JPH0767655A - 組み合せポックスウイルス用プロモーター、及びそれを有する組み換えポックスウイルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 強力なポックスウイルスプロモーターを提供
する。 【構成】 プロモーター活性を有するＤＮＡ断片を４つ
以上連結させ、組み合せポックスウイルスプロモーター
を作製する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ポックスウイルスプロ
モーター活性を有するＤＮＡ断片およびその利用に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】近年、組み換えウイルスは、タンパク質
の製造源としての利用や生ワクチンとしての利用が盛ん
である。タンパク質の製造源として組み換えウイルスを
利用する場合、できるだけ多量に目的とするタンパク質
を発現させることが求められる。また、生ワクチンとし
て組み換えウイルスを利用する場合にも、充分な防御免
疫を付与できるだけのタンパク質が生体内で発現するこ
とが求められている。組み換えウイルスの発現量を増加
させるために、ウイルスの種類、プロモーターをはじめ
とする遺伝子発現調節機構についてなど、さまざまな研
究がなされている。例えば、強力なプロモーターを見い
だした例としては、Ｄａｖｉｄｓｏｎらは、ワクチニア
ウイルスのｐ７．５プロモーターの配列を一部改変し、
大量にタンパク質を発現させることのできる新規なプロ
モーターを合成し（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１０、
７４６−７６９（１９８９）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．、２１０、７７１−７８４（１９８９））ている。
しかし、このような強力なプロモーターはごくわずかし
か知られておらず、新たな強力プロモーターが求められ
ているのが現状である。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、かかる
従来技術の下でポックスウイルス内で機能する強力なプ
ロモーターを見いだすべく鋭意検討した結果、プロモー
ターを複数連結させることによりプロモーターとしての
強力な機能を発揮することを見いだし、本発明を完成さ
せるに到った。

【０００４】

【課題を解決するための手段】かくして本発明によれ
ば、プロモーター活性を有するＤＮＡ断片を４つ以上連
結させることを特徴とする組み合せポックスウイルスプ
ロモーター、該プロモーターの支配下に外来遺伝子を結
合させてなるＤＮＡ断片をポックスウイルスの増殖に非
必須な領域に組み込んだ組み換えポックスウイルス、お
よびこれを有効成分とする家禽用組み換え生ワクチンが
提供される。

【０００５】本発明において使用されるプロモーター活
性を有するＤＮＡ断片（以下、単にプロモーターとい
う）は、ポックスウイルス内で機能するものであれば特
に限定されない。このようなプロモーターの具体例とし
ては、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＶｉｒｏｌｏｇｙ，５１，
第６６２〜６６９頁（１９８４年）に例示されるような
ワクチニアウイルス（以下、ＶＶという）のプロモータ
ー、具体的には７．５ＫポリペプチドをコードするＶＶ
遺伝子のプロモーター、１１Ｋポリペプチドをコードす
るＶＶ遺伝子のプロモーター、１９Ｋポリペプチドをコ
ードするＶＶ遺伝子のプロモーター、４２Ｋポリペプチ
ドをコードするＶＶ遺伝子のプロモーター、チミジンキ
ナーゼをコードするＶＶ遺伝子のプロモーター、２８Ｋ
ポリペプチドをコードするＶＶ遺伝子のプロモーターな
どが例示される。また、Ｄａｖｉｄｓｏｎらの文献
（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１０，第７４６〜７４９
頁，第７７１〜７８４頁，１９８９年）を参考にして合
成されたプロモーターである図１および図２記載のプロ
モーターなどが例示される。このようなプロモーターの
中でも好ましくは、７．５Ｋプロモーターと同等以上の
活性を有するプロモーター、より好ましくは７．５Ｋプ
ロモーターより強力な活性を有するプロモーター、更に
好ましくは図１記載のプロモーター、図２記載のプロモ
ーター、あるいはこれらの塩基配列との相同性が９０％
以上、好ましくは９５％以上のプロモーターである。本
発明の組み合せプロモーターは、上述のようなプロモー
ターを常法により４つ以上連結させたものである。連結
するプロモーターは、一種類のプロモーターであっても
二種類以上のプロモーターであってもよく、複数種類の
プロモーターを複数連結させることもできる。また、プ
ロモーターの連結順序については特に限定されないが、
初期プロモーターと後期プロモーターとを組み合わせる
場合は、後期プロモーターの下流側に初期プロモーター
を連結させることが好ましい。

【０００６】本発明の組み換えポックスウイルスは、上
記本発明の組み合せプロモーターの下流に外来遺伝子を
連結させてなるＤＮＡ断片をポックスウイルスの増殖に
非必須なＤＮＡ領域に組み込んだ組み換えウイルスであ
る。このような本発明の組み換えポックスウイルス（以
下、組み換えウイルスということがある）は、常法、例
えば特開平１−１６８２７９号公報に記載の方法により
構築される。即ち、ポックスウイルスの非必須領域に本
発明の組み合せプロモーターを組み込んだ組み換えベク
ターに、該プロモーターの下流に抗原遺伝子を組み込ん
だ組み換え用ベクターを作製する。組み換えベクターの
構築に当たっては遺伝子操作の容易な大腸菌の系を用い
れば良い。ついで、ポックスウイルス感染培養細胞へ常
法にしたがって該組み換え用ベクターを移入し、組み換
えウイルスを作製する。目的とする組み換えウイルス
は、プラークアッセイ等の方法により組み換えウイルス
を得ることができる。組み換えウイルスの単離を容易に
するために、プロモーターや外来遺伝子と共にβ−ｇａ
ｌ遺伝子などのマーカー遺伝子を組み込むこともでき
る。

【０００７】本発明で用いられるポックスウイルスは、
ポックスウイルスに属するウイルスであれば特に限定さ
れず、ラクーンポックスウイルス、ワクチニアウイルス
等のオルソポックスウイルス類やピジョンポックスウイ
ルス、フォウルポックスウイルス（以下、ＦＰＶとい
う）、カナリーポックスウイルス、七面鳥ポックスウイ
ルス等のアビポックスウイルス類などが例示されるが、
好ましくはワクチニアウイルス、七面鳥ポックスウイル
ス、ピジョンポックスウイルス、ＦＰＶであり、より好
ましくはピジョンポックスウイルス、ＦＰＶである。ワ
クチニアウイルスの具体例としては、コペンハーゲン
株、ＷＲ株が挙げられ、ＦＰＶの具体例としては、ＡＴ
ＣＣ ＶＲ−２５１、ＡＴＣＣ ＶＲ−２４９、ＡＴＣ
Ｃ ＣＲ−２５０、ＡＴＣＣ ＶＲ−２２９、ＡＴＣＣ
ＶＲ−２４９、ＡＴＣＣ ＶＲ−２８８、西ヶ原株、
泗水株、ＣＥＶＡ株、ＣＥＶＡワクチン株由来のウイル
スのうち鶏胚繊維芽細胞に感染したときに大きいプラー
クを形成するウイルス株（以下、ＵＳＤＡ株という）な
どのごときＦＰＶやＦＰＶと近縁のウィルスであって、
ＮＰ株（鶏胎化鳩痘毒中野系株）などのように鶏痘生ワ
クチン株として使用されるウィルスなどが例示される。
これらの株はいずれも市販されているなど、容易に入手
することができる。

【０００８】本発明で使用されるポックスウイルスの増
殖に非必須な領域（以下、非必須領域という）として
は、例えば、ワクチニアウイルスのＴＫ遺伝子領域、Ｈ
Ａ遺伝子領域などが例示され、アビポックスウイルスの
非必須領域としては、ＴＫ遺伝子領域や特開平１−１６
８２７９号に記載されている領域を使用することができ
る。その具体的としては、例えば前記公報に記載された
ＡＰＶ・ＮＰ株ＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片（７．３ｂ
ｐ）、ＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（約５．０ｂ
ｐ）、ＢａｍＨＩ断片（約４．０ｂｐ）、ＨｉｎｄＩＩ
Ｉ断片（約５．２ｂｐ）、クエイルポックスウイルスの
ＴＫ遺伝子領域、七面鳥ポックスウイルスのＴＫ遺伝子
領域等、あるいはこれらと相同組み換えを起こす領域が
例示される。

【０００９】本発明で使用されるベクターとしては、例
えばｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＢＲ３２７、ｐＢ
Ｒ３２８、ｐＵＣ７、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＵＣ１９
などのプラスミド、λファージ、Ｍ１３ファージなどの
ファージ、ｐＨＣ７９（ジーン，１１，第２９１頁，１
９８０年）などのコスミドが例示される。

【００１０】本発明で使用される抗原遺伝子はポックス
ウイルス内で発現しうるものであれば特に限定されない
が、ニューカッスル病ウイルスのＨＮタンパク質をコー
ドする遺伝子（特開昭６２−１６３６９３号公報）、ニ
ューカッスル病ウイルスのＦタンパク質（特開昭６３−
２４８８８号公報）、大腸菌ＮＺ−９１０１（微工研菌
寄１２４２２号）から、常法によって抽出できる約６．
０Ｋｂのプラスミド（以下、ｐＩＢＤＶという）が保有
しているファブリキウル嚢病ウイルス（以下、ＩＢＤＶ
という）由来の大セグメント（以下、ＳｅｇＡという）
など鳥類感染ウイルス由来のものであるのが好ましく、
ＩＢＤＶのＳｅｇＡがとりわけ好ましい。

【００１１】上記の方法により構築された本発明の組み
換えウイルスは生ワクチンとして鳥類に接種することが
できる。本発明のワクチンの調製方法は特に限定されな
いが、例えば次の方法によって調製される。本発明の組
み換えウイルスを該ウイルスが生育することのできる細
胞（以下、宿主細胞という）に感染させ、増殖させたの
ち、細胞を回収し破砕する。この細胞破砕物を遠心分離
機によって遠心分離チューブ中で沈澱物と組み換えウイ
ルスを含有する高力価上清とに分離する。得られた上清
は、実質的に宿主細胞を含まず、細胞培養培地と組み換
えウイルスを含んでおり、ワクチンとして使用すること
ができる。この上清にはアジュバントを加えたり、薬理
学的に問題のないキャリアー、例えば生理食塩水などを
添加し、希釈することもできる。また、この上清は凍結
乾燥してもワクチンとして使用できる。本発明のワクチ
ンの家禽への投与方法は特に限定されず、例えば皮膚に
引っかき傷をつけてワクチンを接種する方法、注射によ
り接種する方法、飼料や飲み水に混合して経口投与す
る、エアロゾルやスプレーなどにより吸入させる方法な
どが挙げられる。ワクチンとして使用するには、通常の
生ワクチンの使用と同様でよく、例えば、ニワトリ１羽
当り１０⁴〜１０⁸プラーク・フォーミング・ユニット
（以下、ＰＦＵという）程度を接種する。注射により接
種する場合、通常０．１ｍｌ程度の生理食塩水などの等
張溶媒に本発明の組み換えウイルスを懸濁して用いるこ
とができる。本発明のワクチンは、普通の条件下で保
存、使用することが可能である。例えば、本発明の組み
換えウイルスを凍結乾燥すれば、室温（２０〜２２℃）
での保存が可能である。また、ウイルスの懸濁液を−２
０〜−７０℃下で凍結させ、保存することも可能であ
る。

【００１２】

【発明の効果】かくして本発明によれば、強力なポック
スウイルス用プロモーターを組み込んだ高発現率の組み
換えポックスウイルスを構築することができる。この組
み換えポックスウイルスを用いることにより、効率よく
外来遺伝子を発現させることができ、有効な組み換え生
ワクチンを得ることができる。

【００１３】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明
する。 実施例１ 組み合わせプロモーターの構築と該プロモー
ターの活性測定 （１）ポックスウイルスプロモーターの合成とクローニ
ング Ｍｏｓｓらによって報告されたポックスウイルス初期プ
ロモーター、及び後期プロモーターの配列を参考に、Ｄ
ＮＡシンセサイザーＧｅｎｅｔＡ−ＩＩ（日本ゼオン社
製）を用いて図１及び図２の塩基配列で表される合成プ
ロモーターを作製した。図１の塩基配列で表されるプロ
モーター（以下、Ｅプロモーターという）は、初期プロ
モーターとして機能するものであり、図２の塩基配列で
表されるプロモーター（以下、Ｌプロモーターという）
は、後期プロモーターとして機能するものである。ｐＵ
Ｃ１８を制限酵素ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し
た後、１．５％アガロース電気泳動で、２．６ＫｂのＤ
ＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片に、前記Ｅプロモ
ーターとＬプロモーターを加え、リガーゼで連結した。
これを用いてコンピーテントな大腸菌を形質転換し、ア
ンピシリン５０μｇ／ｌ存在下のＬＢプレート上に、コ
ロニーを形成するものからＥプロモーターとＬプロモー
ターを単離し、得られたプラスミドをｐＵＣ１８−ＬＥ
と命名した。また、このプラスミドに含まれるＬプロモ
ーターとＥプロモーターが連結した組み合せプロモータ
ーを、ＬＥプロモーターという命名した。

【００１４】（２）組み合わせプロモーターの構築（図
６、７、８、９、１０、１１参照） プラスミドｐＵＣ１８を制限酵素ＤｒａＩで消化し、Ｘ
ｈｏＩリンカー（５’−ＣＣＴＣＧＡＧＧ−３’）を導
入し、得られたプラスミドをｐＵＣ１８Ｘと命名した。
このプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＳｐｈＩで
消化し、この部位に図３に示される制限酵素ＭｌｕＩの
認識配列を含む合成ＤＮＡ（ＭｌｕＩアダプター）を導
入し、ｐＵＣ１８ＭｌｕＩを構築した。このプラスミド
を更に、制限酵素ＳｐｈＩとＸｂａＩで消化した後、ク
レノウフラグメントで処理し、リガーゼで連結して得ら
れたプラスミドをｐＵＣ１８ＭＫと命名した。前記
（１）で構築したｐＵＣ１８−ＬＥを制限酵素Ｈｉｎｄ
ＩＩＩとＭｌｕＩで消化した後、１．５％アガロースゲ
ル電気泳動で分離し約５０ｂｐのＤＮＡ断片を回収し
た。ｐＵＣ１８ＭＫを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩとＭｌｕ
Ｉで消化し、前記５０ｂｐのＤＮＡ断片を挿入し、得ら
れたプラスミドをｐＬｈと命名した。このプラスミドに
はＬプロモーターが含まれている。また、ｐＵＣ１８−
ＬＥを制限酵素ＭｌｕＩとＸｈｏＩで消化して得られる
約１．２Ｋｂの初期プロモーターを含むＤＮＡ断片と、
ｐＵＣ１８ＭＫを制限酵素ＭｌｕＩとＸｈｏＩで消化し
て得られる約２．０ＫｂのＤＮＡ断片をそれぞれアガロ
ースゲル電気泳動で分離し、回収した。これらの断片を
混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで連結し、プラスミドｐＥ
ｍを構築した。このプラスミドにはＥプロモーターが含
まれている。つづいてプラスミドｐＬｈを制限酵素Ｈｉ
ｎｄＩＩＩで消化した後、クレノウフラグメントで処理
し、平滑末端とし、ＢｇｌＩＩリンカー（５’−ＣＧＧ
ＡＴＣＣＧ−３’）を導入し、得られたプラスミドをｐ
Ｌｇと命名した。同様にしてｐＥｍのＭｌｕＩ部位にも
ＢｇｌＩＩリンカーを導入し、得られたプラスミドをｐ
Ｅと命名した。ｐＬｈを制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩ
とで消化し、アガロースゲル電気泳動により、Ｌプロモ
ーターを含む１．６Ｋｂの断片を回収した。この断片
と、ｐＬｇを制限酵素ＸｈｏＩとＢｇｌＩＩで消化し
て、アガロースゲル電気泳動により分離し、回収したＬ
プロモーターを含む１．２Ｋｂの断片とをＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで連結し、ｐ２Ｌｈを構築した。このプラスミド
にはＬプロモーターが二つ含まれている。同様にしてｐ
Ｌｇを制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで消化して、アガ
ロースゲル電気泳動により、Ｌプロモーターを含む１．
６Ｋｂの断片を回収した。この断片と、ｐＬｇを制限酵
素ＸｈｏＩとＢｇｌＩＩで消化して、アガロースゲル電
気泳動により分離し回収した１．２Ｋｂの断片とをＴ４
ＤＮＡリガーゼで連結し、得られたプラスミドをｐ２Ｌ
ｇと命名した。このプラスミドにはＬプロモーターが二
つ含まれている。

【００１５】さらにｐ２Ｌｈを制限酵素ＸｈｏＩとＢａ
ｍＨＩで消化し、アガロースゲル電気泳動により分離
し、Ｌプロモーターを二つ含む１．６Ｋｂの断片を回収
した。この断片とｐ２Ｌｇを制限酵素ＸｈｏＩとＢｇｌ
ＩＩで消化して、アガロースゲル電気泳動により分離し
回収したＬプロモーターを二つ含む１．２Ｋｂの断片と
をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合し、得られたプラスミドを
ｐ４Ｌｈと命名した。このプラスミドには、４つのＬプ
ロモーター（以下、４Ｌプロモーターという）が含まれ
ている。また、ｐＥを制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで
消化して、アガロースゲル電気泳動により分離し、Ｅプ
ロモーターを含む１．６Ｋｂの断片を回収した。この断
片とｐＥを制限酵素ＸｈｏＩとＢｇｌＩＩで消化して、
アガロースゲル電気泳動により分離し回収したＥプロモ
ーターを含む１．２Ｋｂの断片とをＴ４ＤＮＡリガーゼ
で連結し、得られたプラスミドをｐ２Ｅと命名した。こ
のプラスミドには２つのＥプロモーターが含まれてい
る。さらに、ｐ２Ｌｈを制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩ
で消化して、アガロースゲル電気泳動により分離し、Ｌ
プロモーター二つを含む１．６Ｋｂの断片を回収した。
この断片とｐ２Ｅを制限酵素ＸｈｏＩとＢｇｌＩＩで消
化して、アガロースゲル電気泳動により分離し、回収し
たＥプロモーター二つを含む１．２Ｋｂの断片とをＴ４
ＤＮＡリガーゼで結合し、得られたプラスミドをｐ２Ｌ
２Ｅｈと命名した。このプラスミドには、二つのＬプロ
モーターと二つのＥプロモーター（以下、２Ｌ２Ｅプロ
モーターという）が含まれている。

【００１６】（３）レポーター遺伝子の挿入 ｐＮＺ７６Ｂ（特開平２−５０１６４６号公報）を制限
酵素ＢａｍＨＩとＫｐｎＩで消化し、ＬａｃＺ遺伝子を
含む３．３ＫｂのＤＮＡ断片を回収した。上記（１）で
構築したプラスミドｐＵＣ１８−ＬＥと（２）で構築し
たプラスミドｐ２Ｌ２Ｅｈ及びｐ４Ｌｈを制限酵素Ｂａ
ｍＨＩとＫｐｎＩで消化し、先に回収したＬａｃＺを含
む断片を挿入し、得られたプラスミドをそれぞれｐＵＣ
ＬＥ／ｌａｃＺ、ｐ２Ｌ２Ｅ／ｌａｃＺ、ｐ４Ｌ／ｌａ
ｃＺと命名した。

【００１７】（４）プロモーター活性の測定 ６０ｍｍの細胞培養用皿中に培養された１×１０⁶個の
ＣＥＦ細胞に５×１０⁷ＰＦＵのフォウルポックスウイ
ルスＵＳＤＡ株を感染させ、３７℃、５％ＣＯ₂インキ
ュベーターで１．５時間培養した。この細胞をＰＢＳで
洗浄後、１００μｌのダルベッコＭＥＭ（日水製薬社
製：以下ＤＭＥという）に溶解させた２０μｇのｐ２Ｌ
２Ｅ／ｌａｃＺとｐ４Ｌ／ｌａｃＺのＤＮＡ溶液、およ
び比較例として同様の調整を行ったｐＮＺＬＥ／ｌａｃ
Ｚとをそれぞれ２倍濃度のＤＭＥと１対１で混合したリ
ポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社製）を混合した溶
液２００μｌを滴下し、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベ
ーターで２０時間培養した。細胞を５ｍｌのｌｙｓｉｓ
バッファー（０．１Ｍリン酸バッファー、１０ｍｌ Ｋ
Ｃｌ、１．０Ｍ ＭｇＳＯ₄、５０ｍＭ ２−メルカプ
トエタノール、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１２５％
ＮＰ−４０）中に回収し、室温で２時間放置した。細胞
がすべて溶けていることを確認した後、１００μｌ取
り、これを４００μｌの活性測定用バッファー（８０ｍ
Ｍリン酸バッファー、１０２ｍＭ ２−メルカプトエタ
ノール、９．０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、８．０ｍＭクロロフ
ェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＣＰＲ
Ｇ：ベーリンガーマンハイム社製））と混合し、吸光度
計で５分後の５７０ｎｍの吸光を測定することにより、
β−ガラクトシダーゼ活性を調べた。この結果、ｐＵＣ
ＬＥ／ｌａｃＺより得られた吸光度を１．００としたと
き、ｐ２Ｌ２Ｅ／ｌａｃＺ、ｐ４Ｌ／ｌａｃＺの吸光度
はそれぞれ１．５６及び１．６３であった。このことか
らｐＵＣＬＥ／ｌａｃＺに挿入されているＬＥプロモー
ターと比較して、本発明のプロモーターであるｐ２Ｌ２
Ｅ／ｌａｃＺに挿入されている２Ｌ２Ｅプロモーターや
ｐ４Ｌ／ｌａｃＺに挿入されている４Ｌプロモーター
は、優位に活性が高いことが判った。

【００１８】実施例２ ＩＢＤＶのＳｅｇＡ遺伝子ＤＮ
Ａを含む組み換えベクターｐＮＺ９９２９の構築 （１）第一の組み換えベクターの構築（図１２、１３、
１４、１５、１６、１７、１８参照） ＡＰＶの増殖に非必須な領域（約７．３ｂｐのＥｃｏＲ
Ｉ断片）をｐＵＣ１８のＥｃｏＲＩ部位に組み込んだプ
ラスミドｐＮＺ１３３（特開平１−１６８２７９号）の
ＡＰＶ・ＤＮＡ断片をさらに切り縮めた約２．７Ｋｂの
ＥｃｏＲＶ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ｐＵＣ１８のＥｃ
ｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクレノウフラグメント処
理した挿入して約５．４ｂｐのＤＮＡ断片とリガーゼで
連結し、プラスミドｐＮＺ１３３Ｓを構築した。ｐＮＺ
１３３Ｓは、常法でコンピーテントな大腸菌を形質転換
し、形質転換された大腸菌を培養して保存した。使用す
る際には、形質転換された大腸菌から常法で抽出・精製
して、用いた（以下、新しくプラスミドを構築した場合
は、同様の処理をした）。次に、ｐＮＺ１３３ＳのＥｃ
ｏＲＶ部位にｐＵＣ１８のＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩ
マルチクローニングサイトを挿入して、約５．４ｂｐの
プラスミドｐＮＺ１３３ＳＬを構築した。続いて実施例
１（１）で構築したプラスミドｐＵＣ１８−ＬＥを制限
酵素ＨｉｎｃＩＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断し合成プロモ
ーターを得た。ｐＮＺ１３３ＳＬを制限酵素ＨｉｎｃＩ
ＩとＨｉｎｄＩＩＩで切断した後、挿入し、約４．５Ｋ
ｂのＮＺ１３３ＳＬ−Ｐを構築した。

【００１９】（２）ＩＢＤＶのＳｅｇＡ遺伝子ＤＮＡを
含むハイブリッドプラスミドの作製 大腸菌ＮＺ−９１０１（微工研菌寄１２４２２号）か
ら、常法によって抽出できるＩＢＤＶのＳｅｇＡ遺伝子
ＤＮＡを有する約６．０ｂｐのプラスミドｐＩＢＤＶを
ＰｖｕＩで消化後、このＤＮＡ断片を接着末端をＤＮＡ
ポリメレースにより平滑末端とした。さらに、このＤＮ
Ａ断片をＫｐｎＩで消化し、これを１．５％アガロース
電気泳動に供した。約３．２ｂｐのＳｅｇＡ遺伝子ＤＮ
ＡのＫｐｎＩ−ＰｖｕＩ断片をアガロースゲルより抽出
し、エタノール沈澱により、ＳｅｇＡ遺伝子ＤＮＡのＫ
ｐｎＩ−ＰｖｕＩ断片を回収した。先に構築したｐＮＺ
１３３ＳＬ−ＰをＨｉｎｃＩＩ、ＫｐｎＩで消化した
後、フェノール・クロロホルム処理で抽出し、エタノー
ル沈澱により約５．４Ｋｂの開裂されたｐＮＺ１３３Ｓ
Ｌ−Ｐを回収した。開裂されたｐＮＺ１３３ＳＬ−Ｐ
ＤＮＡと、約３．３ＫｂのＳｅｇＡＤＮＡのＫｐｎＩ−
ＰｖｕＩ断片をライゲーションし、ＳｅｇＡ遺伝子ＤＮ
Ａを含む約８．７ＫｂのハイブリッドプラスミドｐＮＺ
１３３ＳＬ−Ｐ・ＳｅｇＡを構築した。

【００２０】（３）マーカー遺伝子の導入 ｐＭＡ００１（Ｓｈｉｒａｋａｗａら、Ｇｅｎｅ，２
８，第１２７頁，１９８４年）をＢａｍＨＩで消化後、
約３．３Ｋｂのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子を回収し
た。一方、ｐＵＣ１９をＢａｍＨＩ消化後、フェノール
・クロロホルム抽出し、エタノール沈澱により回収し、
上記で調製したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子とライゲー
ションし、約６．０Ｋｂのハイブリッドプラスミッドｐ
ＮＺ６６を構築した。ハイブリッドプラスミドｐＮＺ６
６をＨｉｎｄＩＩＩで完全消化した後、ＢａｍＨＩで部
分消化し、フェノール・クロロホルム処理で抽出後、エ
タノール沈澱により約６．０Ｋｂの開裂されたｐＮＺ６
６を回収した。図４に示される弱いプロモーター活性を
有する１７ｂｐのＦＰＶ由来の配列を含むＤＮＡ断片と
開裂されたｐＮＺ６６とライゲーションし、約６．０Ｋ
ｂのハイブリッドプラスミドｐＮＺ６６−Ｐを構築し
た。次にハイブリッドプラスミドｐＮＺ６６−ＰをＫｐ
ｎＩで消化した後、フェノール・クロロホルム処理で抽
出し、エタノール沈澱により開裂されたｐＮＺ６６−Ｐ
を回収した。開裂されたｐＮＺ６６−Ｐと図５に示すポ
ックスウイルスの初期転写終結シグナル（ＴＴ）を含む
ＤＮＡ断片をライゲーションし、約６．０Ｋｂのハイブ
リッドプラスミドｐＮＺ６６−ＰＴを構築した。上記
（２）で構築したハイブリッドプラスミドｐＮＺ１３３
ＳＬ−Ｐ・ＳｅｇＡをＳａｃＩで消化した後、フェノー
ル・クロロホルム処理で抽出し、エタノール沈澱によ
り、約３．３Ｋｂの開裂されたｐＮＺ１３３ＳＬ−Ｐを
回収した。またｐＮＺ６６−ＰＴをＳａｃＩで部分消化
後、これを１．５％アガロース電気泳動に供した。約
３．３ＫｂのＤＮＡ断片をアガロースゲルより抽出し、
エタノール沈澱により、Ｐ１７−ｌａｃＺ−ＴＴ断片を
回収した。開裂されたｐＮＺ１３３ＳＬ−Ｐと上記のＰ
１７−ｌａｃＺ−ＴＴ断片をライゲーションし、約１２
ＫｂのハイブリッドプラスミドｐＮＺ９９２９を構築し
た。

【００２１】実施例３ 組み合わせプロモーターを有す
る組み換えＡＰＶの構築 （１）組み換え用プラスミドの構築 構築したプラスミドｐ２Ｌ２Ｅｈ及びｐ４Ｌｈを制限酵
素ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、各組み合わせプ
ロモーター断片を回収した。これらの断片を、それぞれ
ｐＮＺ９９２９を制限酵素ＫｐｎＩとＨｉｎｄＩＩＩで
消化して得られた約８．５Ｋｂの断片とリガーゼにより
連結し、得られたプラスミドをそれぞれｐＮＺ２９／２
Ｌ２Ｅ及びｐＮＺ２９／４Ｌと命名した。これらのプラ
スミドを制限酵素ＢａｍＨＩで消化した後、クレノウフ
ラグメント処理で平滑末端とした。さらにこれらの制限
酵素ＫｐｎＩで消化し、アガロースゲル電気泳動により
約８Ｋｂの断片を回収した。一方、ＳｅｇＡのｃＤＮＡ
を有するプラスミドｐＩＢＤＶを制限酵素ＰｖｕＩとＫ
ｐｎＩで消化し、アガロースゲル電気泳動により約３．
５ＫｂのＳｅｇＡを有するｃＤＮＡ断片を回収した。こ
の断片を、先に構築した組み合わせプロモーターを含む
それぞれのＤＮＡ断片と混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで
連結し、組み換え用プラスミドを構築した。得られたプ
ラスミドをそれぞれ、ｐＮＺ９９２９／２Ｌ２Ｅ及びｐ
ＮＺ９９２９／４Ｌと命名した。

【００２２】（２）組み換えウイルスの構築 １×１０⁶ＰＦＵのＦＰＶのＵＳＤＡ株をＣＥＦ細胞に
感染させ、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーターで５時
間培養した１×１０⁷個のＣＥＦ細胞をトリプシンで回
収した後、２０μｇの上記（１）で構築した組み換え用
プラスミドｐＮＺ９９２９／２Ｌ２Ｅ及びｐＮＺ９９２
９／４Ｌをジーンバルサー（バイオラッド社製）を用い
て、回収した細胞に導入した。条件は、２５μＦ、３。
０ＫＶ／ｃｍで行った。この細胞を３７℃、５％ＣＯ₂
インキュベーターで７２時間培養した後、凍結融解を３
回繰り返し、ウイルス液を調製した。このウイルス液を
ＤＭＥ培地で適当に希釈し、直径１００ｍｍの細胞培養
用皿中に培養したＣＥＦ細胞に４００μｌ程度を加え、
３７℃、５％ＣＯ₂インキュベーターで２時間培養した
後、１％バクトアガー（バイオラッド社製）を含んだＤ
ＭＥ培地を重層し、更に５日間、３７℃、５％ＣＯ₂イ
ンキュベーターで培養した。プラークを確認した後、６
００μｇ／ｍｌのブルオギャル（Ｇｌｉｂｃｏ−ＢＲＬ
社製）と１％バクトアガーを含んだＤＭＥ培地を重層
し、更に１５時間、３７℃、５％ＣＯ₂インキュベータ
ーで培養し、出現してきた青いプラークを目的とする組
み換え体として単離した。これを１ｍｌのＤＭＥに懸濁
し、これをウイルス液とした。再び直径１００ｍｍの細
胞培養用皿中に培養したＣＥＦ細胞に、ウイルス液を４
００μｌを加え、ウイルス感染させた。ブルオギャルと
１％バクトアガーを含んだＤＭＥ培地を重層した時、す
べてのプラークが青く染まるまで、同じ操作を繰り返
し、組み換えウイルスを純化した。ｐＮＺ９９２９／２
Ｌ２Ｅから得られる組み換え体をｆＮＺ９９２９／２Ｌ
２Ｅ、ｐＮＺ９９２９／４Ｌから得られる組み換え体を
ｆＮＺ９９２９／４Ｌと命名した。

【００２３】参考例１ 連結させたプロモーターが２つ
であるものを有する組み換えウイルスの構築 用いるプラスミドがＬＥプロモーターを有するｐＮＺ９
９２９であること以外は、実施例３と同様の方法で組み
換えウイルスを構築した。得られた組み換えウイルスを
ｆＮＺ９９２９と命名した。

【００２４】実施例４ 組み換えウイルスの鶏接種試験 １週令のＳＰＦ白色レグホン鶏６羽に、実施例３で構築
した組み換えウイルスｆＮＺ９９２９／４Ｌ、比較例と
して参考例１で構築した組み換えウイルスｆＮＺ９９２
９、コントロールとして親株であるＦＰＶのＵＳＤＡ株
をそれぞれ４×１０⁴ＰＦＵづつ翼膜下に接種した。３
週間後、同様の方法で再度同じ組み換えウイルスを接種
し、２１日後に、それぞれの鶏から２ｍｌづつ採血し
た。得られた血液を、３５００ｒｐｍ、２０分間遠心分
離機にかけ、上清に分離してくる血清を回収した。９６
穴の平底マイクロプレートの各穴に５０μｌつづ血清を
加えていないＤＭＥを加えた。更に４倍づつに段階希釈
し、５６℃、３０分間非動化した検体の血清を１００Ｔ
ＣＩＤ₅₀のＩＢＤＶを含む５０μｌとともに加えた後、
３７℃、６０分間の中和反応を行った。５％ウシ胎児血
清（以下、ＦＣＳという）を含む培地で１ｍｌあたり２
×１０⁵細胞に調製したＣＥＦ細胞を各穴に５０μｌつ
づ加え、５％ＣＯ₂、３７℃で４日間培養し、細胞変性
効果（以下、ＣＰＥという）を示した細胞の存在する穴
の数を数え、ＴＣＩＤ₅₀の算出と同様に５０％中和の血
清希釈倍率を求め中和価とした。この結果、比較例とし
て用いた組み換えウイルスｆＮＺ９９２９を接種した群
の中和価は１：８であったのに対して、本発明の組み換
えウイルスｆＮＺ９９２９／４Ｌを接種した群の中和価
は１：２３であった。この結果から、連結させたプロモ
ーターの数が２つであるＬＥプロモーターを有する組み
換えウイルスｆＮＺ９９２９と比較して、連結させたプ
ロモーターの数が４つである４Ｌプロモーターを有する
組み換えウイルスｆＮＡ９９２９／４Ｌの方が高い中和
抗体を誘導することが判った。

【００２５】実施例５ 組み換えウイルスの鶏接種・攻
撃試験 実施例３及び参考例１で構築した組み換えウイルスｆＮ
Ｚ９９２９／２Ｌ２Ｅ、ｆＮＺ９９２９／４Ｌ及びｆＮ
Ｚ９９２９をそれぞれ１週令のＳＰＦ白色レグホン鶏の
両翼膜に１×１０⁶ＰＦＵを接種した。攻撃用のウイル
ス液として、ＩＢＤＶ強毒株ＤＶ８６株感染鶏のファブ
リキウス嚢の１０％乳剤を使用した。２群の接種鶏のう
ち一群については、組み換えウイルスの接種から２０日
後に、攻撃用のウイルス液を経口投与し、さらに組み換
えウイルスの接種から３５日後にクロアカより攻撃用ウ
イルス液０．３ｍｌを接種することにより攻撃し、２度
目の攻撃から４日間観察し、（（死亡鶏匹数）／（各群
の鶏匹数））×１００から計算される死亡率を求めた。
コントロールとして非接種群と親株であるＦＰＶのＵＳ
ＤＡ株を接種した群についても同様の実験を行った。そ
の結果を表１に示す。

【００２６】

【表１】

【００２７】この結果から、本発明の組み換えウイルス
は、ＩＢＤＶ感染に対して高い生存率を示すことが判っ
た。

【００２８】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＥプロモーターのＤＮＡ配列を示した説明図で
ある。

【図２】ＬプロモーターのＤＮＡ配列を示した説明図で
ある。

【図３】制限酵素ＭｌｕＩの認識配列を含む合成ＤＮＡ
配列を示した説明図である。

【図４】１７ｂｐのＦＰＶ由来のプロモーターのＤＮＡ
配列を示した説明図である。

【図５】ポックスウイルスの初期転写終結シグナルのＤ
ＮＡ配列を示した説明図である。

【図６】組み合せプロモーターを有する組み換えプラス
ミドの構築方法を示した説明図である。

【図７】組み合せプロモーターを有する組み換えプラス
ミドの構築方法を示した説明図である。

【図８】組み合せプロモーターを有する組み換えプラス
ミドの構築方法を示した説明図である。

【図９】組み合せプロモーターを有する組み換えプラス
ミドの構築方法を示した説明図である。

【図１０】組み合せプロモーターを有する組み換えプラ
スミドの構築方法を示した説明図である。

【図１１】組み合せプロモーターを有する組み換えプラ
スミドの構築方法を示した説明図である。

【図１２】抗原遺伝子を有する組み換えベクターの構築
方法を示した説明図である。

【図１３】抗原遺伝子を有する組み換えベクターの構築
方法を示した説明図である。

【図１４】抗原遺伝子を有する組み換えベクターの構築
方法を示した説明図である。

【図１５】抗原遺伝子を有する組み換えベクターの構築
方法を示した説明図である。

【図１６】抗原遺伝子を有する組み換えベクターの構築
方法を示した説明図である。

【図１７】抗原遺伝子を有する組み換えベクターの構築
方法を示した説明図である。

【図１８】抗原遺伝子を有する組み換えベクターの構築
方法を示した説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｒ 1:92） Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者 青山 茂美 滋賀県甲賀郡水口町貴生川370−13 (72)発明者 山口 猛 滋賀県甲賀郡甲南町希望ヶ丘本町１−2501 −49 (72)発明者 入谷 好一 京都府京都市伏見区深草大亀万帖敷町151 (72)発明者 林 幸弘 滋賀県草津市野村町５−15−５ (72)発明者 小川 良平 神奈川県横浜市港北区綱島東４−９−30 (72)発明者 高村 千鶴子 東京都大田区東雪ケ谷４−23−６ (72)発明者 鴨川 幸市 神奈川県横浜市金沢区釜利谷町2153−42

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 プロモーター活性を有するＤＮＡ断片を
   ４つ以上連結させることを特徴とする組み合せポックス
   ウイルスプロモーター。
2. 【請求項２】 少なくとも一種類の初期プロモーター及
   び少なくとも一種類の後期プロモーターとからなる請求
   項１記載の組み合せポックスウイルスプロモーター。
3. 【請求項３】 初期プロモーターと後期プロモーターが
   それぞれ２つ以上連結されたものである請求項２記載の
   組み合せポックスウイルスプロモーター。
4. 【請求項４】 プロモーター活性を有するＤＮＡ断片の
   塩基配列が図１及び／又は図２で表される塩基配列であ
   る請求項１、２または３記載の組み合せポックスウイル
   スプロモーター。
5. 【請求項５】 プロモーター活性を有するＤＮＡ断片が
   後期プロモーターである請求項１記載の組み合せポック
   スウイルスプロモーター。
6. 【請求項６】 請求項１、２、３、４または５記載の組
   み合せポックスウイルスプロモーターの下流に外来遺伝
   子を結合させてなるＤＮＡ断片をポックスウイルスの増
   殖に非必須な領域に挿入した組み換えポックスウイル
   ス。
7. 【請求項７】 ポックスウイルスがアビポックスウイル
   スである請求項６記載の組み換えポックスウイルス。
8. 【請求項８】 請求項６または７記載の組み換えポック
   スウイルスを有効成分とする家禽用組み換え生ワクチ
   ン。