JPH08103295A - １，５−アンヒドログルシトールの測定方法 - Google Patents
１，５−アンヒドログルシトールの測定方法Info
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- JPH08103295A JPH08103295A JP24151794A JP24151794A JPH08103295A JP H08103295 A JPH08103295 A JP H08103295A JP 24151794 A JP24151794 A JP 24151794A JP 24151794 A JP24151794 A JP 24151794A JP H08103295 A JPH08103295 A JP H08103295A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明の１，５−アンヒドログルシトールの
測定方法は、グルコースおよび１，５−ＡＧが共存する
試料に、グルコースを基質としかつ１，５−ＡＧを基質
としない酵素（Ｅ1 ）と、グルコースおよび１，５−Ａ
Ｇの両方を基質とする酵素（Ｅ2 ）とを同時に反応さ
せ、グルコースと酵素（Ｅ1 ）との反応の結果生じる生
成物（Ｐ1 ）とグルコースおよび１，５−ＡＧと酵素
（Ｅ2 ）との反応の結果生じる生成物の合計（Ｐ2 ）を
独立に検出することを特徴とする。 【効果】 糖尿病のマーカーであるグルコースと１，５
−ＡＧを同時に測定することができ、両方の指標によ
り、糖尿病の診断を容易にかつ確実に行うことができ
る。
測定方法は、グルコースおよび１，５−ＡＧが共存する
試料に、グルコースを基質としかつ１，５−ＡＧを基質
としない酵素（Ｅ1 ）と、グルコースおよび１，５−Ａ
Ｇの両方を基質とする酵素（Ｅ2 ）とを同時に反応さ
せ、グルコースと酵素（Ｅ1 ）との反応の結果生じる生
成物（Ｐ1 ）とグルコースおよび１，５−ＡＧと酵素
（Ｅ2 ）との反応の結果生じる生成物の合計（Ｐ2 ）を
独立に検出することを特徴とする。 【効果】 糖尿病のマーカーであるグルコースと１，５
−ＡＧを同時に測定することができ、両方の指標によ
り、糖尿病の診断を容易にかつ確実に行うことができ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、糖尿病の診断マーカー
である１，５−アンヒドログルシトール（以下、１，５
−ＡＧと略記する）の測定方法に関する。
である１，５−アンヒドログルシトール（以下、１，５
−ＡＧと略記する）の測定方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】グルコースは、糖尿病の診断マーカーと
して古くから知られている。特に血糖値の測定は糖尿病
診断あるいは治療効果の判定にもっとも頻繁に行われる
測定項目であり、酵素法、電極法など種々の測定方法が
実用化されている。
して古くから知られている。特に血糖値の測定は糖尿病
診断あるいは治療効果の判定にもっとも頻繁に行われる
測定項目であり、酵素法、電極法など種々の測定方法が
実用化されている。
【０００３】一方、１，５−ＡＧは、ヒト髄液、血漿、
血清、尿中などに存在し、ある種の疾患、特に糖尿病に
おいて著しい濃度低下を来たすことが報告されている化
合物であり（赤沼安夫、戸辺一之：日本内科学会誌、８
０巻、１１９８〜１２０４頁、１９９１年）、近年、糖
尿病の診断マーカーとして使用されている物質である。
血清、尿中などに存在し、ある種の疾患、特に糖尿病に
おいて著しい濃度低下を来たすことが報告されている化
合物であり（赤沼安夫、戸辺一之：日本内科学会誌、８
０巻、１１９８〜１２０４頁、１９９１年）、近年、糖
尿病の診断マーカーとして使用されている物質である。
【０００４】従来の１，５−ＡＧの測定は、ガスクロマ
トグラフィー法によって行われていた（検査と技術、２
１巻、No. ６、４０７〜４１２頁、１９８２年）。しか
しながら、この方法は、被検液の処理として１，５−Ａ
Ｇのラベル化が必要である上に、測定に長時間を要し、
多数の検体を同時に測定することが困難であり、しかも
分析機器の維持、管理に高度の技術を必要とするなどの
欠点があり、実際の臨床に応用するには不便であった。
トグラフィー法によって行われていた（検査と技術、２
１巻、No. ６、４０７〜４１２頁、１９８２年）。しか
しながら、この方法は、被検液の処理として１，５−Ａ
Ｇのラベル化が必要である上に、測定に長時間を要し、
多数の検体を同時に測定することが困難であり、しかも
分析機器の維持、管理に高度の技術を必要とするなどの
欠点があり、実際の臨床に応用するには不便であった。
【０００５】また、最近ピラノースオキシダーゼという
酸化酵素を利用して１，５−ＡＧを定量する方法が開発
された（特公平５−４１２３８号公報）。しかしなが
ら、この方法では、ピラノースオキシダーゼがグルコー
スに対しても反応するため、血漿を検体とする場合に
は、血漿中に共存する多量のグルコースを除去するため
の前処理が必要であり、操作が煩雑であった。
酸化酵素を利用して１，５−ＡＧを定量する方法が開発
された（特公平５−４１２３８号公報）。しかしなが
ら、この方法では、ピラノースオキシダーゼがグルコー
スに対しても反応するため、血漿を検体とする場合に
は、血漿中に共存する多量のグルコースを除去するため
の前処理が必要であり、操作が煩雑であった。
【０００６】特開昭６３−２９４７９９号公報には、グ
ルコースおよび１，５−ＡＧが共存する試料を液体クロ
マトグラフィーで処理してこれらを分離し、ピラノース
オキシダーゼを固定化したバイオセンサーを用いて、両
者を同時検出する方法が開示されている。しかしなが
ら、この方法では、グルコースおよび１，５−ＡＧを分
離するための特別な分離カラムや、ピラノースオキシダ
ーゼの固定化といった、煩雑でコストのかかる工程が必
要であった。
ルコースおよび１，５−ＡＧが共存する試料を液体クロ
マトグラフィーで処理してこれらを分離し、ピラノース
オキシダーゼを固定化したバイオセンサーを用いて、両
者を同時検出する方法が開示されている。しかしなが
ら、この方法では、グルコースおよび１，５−ＡＧを分
離するための特別な分離カラムや、ピラノースオキシダ
ーゼの固定化といった、煩雑でコストのかかる工程が必
要であった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、かか
る実情に鑑み、従来よりも簡単かつ低コストで１，５−
ＡＧを測定することができる、酵素法による１，５−Ａ
Ｇの測定方法を提供することにある。
る実情に鑑み、従来よりも簡単かつ低コストで１，５−
ＡＧを測定することができる、酵素法による１，５−Ａ
Ｇの測定方法を提供することにある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】酵素法による１，５−Ａ
Ｇ測定がグルコース共存下で難しい理由は、１，５−Ａ
Ｇのみに特異的に反応する酵素が見い出されていないか
らである。しかし、グルコースのみに反応する酵素、お
よびグルコースと１，５−ＡＧの両者に反応する酵素は
いずれも知られており、これらを組み合わせることによ
り、グルコース除去という前処理なしで非常に簡便に
１，５−ＡＧを測定することができる。
Ｇ測定がグルコース共存下で難しい理由は、１，５−Ａ
Ｇのみに特異的に反応する酵素が見い出されていないか
らである。しかし、グルコースのみに反応する酵素、お
よびグルコースと１，５−ＡＧの両者に反応する酵素は
いずれも知られており、これらを組み合わせることによ
り、グルコース除去という前処理なしで非常に簡便に
１，５−ＡＧを測定することができる。
【０００９】酵素反応は、酵素をＥ、基質をＳ、生成物
をＰとすると下記式の反応に従って進む。
をＰとすると下記式の反応に従って進む。
【００１０】
【式１】 この反応において、Ｓ1 のみを基質とする酵素Ｅ1 と２
種類の基質Ｓ1 およびＳ2 を基質にする酵素Ｅ2 を同じ
系で反応させたとき、それぞれの基質が各酵素に対して
過剰に存在すれば次式の各反応は、独立に進むと考えら
れる。
種類の基質Ｓ1 およびＳ2 を基質にする酵素Ｅ2 を同じ
系で反応させたとき、それぞれの基質が各酵素に対して
過剰に存在すれば次式の各反応は、独立に進むと考えら
れる。
【００１１】
【式２】 いま、Ｐ1 、Ｐ2 、Ｐ3 の生成速度をそれぞれＶ1 、Ｖ
2 、Ｖ3 、各反応のミカエリス定数をＫm1、Ｋm2、Ｋm
3、最大速度をそれぞれＶmax1、Ｖmax2、Ｖmax3とする
と、各々の酵素反応速度式は、Michaelis-Menten式から
次式＜１＞’、＜２＞’、＜３＞’にと書き表される
（［Ｘ］はＸのモル濃度を表す）。
2 、Ｖ3 、各反応のミカエリス定数をＫm1、Ｋm2、Ｋm
3、最大速度をそれぞれＶmax1、Ｖmax2、Ｖmax3とする
と、各々の酵素反応速度式は、Michaelis-Menten式から
次式＜１＞’、＜２＞’、＜３＞’にと書き表される
（［Ｘ］はＸのモル濃度を表す）。
【００１２】
【式３】 故に、［Ｓ1 ］は、＜１＞’式から、［Ｓ1 ］＝Ｋm1・
Ｖ1 ／（Ｖmax1−Ｖ1）と求められ、また＜２＞、＜３
＞の生成物Ｐ2 、Ｐ3 を共通の検出系で測定すれば、Ｖ
2 ＋Ｖ3 が測定でき、
Ｖ1 ／（Ｖmax1−Ｖ1）と求められ、また＜２＞、＜３
＞の生成物Ｐ2 、Ｐ3 を共通の検出系で測定すれば、Ｖ
2 ＋Ｖ3 が測定でき、
【００１３】
【式４】 から、［Ｓ2 ］を算出できる。従って、＜１＞、＜２
＞、＜３＞の３つの素反応について、あらかじめＫm1、
Ｋm2、Ｋm3、Ｖmax1、Ｖmax2、Ｖmax3を決定しておき、
同時反応系において、Ｖ1 とＶ2 ＋Ｖ3 を独立に測定す
ることができれば、Ｓ1 、Ｓ2 共存系において各々の濃
度がわかることになる。
＞、＜３＞の３つの素反応について、あらかじめＫm1、
Ｋm2、Ｋm3、Ｖmax1、Ｖmax2、Ｖmax3を決定しておき、
同時反応系において、Ｖ1 とＶ2 ＋Ｖ3 を独立に測定す
ることができれば、Ｓ1 、Ｓ2 共存系において各々の濃
度がわかることになる。
【００１４】本発明は、上記の考え方を発展させたもの
であり、従来達成できなかった、グルコースと１，５−
ＡＧが共存する試料中の各々の濃度を測定することがで
きる画期的な方法を提供するものである。
であり、従来達成できなかった、グルコースと１，５−
ＡＧが共存する試料中の各々の濃度を測定することがで
きる画期的な方法を提供するものである。
【００１５】すなわち、本発明による１，５−ＡＧの測
定方法は、グルコースおよび１，５−ＡＧが共存する試
料に、グルコースを基質としかつ１，５−ＡＧを基質と
しない酵素（Ｅ1 ）と、グルコースおよび１，５−ＡＧ
の両方を基質とする酵素（Ｅ2 ）とを同時に反応させ、
グルコースと酵素（Ｅ1 ）との反応の結果生じる生成物
（Ｐ1 ）とグルコースおよび１，５−ＡＧと酵素（Ｅ2
）との反応の結果生じる生成物の合計（Ｐ2 ）を独立
に検出することを特徴とするものである。
定方法は、グルコースおよび１，５−ＡＧが共存する試
料に、グルコースを基質としかつ１，５−ＡＧを基質と
しない酵素（Ｅ1 ）と、グルコースおよび１，５−ＡＧ
の両方を基質とする酵素（Ｅ2 ）とを同時に反応させ、
グルコースと酵素（Ｅ1 ）との反応の結果生じる生成物
（Ｐ1 ）とグルコースおよび１，５−ＡＧと酵素（Ｅ2
）との反応の結果生じる生成物の合計（Ｐ2 ）を独立
に検出することを特徴とするものである。
【００１６】本発明方法において、酵素（Ｅ1 ）として
グルコースデヒドロゲナーゼ、酵素（Ｅ2 ）としてピラ
ノースオキシダーゼをそれぞれ用い、グルコースと酵素
（Ｅ1 ）との反応の結果生じる生成物（Ｐ1 ）の指標と
してＮＡＤＨを検出し、グルコースおよび１，５−ＡＧ
と酵素（Ｅ2 ）との反応の結果生じる生成物の合計（Ｐ
2 ）の指標として過酸化水素を検出するが好ましい。
グルコースデヒドロゲナーゼ、酵素（Ｅ2 ）としてピラ
ノースオキシダーゼをそれぞれ用い、グルコースと酵素
（Ｅ1 ）との反応の結果生じる生成物（Ｐ1 ）の指標と
してＮＡＤＨを検出し、グルコースおよび１，５−ＡＧ
と酵素（Ｅ2 ）との反応の結果生じる生成物の合計（Ｐ
2 ）の指標として過酸化水素を検出するが好ましい。
【００１７】本発明方法において、以下に示すように、
酵素（Ｅ1 ）とグルコースの酵素反応速度式（１）、酵
素（Ｅ2 ）とグルコースおよび酵素（Ｅ2 ）と１，５−
ＡＧの各々の酵素反応速度式（２）（３）のミカエリス
定数Ｋm11 、Ｋm21 、Ｋm22、および最大速度Ｖmax11
、Ｖmax21 、Ｖmax22 をあらかじめ求めておき、生成
物（Ｐ1 ）の生成速度Ｖ11および生成物の合計（Ｐ2 ）
の生成速度Ｖ21＋Ｖ22を測定することによって、（４）
式および（５）式から、グルコースおよび１，５−ＡＧ
の濃度を算出する方法である。また、一般的に、酵素反
応では、反応液のｐＨ、イオン強度、温度などの種々の
条件によつ反応速度が変化するので、１，５−ＡＧの濃
度算出式（５）にしかるべき補正係数を乗ずることによ
って、１，５−ＡＧの濃度を算出してもよい。
酵素（Ｅ1 ）とグルコースの酵素反応速度式（１）、酵
素（Ｅ2 ）とグルコースおよび酵素（Ｅ2 ）と１，５−
ＡＧの各々の酵素反応速度式（２）（３）のミカエリス
定数Ｋm11 、Ｋm21 、Ｋm22、および最大速度Ｖmax11
、Ｖmax21 、Ｖmax22 をあらかじめ求めておき、生成
物（Ｐ1 ）の生成速度Ｖ11および生成物の合計（Ｐ2 ）
の生成速度Ｖ21＋Ｖ22を測定することによって、（４）
式および（５）式から、グルコースおよび１，５−ＡＧ
の濃度を算出する方法である。また、一般的に、酵素反
応では、反応液のｐＨ、イオン強度、温度などの種々の
条件によつ反応速度が変化するので、１，５−ＡＧの濃
度算出式（５）にしかるべき補正係数を乗ずることによ
って、１，５−ＡＧの濃度を算出してもよい。
【００１８】
【式５】 本発明方法において、クルコースを基質としかつ１，５
−ＡＧを基質としない酵素には、例えば、グルコースデ
ヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，４７）ヘキソキナー
ゼ（ＥＣ２，７，１，１）、グルコキナーゼ（ＥＣ２，
７，１，２）などが用いられ、グルコースおよび１，５
−ＡＧの両方を基質とする酵素としては、ピラノースオ
キシダーゼ（ＥＣ１，１，３，１０）、ソルボースオキ
シダーゼ（ＥＣ１，１，３，１１）などが用いられる。
また、これらの酵素の比活性は高いほど定量にとって良
好であることは言うまでもないが、必ずしも最高純度の
ものを要求するものではない。上記酵素の組み合わせと
しては、後述の実施例から明らかなようにグルコースデ
ヒドロゲナーゼとピラノースオキシダーゼが良好である
が、これに限定されるものではない。
−ＡＧを基質としない酵素には、例えば、グルコースデ
ヒドロゲナーゼ（ＥＣ１，１，１，４７）ヘキソキナー
ゼ（ＥＣ２，７，１，１）、グルコキナーゼ（ＥＣ２，
７，１，２）などが用いられ、グルコースおよび１，５
−ＡＧの両方を基質とする酵素としては、ピラノースオ
キシダーゼ（ＥＣ１，１，３，１０）、ソルボースオキ
シダーゼ（ＥＣ１，１，３，１１）などが用いられる。
また、これらの酵素の比活性は高いほど定量にとって良
好であることは言うまでもないが、必ずしも最高純度の
ものを要求するものではない。上記酵素の組み合わせと
しては、後述の実施例から明らかなようにグルコースデ
ヒドロゲナーゼとピラノースオキシダーゼが良好である
が、これに限定されるものではない。
【００１９】本発明方法において、グルコースを基質と
しかつ１，５−ＡＧを基質としない酵素とグルコースと
の反応の結果生じる生成物の検出系としては、グルコー
スデヒドロゲナーゼの場合には、例えば、生成するＮＡ
ＤＨの３４０〜３５０ｎｍの吸光度を測定する方法があ
る。また、ヘキソキナーゼあるいはグルコキナーゼを用
いる場合には、生成するグルコース−６−リン酸をさら
にグルコース−６−−リン酸デヒドロゲナーゼおよびＮ
ＡＤＰと反応させることによって生成するＮＡＤＰＨの
３４０〜３５０ｎｍの吸光度を測定する方法がある。一
方グルコースおよび１，５−ＡＧの両方を基質とする酵
素とグルコースおよび１，５−ＡＧとの反応の結果生じ
る生成物の検出系としては、ピラノースオキシダーゼ
（ＥＣ１，１−３−１０）、ソルボースオキシダーゼ
（ＥＣ１，１−３−１１）を用いる場合には、例えば生
成する過酸化水素をペルオキシダーゼおよび種々の過酸
化水素検出試薬と反応させ、比色定量する方法がある。
また、生成する過酸化水素の代わりに消費する酵素量を
任意の方法で測定しても良い。また、上記グルコースを
基質としかつ１，５−ＡＧを基質としない酵素と、グル
コースおよび１，５−ＡＧの両方を基質とする酵素とに
よる生成物の検出を吸光度を用いて測定する場合には、
各々の生成物の測定波長において互いに干渉しない組み
合わせ、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼを用いる
ＮＡＤＨを検出し、ピラノースオキシダーゼを用いメチ
レンブルーを検出するという組み合わせが極大吸収波長
が大きく異なるため望ましい。
しかつ１，５−ＡＧを基質としない酵素とグルコースと
の反応の結果生じる生成物の検出系としては、グルコー
スデヒドロゲナーゼの場合には、例えば、生成するＮＡ
ＤＨの３４０〜３５０ｎｍの吸光度を測定する方法があ
る。また、ヘキソキナーゼあるいはグルコキナーゼを用
いる場合には、生成するグルコース−６−リン酸をさら
にグルコース−６−−リン酸デヒドロゲナーゼおよびＮ
ＡＤＰと反応させることによって生成するＮＡＤＰＨの
３４０〜３５０ｎｍの吸光度を測定する方法がある。一
方グルコースおよび１，５−ＡＧの両方を基質とする酵
素とグルコースおよび１，５−ＡＧとの反応の結果生じ
る生成物の検出系としては、ピラノースオキシダーゼ
（ＥＣ１，１−３−１０）、ソルボースオキシダーゼ
（ＥＣ１，１−３−１１）を用いる場合には、例えば生
成する過酸化水素をペルオキシダーゼおよび種々の過酸
化水素検出試薬と反応させ、比色定量する方法がある。
また、生成する過酸化水素の代わりに消費する酵素量を
任意の方法で測定しても良い。また、上記グルコースを
基質としかつ１，５−ＡＧを基質としない酵素と、グル
コースおよび１，５−ＡＧの両方を基質とする酵素とに
よる生成物の検出を吸光度を用いて測定する場合には、
各々の生成物の測定波長において互いに干渉しない組み
合わせ、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼを用いる
ＮＡＤＨを検出し、ピラノースオキシダーゼを用いメチ
レンブルーを検出するという組み合わせが極大吸収波長
が大きく異なるため望ましい。
【００２０】本発明に用いる緩衝液の例には、リン酸緩
衝液、Tris、MopsなどのGoodの緩衝液などが挙げられ、
これらの緩衝液のｐＨは、酵素反応の最適ｐＨ領域、好
ましくは、５〜８に調整される。反応温度は、十分な酵
素活性が得られかつ酵素の失活の恐れが少ない２０〜５
０℃が好ましく、３０〜４０℃がより好ましい。
衝液、Tris、MopsなどのGoodの緩衝液などが挙げられ、
これらの緩衝液のｐＨは、酵素反応の最適ｐＨ領域、好
ましくは、５〜８に調整される。反応温度は、十分な酵
素活性が得られかつ酵素の失活の恐れが少ない２０〜５
０℃が好ましく、３０〜４０℃がより好ましい。
【００２１】また、本発明において定量しようとする試
料は、グルコースと１，５−ＡＧが共存しているもので
あるならば、なんら制限されず、一般的に体液と呼ばれ
る血漿、血清、尿、髄液などが挙げられる。また、体液
中に共存する蛋白質を除去した試料なども用いられる。
料は、グルコースと１，５−ＡＧが共存しているもので
あるならば、なんら制限されず、一般的に体液と呼ばれ
る血漿、血清、尿、髄液などが挙げられる。また、体液
中に共存する蛋白質を除去した試料なども用いられる。
【００２２】以下に実施例を示し本発明をより詳細に説
明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではな
い。
明するが、本発明はこの実施例に限定されるものではな
い。
【００２３】
実施例１ ＜グルコースを基質としかつ１，５−ＡＧを基質としな
い酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼを用いた時の
グルコースとの酵素反応のＫm 、Ｖmax の測定＞ メル
コテストGlucose キット（関東化学（株）、ＬｏｔＮ
ｏ．Ｄ３０３０）を用い、グルコースデヒドロゲナーゼ
とグルコースとの酵素反応のＫm 、Ｖmaxを以下のよう
に測定した。Ｄ（＋）−グルコース（試薬特級、和光純
薬（株）、ＬｏｔＮｏ．ＡＰＧ４６８２）をダルベッコ
のＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）に、濃度が０．００、０．２
５、０．５０、１．００、２．００、５．００および１
０．００ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、メルコテスト
Glucose キットの酵素／補酵素を付属の緩衝液で規定量
に溶解した。上記各濃度のグルコース溶液３ｍｌに酵素
／補酵素液０．１ｍｌを添加し、３５０ｎｍでの吸光度
の変化を紫外可視分光光度計（日本分光Ｕｂｅｓｔ−５
５０）にて、３７℃で攪拌下タイムスキャンした。上記
各グルコース濃度での反応速度をグルコース濃度に対し
て、Lineweaber-Burk プロットし（図１）、このグラフ
の直線の傾きと縦軸切片から、グルコースデヒドロゲナ
ーゼとグルコースとの酵素反応のＫm11 を０．０１５
６、Ｖmax11 を０．０７９９ｍＭ／ｍｉｎと決定した。
い酵素としてグルコースデヒドロゲナーゼを用いた時の
グルコースとの酵素反応のＫm 、Ｖmax の測定＞ メル
コテストGlucose キット（関東化学（株）、ＬｏｔＮ
ｏ．Ｄ３０３０）を用い、グルコースデヒドロゲナーゼ
とグルコースとの酵素反応のＫm 、Ｖmaxを以下のよう
に測定した。Ｄ（＋）−グルコース（試薬特級、和光純
薬（株）、ＬｏｔＮｏ．ＡＰＧ４６８２）をダルベッコ
のＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）に、濃度が０．００、０．２
５、０．５０、１．００、２．００、５．００および１
０．００ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、メルコテスト
Glucose キットの酵素／補酵素を付属の緩衝液で規定量
に溶解した。上記各濃度のグルコース溶液３ｍｌに酵素
／補酵素液０．１ｍｌを添加し、３５０ｎｍでの吸光度
の変化を紫外可視分光光度計（日本分光Ｕｂｅｓｔ−５
５０）にて、３７℃で攪拌下タイムスキャンした。上記
各グルコース濃度での反応速度をグルコース濃度に対し
て、Lineweaber-Burk プロットし（図１）、このグラフ
の直線の傾きと縦軸切片から、グルコースデヒドロゲナ
ーゼとグルコースとの酵素反応のＫm11 を０．０１５
６、Ｖmax11 を０．０７９９ｍＭ／ｍｉｎと決定した。
【００２４】＜グルコースを基質としかつ１，５−ＡＧ
を基質としない酵素としてピラノースオキシダーゼを用
いた時のグルコースおよび１，５−ＡＧとの酵素反応の
Ｋm、Ｖmax の測定＞Ｄ（＋）−グルコースをダルベッ
コのＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）に、濃度が０．００、０．
２５、０．５０、１．００、２．００、５．００、１
０．００および５０．００ｍｇ／ｍｌになるように溶解
し、１，５−ＡＧ（生化学用、和光純薬（株）、Ｌｏｔ
Ｎｏ．ＴＷＱ５０１９）をダブルベッコのＰＢＳ（ｐＨ
＝７．４）に、濃度が０．００、０．２５、０．５０、
１．００、２．００、５．００および２０．００ｍｇ／
ｍｌになるように溶解した。ピラノースオキシダーゼ酵
素液として、ピラノースオキシダーゼ“ＴＡＫＡＲＡ”
（３．７７Ｕ／ｍｇ）（宝酒造（株）、ＬｏｔＮｏ．１
３ＴＡＤＹ（Ｉ））ペルオキシダーゼわさび製（１００
Ｕ／ｍｇ）（生化学用、和光純薬（株）、ＬｏｔＮｏ．
ＰＴＪ７７２３）、高感度過酸化水素測定試薬ＤＡ−６
７（１０−（Carboxymethylaminocarbonyl）−３，７−
bis （dimethylamino ）−phenothiazine sodium salt
、生化学用、和光純薬（株）、Lot No. ＲＳＮ９３９
１）を、濃度が３．１Ｕ／ｍｌおよび１５５０μＭにな
るように、McIlvaine 緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し
た。上記各濃度のグルコースおよび１，５−ＡＧ、３ｍ
ｌに上記のように調製した酵素液０．１ｍｌを添加し、
６６６ｎｍでの吸光度の変化を紫外可視分光光度計（日
本分光Ｕｂｅｓｔ−５５０）にて、３７℃で攪拌下タイ
ムスキャンした。上記各濃度のグルコース、および１，
５−ＡＧとピラノースオキシダーゼとの反応速度を各々
の濃度に対して、Lineweaber-Burk プロットした（図
２、３）。このグラフの直線の傾きと縦軸切片から、ピ
ラノースオキシダーゼとグルコースとの酵素反応のＫm2
1 を０．００１９、Ｖmax21 を０．０１６９ｍＭ／ｍｉ
ｎ、ピラノースオキシダーゼと１，５−ＡＧとの酵素反
応のＫm22 を０．０２４８、Ｖmax22 を０．０１０４ｍ
Ｍ／ｍｉｎと決定した。
を基質としない酵素としてピラノースオキシダーゼを用
いた時のグルコースおよび１，５−ＡＧとの酵素反応の
Ｋm、Ｖmax の測定＞Ｄ（＋）−グルコースをダルベッ
コのＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）に、濃度が０．００、０．
２５、０．５０、１．００、２．００、５．００、１
０．００および５０．００ｍｇ／ｍｌになるように溶解
し、１，５−ＡＧ（生化学用、和光純薬（株）、Ｌｏｔ
Ｎｏ．ＴＷＱ５０１９）をダブルベッコのＰＢＳ（ｐＨ
＝７．４）に、濃度が０．００、０．２５、０．５０、
１．００、２．００、５．００および２０．００ｍｇ／
ｍｌになるように溶解した。ピラノースオキシダーゼ酵
素液として、ピラノースオキシダーゼ“ＴＡＫＡＲＡ”
（３．７７Ｕ／ｍｇ）（宝酒造（株）、ＬｏｔＮｏ．１
３ＴＡＤＹ（Ｉ））ペルオキシダーゼわさび製（１００
Ｕ／ｍｇ）（生化学用、和光純薬（株）、ＬｏｔＮｏ．
ＰＴＪ７７２３）、高感度過酸化水素測定試薬ＤＡ−６
７（１０−（Carboxymethylaminocarbonyl）−３，７−
bis （dimethylamino ）−phenothiazine sodium salt
、生化学用、和光純薬（株）、Lot No. ＲＳＮ９３９
１）を、濃度が３．１Ｕ／ｍｌおよび１５５０μＭにな
るように、McIlvaine 緩衝液（ｐＨ６．０）に溶解し
た。上記各濃度のグルコースおよび１，５−ＡＧ、３ｍ
ｌに上記のように調製した酵素液０．１ｍｌを添加し、
６６６ｎｍでの吸光度の変化を紫外可視分光光度計（日
本分光Ｕｂｅｓｔ−５５０）にて、３７℃で攪拌下タイ
ムスキャンした。上記各濃度のグルコース、および１，
５−ＡＧとピラノースオキシダーゼとの反応速度を各々
の濃度に対して、Lineweaber-Burk プロットした（図
２、３）。このグラフの直線の傾きと縦軸切片から、ピ
ラノースオキシダーゼとグルコースとの酵素反応のＫm2
1 を０．００１９、Ｖmax21 を０．０１６９ｍＭ／ｍｉ
ｎ、ピラノースオキシダーゼと１，５−ＡＧとの酵素反
応のＫm22 を０．０２４８、Ｖmax22 を０．０１０４ｍ
Ｍ／ｍｉｎと決定した。
【００２５】＜種々の濃度で共存するグルコースおよび
１，５−ＡＧの濃度の測定＞グルコースおよび１，５−
ＡＧを、それぞれ、以下の表１のような最終濃度になる
ように、ダルベッコのＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）に溶解し
た。上記のように調製したグルコースデヒドロゲナーゼ
酵素液とピラノースオキシダーゼ酵素液を１：１に混合
した。次に、各グルコース・１，５−ＡＧ混合サンプル
３ｍｌに、グルコースデヒドロゲナーゼ、ピラノースオ
キシダーゼ混合酵素液０．２ｍｌを添加し、各々、３５
０ｎｍ、６６６ｎｍでの吸光度の変化を紫外可視分光光
度計（日本分光Ｕｂｅｓｔ−５５０）にて、３７℃で攪
拌下タイムスキャンし、各サンプルの反応速度を測定し
た。結果を表２に示す。この反応速度と上記のように予
め決定したＫm 、Ｖmax から、下記式により、それぞれ
の濃度を計算し、補正係数＝３．５を乗ずると、表３の
ような結果となり、算出された実測値は良く一致した。
１，５−ＡＧの濃度の測定＞グルコースおよび１，５−
ＡＧを、それぞれ、以下の表１のような最終濃度になる
ように、ダルベッコのＰＢＳ（ｐＨ＝７．４）に溶解し
た。上記のように調製したグルコースデヒドロゲナーゼ
酵素液とピラノースオキシダーゼ酵素液を１：１に混合
した。次に、各グルコース・１，５−ＡＧ混合サンプル
３ｍｌに、グルコースデヒドロゲナーゼ、ピラノースオ
キシダーゼ混合酵素液０．２ｍｌを添加し、各々、３５
０ｎｍ、６６６ｎｍでの吸光度の変化を紫外可視分光光
度計（日本分光Ｕｂｅｓｔ−５５０）にて、３７℃で攪
拌下タイムスキャンし、各サンプルの反応速度を測定し
た。結果を表２に示す。この反応速度と上記のように予
め決定したＫm 、Ｖmax から、下記式により、それぞれ
の濃度を計算し、補正係数＝３．５を乗ずると、表３の
ような結果となり、算出された実測値は良く一致した。
【００２６】
【式６】
【表１】
【表２】
【表３】
【００２７】
【発明の効果】本発明によれば、糖尿病のマーカーであ
るグルコースと１，５−ＡＧを同時に測定することがで
き、両方の指標により、糖尿病の診断を容易にかつ確実
に行うことができる。
るグルコースと１，５−ＡＧを同時に測定することがで
き、両方の指標により、糖尿病の診断を容易にかつ確実
に行うことができる。
【図１】グルコースとグルコースデヒドロゲナーゼの酵
素反応ミカエリス定数Ｋm および最大速度の決定方法を
示すグラフである。
素反応ミカエリス定数Ｋm および最大速度の決定方法を
示すグラフである。
【図２】グルコースとピラノースオキシダーゼとの酵素
反応のミカエリス定数および最大速度の決定方法を示す
グラフである。
反応のミカエリス定数および最大速度の決定方法を示す
グラフである。
【図３】１，５−ＡＧとピラノースオキシダーゼとの酵
素反応のミカエリス定数および最大速度の決定方法を示
すグラフである。
素反応のミカエリス定数および最大速度の決定方法を示
すグラフである。
Claims (2)
- 【請求項１】 グルコースおよび１，５−ＡＧが共存す
る試料に、グルコースを基質としかつ１，５−ＡＧを基
質としない酵素（Ｅ1 ）と、グルコースおよび１，５−
ＡＧの両方を基質とする酵素（Ｅ2 ）とを同時に反応さ
せ、グルコースと酵素（Ｅ1 ）との反応の結果生じる生
成物（Ｐ1 ）とグルコースおよび１，５−ＡＧと酵素
（Ｅ2 ）との反応の結果生じる生成物の合計（Ｐ2 ）を
独立に検出することを特徴とする１，５−ＡＧの測定方
法。 - 【請求項２】 酵素（Ｅ1 ）としてグルコースデヒドロ
ゲナーゼ、酵素（Ｅ2 ）としてピラノースオキシダーゼ
をそれぞれ用い、グルコースと酵素（Ｅ1 ）との反応の
結果生じる生成物（Ｐ1 ）の指標としてＮＡＤＨを検出
し、グルコースおよび１，５−ＡＧと酵素（Ｅ2 ）との
反応の結果生じる生成物の合計（Ｐ2）の指標として過
酸化水素を検出することを特徴とする請求項１記載の方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24151794A JP3670687B2 (ja) | 1994-10-05 | 1994-10-05 | １，５−アンヒドログルシトールの測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24151794A JP3670687B2 (ja) | 1994-10-05 | 1994-10-05 | １，５−アンヒドログルシトールの測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH08103295A true JPH08103295A (ja) | 1996-04-23 |
| JP3670687B2 JP3670687B2 (ja) | 2005-07-13 |
Family
ID=17075526
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24151794A Expired - Fee Related JP3670687B2 (ja) | 1994-10-05 | 1994-10-05 | １，５−アンヒドログルシトールの測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3670687B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0846773A1 (en) * | 1996-12-04 | 1998-06-10 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Method of quantitative assay for 1,5-anhydroglucitol and reagent for quantitative assay |
-
1994
- 1994-10-05 JP JP24151794A patent/JP3670687B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0846773A1 (en) * | 1996-12-04 | 1998-06-10 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Method of quantitative assay for 1,5-anhydroglucitol and reagent for quantitative assay |
| US5871949A (en) * | 1996-12-04 | 1999-02-16 | Daiichi Pure Chemicals Co., Ltd. | Method of quantitative assay for 1,5-anhydroglucitol and reagent for quantitative assay |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3670687B2 (ja) | 2005-07-13 |
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