996,345;および 4,020,151号に見られ
る。これらの参照は、特許文献において報告されたイム
ノアッセイの広範囲の多様性の例証のみである。
【0019】いろいろの標識への接合の方法は、特別の
標識の性質に依存する。いくつかの例において、オリゴ
ペプチドまたは標識のどちらかが他のものと反応するた
めに、活性化するように、標識は、単作用性である。他
の例において、オリゴペプチドを活性化するにもっと好
都合であるように、標識は重作用性、たとえば酵素であ
る。これらの例の多くにおいて先に記述したように、特
殊化試薬を用いることが望ましい。放射性核種を連結す
るために、チロシンは放射活性ヨー化物のようなヨー化
剤およびラクトパーオキシダーゼを用いて標識化され
る。
標識の性質に依存する。いくつかの例において、オリゴ
ペプチドまたは標識のどちらかが他のものと反応するた
めに、活性化するように、標識は、単作用性である。他
の例において、オリゴペプチドを活性化するにもっと好
都合であるように、標識は重作用性、たとえば酵素であ
る。これらの例の多くにおいて先に記述したように、特
殊化試薬を用いることが望ましい。放射性核種を連結す
るために、チロシンは放射活性ヨー化物のようなヨー化
剤およびラクトパーオキシダーゼを用いて標識化され
る。
【0020】標識の性質に依存する既知の方法に基づい
て、分析は行なわれる。いろいろの方法は、標識化オリ
ゴペプチドとBGPが測定される試料における抗−BG
Pに結合するためのBGP分析物との間の競争が含まれ
る。BGPが分析されうる興味あるいろいろ生理学的液
体には、血清、血漿、尿、脳脊髄液、羊水および唾液が
含まれる。前述の生物学的液に加えて、抽出液、特に
骨、歯および病理学的石灰化(変位石灰化または動脈硬
化)のようなヒト組織からの酸抽出物も興味ある。
て、分析は行なわれる。いろいろの方法は、標識化オリ
ゴペプチドとBGPが測定される試料における抗−BG
Pに結合するためのBGP分析物との間の競争が含まれ
る。BGPが分析されうる興味あるいろいろ生理学的液
体には、血清、血漿、尿、脳脊髄液、羊水および唾液が
含まれる。前述の生物学的液に加えて、抽出液、特に
骨、歯および病理学的石灰化(変位石灰化または動脈硬
化)のようなヒト組織からの酸抽出物も興味ある。
【0021】分析を実施する場合、分析物標識化オリゴ
ペプチドおよびオリゴペプチドへの抗体(抗−オリゴペ
プチド)を含む試料を、水性緩衝化媒質、通常はpHの範
囲約6〜9で、いっしょにし、測定される分析媒質と抗
体との間に標識化オリゴペプチドの分配化をさせる。
ペプチドおよびオリゴペプチドへの抗体(抗−オリゴペ
プチド)を含む試料を、水性緩衝化媒質、通常はpHの範
囲約6〜9で、いっしょにし、測定される分析媒質と抗
体との間に標識化オリゴペプチドの分配化をさせる。
【0022】分析プロトコールおよび試薬の性質に依存
して、分離(“異質”)または非分離(“同質”)段階
が含まれる。相違は、標識化試薬への抗体の結合が試薬
から得られたシグナルに影響するかどうかに依存する。
たとえば、放射性核種は、結合と未結合標識との分別を
必要とし、一方螢光標識は、分別段階を必要とするかも
しくは必要としない。
して、分離(“異質”)または非分離(“同質”)段階
が含まれる。相違は、標識化試薬への抗体の結合が試薬
から得られたシグナルに影響するかどうかに依存する。
たとえば、放射性核種は、結合と未結合標識との分別を
必要とし、一方螢光標識は、分別段階を必要とするかも
しくは必要としない。
【0023】分析を実施するに、化合物の添加の順序
は、異なりうる。すべての物質を同時にいっしょにする
かまたは試料をまず初めに抗−オリゴペプチドと結合さ
せ、次いで標識化オリゴペプチドを加える。培養段階
は、いろいろの添加間に含まれ、通常は5分間より少な
くなく約7日間以上であることはない。率または平衡測
定のどちらかが含まれうる。
は、異なりうる。すべての物質を同時にいっしょにする
かまたは試料をまず初めに抗−オリゴペプチドと結合さ
せ、次いで標識化オリゴペプチドを加える。培養段階
は、いろいろの添加間に含まれ、通常は5分間より少な
くなく約7日間以上であることはない。率または平衡測
定のどちらかが含まれうる。
【0024】試料および試薬を結合させた後、標識化オ
リゴペプチドに結合した抗−オリゴペプチドは、未結合
標識化オリゴペプチドから分離し、異質(不均一)分析
が含まれ、シグナルは標識の性質にもとづいて標識から
測定される。分別が要求されない場合、シグナルは分析
媒質から直接に測定される。測定される放射線に依存し
て、ガンマカウンター、シンチレーションカウンター、
分光測定器、螢光測定器または類似物が用いられる。
リゴペプチドに結合した抗−オリゴペプチドは、未結合
標識化オリゴペプチドから分離し、異質(不均一)分析
が含まれ、シグナルは標識の性質にもとづいて標識から
測定される。分別が要求されない場合、シグナルは分析
媒質から直接に測定される。測定される放射線に依存し
て、ガンマカウンター、シンチレーションカウンター、
分光測定器、螢光測定器または類似物が用いられる。
【0025】次に実施例は、本発明を例示しており、本
発明を制限するものではない。
発明を制限するものではない。
【0026】実験 1.オリゴペプチドの調製 本発明の13アミノ酸オリゴペプチドは、バラニイおよび
メリフィールドに記載された固体相方法(“ペプチド、
分析、合成、生理学”における固体相ペプチド合成、ペ
プチド合成における特別な方法、パートA、2巻、グロ
スおよびメレンホーファー編集、アカデミックプレス、
ニューヨーク、1980, 1−284 ページ)を用いて合成す
る。
メリフィールドに記載された固体相方法(“ペプチド、
分析、合成、生理学”における固体相ペプチド合成、ペ
プチド合成における特別な方法、パートA、2巻、グロ
スおよびメレンホーファー編集、アカデミックプレス、
ニューヨーク、1980, 1−284 ページ)を用いて合成す
る。
【0027】2.オリゴペプチドに対する抗体の調製 オリゴペプチドhBGP37-49 ( 1.5mg)は、室温で、
1−エチルジメチル−アミノプロピルカルボジイミド
( 250μg)の2添加を用いて、リン酸緩衝化塩化ナト
リウムにおいてキイホールリンペットヘモシアニン(
1.8mg)と接合させる。24時間後、物質を水に対して透
析する。ウサギは不完全フロインドアジュバンドにおけ
る精製した免疫原(50μg)の毎月の多位皮内注射によ
って免疫化する。抗体は中心耳動脈から採血した血液試
料から得られる。
1−エチルジメチル−アミノプロピルカルボジイミド
( 250μg)の2添加を用いて、リン酸緩衝化塩化ナト
リウムにおいてキイホールリンペットヘモシアニン(
1.8mg)と接合させる。24時間後、物質を水に対して透
析する。ウサギは不完全フロインドアジュバンドにおけ
る精製した免疫原(50μg)の毎月の多位皮内注射によ
って免疫化する。抗体は中心耳動脈から採血した血液試
料から得られる。
【0028】3.放射標識化オリゴペプチドの調製 オリゴペプチドhBGP37-49 ( 0.5μg)を、β−D
−グルコース(2μmole)およびグルコースオキシダー
ゼ(0.64ng; 125U/mg)の存在下にラクトパーオキシ
ダーゼ(2μg)によってNaI(1mCi 125I)を用
いて0.05Mリン酸緩衝液でヨウ素化する。混合物を室温
で15分間放置後、全量1mlに希釈し、トリクロロ酢酸
(6重量%)および燐タングステン酸(0.25重量%)に
おいてチトクロームC( 100μg)とともに共沈させ
る。ペレットを洗浄し、 0.5M水酸化ナトリウム(10−
20μl)で中性化によって再溶解し、タングステン酸塩
を 0.5Mジエチレントリアミンの1容量と配位によって
複合化する。標識化ペプチドの全比活性は、 500Ci/mm
ole 以上である。溶液を25mMエタノールアミン−塩酸
(pH9.0 )で 0.5mlに希釈し、PBE94(ファーマシ
ア、ピスカタウェイ、ニュージャージィ)をつめたカラ
ム( 0.5×20cm)でのアフィニティクロマトグラフィー
を用いて、チトクロームC10mg/mlを含む25μMエタノ
ールアミン−塩酸( pH9.0)で、すべて等しく溶出する
ことによって精製する。ピーク3および4において得ら
れる物質は、ラジオイムノアッセイに用いる。
−グルコース(2μmole)およびグルコースオキシダー
ゼ(0.64ng; 125U/mg)の存在下にラクトパーオキシ
ダーゼ(2μg)によってNaI(1mCi 125I)を用
いて0.05Mリン酸緩衝液でヨウ素化する。混合物を室温
で15分間放置後、全量1mlに希釈し、トリクロロ酢酸
(6重量%)および燐タングステン酸(0.25重量%)に
おいてチトクロームC( 100μg)とともに共沈させ
る。ペレットを洗浄し、 0.5M水酸化ナトリウム(10−
20μl)で中性化によって再溶解し、タングステン酸塩
を 0.5Mジエチレントリアミンの1容量と配位によって
複合化する。標識化ペプチドの全比活性は、 500Ci/mm
ole 以上である。溶液を25mMエタノールアミン−塩酸
(pH9.0 )で 0.5mlに希釈し、PBE94(ファーマシ
ア、ピスカタウェイ、ニュージャージィ)をつめたカラ
ム( 0.5×20cm)でのアフィニティクロマトグラフィー
を用いて、チトクロームC10mg/mlを含む25μMエタノ
ールアミン−塩酸( pH9.0)で、すべて等しく溶出する
ことによって精製する。ピーク3および4において得ら
れる物質は、ラジオイムノアッセイに用いる。
【0029】4.子牛BGPの調製 BGPは、子牛骨の鉱質強化法によって、放出されたタ
ンパク質からセファデックス(登録商標)G100 (ファ
ーマシア)でのゲルろ過、ひき続いてのプライスら(PN
AS USA(1976)、73巻:1447−1451ページ)によって記
載のようにDEAE−セファデックス(登録商標)A−
25(ファーマシア)からのグレディエント溶出によって
精製される。牛BGPは、アミノ酸37−49に対するhB
GPのように同じアミノ酸配列を有する。
ンパク質からセファデックス(登録商標)G100 (ファ
ーマシア)でのゲルろ過、ひき続いてのプライスら(PN
AS USA(1976)、73巻:1447−1451ページ)によって記
載のようにDEAE−セファデックス(登録商標)A−
25(ファーマシア)からのグレディエント溶出によって
精製される。牛BGPは、アミノ酸37−49に対するhB
GPのように同じアミノ酸配列を有する。
【0030】5.放射ヨウ素化子牛BGPの調製 精製した子牛BGPは、BGP10mgと 125I1mCi とと
もに培養することによる固体状態ラクトパーオキシダー
ゼ法(ダヴィドおよびレルスフェルド、Biochemistry,
13巻:1014−1021)によって 125I(4×1018cpm /mo
le;アマーシャム)で標識化する。標識化BGPは、未
結合 125Iから分析物希釈剤(0.14M塩化ナトリウム;
0.01Mリン酸塩;25mM EDTA ; 0.1%ゲラチン; 0.1%
ツゥィーン(登録商標)20(シグマケミカルCo.,セント
ルイス.ミズィーリ),pH7.4 で)平衡化したセファデ
ックス(登録商標)G−25(ファーマシア)カラムで、
ゲルろ過で分離する。
もに培養することによる固体状態ラクトパーオキシダー
ゼ法(ダヴィドおよびレルスフェルド、Biochemistry,
13巻:1014−1021)によって 125I(4×1018cpm /mo
le;アマーシャム)で標識化する。標識化BGPは、未
結合 125Iから分析物希釈剤(0.14M塩化ナトリウム;
0.01Mリン酸塩;25mM EDTA ; 0.1%ゲラチン; 0.1%
ツゥィーン(登録商標)20(シグマケミカルCo.,セント
ルイス.ミズィーリ),pH7.4 で)平衡化したセファデ
ックス(登録商標)G−25(ファーマシア)カラムで、
ゲルろ過で分離する。
【0031】数多くの分析が、実施例2において記載の
ように調製された抗体とともにhBGP37-49 放射ヨウ
素化試薬を用いて実施される。分析は、0.25%牛血清ア
ルブミン、20mMリン酸塩、hBGP37-49 の標準を有す
る1mM. EDTAプラスBGP欠乏血漿において実施さ
れる。トレーサーの付加前3日間、および後1日培養
後、結合トレーサーは、ウサギ抗BGP抗体に対する第
二抗体を用いることによって遊離トレーサーから分離す
る。分析は、9フェムトモルBGP37-49 が検出され、
49フェムトモルで50%結合阻害を示す。精製子牛BGP
は、モル基準で、hBGP37-49 の50%反応性を与え、
ヒト骨抽出物は、BGPの高濃度( 100−300nMhBGP
37-49 /g)を示す。上皮小体機能亢進症血漿は、hB
GP37-4 9 基準に平行な結合阻害を示す。4種の分析で
検査した20名女性および20名男性の正常血漿試料は、17
%の内−分析C.V.を示し、血漿hBGPレベル(ピ
コモルhBGP37-49 ml)女性では 5.8±0.9 および男
性では 7.1±1.3 を示す。正常の上限は20ピコモル/ml
(N=103 )である。hBGPは、上皮小体機能亢進症
患者27名中16名、パゲット病患者33名中24名、および血
液透析の慢性腎不全患者15名中12名において増加する。
ように調製された抗体とともにhBGP37-49 放射ヨウ
素化試薬を用いて実施される。分析は、0.25%牛血清ア
ルブミン、20mMリン酸塩、hBGP37-49 の標準を有す
る1mM. EDTAプラスBGP欠乏血漿において実施さ
れる。トレーサーの付加前3日間、および後1日培養
後、結合トレーサーは、ウサギ抗BGP抗体に対する第
二抗体を用いることによって遊離トレーサーから分離す
る。分析は、9フェムトモルBGP37-49 が検出され、
49フェムトモルで50%結合阻害を示す。精製子牛BGP
は、モル基準で、hBGP37-49 の50%反応性を与え、
ヒト骨抽出物は、BGPの高濃度( 100−300nMhBGP
37-49 /g)を示す。上皮小体機能亢進症血漿は、hB
GP37-4 9 基準に平行な結合阻害を示す。4種の分析で
検査した20名女性および20名男性の正常血漿試料は、17
%の内−分析C.V.を示し、血漿hBGPレベル(ピ
コモルhBGP37-49 ml)女性では 5.8±0.9 および男
性では 7.1±1.3 を示す。正常の上限は20ピコモル/ml
(N=103 )である。hBGPは、上皮小体機能亢進症
患者27名中16名、パゲット病患者33名中24名、および血
液透析の慢性腎不全患者15名中12名において増加する。
【0032】1mM塩化マグネシウム、 150mM塩化ナトリ
ウムにおけるビオゲルP−30で、血漿hBGPを骨から
hBGPとともに共−溶出し、20%は、大きい血漿タン
パクと非−共有的に結合している。正常ヒト被検者の血
液におけるこの領域−特異RIAによって検出されるh
BGPは、骨におけるペプチドと同じであり、部分的に
より大きなタンパク質と非共有的に結合していると結論
づけられる。
ウムにおけるビオゲルP−30で、血漿hBGPを骨から
hBGPとともに共−溶出し、20%は、大きい血漿タン
パクと非−共有的に結合している。正常ヒト被検者の血
液におけるこの領域−特異RIAによって検出されるh
BGPは、骨におけるペプチドと同じであり、部分的に
より大きなタンパク質と非共有的に結合していると結論
づけられる。
【0033】本分析は、生理学的液体におけるBGPの
測定用の非常に感度の良い方法を提供することである。
このように骨と関連のある広範囲の疾病をもつと考えら
れる患者を、鋭敏にモニターでき、特に血漿または他の
液体におけるBGPの変動を検出できる。なぜなら、用
いられたオリゴペプチドは、実質的に、天然に存在する
タンパク質より小さく、常法によって容易に合成でき
る。付加的に、特異性の重大な損失なくオリゴペプチド
の物理的性質を増大できる。
測定用の非常に感度の良い方法を提供することである。
このように骨と関連のある広範囲の疾病をもつと考えら
れる患者を、鋭敏にモニターでき、特に血漿または他の
液体におけるBGPの変動を検出できる。なぜなら、用
いられたオリゴペプチドは、実質的に、天然に存在する
タンパク質より小さく、常法によって容易に合成でき
る。付加的に、特異性の重大な損失なくオリゴペプチド
の物理的性質を増大できる。
【0034】前述の発明は、実施例によって詳細に記載
したが、理解を明確にするためであり、本発明の範囲が
これらの実施例に限定するものではないということはい
うまでもない。
したが、理解を明確にするためであり、本発明の範囲が
これらの実施例に限定するものではないということはい
うまでもない。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 G01N 33/53 D 33/68 // A61K 35/32 39/00 H 39/395 N D 51/00
Claims (13)
- 【請求項1】 hBGPに対する特異抗体に対して、h
BGPと競争することのできるオリゴペプチドであっ
て、以下のhBGPのアミノ酸配列 Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val (ただし、前記オリゴペプチドの末端配列が前記hBG
P配列の末端アミノ酸を含み、かつ、Phe、Tyr、
Glu又はGlaのいずれでもないアミノ酸は1個まで
しか置換できないという条件の下で、前記配列の3個ま
でのアミノ酸が他のアミノ酸に置き換えられて前記オリ
ゴペプチドを構成していてもよい)のアミノ酸10個から
16個までのアミノ酸配列を含んでなるオリゴペプチドを
hBGPについての診断分析において有用な検出可能な
シグナルを提供できる標識と接合せしめてなるが、ただ
し、前記オリゴペプチドがGly Phe Gln Glu Ala TyrArg
Arg Phe Tyr Gly Pro Val から成り、且つ放射性沃素
標識されている場合を除く、前記オリゴペプチドの接合
体。 - 【請求項2】 該標識が、放射性核種である請求項1記
載の接合体。 - 【請求項3】 該放射性核種が放射性ヨウ素である請求
項2記載の接合体。 - 【請求項4】 該標識が、螢光体である請求項1記載の
接合体。 - 【請求項5】 該標識が、酵素である請求項1記載の接
合体。 - 【請求項6】 共有的に免疫原と接合し、かつhBGP
に対する特異抗体に対して、hBGPと競争することの
できるオリゴペプチドであって、以下のhBGPのアミ
ノ酸配列 Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val (ただし、前記オリゴペプチドの末端配列が前記hBG
P配列の末端アミノ酸を含み、かつ、Phe、Tyr、
Glu又はGlaのいずれでもないアミノ酸は1個まで
しか置換できないという条件の下で、前記配列の3個ま
でのアミノ酸が他のアミノ酸に置き換えられて前記オリ
ゴペプチドを構成していてもよい)のアミノ酸10個か
ら16個までのアミノ酸配列を含んでなるオリゴペプチド
を含んでなる免疫原接合体。 - 【請求項7】 該免疫原が、キイホールリンペットヘモ
シアニンである請求項6記載の免疫原結合体。 - 【請求項8】 請求項6記載の免疫原によるホストの免
疫化によって調製された抗体。 - 【請求項9】 該オリゴペプチドが Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Va
l のアミノ酸配列を有するhBGP37-49 である請求項8
記載の抗体。 - 【請求項10】 生理学的液体におけるhBGPを測定
するに当たり、 (i)hBGPに対する特異抗体に対して、hBGPと
競争することのできるオリゴペプチドであって、以下の
hBGPのアミノ酸配列 Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val のうちの以下の配列のアミノ酸フラグメント (1)Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro
Tyr Pro Asp Pro (2)Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla Leu
Asn Pro Asp Cys Asp 又は (3)Ile Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr
Gly Pro Val (ただし、前記オリゴペプチドの末端配列が前記hBG
P配列の末端アミノ酸を含み、かつ、Phe、Tyr、
Glu又はGlaのいずれでもないアミノ酸は1個まで
しか置換できないという条件の下で、前記配列の3個ま
でのアミノ酸が他のアミノ酸に置き換えられて前記オリ
ゴペプチドを構成していてもよい)の配列を有するアミ
ノ酸10個から16個までのアミノ酸配列を含んでなるオリ
ゴペプチドの免疫原接合体でホストを免疫化することに
よって調製される抗体並びに(ii)共有的に免疫源を接
合し、かつhBGPに対する特異抗体に対して、hBG
Pと競争することのできるオリゴペプチドであって、以
下のhBGPのアミノ酸配列 Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val (ただし、前記オリゴペプチドの末端配列が前記hBG
P配列の末端アミノ酸を含み、かつ、Phe、Tyr、
Glu又はGlaのいずれでもないアミノ酸は1個まで
しか置換できないという条件の下で、前記配列の3個ま
でのアミノ酸が他のアミノ酸に置き換えられて前記オリ
ゴペプチドを構成していてもよい)のアミノ酸10個から
16個までのアミノ酸配列を含んでなるオリゴペプチドの
標識化接合体からなる群から選択された少なくても1つ
の試薬を用いる方法であり、該方法が、 分析媒質において、hBGPに対して特異抗体、該抗体
に対して、hBGPと競争できる標識化接合体を結合さ
せ、該標識が検出されうるシグナルを提供し;そして、 該資料におけるBGPの測定として該抗体に結合もしく
は未結合する標識化接合体の量を定量することを含んで
なる方法。 - 【請求項11】 該抗体は、hBGP37-49 の接合体で
産生され、該標識化接合体は、放射性ヨウ素化hBGP
37-49 であり、該hBGP37-49 が Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Va
l のアミノ酸配列を有する請求項10記載の方法。 - 【請求項12】 hBGPに対する特異抗体に対して、
hBGPと競争することのできるオリゴペプチドであっ
て、以下のhBGPのアミノ酸配列 Tyr Leu Tyr Gln Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu Glu Pro Arg Arg Gla Val Cys Gla Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu Ala Asp His Ile Gly Phe Gln Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly Pro Val (ただし、前記オリゴペプチドの末端配列が前記hBG
P配列の末端アミノ酸を含み、かつ、Phe、Tyr、
Glu又はGlaのいずれでもないアミノ酸は1個まで
しか置換できないという条件の下で、前記配列の3個ま
でのアミノ酸が他のアミノ酸に置き換えられて前記オリ
ゴペプチドを構成していてもよい)のアミノ酸10個から
16個までのアミノ酸配列を含んでなるオリゴペプチドに
応答して産生する抗体。 - 【請求項13】 該抗体がモノクローナルである請求項
12記載の抗体。
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