JPH0753589A - 分子量マーカーの形成方法 - Google Patents

分子量マーカーの形成方法

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JPH0753589A
JPH0753589A JP5203845A JP20384593A JPH0753589A JP H0753589 A JPH0753589 A JP H0753589A JP 5203845 A JP5203845 A JP 5203845A JP 20384593 A JP20384593 A JP 20384593A JP H0753589 A JPH0753589 A JP H0753589A
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JP
Japan
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molecular weight
protein
weight marker
marker
subunits
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Withdrawn
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JP5203845A
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Inventor
Masahide Yamamoto
昌英 山本
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Fujitsu Ltd
Original Assignee
Fujitsu Ltd
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 本発明は、分子量マーカーの形成方法に関
し、Native−PAGEを用いたタンパク質の分析
を行う際、タンパク質の電荷の移動距離を分子量のみに
依存させることができ、分子量マーカーとして正確な指
標を得ることができる分子量マーカーの形成方法を提供
することを目的としている。 【構成】 一種類のサブユニットを会合させて少なくと
も2種類以上の分子量を有する分子量マーカーを形成す
ることを特徴とするように構成する。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、分子量マーカーの形成
方法に係り、詳しくは、Native−PAGE(天然
状態−ポリアクリルアミドゲル電気泳動)を用いたタン
パク質の分析技術に適用することができ、特に、Nat
ive−PAGEを用いたタンパク質の分析を行う際、
分子量マーカーとして正確な指標を得ることができる分
子量マーカーの形成方法に関する。
【0002】近年、タンパク質の分離及び分析を行う場
合は、アクリルアミドゲルによる電気泳動が容易に分離
及び分析を行うことができる点で必要不可欠な技術とな
っている。タンパク質のアクリルアミドゲルによる電気
泳動には、分離の原理の違いによりSDS−PAGE
(ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動),Native−PAGE及び等電点電気泳動
等があり、これらの電気泳動を用いたタンパク質の分析
法は、手軽なタンパク質の分析法として広く普及してい
る。このうち、Native−PAGEを用いたタンパ
ク質の分析法は、特に、タンパク質を天然状態のまま
(変性させずに)分離できるという点で優れており、マ
ーカータンパク質をおおよそ分子量に従って移動させる
ことができるが、後で詳述する如く、原理的に正確な指
標とは成り得ないという不具合が有する。
【0003】このため、Native−PAGEを用い
たタンパク質の分析を行う際、タンパク質の移動距離を
分子量のみに依存させることができ、分子量マーカーと
して正確な指標を得ることができるものが要求されてい
る。
【0004】
【従来の技術】従来、タンパク質の分離及び分析を行う
場合は、アクリルアミドゲルによる電気泳動が容易に分
離及び分析を行うことができる点で必要不可欠な技術と
なっている。タンパク質のアクリルアミドゲルによる電
気泳動には、分離の原理の違いによりSDS−PAG
E,Native−PAGE及び等電点電気泳動等があ
り、これらの電気泳動を用いたタンパク質の分析法は、
手軽なタンパク質の分析法として広く普及している。
【0005】さて、マーカータンパク質は、各々の電気
泳動において重要な指標となっているが、電気泳動の原
理の違いにより各々に適したものを使用している。例え
ばSDS−PAGEを用いたタンパク質の分析法では、
SDSによりタンパク質分子を完全に変性させて分子ふ
るい効果により分離するため、分子の形状や電荷とは無
関係に分子量のみが重要なファクターとなっている。こ
のため、マーカータンパク質は、アクリルアミドゲルの
分離範囲に適した分子量を有するタンパク質を選択すれ
ばよい。
【0006】また、等電点電気泳動を用いたタンパク質
の分析方法は、pH勾配を付与したアクリルアミドゲル
を用いて、タンパク質が等電点と同じpHの位置に達す
るまで十分に通電する方法であるため、マーカータンパ
ク質は、アクリルアミドゲルを通り抜けられる大きさで
あれば、分子量とは無関係に等電点のみを考慮すればよ
い。
【0007】
【発明を解決しようとする課題】しかしながら、上記し
た従来のNative−PAGEを用いたタンパク質の
分析方法では、電気泳動を行うpHにおける表面電荷Q
とストークス半径Sの両方が関係し、タンパク質の種類
によってストークス半径S及び表面電荷Qが種々異なる
ため、タンパク質の種類によってポリアクリルアミドの
ポアの中を通ることができるものとできないものが生じ
る等、正確な指標となるマーカータンパク質を選択する
のが困難であるという問題があった。
【0008】さて、Native−PAGEにおいてタ
ンパク質分子に働く力は、ストークス半径S/表面電荷
Q値に依存するため、ストークス半径S/表面電荷Q値
が同じであれば、ポリアクリルアミドのポア内での移動
距離は、ストークス半径Sによって決まる。このため、
上記の如く、タンパク質の種類が変ると、ストークス半
径Sが異なるので、ポリアクリルアミドのポア内でのタ
ンパク質の移動距離が変化する。そこで、タンパク質分
子の形状が球状タンパク質に近似できる時には、分子量
M/表面電荷Qに置き換えても良いため、従来は、マー
カータンパク質として分子量が異なり、等電点が比較的
近いものを使用していた。
【0009】しかしながら、マーカータンパク質として
分子量が異なり、等電点が比較的近いものを使用する従
来の方法では、タンパク質の表面電荷Qが分子の表面に
露出した酸性及び塩基性アミノ酸側鎖の数や状態によっ
て決まるため、必ずしも等電点と一義的な関係がない
他、実際に分子量M/表面電荷Q値が等しく分子量が異
なるタンパク質を見出すのは非常に困難である。従っ
て、従来使用していたマーカータンパク質は、おおよそ
分子量に従って移動させることができるが、原理的に正
確な指標とは成り得ないという問題があった。
【0010】そこで本発明は、Native−PAGE
を用いたタンパク質の分析を行う際、タンパク質の電荷
の移動距離を分子量のみに依存させることができ、分子
量マーカーとして正確な指標を得ることができる分子量
マーカーの形成方法を提供することを目的としている。
【0011】
【課題を解決するための手段】本発明による分子量マー
カーの形成方法は上記目的達成のため、一種類のサブユ
ニットを会合させて少なくとも2種類以上の分子量を有
する分子量マーカーを形成することを特徴とするもので
ある。本発明においては、前記サブユニットを会合させ
る好ましい手段には、タンパク質自身が有するシスティ
ン残基のスルホヒドリル基を酸化してサブユニット間に
ジスルフィド結合を形成させることにより行う場合や、
架橋剤を添加してサブユニット間を繁ぐことにより行う
場合等が挙げられる。なお、前者のスルホヒドリル基を
酸化してサブユニット間にジスルフィド結合を形成させ
る好ましい態様には、クロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼをスルホヒドリル基を有する化合物が
存在しない酸化状態に放置することにより作製して行う
場合等が挙げられる。
【0012】
【作用】本発明者は、苦心しながら思考錯誤を繰り返し
つつ各種実験を行った結果、一種類のサブユニットを会
合させて数種類の分子量を有するものを作製して、これ
をNative−PAGEのマーカータンパク質として
利用したところ、同一サブユニットを用いたため、分子
量M及び表面電荷Qが2倍、3倍等となっても分子量M
/表面電荷Q値を全ての分子において一定とすることが
でき、移動距離を分子量のみに依存することができた。
この結果、Native−PAGEを行う場合の分子量
のマーカーとして正確な指標を得ることができた。
【0013】
【実施例】以下、本発明を図面に基づいて説明する。本
実施例では、Type I CAT(クロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ)を用いてNativ
e−PAGEの分子量マーカーを作製した。ここで、C
ATは、抗生物質の一種であるクロラムフェニコールを
補酵素の一種であるアセチルCoAによってアセチル化
する反応を触媒する酵素タンパク質である。次いで、サ
ブユニットの分子量は、25,200であり、スルホヒ
ドリル基を有する化合物が存在する天然状態では、3量
体を形成して分子量75,600となっている。Typ
e I CATは、1つのサブユニットに付き4つのシ
スティン残基を有しており、分子間ジスルフィド結合を
形成させることで分子量マーカーを作製した。
【0014】具体的には、まず、精製した3mg/ml
のType I CATをスルホヒドリル基を有する化
合物が存在しない酸化状態で約30日間放置して、Ty
peI CATの会合体からなる分子量マーカーを作製
した後、この得られたType I CATの会合体か
らなる分子量マーカーを適当量取り、10〜15%アク
リルアミドゲルを用いたNative−PAGEを行っ
て分離し、CBB染色により分析したところ、図1に示
す如く、3量体(天然状態)、6量体、9量体、12量
体、15量体、18量体からなる分子量マーカーを得る
ことができた。このため、Type I CATは、上
記の方法で会合してNative−PAGEの分子量マ
ーカーとして正確な指標を得ることができることが判っ
た。
【0015】
【発明の効果】本発明によれば、Native−PAG
Eを用いたタンパク質の分析を行う際タンパク質の電荷
の移動距離を分子量のみに依存することができ、分子量
マーカーとして正確な指標を得ることができるという効
果がある。
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明の一実施例に則した分子量マーカーをN
ative−PAGEで分離してCBB染色を行った様
子を示す図である。

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 一種類のサブユニットを会合させて少な
    くとも2種類以上の分子量を有する分子量マーカーを形
    成することを特徴とする分子量マーカーの形成方法。
  2. 【請求項2】 前記サブユニットの会合は、タンパク質
    自身が有するシスティン残基のスルホヒドリル基を酸化
    してサブユニット間にジスルフィド結合を形成させるこ
    とにより行うことを特徴とする請求項1記載の分子量マ
    ーカーの形成方法。
  3. 【請求項3】 前記サブユニットの会合は、架橋剤を添
    加してサブユニット間を繁ぐことにより行うことを特徴
    とする請求項1記載の分子量マーカーの形成方法。
  4. 【請求項4】 前記サブユニットの会合は、クロラムフ
    ェニコールアセチルトランスフェラーゼをスルホヒドリ
    ル基を有する化合物が存在しない酸化状態に放置するこ
    とにより行うことを特徴とする請求項2記載の分子量マ
    ーカーの形成方法。
JP5203845A 1993-08-18 1993-08-18 分子量マーカーの形成方法 Withdrawn JPH0753589A (ja)

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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7128844B2 (en) * 2003-05-30 2006-10-31 Dowa Mining Co., Ltd. Metal/ceramic circuit board and method for producing same
JP2008547035A (ja) * 2005-06-27 2008-12-25 インヴィトロジェン コーポレーション ネイティブゲル電気泳動用の液体状タンパク質マーカー

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7128844B2 (en) * 2003-05-30 2006-10-31 Dowa Mining Co., Ltd. Metal/ceramic circuit board and method for producing same
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