JPH0767640A - 新規トリプシン様酵素 - Google Patents
新規トリプシン様酵素Info
- Publication number
- JPH0767640A JPH0767640A JP21403993A JP21403993A JPH0767640A JP H0767640 A JPH0767640 A JP H0767640A JP 21403993 A JP21403993 A JP 21403993A JP 21403993 A JP21403993 A JP 21403993A JP H0767640 A JPH0767640 A JP H0767640A
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- JP
- Japan
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- trypsin
- enzyme
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- substrate
- synthetic substrate
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 新規なトリプシン様酵素
【構成】 トリプシン用合成基質及びトロンビン用合成
基質をよく分解し、キモトリプシン用合成基質、エラス
ターゼ用合成基質、コラゲナーゼ用合成基質及びロイシ
ンアミノペプチダーゼ用合成基質を分解しない、２８，
０００Ｄａの酵素。
基質をよく分解し、キモトリプシン用合成基質、エラス
ターゼ用合成基質、コラゲナーゼ用合成基質及びロイシ
ンアミノペプチダーゼ用合成基質を分解しない、２８，
０００Ｄａの酵素。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規トリプシン様酵素に
関する。
関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒト肺および気道内に存在する様々なプ
ロテアーゼが知られているが、例えば慢性呼吸器疾患患
者の肺および気道内に見出せる好中球由来プロテアーゼ
としてエラスターゼ、カテプシンＧ、コラゲナーゼ、ゼ
ラチナーゼ、プロテアーゼ３がある。好中球は細菌、ウ
イルスなどの外来異物に対する防御機構として働くが、
炎症が亢進したり慢性化した場合異物が処理しきれず、
好中球自身の破壊により好中球プロテアーゼの放出が起
るとされている。
ロテアーゼが知られているが、例えば慢性呼吸器疾患患
者の肺および気道内に見出せる好中球由来プロテアーゼ
としてエラスターゼ、カテプシンＧ、コラゲナーゼ、ゼ
ラチナーゼ、プロテアーゼ３がある。好中球は細菌、ウ
イルスなどの外来異物に対する防御機構として働くが、
炎症が亢進したり慢性化した場合異物が処理しきれず、
好中球自身の破壊により好中球プロテアーゼの放出が起
るとされている。
【０００３】また肥満細胞由来のトリプシン様酵素とし
て分子量１４万のトリプターゼが肺および気道内に存在
することが知られているが、その生理的な役割は完全に
解明されているわけではない（Ｊ．Ｂ．Ｃ．，２５９，
１１０４６〜１１０５１，１９８４）。
て分子量１４万のトリプターゼが肺および気道内に存在
することが知られているが、その生理的な役割は完全に
解明されているわけではない（Ｊ．Ｂ．Ｃ．，２５９，
１１０４６〜１１０５１，１９８４）。
【０００４】このトリプターゼとは異なるトリプシン様
酵素として慢性気道疾患患者痰より粗精製された分子量
２００００のプロテアーゼが知られている（１９９２年
５月胸部疾患学会要旨集ｐ２８０，Ｇ―７７、ｐ３１
９，Ｉ―３６）。このプロテアーゼはトロンビン合成基
質およびトリプシン合成基質を分解し、生体基質として
フィブリノーゲンを分解することが示されているが、そ
の生理的な役割は不明である。
酵素として慢性気道疾患患者痰より粗精製された分子量
２００００のプロテアーゼが知られている（１９９２年
５月胸部疾患学会要旨集ｐ２８０，Ｇ―７７、ｐ３１
９，Ｉ―３６）。このプロテアーゼはトロンビン合成基
質およびトリプシン合成基質を分解し、生体基質として
フィブリノーゲンを分解することが示されているが、そ
の生理的な役割は不明である。
【０００５】生体基質であるフィブリノーゲンの分解作
用を有する酵素は様々な疾患の治療薬への応用が考えら
れる。気管支喘息など呼吸器疾患の痰、特に粘性痰には
フィブリンが含まれており、その粘性に関与しているこ
とが示唆されている（１９９３年胸部疾患学会要旨集ｐ
３１１，Ｋ１―５８）。したがってフィブリンの前駆物
質であるフィブリノーゲンを選択的に分解するトリプシ
ン様酵素は去痰剤への応用が期待される。
用を有する酵素は様々な疾患の治療薬への応用が考えら
れる。気管支喘息など呼吸器疾患の痰、特に粘性痰には
フィブリンが含まれており、その粘性に関与しているこ
とが示唆されている（１９９３年胸部疾患学会要旨集ｐ
３１１，Ｋ１―５８）。したがってフィブリンの前駆物
質であるフィブリノーゲンを選択的に分解するトリプシ
ン様酵素は去痰剤への応用が期待される。
【０００６】腫瘍細胞の転移形成過程における血管床着
床にフィブリン網形成が関与しており（Irish. J. Med.
Sci. ３９４，４７４〜４７９，１９５８）、さらにフ
ィブリン網は腫瘍細胞を免疫細胞から保護する役割があ
ることが知られている（Thromb. Diath. Haem. Sappl.
５９，１３９〜１５６，１９７４）。したがってフィブ
リノーゲンを分解し、フィブリン網形成を減少させるト
リプシン様酵素は、腫瘍細胞転移抑制剤として期待され
る。
床にフィブリン網形成が関与しており（Irish. J. Med.
Sci. ３９４，４７４〜４７９，１９５８）、さらにフ
ィブリン網は腫瘍細胞を免疫細胞から保護する役割があ
ることが知られている（Thromb. Diath. Haem. Sappl.
５９，１３９〜１５６，１９７４）。したがってフィブ
リノーゲンを分解し、フィブリン網形成を減少させるト
リプシン様酵素は、腫瘍細胞転移抑制剤として期待され
る。
【０００７】血液中のフィブリノーゲンを分解し、血液
凝固時間を延長するトリプシン様酵素は広義の血液凝固
阻止剤として、循環器疾患例えば慢性動脈閉塞症、末梢
循環障害などへの適用が期待される。
凝固時間を延長するトリプシン様酵素は広義の血液凝固
阻止剤として、循環器疾患例えば慢性動脈閉塞症、末梢
循環障害などへの適用が期待される。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、上記目
的への利用に供することができる新規なトリプシン様活
性を有する酵素を見出すべく鋭意研究の結果、本発明に
到達した。
的への利用に供することができる新規なトリプシン様活
性を有する酵素を見出すべく鋭意研究の結果、本発明に
到達した。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、下記特性を有
するトリプシン様酵素である。 作用：トリプシン様のプロテアーゼ（蛋白分解酵素）
活性、 基質特異性：トリプシン用合成基質、およびトロンビ
ン用合成基質をよく分解し、キモトリプシン用合成基
質、エラスターゼ用合成基質、コラゲナーゼ用合成基質
およびロイシンアミノペプチダーゼ用合成基質を分解し
ない、 至適ｐＨ：約８．６ 力価の測定法：トリプシン用合成基質を用いたプロテ
アーゼ活性の測定 作用適温：約３７℃ ｐＨによる失活；ｐＨ６．０ではｐＨ７．６の約２割
になる。 阻害：ＤＦＰ（ジイソプロピルフルオロホスフェー
ト）、ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルフォニルフルオラ
イド）（以上、セリンプロテアーゼ阻害剤）、ロイペプ
チン（Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）およびアンチパイン（Ａｎ
ｔｉｐａｉｎ）（以上トリプシン阻害剤）で阻害され
る、 精製方法：慢性呼吸器疾患患者痰からカラムクロマト
グラフィーで精製 分子量：２８０００Ｄａ（ＳＤＳ―ＰＡＧＥ） 本発明における新規トリプシン様酵素は、ヒト下気道に
存在するプロテアーゼであり、慢性気道疾患患者痰など
から精製される。この酵素はトリプシンおよびトロンビ
ン合成基質を選択的に分解し、生体基質としてフィブリ
ノーゲンおよびＶＩＰを分解し、至適ｐＨが８．２〜
９．２、分子量が２８０００、Ｎ末端アミノ酸配列が
［配列表１］に示した下記配列 Ile-Leu-Gly-Gly-Thr-Glu-Ala-Glu-Glu-Gly であるが、本発明はこれと生物学的に同等のプロテアー
ゼも包含する。
するトリプシン様酵素である。 作用：トリプシン様のプロテアーゼ（蛋白分解酵素）
活性、 基質特異性：トリプシン用合成基質、およびトロンビ
ン用合成基質をよく分解し、キモトリプシン用合成基
質、エラスターゼ用合成基質、コラゲナーゼ用合成基質
およびロイシンアミノペプチダーゼ用合成基質を分解し
ない、 至適ｐＨ：約８．６ 力価の測定法：トリプシン用合成基質を用いたプロテ
アーゼ活性の測定 作用適温：約３７℃ ｐＨによる失活；ｐＨ６．０ではｐＨ７．６の約２割
になる。 阻害：ＤＦＰ（ジイソプロピルフルオロホスフェー
ト）、ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルフォニルフルオラ
イド）（以上、セリンプロテアーゼ阻害剤）、ロイペプ
チン（Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）およびアンチパイン（Ａｎ
ｔｉｐａｉｎ）（以上トリプシン阻害剤）で阻害され
る、 精製方法：慢性呼吸器疾患患者痰からカラムクロマト
グラフィーで精製 分子量：２８０００Ｄａ（ＳＤＳ―ＰＡＧＥ） 本発明における新規トリプシン様酵素は、ヒト下気道に
存在するプロテアーゼであり、慢性気道疾患患者痰など
から精製される。この酵素はトリプシンおよびトロンビ
ン合成基質を選択的に分解し、生体基質としてフィブリ
ノーゲンおよびＶＩＰを分解し、至適ｐＨが８．２〜
９．２、分子量が２８０００、Ｎ末端アミノ酸配列が
［配列表１］に示した下記配列 Ile-Leu-Gly-Gly-Thr-Glu-Ala-Glu-Glu-Gly であるが、本発明はこれと生物学的に同等のプロテアー
ゼも包含する。
【００１０】これと生物学的に同等のプロテアーゼと
は、本発明の上記新規トリプシン様酵素の一部分あるい
は該プロテアーゼから１個または複数個のアミノ酸が欠
失、または付加され、そして／または該プロテアーゼ中
の１個または複数個のアミノ酸が他のアミノ酸により置
き換えられているプロテアーゼで該プロテアーゼの生物
学的性質を有するものをいう。
は、本発明の上記新規トリプシン様酵素の一部分あるい
は該プロテアーゼから１個または複数個のアミノ酸が欠
失、または付加され、そして／または該プロテアーゼ中
の１個または複数個のアミノ酸が他のアミノ酸により置
き換えられているプロテアーゼで該プロテアーゼの生物
学的性質を有するものをいう。
【００１１】かかる新規トリプシン様酵素は、例えば慢
性気道疾患患者痰、気道粘液、気道洗浄液などから単離
精製することにより得られる。あるいは該プロテアーゼ
のアミノ酸配列を解析し、それをコードするＤＮＡを調
製することにより遺伝子工学的に得ることもできる。
性気道疾患患者痰、気道粘液、気道洗浄液などから単離
精製することにより得られる。あるいは該プロテアーゼ
のアミノ酸配列を解析し、それをコードするＤＮＡを調
製することにより遺伝子工学的に得ることもできる。
【００１２】さらに詳しくは、該新規トリプシン様酵素
は トリプシン用合成基質：Boc-Phe-Ser-Arg-MCA およびBo
c-Gln-Ala-Arg-MCA 、 トロンビン用合成基質：Boc-Val-Pro-Arg-MCA をよく分解し ファクターＸａ用合成基質：Boc-Ile-Gln-Gly-Arg-MCA
、 ウロキナーゼ用合成基質：Boc-Gln-Gly-Arg-MCA プラスミン用合成基質：Boc-Val-Leu-Lys-MCA をわずかに分解し、 キモトリプシン用合成基質：Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA
、 エラスターゼ用合成基質：Suc-Ala-Pro-Ala-MCA 、 コラゲネース用合成基質：Suc-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-MC
A を分解しない。これらの基質特異性から本発明の酵素は
トリプシン様酵素に分類される。
は トリプシン用合成基質：Boc-Phe-Ser-Arg-MCA およびBo
c-Gln-Ala-Arg-MCA 、 トロンビン用合成基質：Boc-Val-Pro-Arg-MCA をよく分解し ファクターＸａ用合成基質：Boc-Ile-Gln-Gly-Arg-MCA
、 ウロキナーゼ用合成基質：Boc-Gln-Gly-Arg-MCA プラスミン用合成基質：Boc-Val-Leu-Lys-MCA をわずかに分解し、 キモトリプシン用合成基質：Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-MCA
、 エラスターゼ用合成基質：Suc-Ala-Pro-Ala-MCA 、 コラゲネース用合成基質：Suc-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-MC
A を分解しない。これらの基質特異性から本発明の酵素は
トリプシン様酵素に分類される。
【００１３】生体基質としてはフィブリノーゲン、ＶＩ
Ｐを分解するが、ＩｇＡ、ＩｇＧ、アルブミン、α1 ―
アンチトリプシン、サブスタンスＰは分解しない。
Ｐを分解するが、ＩｇＡ、ＩｇＧ、アルブミン、α1 ―
アンチトリプシン、サブスタンスＰは分解しない。
【００１４】トリプシン用合成基質による活性測定にお
いて、その至適ｐＨは８．２〜９．２（Ｔｒｉｓ―ＨＣ
ｌバッファー）であるが、特にｐＨ８．６付近が最も望
ましい。
いて、その至適ｐＨは８．２〜９．２（Ｔｒｉｓ―ＨＣ
ｌバッファー）であるが、特にｐＨ８．６付近が最も望
ましい。
【００１５】新規トリプシン様酵素の分子量はＳＤＳ―
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により２８０００と
測定される。
ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により２８０００と
測定される。
【００１６】さらに本酵素は慢性気道疾患、例えばびま
ん性汎細気管支炎患者の痰より精製される。
ん性汎細気管支炎患者の痰より精製される。
【００１７】以下、実施例により本発明を具体的に説明
するが、本発明をこれらの実施例に限定するものでない
ことはいうまでもない。
するが、本発明をこれらの実施例に限定するものでない
ことはいうまでもない。
【００１８】
【実施例１】新規トリプシン様酵素の精製 慢性呼吸器疾患患者喀痰の原液１０００ｍｌを、同量の
０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．
５）０．３Ｍ ＮａＣｌと混合し、ホモジナイザーによ
り氷冷下１分間ホモジナイズした後、遠心分離（１９０
００ｒｐｍ）した上清に対し硫安を終濃度４０％になる
ように加える。沈殿物を遠心分離（１００００ｒｐｍ）
で除去し、上清中のプロテアーゼをブチル・トヨパール
・ゲル（Ｂｕｔｙｌ Ｔｏｙｏｐｅｒｌ Ｇｅｌ）に吸
着させた後、５％（ＮＨ4 ）2 ＳＯ 4 ；１０％グリセロ
ール、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で
プロテアーゼ画分を溶出させた。
０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．
５）０．３Ｍ ＮａＣｌと混合し、ホモジナイザーによ
り氷冷下１分間ホモジナイズした後、遠心分離（１９０
００ｒｐｍ）した上清に対し硫安を終濃度４０％になる
ように加える。沈殿物を遠心分離（１００００ｒｐｍ）
で除去し、上清中のプロテアーゼをブチル・トヨパール
・ゲル（Ｂｕｔｙｌ Ｔｏｙｏｐｅｒｌ Ｇｅｌ）に吸
着させた後、５％（ＮＨ4 ）2 ＳＯ 4 ；１０％グリセロ
ール、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ（ｐＨ７．５）で
プロテアーゼ画分を溶出させた。
【００１９】この溶出液に硫安を終濃度６５％になるよ
うに加え、遠心分離（１００００ｒｐｍ）して得られた
沈殿を０．０５Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．０）、１０
％グリセロールに溶かし全容量１００ｍｌとし、同じバ
ッファー中で透析した。透析液中のプロテアーゼをＳＰ
―トヨパール（ＳＰ―Ｔｏｙｏｐｅｒｌ）６５０Ｍゲル
（Ｇｅｌ）に吸着させ、０．０５Ｍ酢酸バッファー（ｐ
Ｈ４．０）で３回、０．０５Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ
４．０）０．１Ｍ ＮａＣｌで２回洗浄し、０．０５Ｍ
酢酸バッファー（ｐＨ４．０）、１０％グリセロール
０．３Ｍ ＮａＣｌでプロテアーゼ画分を溶出させた。
これに硫安を終濃度８０％になるように加え、遠心分離
（８０００ｒｐｍ）により得られた沈殿を０．０５Ｍ酢
酸バッファー（ｐＨ４．０）、１０％グリセロール４０
ｍｌに溶かし、同じバッファーで透析した。
うに加え、遠心分離（１００００ｒｐｍ）して得られた
沈殿を０．０５Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．０）、１０
％グリセロールに溶かし全容量１００ｍｌとし、同じバ
ッファー中で透析した。透析液中のプロテアーゼをＳＰ
―トヨパール（ＳＰ―Ｔｏｙｏｐｅｒｌ）６５０Ｍゲル
（Ｇｅｌ）に吸着させ、０．０５Ｍ酢酸バッファー（ｐ
Ｈ４．０）で３回、０．０５Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ
４．０）０．１Ｍ ＮａＣｌで２回洗浄し、０．０５Ｍ
酢酸バッファー（ｐＨ４．０）、１０％グリセロール
０．３Ｍ ＮａＣｌでプロテアーゼ画分を溶出させた。
これに硫安を終濃度８０％になるように加え、遠心分離
（８０００ｒｐｍ）により得られた沈殿を０．０５Ｍ酢
酸バッファー（ｐＨ４．０）、１０％グリセロール４０
ｍｌに溶かし、同じバッファーで透析した。
【００２０】透析液を再びＳＰ―トヨパール（ＳＰ―Ｔ
ｏｙｏｐｅｒｌ）６５０Ｍカラム（１．２×２ｃｍ）に
かけ０．０５Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．０）、１０％
グリセロールから０．０５Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．
５）、１０％グリセロール、０．２Ｍ ＮａＣｌまでの
グラジエント溶出によりプロテアーゼ画分を得た。この
溶出液を限外濾過（ＹＭ１０膜）により約３０ｍｌまで
濃縮した後、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ（ｐＨ９．
２）、１０％グリセロール０．５Ｍ ＮａＣｌで透析し
た。
ｏｙｏｐｅｒｌ）６５０Ｍカラム（１．２×２ｃｍ）に
かけ０．０５Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．０）、１０％
グリセロールから０．０５Ｍ酢酸バッファー（ｐＨ４．
５）、１０％グリセロール、０．２Ｍ ＮａＣｌまでの
グラジエント溶出によりプロテアーゼ画分を得た。この
溶出液を限外濾過（ＹＭ１０膜）により約３０ｍｌまで
濃縮した後、０．０５Ｍ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ（ｐＨ９．
２）、１０％グリセロール０．５Ｍ ＮａＣｌで透析し
た。
【００２１】透析液をアフィニティークロマトグラフィ
ーで精製した。すなわち、ベンザミジン―セファロース
（Benzamidine-Sepharose ）６Ｂカラムにかけ０．５Ｍ
Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ（ｐＨ９．２）、１０％グリセロー
ル、０．５Ｍ ＮａＣｌで洗浄した後、０．０５Ｍ酢酸
バッファー（ｐＨ４．０）、１０％グリセロール、０．
５Ｍ ＮａＣｌで溶出させることにより、精製されたプ
ロテアーゼ溶液を得た。このトリプシン様酵素をＳＤＳ
―ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果分子
量２８０００に単一バンドとして検出された（図１）。
ーで精製した。すなわち、ベンザミジン―セファロース
（Benzamidine-Sepharose ）６Ｂカラムにかけ０．５Ｍ
Ｔｒｉｓ―ＨＣｌ（ｐＨ９．２）、１０％グリセロー
ル、０．５Ｍ ＮａＣｌで洗浄した後、０．０５Ｍ酢酸
バッファー（ｐＨ４．０）、１０％グリセロール、０．
５Ｍ ＮａＣｌで溶出させることにより、精製されたプ
ロテアーゼ溶液を得た。このトリプシン様酵素をＳＤＳ
―ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果分子
量２８０００に単一バンドとして検出された（図１）。
【００２２】分子量マーカーとしては、バイオ・ラッド
・ラボラトリーズ社の下記のものを用いた。 ９７．４ｋＤａ：フォスフォリラーゼｂ ６６．２ｋＤａ：アルブミン ４２．７ｋＤａ：オボアルブミン ３１．０ｋＤａ：カルボニックアンハイドラーゼ ２１．５ｋＤａ：ダイズトリプシンインヒビター １４．４ｋＤａ：リゾチーム
・ラボラトリーズ社の下記のものを用いた。 ９７．４ｋＤａ：フォスフォリラーゼｂ ６６．２ｋＤａ：アルブミン ４２．７ｋＤａ：オボアルブミン ３１．０ｋＤａ：カルボニックアンハイドラーゼ ２１．５ｋＤａ：ダイズトリプシンインヒビター １４．４ｋＤａ：リゾチーム
【００２３】
【実施例２】トリプシン活性の測定方法 トリプシン用合成基質Ｂｏｃ―Ｐｈｅ―Ｓｅｒ―Ａｒｇ
―ＭＣＡ（メチルクマリン アミド：Methylcoumarin a
mide）を１００μＭ含有する０．１Ｍ Ｔｒｉｓ―ＨＣ
ｌバッファー（ｐＨ８．６）１．５ｍｌに対し、実施例
１で得られたトリプシン様プロテアーゼの溶液を５０μ
ｌ加え、３７℃で１時間インキュベートした。次いで１
ｍｌの３０％酢酸を加え生成した７―アミノ―４―メチ
ルクマリン（７―amino ―４―methylcoumarin：ＡＭ
Ｃ）量を蛍光測定により定量し（蛍光４４０ｎｍ、励起
光３８０ｎｍ）、酵素の活性を算出した。 １分間に１
ｐＭのＡＭＣを生成させる活性を１単位と定義する。
（１単位＝１ｐＭ ＡＭＣ／ｍｉｎ）
―ＭＣＡ（メチルクマリン アミド：Methylcoumarin a
mide）を１００μＭ含有する０．１Ｍ Ｔｒｉｓ―ＨＣ
ｌバッファー（ｐＨ８．６）１．５ｍｌに対し、実施例
１で得られたトリプシン様プロテアーゼの溶液を５０μ
ｌ加え、３７℃で１時間インキュベートした。次いで１
ｍｌの３０％酢酸を加え生成した７―アミノ―４―メチ
ルクマリン（７―amino ―４―methylcoumarin：ＡＭ
Ｃ）量を蛍光測定により定量し（蛍光４４０ｎｍ、励起
光３８０ｎｍ）、酵素の活性を算出した。 １分間に１
ｐＭのＡＭＣを生成させる活性を１単位と定義する。
（１単位＝１ｐＭ ＡＭＣ／ｍｉｎ）
【００２４】
【実施例３】新規トリプシン様酵素の至適ｐＨの測定 各ｐＨでのトリプシン活性を確認するために以下のバッ
ファーを作成した。 ＭＥＳバッファー ；ｐＨ６．０，６．２，６．４，
６．６，６．８ ＨＥＰＥＳバッファー；ｐＨ６．８，７．０，７．２，
７．４，７．６ Ｔｒｉｓバッファー ；ｐＨ７．４，７．６，７．８，
８．０，８．２，８．４，８．６，８．７，８．８，
９．０，９．２，９．４ 夫々のバッファー中で実施例１で得られたトリプシン様
酵素の活性を実施例２記載の方法でトリプシン活性を測
定し、その結果を図２に示した。
ファーを作成した。 ＭＥＳバッファー ；ｐＨ６．０，６．２，６．４，
６．６，６．８ ＨＥＰＥＳバッファー；ｐＨ６．８，７．０，７．２，
７．４，７．６ Ｔｒｉｓバッファー ；ｐＨ７．４，７．６，７．８，
８．０，８．２，８．４，８．６，８．７，８．８，
９．０，９．２，９．４ 夫々のバッファー中で実施例１で得られたトリプシン様
酵素の活性を実施例２記載の方法でトリプシン活性を測
定し、その結果を図２に示した。
【００２５】ｐＨ８．２〜９．２の範囲で強い活性を示
し、中でもｐＨ８．４，８．６，８．７，８．８の場合
が最も高い活性を示した。
し、中でもｐＨ８．４，８．６，８．７，８．８の場合
が最も高い活性を示した。
【００２６】
【実施例４】トリプシン様酵素の基質特異性 （１）合成基質 反応バッファーとして０．１Ｍ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌバッ
ファー（ｐＨ８．６）を用い、合成基質として、トリプ
シン用基質（Ｂｏｃ―Ｐｈｅ―Ｓｅｒ―Ａｒｇ―ＭＣ
Ａ、Ｂｏｃ―Ｇｌｎ―Ａｌａ―Ａｒｇ―ＭＣＡ）、トロ
ンビン用基質（Ｂｏｃ―Ｖａｌ―Ｐｒｏ―Ａｒｇ―ＭＣ
Ａ）、ファクターＸａ用基質（Ｂｏｃ―Ｉｌｅ―Ｇｌｎ
―Ｇｌｙ―Ａｒｇ―ＭＣＡ）、ウロキナーゼ用基質（Ｂ
ｏｃ―Ｇｌｎ―Ｇｌｙ―Ａｒｇ―ＭＣＡ）、プラスミン
用基質（Ｂｏｃ―Ｖａｌ―Ｌｅｕ―Ｌｙｓ―ＭＣＡ）、
キモトリプシン用基質（Ｂｏｃ―Ａｌａ―Ａｌａ―Ｐｒ
ｏ―Ｐｈｅ―ＭＣＡ）、エラスターゼ用基質（Ｓｕｃ―
Ａｌａ―Ｐｒｏ―Ａｌａ―ＭＣＡ）、コラゲネース用基
質（Ｓｕｃ―Ｇｌｙ―Ｐｒｏ―Ｌｅｕ―Ｇｌｙ―Ｐｒｏ
―ＭＣＡ）およびロイシンアミノペプチダーゼ用基質
（Ｌｅｕ―ＭＣＡ）を用い、実施例１で得られたトリプ
シン様酵素の活性を実施例２記載の方法により測定し
た。トリプシン様酵素のＢｏｃ―Ｐｈｅ―Ｓｅｒ―Ａｒ
ｇ―ＭＣＡ（トリプシン用基質）に対する活性を１００
％とした時の各基質に対する反応性を表１に示した。ま
た、ヒト好中球エラスターゼとラット肥満細胞由来トリ
プターゼについてもそれぞれＳｕｃ―Ａｌａ―Ｐｒｏ―
Ａｌａ―ＭＣＡとＳｕｃ―Ｐｈｅ―Ｓｅｒ―Ａｒｇ―Ｍ
ＣＡに対する活性を１００％とした時の各基質に対する
反応性を表１に示した。
ファー（ｐＨ８．６）を用い、合成基質として、トリプ
シン用基質（Ｂｏｃ―Ｐｈｅ―Ｓｅｒ―Ａｒｇ―ＭＣ
Ａ、Ｂｏｃ―Ｇｌｎ―Ａｌａ―Ａｒｇ―ＭＣＡ）、トロ
ンビン用基質（Ｂｏｃ―Ｖａｌ―Ｐｒｏ―Ａｒｇ―ＭＣ
Ａ）、ファクターＸａ用基質（Ｂｏｃ―Ｉｌｅ―Ｇｌｎ
―Ｇｌｙ―Ａｒｇ―ＭＣＡ）、ウロキナーゼ用基質（Ｂ
ｏｃ―Ｇｌｎ―Ｇｌｙ―Ａｒｇ―ＭＣＡ）、プラスミン
用基質（Ｂｏｃ―Ｖａｌ―Ｌｅｕ―Ｌｙｓ―ＭＣＡ）、
キモトリプシン用基質（Ｂｏｃ―Ａｌａ―Ａｌａ―Ｐｒ
ｏ―Ｐｈｅ―ＭＣＡ）、エラスターゼ用基質（Ｓｕｃ―
Ａｌａ―Ｐｒｏ―Ａｌａ―ＭＣＡ）、コラゲネース用基
質（Ｓｕｃ―Ｇｌｙ―Ｐｒｏ―Ｌｅｕ―Ｇｌｙ―Ｐｒｏ
―ＭＣＡ）およびロイシンアミノペプチダーゼ用基質
（Ｌｅｕ―ＭＣＡ）を用い、実施例１で得られたトリプ
シン様酵素の活性を実施例２記載の方法により測定し
た。トリプシン様酵素のＢｏｃ―Ｐｈｅ―Ｓｅｒ―Ａｒ
ｇ―ＭＣＡ（トリプシン用基質）に対する活性を１００
％とした時の各基質に対する反応性を表１に示した。ま
た、ヒト好中球エラスターゼとラット肥満細胞由来トリ
プターゼについてもそれぞれＳｕｃ―Ａｌａ―Ｐｒｏ―
Ａｌａ―ＭＣＡとＳｕｃ―Ｐｈｅ―Ｓｅｒ―Ａｒｇ―Ｍ
ＣＡに対する活性を１００％とした時の各基質に対する
反応性を表１に示した。
【００２７】その結果、実施例１で得られたトリプシン
様酵素はトリプシン用基質とスロンビン用基質をよく分
解し、キモトリプシン活性、エラスターゼ活性、コラゲ
ネース活性およびロイシンアミノペプチターゼ活性を示
さなかった。また、基質特異性の点で好中球エラスター
ゼとラット肥満細胞由来トリプターゼとは異なってい
た。
様酵素はトリプシン用基質とスロンビン用基質をよく分
解し、キモトリプシン活性、エラスターゼ活性、コラゲ
ネース活性およびロイシンアミノペプチターゼ活性を示
さなかった。また、基質特異性の点で好中球エラスター
ゼとラット肥満細胞由来トリプターゼとは異なってい
た。
【００２８】（２）生体基質 生体基質としてＩｇＡ、ＩｇＧ、アルブミン、α1 ―ア
ンチトリプシンフィブリーゲン、ＶＩＰ（vasoactive i
ntestinal peptide ）およびサブスタンスＰを用い、こ
れらに実施例１で得られたトリプシン様酵素を反応させ
た後、基質の分解をＳＤＳ―ポリアクリルアミドゲル電
気泳動で検出した結果、フィブリノーゲンとＶＩＰだけ
が特異的に分解され、その他の生体基質は分解されなか
った。
ンチトリプシンフィブリーゲン、ＶＩＰ（vasoactive i
ntestinal peptide ）およびサブスタンスＰを用い、こ
れらに実施例１で得られたトリプシン様酵素を反応させ
た後、基質の分解をＳＤＳ―ポリアクリルアミドゲル電
気泳動で検出した結果、フィブリノーゲンとＶＩＰだけ
が特異的に分解され、その他の生体基質は分解されなか
った。
【００２９】
【表１】
【００３０】
【実施例５】新規トリプシン様酵素に対するプロテアーゼ阻害剤の効
果 プロテアーゼ阻害剤としてセリンプロテアーゼ阻害剤で
あるＤＦＰ（Diisopropyl Fluorophosphate ）とＰＭＳ
Ｆ（Phenylmethyl sulfonyl Fluoride）、トリプシン阻
害剤であるロイペプチン（Leupeptin ）とアンチパイン
（Antipain）、エラスチン阻害剤であるエラスチノール
（Elastinol ）、ロイシンアミノペプチダーゼ阻害剤で
あるベスタチン（Bestatin）、キモトリプシン阻害剤で
あるアマスタチン（Amastatin ）、血中プロテアーゼイ
ンヒビターであるα1 ―アンチトリプシンを用い、実施
例１で得られたトリプシン様酵素、ヒト由来好中球エラ
スターゼ、ラット肥満細胞（Mast cell ）由来トリプタ
ーゼに対する阻害効果を測定した。阻害剤の濃度はＰＭ
ＳＦのみ１ｍＭとしその他の阻害剤は１０μＭとした。
阻害剤と酵素を反応させた後実施例２に記載の方法に従
って酵素活性を測定し阻害剤による酵素活性の阻害率
（％）を求め表２に示した。
果 プロテアーゼ阻害剤としてセリンプロテアーゼ阻害剤で
あるＤＦＰ（Diisopropyl Fluorophosphate ）とＰＭＳ
Ｆ（Phenylmethyl sulfonyl Fluoride）、トリプシン阻
害剤であるロイペプチン（Leupeptin ）とアンチパイン
（Antipain）、エラスチン阻害剤であるエラスチノール
（Elastinol ）、ロイシンアミノペプチダーゼ阻害剤で
あるベスタチン（Bestatin）、キモトリプシン阻害剤で
あるアマスタチン（Amastatin ）、血中プロテアーゼイ
ンヒビターであるα1 ―アンチトリプシンを用い、実施
例１で得られたトリプシン様酵素、ヒト由来好中球エラ
スターゼ、ラット肥満細胞（Mast cell ）由来トリプタ
ーゼに対する阻害効果を測定した。阻害剤の濃度はＰＭ
ＳＦのみ１ｍＭとしその他の阻害剤は１０μＭとした。
阻害剤と酵素を反応させた後実施例２に記載の方法に従
って酵素活性を測定し阻害剤による酵素活性の阻害率
（％）を求め表２に示した。
【００３１】その結果、トリプシン様酵素はＤＦＰ、Ｐ
ＭＳＦ、ロイペプチン（Leupeptin）、アンチパイン（A
ntipain）、α1 ―アンチトリプシンによって阻害され
エラスチノール（Elastinol ）、ベスタチン（Bestati
n）、アマスタチン（Amastatin ）では阻害されなかっ
た。基質特異性および各阻害剤の阻害効果から判断し
て、トリプシン様酵素はヒト好中球エラスターゼおよび
ラット肥満細胞由来トリプターゼとは異なる性質を示し
た。
ＭＳＦ、ロイペプチン（Leupeptin）、アンチパイン（A
ntipain）、α1 ―アンチトリプシンによって阻害され
エラスチノール（Elastinol ）、ベスタチン（Bestati
n）、アマスタチン（Amastatin ）では阻害されなかっ
た。基質特異性および各阻害剤の阻害効果から判断し
て、トリプシン様酵素はヒト好中球エラスターゼおよび
ラット肥満細胞由来トリプターゼとは異なる性質を示し
た。
【００３２】
【表２】
【００３３】
【実施例６】新規トリプシン様酵素のフィブリノーゲン凝固に対する
影響 フィブリノーゲンを０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌバッ
ファー（ｐＨ７．４）、０．０１Ｍ ＣａＣｌ2 ０．１
５Ｍ ＮａＣｌに２ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、こ
れに実施例１で得られたトリプシン様酵素を活性単位を
変化させて加え、３７℃で加温した後、この反応液０．
１ｍｌとスロンビン溶液（２．５単位／ｍｌ）０．１ｍ
ｌとを混合し、凝固時間を測定した。その結果を図３に
示した。トリプシン様酵素の加えた活性単位が増加する
ほど、凝固時間は延長された。
影響 フィブリノーゲンを０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ―ＨＣｌバッ
ファー（ｐＨ７．４）、０．０１Ｍ ＣａＣｌ2 ０．１
５Ｍ ＮａＣｌに２ｍｇ／ｍｌとなるように溶解し、こ
れに実施例１で得られたトリプシン様酵素を活性単位を
変化させて加え、３７℃で加温した後、この反応液０．
１ｍｌとスロンビン溶液（２．５単位／ｍｌ）０．１ｍ
ｌとを混合し、凝固時間を測定した。その結果を図３に
示した。トリプシン様酵素の加えた活性単位が増加する
ほど、凝固時間は延長された。
【００３４】
【実施例７】新規トリプシン様酵素のＮ末端アミノ酸配列 実施例１で得られたトリプシン様酵素を、逆相ＨＰＬＣ
（Ｖｙｄａｃ２１４ＴＰ５４）にかけ、アセトニトリル
濃度５０．４％で酵素を溶出させた。次いで、溶媒留去
により濃縮し、そのままプロテインシーケンサー（Appl
ied BiosystemsModel４７７Ａ）によりＮ末端アミノ酸
配列を解析した。
（Ｖｙｄａｃ２１４ＴＰ５４）にかけ、アセトニトリル
濃度５０．４％で酵素を溶出させた。次いで、溶媒留去
により濃縮し、そのままプロテインシーケンサー（Appl
ied BiosystemsModel４７７Ａ）によりＮ末端アミノ酸
配列を解析した。
【００３５】その結果トリプシン様酵素のＮ末端から１
０残基までの配列はＩｌｅ―Ｌｅｕ―Ｇｌｙ―Ｇｌｙ―
Ｔｈｒ―Ｇｌｕ―Ａｌａ―Ｇｌｕ―Ｇｌｕ―Ｇｌｙであ
った。
０残基までの配列はＩｌｅ―Ｌｅｕ―Ｇｌｙ―Ｇｌｙ―
Ｔｈｒ―Ｇｌｕ―Ａｌａ―Ｇｌｕ―Ｇｌｕ―Ｇｌｙであ
った。
【００３６】
配列番号：１ 配列の長さ：１０ 配列の型：アミノ酸 鎖の数： トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：アミノ末端
【図１】本発明のトリプシン様酵素の分子量を測定した
ＳＤＳ―ＰＡＧＥを示す。
ＳＤＳ―ＰＡＧＥを示す。
【図２】本発明のトリプシン様酵素の活性に対するｐＨ
の影響を示す。
の影響を示す。
【図３】本発明のトリプシン様酵素のフィブリノーゲン
凝固に対する影響を示す。
凝固に対する影響を示す。
Claims (1)
- 【請求項１】 下記特性を有するトリプシン様酵素。 作用：トリプシン様のプロテアーゼ（蛋白分解酵素）
活性、 基質特異性：トリプシン用合成基質、およびトロンビ
ン用合成基質をよく分解し、キモトリプシン用合成基
質、エラスターゼ用合成基質、コラゲナーゼ用合成基質
およびロイシンアミノペプチダーゼ用合成基質を分解し
ない、 至適ｐＨ：約８．６ 力価の測定法：トリプシン用合成基質を用いたプロテ
アーゼ活性の測定 作用適温：約３７℃ ｐＨによる失活；ｐＨ６．０ではｐＨ７．６の約２割
になる。 阻害：ＤＦＰ（ジイソプロピルフルオロホスフェー
ト）、ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルフォニルフルオラ
イド）（以上、セリンプロテアーゼ阻害剤）、ロイペプ
チンおよびアンチペイン（以上トリプシン阻害剤）で阻
害される、 精製方法：慢性呼吸器疾患患者痰からカラムクロマト
グラフィーで精製 分子量：２８０００Ｄａ（ＳＤＳ―ＰＡＧＥ）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21403993A JP2839825B2 (ja) | 1993-08-30 | 1993-08-30 | 新規トリプシン様酵素 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21403993A JP2839825B2 (ja) | 1993-08-30 | 1993-08-30 | 新規トリプシン様酵素 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0767640A true JPH0767640A (ja) | 1995-03-14 |
| JP2839825B2 JP2839825B2 (ja) | 1998-12-16 |
Family
ID=16649268
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21403993A Expired - Fee Related JP2839825B2 (ja) | 1993-08-30 | 1993-08-30 | 新規トリプシン様酵素 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2839825B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0699763A1 (en) * | 1994-07-29 | 1996-03-06 | Teijin Limited | Nucleic acid sequence encoding trypsin-like enzyme and process for producing the enzyme |
| WO1999031271A1 (en) * | 1997-12-16 | 1999-06-24 | Teijin Limited | Analysis of predisposition based on human airway tripsin protease gene polymorphism |
| WO2001042450A1 (fr) * | 1999-12-06 | 2001-06-14 | Teijin Limited | Anticorps se liant a l'enzyme du type trypsine des voies aeriennes humaines et son utilisation |
-
1993
- 1993-08-30 JP JP21403993A patent/JP2839825B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0699763A1 (en) * | 1994-07-29 | 1996-03-06 | Teijin Limited | Nucleic acid sequence encoding trypsin-like enzyme and process for producing the enzyme |
| US5804410A (en) * | 1994-07-29 | 1998-09-08 | Teijin Limited | Nucleic acid sequence encoding trypsin-like enzyme and process for producing the enzyme |
| WO1999031271A1 (en) * | 1997-12-16 | 1999-06-24 | Teijin Limited | Analysis of predisposition based on human airway tripsin protease gene polymorphism |
| US6346385B1 (en) | 1997-12-16 | 2002-02-12 | Teijin Limited | Analysis of predisposition based on human airway trypsin protease gene polymorphism |
| WO2001042450A1 (fr) * | 1999-12-06 | 2001-06-14 | Teijin Limited | Anticorps se liant a l'enzyme du type trypsine des voies aeriennes humaines et son utilisation |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2839825B2 (ja) | 1998-12-16 |
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Legal Events
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