JPH0773516B2 - ミコバクテリアの溶菌方法 - Google Patents

ミコバクテリアの溶菌方法

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JPH0773516B2
JPH0773516B2 JP4166390A JP16639092A JPH0773516B2 JP H0773516 B2 JPH0773516 B2 JP H0773516B2 JP 4166390 A JP4166390 A JP 4166390A JP 16639092 A JP16639092 A JP 16639092A JP H0773516 B2 JPH0773516 B2 JP H0773516B2
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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、分子生物学の分野であ
る。特に、本発明は、細胞溶解の領域である。更に詳し
くは、本発明は、ミコバクテリアの溶菌方法である。
【０００２】
【従来の技術】ミコバクテリアは、細胞壁脂質含量が高
く且つ増殖速度が遅い、大型で種々の、そして広範に分
布した系統の、好気性で非芽胞形成の非運動性バチルス
属である。ミコバクテリウム属はそれぞれ毒性が極めて
異なる。ある種のミコバクテリアは無害であるが、ヒト
結核菌のような他のものは有意の病原体である。ミコバ
クテリウム属の種は、それらの増殖速度、色素産生、動
物毒性および生化学的反応性によって区別される。
【０００３】ミコバクテリウム科の系統のものなどの病
原性生物の存在を決定するための多数の検出法は、これ
らの生物の溶菌によるものである。しかしながら、ミコ
バクテリウム科に対する溶菌方法は、労力を要し且つ時
間を浪費するものである。例えば、ミコバクテリアの化
学的破壊は単調で且つ日数を要することがある。欧州特
許出願第８７ ３０３６４１．２号明細書に、微小ビー
ズを音波破砕浴と併用することを含む、ミコバクテリア
からＤＮＡまたはＲＮＡを放出させるための方法が開示
されている。エス・ハーリー（Ｓ．Ｈｕｒｌｅｙ）ら、
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２５：２２２７
（１９８７）に、小型ビードビーター細胞破壊装置およ
びジルコニウムビーズを用いるミコバクテリアを溶菌す
るための方法が開示されている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】ミコバクテリア遺伝学
の最近の発達および後天性免疫不全症候群に罹患してい
る患者などでのその日和見性病原体に関心が高まってい
ることにより、ミコバクテリウム科の速やかな溶菌方法
が必要であるということが注目されてきた。簡単で速や
かな、そして溶菌から望まれる物質を破壊しないミコバ
クテリアを溶菌する方法を得ることは好都合であると考
えられる。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明は、簡単で速やか
な、そして溶菌から望まれる物質を破壊しないミコバク
テリアを溶菌する方法を提供する。一つの実施態様にお
いて、細菌を溶菌有効量の酵素アクロモペプチダーゼに
対して暴露することを含む、ミコバクテリアを溶菌する
ための方法を提供する。
【０００６】もう一つの実施態様は、ミコバクテリアの
溶菌から遊離される特定の細胞成分を、本発明の方法を
用いて単離することを含む。
【０００７】具体的な実施態様は、更に、ミコバクテリ
アから核酸を単離し且つ本発明の方法を実施することか
ら得られた核酸を増幅する追加の工程を含む。
【０００８】他の実施態様は、溶解したミコバクテリア
に対してミコバクテリア同定試薬を加えて、ミコバクテ
リアの存在を確認することを含む。
【０００９】更に、実施態様は、溶菌有効量のアクロモ
ペプチダーゼおよびミコバクテリア同定試薬を含むキッ
トを含む。
【００１０】本発明の方法は、特に、１回の工程だけを
必要とするので便利であり、先行の方法と比較して好都
合であり、そしてほとんど器具を必要としない。本発明
の方法を実施することにより、最小の努力でミコバクテ
リアを溶菌することが可能である。更に、本発明を実施
する結果として、ミコバクテリアからデオキシリボ核酸
（ＤＮＡ）を遊離させる。ＤＮＡを単に遊離するだけで
なく、ＤＮＡを比較的均一な寸法で遊離して、プローブ
ハイブリダイセーション、制限酵素分析、増幅、その他
同種類のものによって引き続き分析するのに十分に適し
たＤＮＡを与える。 本明細書中で用いる「溶菌有効量
のアクロモペプチダーゼ」とは、ＤＮＡ、ＲＮＡ等のよ
うな細胞内成分を遊離させるアクロモペプチダーゼの量
を意味する。 本発明は、溶菌並びに結果として生じる
ミコバクテリアからのＤＮＡおよび細胞性物質の遊離を
可能にする。その方法で用いられる酵素はアクロモペプ
チダーゼであり、リシルエンドペプチダーゼとしても知
られている。酵素は、発売元からの商業的入手可能性を
含む種々の源から容易に入手可能である。酵素は、更
に、生物のアクロモバクター・リティクス（Ａｃｈｒｏ
ｍｏｂａｃｔｅｒ ｌｙｔｉｃｕｓ）から単離すること
によって入手可能である。
【００１１】ミコバクテリアを酵素アクロモペプチダー
ゼに暴露することは、苛性化学を利用し、時間を浪費し
て培養することを行うミコバクテリアを溶菌する既知の
方法、並びにフレンチ（Ｆｒｅｎｃｈ）プレス、ヒュー
ズ（Ｈｕｇｈｅｓ）プレス、音波破砕プローブ、浴音波
破砕装置、凍結−融解、ガラスビーズ、リビ（Ｒｉｂ
ｉ）プレッシャー細胞等を用いる機械的方法よりも好都
合である。
【００１２】種々の生物を溶解するための多数の酵素お
よび方法があるが、ミコバクテリアを溶菌するのに酵素
アクロモペプチダーゼを用いることは独特である。ミコ
バクテリアは、それらを容易に溶解できないことが周知
である。更に、ミコバクテリアの溶菌を結果として生じ
るこれらの方法は、概して、望まれた細胞の内容物も破
壊する。細胞の内容物が溶菌方法によって破壊されない
としても、概して、それは偶然の結果であり且つ困難な
プロトコルであった。ミコバクテリアは、物理的ストレ
スに対して極めて耐性であり、普通の細菌を殺菌する濃
度および消化方法を施すことができる。したがって、あ
まり活発ではない細菌を溶菌することができる酵素アク
ロモペプチダーゼが、並外れて耐溶菌性のミコバクテリ
アを溶菌することもできるとは予期されない。更に、他
のものは一層苛酷な条件では作用しないので、アクロモ
ペプチダーゼがミコバクテリアを溶菌する場合にそのよ
うに十分に作用するとは予期されない。しかしながら、
本発明の実施の結果、ミコバクテリアの溶菌が生じ、引
き続き、検出法および増幅などの種々の目的に用いるの
に適している便利なＤＮＡ断片を生じ、更には、ＲＮＡ
および他の細胞成分を遊離させる。
【００１３】溶菌によって遊離された細胞成分を引き続
き用いることとしては、ミコバクテリアの同定およびポ
リメラーゼチェインリアクション、リガーゼチェインリ
アクション等のような手段による核酸の増幅がある。同
定は、ミコバクテリア同定試薬によって行うことができ
る。同定試薬とは、デオキシリボ核酸およびリボ核酸等
を含む核酸プローブを含んでいる、ミコバクテリアを同
定するのに適当な薬剤を意味する。
【００１４】例えば、特定のミコバクテリウム属の存在
を確認するためにプローブを用いると、一工程の同定方
法で用いることができる。例えば、喀痰試料などの試料
が得られたら、その喀痰を、Ｎ−アセチル−Ｌ−システ
イン（ＮＡＬＣ）のような融解剤で消化する。消化およ
び濃縮後、溶菌有効量のアクロモペプチダーゼを試料に
加え、続いて同定試薬を加える。次に、ミコバクテリテ
アの存在を、同定試薬を用いるのに選択された標識（例
えば、検出されるシグナル）に応じて、種々の手段によ
って検出することができる。ミコバクテリアの存在を確
認するための手段は、通常、用いられる同定試薬によっ
て指示される。例えば、核酸プローブ（例えば、ミコバ
クテリア種に特異的な）は、典型的に、１２５Ｉ、３２
Ｐ、蛍光標識等で標識される。次に、標識を検出し、そ
の検出は特定のミコバクテリアが存在するという指標で
ある。他の検出手段としては、サザンブロット分析、電
気泳動ゲル可視化等がある。
【００１５】ミコバクテリア同定試薬およびアクロモペ
プチダーゼは、便宜上、キットの形態で提供することが
できる。このようなキットは少なくとも１種類の同定試
薬および溶菌有効量のアクロモペプチダーゼを含む。具
体的なキットは、任意のミコバクテリアまたは特定のミ
コバクテリウム属に対する同定試薬を含む。具体的なキ
ットは、更に、核酸プローブまたは抗体などの特定のミ
コバクテリア同定手段を含む。そして同定試薬を検出す
ることによる手段は、更に、特異的であることができ、
例えば、薬剤は、蛍光、放射性および化学発光検出用に
設計することができ、必要ならば、試料要件に応じて、
融解剤、単離剤等をキット中に含むことができる。
【００１６】本発明の方法は、ミコバクテリアが喀痰な
どの試料の形態でまたは単離形態で得られたら用いるこ
とができる。ミコバクテリアは、便、喀痰、尿、血清、
組織、他の体液を含む種々の源から単離され、または公
的若しくは私的培養採集物等から得られる。種々の源か
ら得られたミコバクテリアは、典型的に培養され、それ
は非常に時間を浪費し、培養時間は３〜６週間になる。
しかしながら、本発明の方法を実施することにより、培
養する必要を除くことができる。培養することが望まし
くない場合、細胞は、概して最初に、慣用的な試料処理
方法によって源から単離した後、通常、遠心分離によっ
てペレットにし且つ細胞懸濁液に入れる。次に、細胞懸
濁液中のミコバクテリアを溶菌させる。本発明による溶
菌は、溶菌有効量のアクロモペプチダーゼを細胞に加え
ることを含む。アクロモペプチダーゼは純粋でなければ
ならないことはなく、不純であるのが好ましい。これ
は、酵素を用いる前の精製工程を省くことにおいて好都
合であり、汚染に対する注意が軽減される。好ましく
は、酵素は約５０単位〜約１０００単位で存在し、最も
好ましくは、酵素は約１００単位〜約３００単位で存在
している。
【００１７】本発明の方法は、培養することなく実施す
ることができる。喀痰、便、組織、血液、血清等からの
未精製の生物学的試料は、本発明を実施することによっ
て溶菌することができ、同一試料において、ミコバクテ
リア同定試薬で同定することができる。したがって、そ
の方法は、臨床的試料、生物学的試料、食品または環境
試料中のミコバクテリアを検出するための単純化された
手段を含む。
【００１８】アクロモペプチダーゼによってミコバクテ
リアを溶菌するための典型的なプロトコルは、ミコバク
テリアの試料を短時間（例えば、約５分間）遠心分離し
且つ得られた上澄みを捨てることを含む。次に、ミコバ
クテリアのペレットを、アクロモペプチダーゼ酵素の緩
衝混合物中で再構成することができる。あらゆる適当な
緩衝剤が作用する。適当な緩衝剤としては、トリズマ
（Ｔｒｉｚｍａ）およびＮａＣｌ、並びにホウ酸塩およ
びＮａＣｌがある。ほぼ室温〜約５０℃での短時間のイ
ンキュベーション（例えば、約３０分間）後、溶菌を完
了し、遊離した細胞内容物は、便宜上、慣用的な方法に
よって単離することができる。ＤＮＡを単離するための
慣用的な方法としては、フェノール：クロロホルム抽
出、引き続く溶出を伴うガラス結合等がある。ＤＮＡを
単離するための慣用的なプロトコルの例は、ティー・マ
ニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍ
ａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂ）（１９８２）およびブーム（Ｂｏｏｍ）ら、
Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ，２８：４９５（１９９０）
などの参考文献で見出される。
【００１９】本発明の方法が、ＤＮＡを利用可能な寸法
で遊離するという事実は重要である。先行の方法では困
難で且つ時間を浪費する方法論によってミコバクテリア
の溶菌を得たが、その遊離されたＤＮＡは、概して、便
利な寸法ではなかった（それは、引き続き用いるのには
小さすぎる断片に分解された）。遊離されたＤＮＡが、
検出法においてそれを引き続き用いることを可能にする
十分な寸法であることは重要である。したがって、種々
の溶菌法でＤＮＡが得られるという事実にもかかわら
ず、ＤＮＡを有用な量および寸法で得ることは重要であ
る。
【００２０】本発明を実施することによって溶菌するこ
とができる重要なミコバクテリアとしては、鳥型結核菌
（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、エム・イントラセルラレエ（Ｍ．
ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒａｅ）、エム・ゴルドネエ
（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、ヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂ
ｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、エム・カンサシイ（Ｍ．ｋａｎ
ｓａｓｉｉ）、エム・フォルツイツム（Ｍ．ｆｏｒｔｕ
ｉｔｕｍ）、エム・ケロネエ（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａ
ｅ）、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、エム・スクロ
フラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、パラ結
核菌（Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、エム
・マリヌム（Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ）、エム・シミエー
（Ｍ．ｓｉｍｉａｅ）、エム・スズルガイ（Ｍ．ｓｚｕ
ｌｇａｉ）、エム・イントラセルレア（Ｍ．ｉｎｔｒａ
ｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、エム・キセノピ（Ｍ．ｘｅｎｏ
ｐｉ）、エム・ウルセランス（Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎ
ｓ）、らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）、鼠らい菌（Ｍ．ｌ
ｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ）、スメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇ
ｍａｔｉｓ）、エム・フラベセンス（Ｍ．ｆｌａｖｅｓ
ｃｅｎｓ）、エム・テレエ（Ｍ．ｔｅｒｒａｅ）、エム
・ノンクロモジェニクム（Ｍ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅ
ｎｉｃｕｍ）、エム・マルメンス（Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎ
ｓｅ）、エム・アシアティクム（Ｍ．ａｓｉａｔｉｃｕ
ｍ）、エム・ヴァケエ（Ｍ．ｖａｃｃａｅ）、エム・ガ
ストリ（Ｍ．ｇａｓｔｒｉ）、エム・トリビアル（Ｍ．
ｔｒｉｖｉａｌｅ）、エム・ヘモフィクム（Ｍ．ｈａｅ
ｍｏｐｈｉｃｕｍ）、エム・アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒ
ｉｃａｎｕｍ）、エム・サーモレジスタブル（Ｍ．ｔｈ
ｅｒｍｏｒｅｓｉｓｔａｂｌｅ）およびチモテ菌（Ｍ．
ｐｈｌｅｉ）がある。若干のミコバクテリアは病原性で
ある。例えば、既に２０億人に感染し且つ毎年更に７０
０万〜９００万人に感染しているヒト型結核菌は、疫学
的および臨床的観点から重要なミコバクテリアである。
更に、エム・アベリウム（Ｍ．ａｖｅｒｉｕｍ）、ウシ
型結核菌、エム・イントラセルラレエ、エム・アフリカ
ヌム、らい菌、エム・ケロネエ、パラ結核菌およびエム
・マリヌムも、疫学的および臨床的観点から重要であ
る。
【００２１】本発明の実施により、種々の検出法で引き
続き用いるためのＤＮＡ、ＲＮＡおよび細胞成分を提供
する、ミコバクテリアのための急速且つ簡単な溶菌方法
を提供する。
【００２２】下記の実施例で、本明細書に記載した発明
の具体的な実施態様を例証する。当業者に明らかである
ように、種々の変更および修正が可能であり且つ記載し
た発明の範囲内であると考えられる。
【００２３】
【実施例】
【００２４】
【実施例１】目的 ：この実験では、当量（重量および酵素単位によ
る）を用いる精製アクロモペプチダーゼ酵素と粗生成物
との比較をバクテク（Ｂａｃｔｅｃ）培養物で比較す
る。材料 ： −「粗製」アクロモペプチダーゼ−［シグマ（Ｓｉｇｍ
ａ）、ミズーリ州、セント・ルイス、ｃａｔ＃Ａ−７５
５０ ｌｏｔ＃１２７Ｆ−６８３９１］ −「精製」アクロモペプチダーゼ−（シグマ、ｃａｔ＃
Ａ−３４２２ ｌｏｔ＃６３０Ｈ−０４３８） −ヒト型結核菌［菌株Ｈ３７ＲＶ、アメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙ
ｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴ
ＣＣ）］およびエム・フォルツイツムのプールされたバ
クテク培養物 −アムレスコ（Ａｍｒｅｓｃｏ）（ソロン（Ｓｏｌｏ
ｎ）、ＯＨ）ＴＥ（１０ミリモルトリス−ＨＣｌ、１ミ
リモルＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）緩衝フェノール／クロロ
ホルム（１：１）操作 ： −ヒト型結核菌およびエム・フォルツイツム（それぞれ
の種に４個のペレット）のペレット２ｍｌを単離する。
【００２５】−下記の処方にしたがってペレットを再構
成する。
【００２６】「粗製」アクロモペプチダーゼ：１ｍｇ／
ｍｌ ５５０単位／ｍｇ、１００単位＝１８２マイクロ
リットル 「精製」アクロモペプチダーゼ：１ｍｇ／ｍｌ ２５，
０００単位／ｍｇ，１００単位＝４マイクロリットル ＃１ 粗製アクロモペプチダーゼ５０μｇ＝５０マイク
ロリットル＋ＴＲｉｚｍａ９．０（トリスＨＣｌ＋トリ
ス−ヒドロキシドの混合物を予めｐＨ調整して一定のｐ
Ｈにする）４５０マイクロリットル（２７単位） ＃２ 精製アクロモペプチダーゼ５０μｇ＝５０マイク
ロリットル＋ＴＲｉｚｍａ９．０を４５０マイクロリッ
トル（１２５０単位） ＃３ 粗製アクロモペプチダーゼ１００単位＝１８２マ
イクロリットル＋ＴＲｉｚｍａ９．０を３１８マイクロ
リットル（１８２μｇ） ＃２ 精製アクロモペプチダーゼ１００単位＝４マイク
ロリットル＋ＴＲｉｚｍａ９．０を４９６マイクロリッ
トル（４μｇ） −全試料を渦動させた後、５０℃で３０分間インキュベ
ートする。
【００２７】−２回のフェノール／クロロホルム抽出に
続いて、エタノールで抽出を行う。試料を沈殿させ且つ
高速真空（ｓｐｅｅｄ−ｖａｃ）で乾燥させた後、ペレ
ットをＴＥ緩衝液１０マイクロリットル中に再構成さ
せ、そして試料を１％アガロースゲルに流す。
【００２８】−試料は、臭化エチジウム１μｇ／ｍｌで
染色され、紫外線下で可視化された。結果（バンド強
度）は、粗製酵素が部分精製酵素よりも十分に作用する
ことを示す。更に多量のＤＮＡが、粗製酵素によってヒ
ト型結核菌およびエム・フォルツイツムから放出され
た。
【００２９】
【実施例２】目的 ：この実験では、８種類のミコバクテリアについて
１００単位のアクロモペプチダーゼを用いて実験する。
ミコバクテリアは、 鳥型結核菌 エム・スクロフラセウム エム・イントラセルラレエ エム・ゴルドネエ ヒト型結核菌 エム・カンサシイ エム・フォルツイツム エム・ケロネエ である。
【００３０】材料： −粗製アクロモペプチダーゼ −ミコバクテリアの８種類のプールしたバクテク培養物 −アムレスコＴＥ緩衝フェノール／クロロホルム操作 ： −それぞれの種のペレット２ｍｌを単離する。
【００３１】−各ペレットをＴＲｉｚｍａ９．０の５０
０マイクロリットル中に再構成する。 −アクロモペプチダーゼ（３６マイクロリットルまたは
５ｍｇ／ｍｌストック＝２７５０単位／ｍｇ）１００単
位と一緒に５０℃で３０分間インキュベートする。 −インキュベートしながら渦動させる（２または３
回）。
【００３２】−それぞれについて２回のフェノール／ク
ロロホルム抽出を行う。
【００３３】−試料を−２０℃で一晩中エタノール沈殿
させる。
【００３４】−４℃で１／２時間回転させ、エタノール
を除去し、ペレットをヴァーティス（ｖｉｒｔｉｓ）凍
結乾燥器で３０分間乾燥させる。ＴＥ１７マイクロリッ
トルおよび添加染料３マイクロリットル中に再懸濁させ
る。
【００３５】−１％アガロースで電気泳動を行う。臭化
エチジウムで１０分間染色した後、紫外線下で可視化す
る。
【００３６】結果は、同一寸法のＤＮＡが全部の種につ
いて見られることを示す（ゲル可視化）。
【００３７】
【実施例３】目的 ： 一連の酵素をヒト型結核菌の溶菌効率についてスクリー
ンすること。
【００３８】材料： −ヒト型結核菌 −リゾチーム（シグマ、ｃａｔ＃Ｌ−６８７６ ｌｏｔ
＃３９Ｆ−８２１０） −アクロモペプチダーゼ−（シグマ、ｃａｔ＃Ａ−３５
４７ ｌｏｔ＃８８Ｆ−０７９９） −リポキシダーゼ（シグマ、ｃａｔ＃Ｌ−７３９５ ｌ
ｏｔ＃１１８Ｆ−０５４２１） −混合グリコシダーゼＡ［シー・ラムダス（Ｃ．Ｌａｍ
ｄａｓ）由来、セカガク（Ｓｅｋａｇａｋｕ）、マイル
ズ（Ｍｉｌｅｓ）、インディアナ州、エルクハート、ｌ
ｏｔ＃８Ｌ８４８０３） −チモラーゼ（Ｚｙｍｏｌａｓｅ）２０Ｔ（セカガク／
マイルズ、ｃａｔ＃３２−０９２−１ ｌｏｔ＃２） −混合グリコシダーゼＢ［ティー・コルネリウス（Ｔ．
Ｃｏｒｎｅｌｉｕｓ）由来、セカガク、ｌｏｔ＃ＥＴ８
４７０１］ −溶菌酵素（Ｌｙｓｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅｓ）Ａ［トリ
コデルマ・ハーザニウム（Ｔｒｉｃｏｄｅｒｍａ ｈａ
ｒｚａｎｉｕｍ）由来、シグマ、ｃａｔ＃Ｌ−２２６５
ｌｏｔ＃３６Ｆ−０８０］ −溶菌酵素Ｂ［リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔ
ｏｎｉａ Ｓｏｌａｎｉ）由来、シグマ、ｃａｔ＃Ｌ−
８７５７ ｌｏｔ＃４６８−０２７３］ −ホスホリパーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ）Ａ
（シグマ、ｃａｔ＃Ｄ−６５３４ ｌｏｔ＃１２９Ｆ−
８００５） −リパーゼ（シグマ、ｃａｔ＃Ｌ−４３８４ ｌｏｔ＃
８８Ｆ−０２０８１） −ムタノライシン（シグマ、ｃａｔ＃Ｍ−９９０１ ｌ
ｏｔ＃９８Ｆ−６８２１１） −アクロモペプチダーゼ／ムタノライシンカクテル（１
０ｍｇ／ｍｌ／１ｍｇ／ｍｌ） −ジェンプローブ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ）（カリホルニ
ア州、サン・ディエゴ）溶菌試薬試験管（ｌｏｔ＃９２
０８４、保証期間１２／１６／９１） −１：１フェノール／クロロホルム（トリス飽和ＢＲＬ
５５０９０Ａ ｌｏｔ＃７１２０９／バクスター（Ｂ
ａｘｔｅｒ）Ｂ＆Ｊ ｃａｔ＃６７−６６−３ｌｏｔ＃
Ａ Ｗ３４２） −エタノール［フィシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）（ペンシル
バニア州、ピッツバーグ）Ｅ−５７５−５００ ｌｏｔ
＃８８７３０９］７０％ −３モル酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５ −凍結乾燥器［サバント（Ｓａｖａｎｔ）高速真空濃縮
器型］ −ＴＥ緩衝液 −他の電気泳動装置操作 ： （１）１３本の試験管それぞれに、ペレットにしたヒト
型結核菌２ｍｌを入れた後、傾瀉した。
【００３９】（２）それぞれにＨ２Ｏ９０マイクロリッ
トル（ＧＥＮプローブ試験管を除き、それには１００マ
イクロリットルを入れた）および酵素１０マイクロリッ
トルを加えて、最終濃度を５００ｍｇ／ｍｌにした（総
量５０μｇ）。
【００４０】（３）全部の試験管を３７℃で３０分間イ
ンキュベートした（ＧＥＮプローブはプロトコルにした
がって行った）。
【００４１】（４）水２００マイクロリットルを各試験
管に加えて、容量を３００マイクロリットルにした後、
２回のフェノール／クロロホルム抽出を行った（ＧＥＮ
プローブを含む）。
【００４２】（５）３モル酢酸ナトリウム３０マイクロ
リットルおよびエタノール６００マイクロリットルを水
性層に加え、この混合物を−２０℃で週末の間中インキ
ュベートした。
【００４３】（６）試料を４℃で３０分間回転させ、過
剰のエタノールを除去し、そしてペレットを凍結乾燥器
中で１時間乾燥させた。
【００４４】（７）試料をＴＥ２０マイクロリットル＋
添加緩衝液３マイクロリットル中に再懸濁させ、１５０
Ｖ（９４ＶＨ）で３５分間電気泳動を行った（１×ＴＡ
Ｅ緩衝液中１％アガロースゲル）（４０ミリモルトリス
−アセテート／１ミリモルＥＤＴＡ）。
【００４５】（８）ゲルを臭化エチジウムで染色し（１
μｇ／ｍｌ）、紫外線下で可視化した。
【００４６】結果は、アクロモペプチダーゼで放出され
たＤＮＡ寸法が明確な２３，０００塩基対であることを
示す。他の酵素で多量のＤＮＡを放出したものはなかっ
た。
【００４７】
【実施例４】この実験では、第二組の酵素について、ミ
コバクテリアを溶菌し、同時に、ＤＮＡを可能な検出法
のために保持する能力をスクリーンする。
【００４８】材料： −ヒト型結核菌 −ジェンプローブ溶菌試験管酵素 １．アクロモペプチダーゼ ２．Ｏ−グリカナーゼ（Ｇｌｙｃａｎａｓｅ）［ジェン
ザイム（Ｇｅｎｚｙｍｅ）（マサチューセッツ州、ボス
トン）コードＯ−ＡＳＥ Ｌｏｔ＃３９１７８］ ３．
ライティカーゼ（Ｌｙｔｉｃａｓｅ）［アルトロバクタ
ー・ルレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｌｕｒｅｕ
ｓ）由来、シグマ、Ｃａｔ＃Ｌ−８１３７ Ｌｏｔ＃６
９Ｆ−６８１９］ ４．ヒアルウロニダーゼ（ＶＩ−Ｓ型、シグマ、Ｃａｔ
＃Ｈ−３６３１ Ｌｏｔ＃８８Ｆ−８０７） ５．サーモライシン（Ｔｈｅｒｍｏｌｙｓｉｎ）［バチ
ルス・サーモプロテクリティクス・ロッコー（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ Ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｔｅｃｌｙｔｉｃｕｓ
ｒｏｋｋｏ）由来プロテアーゼＸ型、シグマ、Ｃａｔ＃
Ｐ−１５１２Ｌｏｔ＃９７８−０８３３］ ６．α−Ｌ−フコシダーゼ［ベーリンガー・マンハイム
（ＢｏｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）、インディア
ナ州、インディアナポリス、Ｃａｔ＃１０４９４５ Ｌ
ｏｔ＃１１０９８２２−１０］操作 試料を、実施例３の場合と同じ方法で処理した。基本的
に、ミコバクテリア２ｍｌを試料毎に用いた。試料を、
Ｈ２Ｏ中の酵素１００マイクロリットル中に濃度５００
μｇ／ｍｌ（総量５０μｇ）で再懸濁させ、全試料を３
７℃で３０分間インキュベートした。ジェンプローブを
対照として実験した（６０℃で１５分間音波破砕するこ
とを含んだ）。２回のフェノール／クロロホルム抽出
を、フコシダーゼ試料を用いて行う一つを除いて実施
し、試料をエタノール中に沈殿させ、凍結乾燥し、ＴＥ
緩衝液に再懸濁させ、そして１％アガロースゲルに流し
た後、臭化エチジウムで染色した。
【００４９】目視結果は、アクロモペプチダーゼ酵素が
他の酵素よりも多量のＤＮＡを放出することを示す。
【００５０】
【実施例５】この実験で、アクロモペプチダーゼを用い
るミコバクテリアの溶菌のためのｐＨおよび緩衝液の条
件を最適にする。
【００５１】材料： −ヒト型結核菌 −バクテクボトル＃１６ −アクロモペプチダーゼ（シグマ、Ｃａｔ＃Ａ−３５４
７ Ｌｏｔ＃８８Ｆ−０７９９） −トリズマ７．０（Ｅ Ｃａｔ＃３５０３ Ｌｏｔ＃８
９Ｆ−５６１５） −トリズマ８．０（シグマ、Ｃａｔ＃Ｔ−４７５３ Ｌ
ｏｔ＃２８Ｆ−５６２８）−ホウ酸［アルドリッチ（Ａ
ｌｄｒｉｃｈ）、ウィスコンシン州、ミルウォーキー、
Ｃａｔ＃２６，６４６−２ Ｌｏｔ＃３５０１ＴＪ） −塩化ナトリウム（シグマ、Ｃａｔ＃Ｓ−９６２５ Ｌ
ｏｔ＃２７Ｆ−６０８６） −フェノール：クロロホルム１：１、トリス飽和 −７０％エタノール（バクスター、ノース・カロライナ
州、シャーロット、Ｂ＋Ｊ製、Ｌｏｔ＃Ｅ−Ｋ４７６） −３モル酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２ −凍結乾燥装置［ヴァーティス（Ｖｉｒｔｉｓ）型）］ −電気泳動装置 下記の４種類の緩衝液を５０ｍｌの量で調製した。
【００５２】１．１００ミリモルトリズマ、ｐＨ７．０
＋１０ミリモルＮａＣｌ ２．１００ミリモルトリズマ、ｐＨ８．０＋１０ミリモ
ルＮａＣｌ ３．１００ミリモルトリズマ、ｐＨ９．０＋１０ミリモ
ルＮａＣｌ ４．６０ミリモルホウ酸塩、ｐＨ９．０＋１０ミリモル
ＮａＣｌ ミコバクテリア２ｍｌずつを４部分に採取し、そのペレ
ットを各緩衝液１ｍｌ中に再懸濁させた。
【００５３】５ｍｇ／ｍｌのアクロモペプチダーゼのＨ
２Ｏ中溶液１０マイクロリットルを各１ｍｌ部分に加え
た（総量５０μｇ）。
【００５４】全試料を約５０℃で３０分間インキュベー
トし、インキュベーション中に数回渦動させた。
【００５５】各試料で、２回のフェノール／クロロホル
ム抽出を行った後、２容量のエタノールおよび１／１０
容量の３モル酢酸ナトリウムと一緒に−２０℃で一晩中
インキュベーションを行った。
【００５６】ＤＮＡを沈殿させ、ペレットを高速真空で
乾燥させ、追跡用染料を含むＴＥ中に再懸濁させて、そ
してアガロースゲルに流した。
【００５７】結果は、トリズマ９．０＋１０ミリモルＮ
ａＣｌが最もよい緩衝液であることを示す。この緩衝液
を用いると、他のものよりも多量のＤＮＡが観察され
る。
【００５８】本発明を具体的な実施態様に関して記載し
たが、それらの詳細は制限として解釈されるべきではな
く、種々の同等物、変更および修正を、それらの精神お
よび範囲から逸脱することなく復元させることができる
ことは明らかであり、このような同等の実施態様が本発
明に包含されるものであることは理解される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:32） (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:33） (Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:32） (Ｃ１２Ｑ 1/04 Ｃ１２Ｒ 1:33） (72)発明者 ジリアン・エイ・ロブソン アメリカ合衆国ノース・カロライナ州 27312，ピッツボロー，フィアリントン・ ポスト 46

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ミコバクテリアを、溶菌有効量の酵素ア
    クロモペプチダーゼに対して暴露することを必須とす
    る、ミコバクテリアを溶菌する方法。
  2. 【請求項２】 溶菌有効量の酵素アクロモペプチダーゼ
    が約５０〜約１０００単位である、請求項１に記載の方
    法。
  3. 【請求項３】 ミコバクテリアが、鳥型結核菌（Ｍ．ａ
    ｖｉｕｍ）、エム・イントラセルラレエ（Ｍ．ｉｎｔｒ
    ａｃｅｌｌｕｌａｒａｅ）、エム・ゴルドネエ（Ｍ．ｇ
    ｏｒｄｏｎａｅ）、ヒト型結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕ
    ｌｏｓｉｓ）、エム・カンサシイ（Ｍ．ｋａｎｓａｓｉ
    ｉ）、エム・フォルツイツム（Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕ
    ｍ）、エム・ケロネエ（Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ）、ウシ
    型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、エム・スクロフラセウム
    （Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、パラ結核菌（Ｍ．
    ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、チモテ菌（Ｍ．
    ｐｈｌｅｉ）、エム・マリヌム（Ｍ．ｍａｒｉｎｕ
    ｍ）、エム・シミエー（Ｍ．ｓｉｍｉａｅ）、エム・ス
    クロフラセウム（Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）、エ
    ム・スズルガイ（Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ）、らい菌（Ｍ．
    ｌｅｐｒａｅ）、エム・キセノピ（Ｍ．ｘｅｎｏｐ
    ｉ）、エム・ウルセランス（Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ）、
    鼠らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ）、エム・フ
    ラベセンス（Ｍ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、エム・テレ
    エ（Ｍ．ｔｅｒｒａｅ）、エム・ノンクロモジェニクム
    （Ｍ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ）、エム・マ
    ルメンス（Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎｓｅ）、エム・アシアテ
    ィクム（Ｍ．ａｓｉａｔｉｃｕｍ）、エム・ヴァケエ
    （Ｍ．ｖａｃｃａｅ）、エム・ガストリ（Ｍ．ｇａｓｔ
    ｒｉ）、エム・トリビアル（Ｍ．ｔｒｉｖｉａｌｅ）、
    エム・ヘモフィクム（Ｍ．ｈａｅｍｏｐｈｉｃｕｍ）、
    エム・アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、エム
    ・サーモレジスタブル（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｒｅｓｉｓｔ
    ａｂｌｅ）およびスメグマ菌（Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉ
    ｓ）から成る群より選択される、請求項１に記載の方
    法。
  4. 【請求項４】 ミコバクテリアが、ヒト型結核菌である
    請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】 細胞成分の単離をさらに含む、請求項１
    に記載の方法。
  6. 【請求項６】 ミコバクテリアの核酸の増幅をさらに含
    む、請求項１に記載の方法。
  7. 【請求項７】 ミコバクテリア同定試薬の付加をさらに
    含む、請求項１に記載の方法。
  8. 【請求項８】 ミコバクテリア同定試薬およびミコバク
    テリアを溶菌するのに有効な量のアクロモペプチダーゼ
    を含むキット。
  9. 【請求項９】 ミコバクテリア同定試薬が核酸プローブ
    である、請求項８に記載のキット。
  10. 【請求項１０】 融解剤を更に含む、請求項８に記載の
    キット。
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0552571A1 (en) * 1992-01-09 1993-07-28 Becton, Dickinson and Company Release of intracellular components
CA2121659C (en) * 1993-05-11 2000-11-28 Michael C. Little Sample processing method for mycobacteria
IL110463A0 (en) * 1993-08-13 1994-10-21 Du Pont In situ extraction of microbial DNA
AU682538B2 (en) * 1993-11-16 1997-10-09 Becton Dickinson & Company Process for lysing mycobacteria
US6071480A (en) * 1994-12-22 2000-06-06 Abbott Laboratories Method for generating a standing sonic wave, methods of sonication with a standing sonic wave, and a standing sonic wave sonicator
US5985593A (en) * 1996-10-11 1999-11-16 Integrated Research Technology, L.L.C. Compositions and methods for enzymatic decontamination
US6605434B1 (en) 1999-03-16 2003-08-12 Human Genome Sciences, Inc. Direct bacterial lysate sequencing
ITMI20051558A1 (it) 2005-08-09 2007-02-10 Isagro Spa Miscele e-o composizioni sinergiche cin elevata attivita'fungicida
WO2011115975A2 (en) * 2010-03-16 2011-09-22 Becton, Dickinson And Company Use of achromopeptidase for lysis at room temperature
US9528987B2 (en) 2011-06-23 2016-12-27 University Of Washington Reagent patterning in capillarity-based analyzers and associated systems and methods
WO2013117968A1 (en) 2012-02-10 2013-08-15 Reametrix Inc. Methods for lysing bacteria from sample and isolating cellular components therefrom, and kits therefor
WO2014116756A1 (en) 2013-01-22 2014-07-31 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Sequential delivery of fluid volumes and associated devices, systems and methods
DK3286323T3 (da) 2015-04-24 2023-03-13 Becton Dickinson Co Multipleks detektion af bakteriel vaginose
WO2022095921A1 (en) 2020-11-05 2022-05-12 Becton, Dickinson And Company Multiplex detection and typing of vibrio cholerae
AU2021373166A1 (en) 2020-11-05 2023-05-11 Becton, Dickinson And Company Multiplex detection of bacterial respiratory pathogens
US20240060145A1 (en) 2020-11-05 2024-02-22 Becton, Dickinson And Company Rapid identification and typing of vibrio parahaemolyticus

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4626502A (en) * 1984-01-27 1986-12-02 Abbott Laboratories Method for exposing bacterial antigen in bacterial cells assay using same
GB8414273D0 (en) * 1984-06-05 1984-07-11 Oxoid Ltd Identifying streptococcal grouping
US4777130A (en) * 1984-12-05 1988-10-11 Andra Biologicals Isolation of mycobacterial a 60 antigen for diagnostic purposes
AU604684B2 (en) * 1986-03-20 1991-01-03 Gen-Probe Incorporated Method for releasing RNA and DNA from cells
EP0261955A3 (en) * 1986-09-26 1989-06-07 E.I. Du Pont De Nemours And Company Process for immobilization of dna
US4900677A (en) * 1986-09-26 1990-02-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for rapid isolation of high molecular weight DNA
CA2016553A1 (en) * 1989-05-16 1990-11-16 Dyann F. Wirth Dna hybridization probes for identification of mycobacteria

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAN J MICROBIOL=1984 *
MICROBIOL IMMUNOL=1982 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2067692C (en) 1999-01-05
US5185242A (en) 1993-02-09
EP0520756A3 (en) 1993-04-21
DE69202111D1 (de) 1995-05-24
CA2067692A1 (en) 1992-12-25
EP0520756A2 (en) 1992-12-30
DE69202111T2 (de) 1995-11-23
EP0520756B1 (en) 1995-04-19
JPH05292999A (ja) 1993-11-09
MX9202644A (es) 1992-12-01
SG44692A1 (en) 1997-12-19

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