JPH07508984A - 免疫不全ウイルスに対するワクチンとして用いるｍｈｃ抗原 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 免疫不全ウィルスに対するワクチン として用いるＭＨＣ抗原 本発明は、免疫不全ウィルスに対するワクチンに関するものである。

部分精製して不活化したサル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）、固定した５ＩＶ−感 染Ｃ８１６６（ヒトＴリンパ芽球様細胞系）細胞、または固定した非感染Ｃ８１ ６６細胞のいずれかを接種したマカクザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ　ｍａｃａｑ ｕｅ）は、ＳＩＶｍａｃ２５１の３２Ｈ単離物（Ｃ８１６６中で増殖したもの） によるチャレンジ感染から防御され得る１２゜防御はウィルス免疫原を増殖させ たヒト細胞の細胞性抗原に対する抗体応答のレベルと相関している２−６゜しか しながら、防御のメカニズムははっきりしていない。

本発明者らは、これらのサルから得られた血清を分析したところ、ＨＬＡクラス Ｉ分子に対する抗体応答と防御との間に正の相関関係があることをつきとめた。

さらに、防御されたサルから得られた血清は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏで異種抗原−誘 発サルＴ細胞の増殖を阻害したが、同種抗原−誘発サルＴ細胞の増殖を阻害せず 、この阻害はヒトＨＬ　ＡクラスＩ遺伝子でトランスフェクトしたマウスＰ８１ ５細胞による吸着（ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ）によりブロックすることができた。

従って、本発明は、ヒトまたは動物体の治療方法において使用するための、とり わけ免疫不全ウィルスに対するワクチンとじて使用するための、主要組織適合遺 伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ抗原を提供する。

本発明は、また、薬学的に許容される担体または希釈剤ならびに有効成分として のＭＨＣクラスＩ抗原を含有する医薬組成物を提供する。本発明は、さらに、免 疫不全ウィルスに対するワクチンとして使用するための医薬の製造におけるＭＨ Ｃクラス■抗原の使用法を提供する。

この抗原はヒトのクラスＩ抗原であることが好ましい。それゆえ、クラス１分子 はＨＬＡ−Ａ、ＨＬ　Ａ　−ＢもしくはＨＬＡ−Ｃ。

またはＨＬ　Ａ２５２１分子のβ鎖であるβ２−ミクログロブリン（βｒ　ｍ　 ）であり得る。該抗原は完全なりラス１分子であってもよく、その場合の重鎖は ＨＬＡ−ＡＳＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−Ｃである。これらは既知の抗原であって 、精製された形で得ることができるし、組換えタンパク質として調製することも できる。

また、クラス■抗原は、トランスフェクトした細胞（すなわち、該抗原をコード する遺伝子でトランスフェクトした結果、該抗原を発現する細胞）に提示させて も得られる。ヒトに投与可能なトランスフェクト細胞はヒト二倍体細胞系のトラ ンスフェクト細胞であり得る。かかる細胞系はヒトワクチンの製造業者のために 安全性について検査されている。適当な細胞系はＩｖｌＲＣ５細胞系である。

クラスＩ抗原を提示する同種リンパ球を患者に投与することができる。これらの リンパ球は生きている細胞として、例えば輸血により、投与しても、固定した細 胞または不活化した細胞として投与してもよい。リンパ球は、クラス■抗原の発 現が、例えばマイトンエンやγインターフェロンで刺激することにより、増強さ れているものであってもよい。

該抗原を用いて、宿主に免疫不全ウィルスに対するワクチン接種を施すことがで きる。宿主はヒトまたは動物でありうるが、一般にはヒト免疫不全ウィルス（Ｈ ＩＶ）に対するワクチン接種をヒトに施すことが望まれるだろう。このウィルス はＨＩ　Ｖ−１またはＩ（Ｔ　Ｖ　−２であり得る。かくして、免疫不全ウィル スによる感染が原因であると考えられる症状の予防処置も提供される。クラスＩ 抗原は特にエイズワクチンとして機能しうる。

ワクチン接種を希望する宿主には、有効量の該抗原が投与される。該抗原は非経 口的に、例えば皮下または筋肉内に投与することができる。１回あたりの抗原の 投与量はさまざまな要因に左右され、例えば被験者の年齢や健康状態によって決 まる。一般に、非経口投与量は２０μｇ〜１ｍｇの抗原、例えば５０〜５００μ ｇの抗原からなる。抗原を多数回投与してもよく、例えば６力月までの期間にわ たって２〜４回投与することができる。それぞれ１または２力月間あいだをおい て投与する。

かくして、免疫不全ウィルスに対するワクチンとして使用するための薬剤が提供 される。薬学的に許容される担体または希釈剤をさらに含有する医薬組成物を製 剤化することができる。該組成物は無菌で、しかもパイロジエン（発熱物質）フ リーでなければならない。また、該組成物はＡｌ（ＯＨ）３やサポニンのような アノユバントを含んでいてもよい。

筋肉内または皮下注射用の組成物は、抗原とともに、薬学的に許容される担体、 例えば滅菌水、オリーブ油、オレイン酸エチル、グリコール（例えばプロピレン グリコール）、所望により、適量の塩酸リドカインを含有していてもよい。

ＭＨＣクラス■抗原はその毒性が無視できるほど低いために安全に使用すること ができる。

以下の実施例は本発明を例示するものである。添付の図面において。

図１ａ−ｄは、放射免疫沈降とこれに続＜　５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示し、そ して 図１ｅは、フローサイトメトリー分析の結果を示す。

実施例１ １、サルに次のようにワクチンを接種した。１１７９〜１８２：　４ｘ５００μ ｇのホルマリン−固定ＳＩＶｍａｃ２５１　（３２Ｈ単離物；　１１／８８プー ル）＋５ＡＦ−１アジユバント、皮下；Ｊ１３４〜１３７：３Ｘ５００μｇのホ ルマリン−固定ＳＩＶｍａｃ２５１＋ＲＩＢＩアジュバント３６、皮下；Ｊ１３ ８〜１４１　：　４ＸＩ００μｇのホルマリン−固定ＳＩＶｍａｃ２５１＋ＲＩ ＢＴ、皮下；Ｉ２１７〜２２０およびＪ６８〜７１：２Ｘ１０６個のＳＩＶｍａ ｃ２５１−感染Ｃ８１６６細胞（グルタルアルデヒドで固定）　＋Ｑｕ　ｉ　ｌ −Ａアジュバント、皮下にそれぞれ４回および２回、Ｊ７２〜７５：２Ｘ１０’ 個のＣ８１６６細胞（グルタルアルデヒドで固定）　＋Ｑｕ　ｉ　１−Ａアジュ バント、皮下に２回。最終ブースターの１週間後に、すべてのサルを、５０％サ ル感染量（Ｍ　Ｉ　Ｄ、。）のＳＩＶｍａｃ３２Ｈ単離物（１１／８８プール； Ｃ８１６６細胞中で増殖させたもの）で静脈内に１０回チャレンジした。

Ｊ６８〜７０、Ｊ７２およびＪ７３を除いて、防御された動物には、ウィルスス トックの同一調製物による再チャレンジ前にブースターワクチン接種を施さなか った。防御は、プライマーとしてｌｌ亙、ｐｏ±を用いるＳＩＶｍａｃプロウィ ルスＤＮＡについてのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による既知の方法７、な らびにサル末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）とＣ８１６６細胞との直接同時培養によ るウィルスの単離により測定した。ウィルスは細胞変性効果（ＣＰ　Ｅ）の出現 により検出し、標準法を用いる感染細胞上のウィルス抗原の免疫蛍光検査により 確認した。ＣＰＥを示さなかった培養物は、陰性として処分する前に、少なくと も２８日間維持した。

ａ−ｄ：　活発に分裂しているＣ８１６６細胞（２０〜３０×１０’）を、ｌＯ ％ウシ胎児血清（Ｆ　ＣＳ）を含むメチオニン不含ＲＰＭＩ培地中で、０．５ｍ Ｃ１の３５３−メチオニンで６時間標識し、細胞を溶解し、以前に記載されたよ うにして放射免疫沈降させた８゜洗浄した免疫複合体を還元し、１２．５％アク リルアミドケルで電気泳動にかけた。ゲルをＡｍｐｌｉｆｙ　（Ａｍｅｒｓｈａ ｍ）で処理し、乾燥して、Ｋｏｄａｋ　Ｘ−Ｏｍａｔ　ＲＰフィルムに一７０℃ で露出した。

ｅ：　１０％ＦＣ３を含むＲＰＭ１１６４０中に１ｍＬあたりｌＸｌ０’個のＰ ８１５細胞またはヒトＨＬＡクラス１分子Ｂ２７てトランスフェクトしたＰ８１ ５細胞（ＰＢ　１５−８２７）を含有する浮遊液１００μＬを、０，１％アジ化 ナトリウムを含むサル血漿（チャレンジの日に採血したもの）の連続４倍希釈液 （１／３０〜ｌ／７６８０）１００μＬとともに４°Ｃて３０分間インキュベー トした。ｌＯ％ＦＣ３とアジ化ナトリウムを含むＲＰＭＩて細胞を３回洗い、そ の後ＦＩＴＣに結合させたヒト免疫グロブリンに対するウサギ抗体（１：１００ 、ＤＡＫＯ）１００μＬとともにさらに３０分間インキュベートした。細胞を前 のように洗い、１％ホルムアルデヒド含有ＰＢＳ中に再度浮遊させた。

ＦＡＣ３Ｃｏｎ５ｏｒｔ　３０　（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使っ てパーセンテージおよび最大チャンネル蛍光を分析した。終点力価は２０％以上 の細胞が陽性である場合の希釈率とした。

結果を図１に示す。図１ａ−１ｅより、防御されたサルから得られた血清はヒト ＨＬＡクラス■分子に特異的な抗体を含むことが明らかである。

ａ・　３５Ｓ−メチオニン標識Ｃ８１６（ｉ細胞溶解液を、サルから前もって採 血しておいた血漿（Ｂ）および不活化した精製ＳＩＶｍａｃ（１１７９，１１８ ０，１１８１，１１８２）、固定化したＳＩＶ感染Ｃ８１６６細胞（Ｉ２１７、 Ｉ２１９、Ｊ６８、Ｊ６９、Ｊ７１）またはＣ８１６６細胞（Ｊ７３、Ｊ７５） を接種したサルから得られた高度免疫血漿（Ａ）（２０μＬ）により免疫沈降さ せた。Ｊ７１Ｊ７５および１２１９を除いて、他のすべてのサルはＳＩＶｍａｃ ２５１　（Ｃ８１６６細胞中で増殖させたもの）によるチャレンジ感染から防御 された。

ｂ・　トラックＩ　１８１＋Ｗ６／３２および抗β２ｍ　＋　Ｉ　１８２ては、 放射性標識した細胞溶解液を１１８１からの血漿または抗β２ｍにより予め沈降 させ、その後モノクローナル抗体Ｗ６／３２　（ヒトＮ・ｉＨＣクラス１分子Ｈ ＬＡ−Ａ、−Ｂ、−Ｃ上の単形性抗原決定基に対して特異的である）または１１ ８２血漿によりそれぞれ沈降させた。

Ｃ４同様に、トラックＩ　ｌ　８１＋０ＫＴｌ　１では、１１８１による沈降に 続いてモノクローナル抗体０ＫＴＩＩにより沈降させた。１１８１　ＰＢは免疫 前血漿を表す。

ｄ　：　ｌ１ｅｒｐｅｓ　ｐａｐｉｏで形質転換したサルＢリンパ芽球様細胞系 の３″Ｓ−メチオニン標識細胞溶解液を、サルから前もって採血しておいた血漿 または防御されたサル１１８１から得られた高度免疫血漿２５μＬおよびモノク ローナル抗体Ｗ６／３２またはＬ２４３（ヒトクラス１１分子ＨＬＡ−ＤＲの非 多形性抗原決定基に対して特異的である）２μＬ　（ＩＩ！水）により免疫沈降 させた。

ｅ：　ＨＬＡ　Ｂ２７でトランスフェクトしたマウスＰ８１５細胞を用いた、代 表的なサル１１８１から前もって採血しておいた血漿および高度免疫血漿による 抗ヒトＨＬＡクラス■反応性のＦＡＣ３分析。防御された他のサルから得られた 血清を用いた場合も、ｂ　−ｅに類似した結果が得られた。

ＳＩＶｍａｃ２５１の３２Ｈ同族単離物およびＨＩＶ−１単離物ＧＢ８をＣ８１ ６６細胞中で増殖させ、ゲル排除クロマトグラフィーで部分精製してエンベロー プ糖タンパク質の損失を最小限に抑えた９゜両方のウィルス調製物をホルマリン で不活化し、使用前にリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で透析した。ＥＬＩＳＡアッセ イの場合は、Ｏ，１Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ９，６で希釈したＳＩＶｍａ　ｃ　（２ｕ 　ｇ／ｍＬ）またはＨＩＶ−１（１６μｇ／ｍＬ）５０μＬを９６ウエルのマイ クロタイタープレート（Ｎｕｎｃ、　ＭａｘｉＳＯｒｂ　）の各ウェルに加え、 後続の全ステップを以前に記載されたように行った１０゜ モノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびセイヨウワサビペルオキシダーゼに結合さ せたヒト免疫グロブリンに対するウサギ抗体（ｉｇｌｏｏ、ＤＡＫＯ）は０．０ ５％トウィーン２０とｌＯ％熱不活化ウシ新生児血清（ＨＩ　ＮＣ５）を含有す るＰＢＳで希釈した。用いたｍＡｂの希釈率は腹水については１　：　１００、 精製した免疫グロブリンについては２０〜５０μｇ　／　ｍ　Ｌ、そして組織培 養上清についてはそのままであった。すべての洗浄には０゜０５％トゥイーン２ ０含有ＰＢＳを用いた。基質は２．２゛　−アジノービス（３−エチルベンゾチ アゾリン−６−スルホン酸）（ＳＩＧＭＡ　）を使用し、吸光度（ＯＤ）は４０ ５ｎｍで測定した。

結果を表１に示す。陰性対照の読取り値よりも５倍高い値（平均±Ｉ　ＳＥＭ、 　Ｎ＝６）を陽性（太字で表す）とした。用いたｍＡｂはエイズに関するプログ ラム、ＭＲＣ（ＡＤＰ３７３、ＡＤＰ３１７、ＡＤＰ３１８、ＡＤＰ３３６、Ａ ＤＰ３５１、ＡＤＰ３５６、ＡＤＰ３５９）；アメリカン・タイプ・ティッシュ ・カルチャー・コレクション（Ｗ６／３２、Ｌ２０３、Ｌ２２７、Ｌ２４３、Ｏ ＫＴ　３　）　；　Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ　５ｑｕｉｂｂ　（シアトル） （９゜３）から得られ、そして０ＫＴＩＩとｎｍ３１はそれぞれ、Ｌｉｎｃｏｌ ｎ’ｓ　Ｉｎｎ　Ｆｉｅｌｄ　（ｏノドン）のり、　Ｃａｎｔｒｅｌｌ博士およ びＩｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　（オ ックスフォード）のＡ。

ＭｃＭｉｃｈａｅｌ教授からの贈り物であった。用いた全ｍＡｂの活性はフロー サイトメトリーを使って調べた（データは示してない）。

五−上 パーコール勾配での遠心分離により脱線維素血液（ＳＩＶｅｎＶを接種したサル から得られたもの）力１らサルＰＢＭＣを単離し一５Ｍ）を含有するＲＰＭ１１ ６４０の１ｍＬあたりｌＸｌ０’個のＰＢＭＣを、９６ウエルの平底プレート（ Ｃｏｓｔａｒ）に１００μＬ／ウエルで分配した。

次に、防御された（Ｐ）もしくは防御されなかった（ＮＰ）サルから得られた血 清（全血清を５６℃で４５分間熱不活化した）の表示した希釈液または培地５０ μＬをウェルに加えた。続いて、Ｓ　ＩＶｇｐ　ｌ　４０　（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ 、５　μｇ／ｍＬ）　５０　μＬを添加した。混合リンパ球培養物では、ｌＸｌ ０’個の照射した０８１６６細胞（７５００Ｒ）または若いサルＪ７由来のＰＢ ＭＣ（２５００Ｒ）を含有する５０μＬを刺激抗原として加えた。

培養物は湿潤ＣＯ２インキュベーター内で３７℃、５日間インキュベートし、イ ンキュベーションの最後の６時間のあいだ１μＣ４／ウエルの３Ｈ−チミジン（ Ａｍｅｒｓｈａｍ、比活性２５Ｃｉ／ｍｍｏｌ）でパルスした。３反復実験の培 養物を自動細胞収穫機（ＬＫＢ、スウェーデン）で収穫し、βカウンター（ＬＫ Ｂ、ベータプレート、スウェーデン）で放射能を測定した。吸着実験では、ｌ： ４０に希釈したサル血清７００μＬを１０７個のＰ８１５またはＰ８１５−Ａｌ 細胞とインキュベートし、次に１０７個のＰ８１５またはＰ８１５−Ｂ２７細胞 とそれぞれインキュベートした。

予め吸着させた血清は濾過しく０．２２μｍ）、適度に希釈したのち培養物に添 加した。結果を表２に示す。それぞれの値は平均±ｌ　ＳＥＭ、　Ｎ＝６を表す 。７５％以上の阻害を示す値を太字で示しである。他の血清およびサルＰＢＭＣ を用いた場合にも同様の結果が得られた。

表　２ ４、　防御されたサルの血清によるＰＨＡ、０ＫＴ３または抗原−誘導ヒトＴ細 胞増殖の阻害ヒストバク−（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ、　ＳＩＧＭＡ　）での遠心 分離により脱線維素血液（ボツリヌス毒素を４回接種した個体から得られたもの ）からヒトＰＢＭＣを単離した。Ｔ細胞増殖アッセイは表２におけるものと本質 的に同じであったが、Ｔ細胞を刺激するためにフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ、 　Ｗｅｌｌｃｏｍｅ　ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＳｌ　ｌ　μｇ　／　ｍ　Ｌ　） またはボッリヌス毒素（Ｄ、　５ｅｓａｒｄｉｃ博士より入手、２．５μｇ／ｍ Ｌ）または精製０ＫＴ３　（５ｎｇ／ｍＬ）を用いた。対照抗体としてｍＡｂＷ ６／３２およびＡＤＰ３１４（抗ＨＩＶ−１ｐ５５／ｐ２４）　の腹水も使用し た。Ｐ　ＨＡまたは０ＫＴ３との培養には３日間、そして抗原との培養には５日 間、培養物をインキュベートした。結果を表３に示す。それぞれの値は平均±Ｉ 　ＳＥＭ、　Ｎ＝３を表す。７５％以上の阻害を示す値を太字で示しである。他 のサル血清を用いた場合にも同様の結果が得られた。対照のサルＪ１４２にはＲ ＩＢＩアジュバントのみを接種した。

（本頁以下余白） 表　３ ５、考察 サル血清を用いる１６８−メチオニン標識Ｃ８１６６細胞溶解液の放射免疫沈降 から、防御されたサルの血清はすべてが２つの主要なタンパク質バンド（１２お よび４４ｋＤａ）を認識するが、防御されなかったサルの血清はそれらを認識し ないことが実証された（図１ａ）。これらのバンドは３種のワクチングループの 防御された全動物から得られた血清により沈降したが、免疫前血清によっては沈 降しなかった。阻害実験は、３１Ｓ−メチオニン標識Ｃ８１６６細胞溶解液を、 防御されたサルの血清で予め沈降させ、続いてｍＡｂＷ６／３２（ヒトＭＨＣク ラスＩ分子ＨＬＡ−Ａ。

−Ｂ、−Ｃ上の単形性抗原決定基に対して特異的である）で沈降させることによ り実施した。また、該溶解液はウサギ抗β２ｍ（ＨＬＡクラスＩ分子のβ鎖）で 前もって沈降させ、次に防御されたサルの血清で沈降させた。

図１ｂに示した結果から、１２および４４ｋＤａのバンドはそれぞれＨＬ　Ａ２ ５２１分子のβ２ｍおよび重（ｈ）鎖であることがわかった。フローサイトメト リー分析からも、防御サル由来の血清はヒトＨＬＡクラスＩ　Ｂ２７でトランス フェクトしたマウス細胞系（Ｐ８１５）を認識することが明らかである（図１ｅ ）。

防御されたサルの平均抗体価はｌ０ｇ１ｏ　３．１±０．１３（Ｎ＝３２）であ り、防御されなかったサルの平均抗体価は１．８６±０．０９　（Ｎ＝１９）、 Ｐ＜０．０００５てあった。一部の防御サルから得られた血清により沈降した４ ４ｋＤａ領域付近のバンドの強度および質量（図１ａ）は、同様の分子員をもつ 他のＴ細胞表面タンパク質、例えばＣＤ２　Ｂ　（４４ｋＤａ）　、ＣＤ２（Ｔ ｌｌ、５０ｋＤａ）およびアクチン（４４ｋＤａ）も認識されうろことを示唆し ている。

しかしながら、精製ＳＩＶｍａｃ２５１ウィルスを接種した防御サルからの血清 は抗ＣＤ２抗体（図１ｃ）または抗ＣＤ２８抗体（データは示してない）を含ん でいない。防御サル由来の血清は３ｓＳ−メチオニン標識したＨｅｒｐｅｓ　ｐ ａｐｉｏ−形質転換サルＢリンパ芽球様細胞系のクラス１分子のα鎖もβ鎖も沈 降させなかった（図１６）。このことは該血清中の抗ヒトクラスＩ抗体がヒトＨ ＬＡクラスＩ分子の多形性領域で誘導されたことを示唆している。

精製ＳＩＶｍａｃ２５１ウィルスを接種した防御サルにおいて高レベルの抗ヒト ＨＬＡクラスＩ抗体が誘導されたことから、精製ウィルス調製物はＨＬＡクラス Ｉ抗原を含みうろことが考えられる。本発明者らのＥＬ　Ｉ　ＳＡの結果（表１ ）からは、免疫感作に使用した部分精製ＳＩＶｍａｃ２５１ウィルス調製物、お よびＨＩＶワクチン製剤（ＧＢ８）が、ＨＬＡクラス■分子と、さらに、Ｔ細胞 受容体（Ｔ　ｃ　Ｒ）複合体の一部を形成するＴ細胞抗原ＣＤ３を含んでいるが 、検出可能なりラスｌＬＣＤ４、ＣＤ２またはＣＤ２８抗原をほとんど含まない か、まったく含まないことが確認できる。しかし、防御サル由来の血清はＣＤ３ γ−１δ−１ε−１ξ−およびη−鎖（２６，２０および１６ｋＤａ）を表すい ずれのバンドをも沈降させることができず（図１ａ）、このことは、これらのサ ルにおいてＣＤ３は免疫原性が弱く、存在するにしても抗ＣＤ３のレベルが我々 のアッセイ系の検出限界以下であることを示している。

ＨＬＡクラス■重鎖またはβ２ｍに対するｍＡｂはｉｎ　ｖｉｔｒｏでＴ細胞の 増殖ならびに活性化を阻止しうろことがいくつか報告されているｌｌ−ｌｌ。さ らに、これらの抗体はｉｎ　ｖｉｔｒｏでＨＩＶの複製を阻止することができた １−４２゜本発明者らは、防御されたサルと防御されなかったサルから得られた 血清が、ｉｎ　ＶｉｔｒＯにおいて、照射したＣ８１６６細胞もしくはサルＰＭ ＢＣまたは組換えＳＩＶ抗原（ｒｇｐ　１４０）に対するサル由来の末梢血Ｔ細 胞の増殖応答に及ぼす影響を調べた（表２）。防御されなかったサルの血清はあ らゆる増殖応答にまったく影響を及ぼさなかった。防御されたサルの血清は照射 サル細胞またはｒｇｐ１４０に対する増殖応答には影響を及ぼさなかったものの 、それらはＣ８１６６細胞に対するサルＴ細胞の増殖応答を強く阻害した。血清 の阻害効果は、ヒトＨＬＡクラスＩ遺伝子（ＡＩおよびＢ２７）でトランスフェ クトしたＰ８１５細胞を用いた吸着により顕著に消失したが、Ｐ８１５細胞のみ では消失しなかった（表２）。

また、本発明者らは、防御されたサルの血清がフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ） 　、抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）および特異的抗原、ボツリヌス毒素（ＢＴｘｄ） に対するヒト末梢血Ｔ細胞の増殖応答に及ぼす影響を調べた（表３）。防御され なかったサルの血清は抗原特異的増殖に何の影響も及ぼさず、０ＫＴ３−誘導応 答に対して高濃度で弱い阻害効果（Ｊ　ｌ　３９、ＳＩＶを接種）を示しただけ だった。これとは対照的に、防御サル由来の血清とモノクローナル抗体Ｗ６／３ ２はこれらの応答のすべてを強く阻害した。

これら血清の阻害効果は、この場合も、ヒトＨＬＡクラスＩ遺伝子（Ａｌおよび Ｂ２７）でトランスフェクトしたＰ８１５細胞を用いた吸着により消失した（デ ータは示してない）。

我々の結果は、ＨＬＡクラスＩ抗原に対する抗体応答とＳＩＶｍａｃ２５１　（ Ｃ８１６６細胞中で増殖させたもの）感染からのサルの防御との間に直接の相関 関係があることを示すものである。

この抗体による正確な防御機構は目下のところ明らかではない。

この抗体はウィルスエンベロープのクラスＩ抗原と反応することによりｇｐ１２ ０と標的細胞上のＣＤ４決定基との相互作用を立体障害によりブロックするのか もしれない。しかし、このことは、防御サル由来の血清がＣＤ４保有ヒトＴ細胞 への生存ＳＩＶの結合をブロックしなかったので、ありそうもないことである■ 。

さらに、防御されなかったサルの血清は高レベルの特異的抗ＳＩＶ抗体を含んで おり３″・■・２＋、それゆえ、ウィルス−〇Ｄ４相互作用のみをブロックする ことがこの系の主な防御機構ではないのかもしれない。また、防御されなかった サルの血清中に高レベルのＳＩＶ特異的抗体が存在するということは、クラスＩ 抗原とレンチウィルスとの交差反応がＳＩＶ感染からの防御において重要な役割 を果たしているという考えに対して異議を唱えるものである２５゜ しかしながら、特異的中和抗体がクローン化ＳＩＶによる同種チャレンジ感染か らサルを防御しうろことを認めないわけではない２６゜抗ＣＤ４抗体がこの系に おいて重要な役割を担っているとは考えにくい。なんとなれば、防御されたサル の血清中に抗ＣＤ４抗体がフローサイトメトリーによって全く検出されていない しくデータは示してない）、ＳＩＶウィルス調製物中にもＣＤ４抗原が存在して いないからである（表１）。以前の報告ｆ７と対照的に、本発明者らは、ＳＩＶ ウィルス調製物中にクラスＴＩ抗原を検出することができなかった。これはウィ ルスの精製に異なる方法を採用したことによるのかもしれない。

我々のデータは、ＨＩＶ複製にとって必要であることが知られているＩＩＩ−Ｉ Ｉ　、Ｔ細胞の活性化をダウンレギュレーションすることにより、抗りラスＩ抗 体がＳＩＶ感染からの防御に寄与しうろことを示唆するものである。これは、抗 りラスＩ抗体がヒトＰＭＢＣにおけるＨＩＶ複製を妨害しうるという以前の報告 と合致する２０−２２゜抗りラスＩ抗体がＴ細胞の活性化をダウンレギュレーシ ョンする正確な機構は不明である。それらは単核細胞の抗原提示を阻害すること によって作用するのかもしれない。かくして、ヒトクラスＩ抗原を含むＳＩＶ調 製物で防御サルをチャレンジした場合には、抗ヒトクラス■抗体がこれらの抗原 に結合して、サル抗原提示細胞と反応することから該抗原を効果的にブロックし 、これによりＴ細胞の優勢な異種活性化（ＸｅｎＯｇｅｎｉＣａｃｔｉｖａｔｉ ｏｎ）（抗ＳＩＶ応答より１０倍以上高い）を抑制し、その結果ウィルスの複製 を阻害することができたのだろう。

抗ヒトクラスＩ抗体はサルクラスＩ抗原と交差反応しないので（図１ｄ）、ワク チン接種サルをＳＩＶでチャレンジしたとき、抗ヒトクラスＩ抗体はサルクラス Ｉ抗原（サル細胞中で増殖させたＳＩＶに存在する）がサル抗原提示細胞に結合 するのをブロックしないだろう（表２）。それゆえ、同種活性化（ａｌ　ｌｏｇ ｅｎｉｃａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）のダウンレギュレーションは存在せず、かくし てウィルス複製が阻害されない。これは、サル細胞中で増殖させたＳＩＶによる チャレンジ感染からワクチン接種サルが防御されなかった理由の説明となりうる ４−６゜ 抗りラス■抗体がＴ細胞活性化をダウンレギュレーションする別の方法は、Ｔ細 胞上のクラ２１分子に直接作用することによるものである１９゜防御サルからの 抗ヒトクラス■抗体とサルＴ細胞上のサルクラスＩ抗原との交差反応性の欠如の ために、該抗体がこのルートで特定の抗原により誘導されたサルＴ細胞の活性化 をダウンレギュレーションすることは期待できないだろう。ＳＩＶ抗原誘導活性 化は異種または同種活性化より少なくとも１０倍弱いことから（表２）、このよ うにして誘導されたＴ細胞の活性化は十分なウィルス複製を促進してサルを感染 させるには十分ではないだろう。しかし、この抗体は特定の抗原またはマイトジ ェンに対するヒトＴ細胞の活性化を強く阻害することが期待できよう。

これが実際に表３に示した実験の場合である。これらの知見は、抗ヒトＨＬＡク ラスＩ抗体がＨＩＶ感染に対する免疫治療に有用でありうることを示唆するもの である。

我々のデータは、抗りラス■抗体がＣＤ４”Ｔリンパ球のＳＩＶ感染に対する抵 抗性には寄与することを示唆するものの、該抗体は単球の感染には効果がないか もしれない。いずれの場合にも、ウィルスはこれらの細胞内で著しく複製すると は予想されず、Ｔ細胞またはＰＨＡ活性化ＰＢＭＣ中で増殖したウィルスは同種 の細胞型に感染するにすぎないだろう３５゜実施例２ ４匹のマカクザルに、アジュバントとしてスクアランおよび水中プルロニックエ マルジョンにより製剤化したＧＭＤＰを用いて、ＨＬＡクラスＩ（Ｂ２７）でト ランスフェクトしたマウスＰ８１５細胞とヒトＢ細胞系由来の精製ＨＬＡ　Ａｌ およびＢ８（０８１６６細胞のハブロタイブ）の混合物を免疫原として接種した 。

対照のサルはＰａ１５細胞とアジュバントで免疫した。２回目のワクチン接種後 、４匹の接種サルはすべて、Ｐａ　１５−Ｂ２７細胞およびヒトＢ細胞系（該細 胞系からＨＬＡ免疫原を調製した）についてのフローサイトメトリーにより、良 好な抗体応答（＞１／ｌ　２０）を示した。対照のサルは＜１／３０の抗体価を 示した。

３回目のワクチン接種後、接種サルの抗体価は、Ｐａ　１５−Ｂ２７細胞とＣ８ １６６細胞の両方についてフローサイトメトリーで検査したとき、≧１’／１９ ２０へとさらに上昇していた。対照サルの抗体価は＜１／３０のままであった。

プラスチックに吸着させた精製ＨＬＡ　Ｉを用いてラジオイムノアッセイを行っ たところ、接種サルは１．／１２０〜１／４８０の抗体価を示したのに、対照サ ルおよびプレブリード（ｐｒｅｂｌｅｅｄ）のそれは＜１／３０であった。

さらに、電子顕微鏡のもとて免疫−金ラベリングにより調べたところ、接種サル 由来の血清はＳＩＶウィルスのエンベロープに結合するが、対照サル由来の血清 は結合しないことがわかった。

（本頁以下余白） 文献 Ｌ］ムユ、、　２５．９２３−９２７　（１９７８）。

ＬｅｖＹＩ　Ｊ−”　Ｌ−≦ｌ：ｍａｎ、１コ１．　２７３５−２７４０　（１ ９８３）。

１６、Ｈｕｇｅ、　Ｓ、　ａｔ　ａｌ、　、ｔ　’　８４．７２２２−７２２６ 、Ｔ、Ｃ，ｌ對よ劇、、　６４．　１４５９−１４６４　（１９９０）。

２２、Ｃｏｒｂｅａｕ、Ｐ、、０１ｉｖｅ、Ｄ、ａｎｄ　Ｄｅｖａｕｘ、Ｃ。

２１．８６５−［１７１（１９９１）。

２：１．Ｍｏｎｔｅｆｉｏｒｉ、Ｄ、Ｃ，、Ｈｉｒｓｃｈ、Ｖ、Ｍ、ａｎｄ　Ｊ ｏｈｎｓｏｎ、Ｐ、Ｒ，＄α↓１コ５４．　４］９−４４０　（１９９１）。

２４、Ｐｕｔｋｏｎｅｎ、Ｐ、ａｔ　ａｌ、　＄迄坪１３５２，４３６−４３８ 　（１９９１）。

２５、　に”ｄｏｘｒ　Ｊ、　ｌＬ塁−誌！旦　３５コ、２９７　（１９９１） 。

２６、　Ｈｕｉ、　Ｓ−Ｌ、、　ａｔ　ａｌ、　シニｌ耳！２５５．４５６−４ ５９　（１９９２）。

２７、Ｈｅｎｄａｒｓｏｎ、Ｌ、Ｅ、ｅｔ　ａｌ、　Ｌ−ぬ工ｊ１６１，６２９ −６３２　（１９８７）。

２８、ＭｃＤｏｕｑａｌ　Ｊ、Ｓ、ｅｔ　ａｌ、σニー」−■Ｗ＾１エ　１コ５ ．　３１５１−３１６２　（１９８５）。

２９、Ｆｏｌｋｓ、　Ｔ、　＠ｔ　ａｌ、　Ｌ−Ｄ唱東Ｌ１３６．　４０４９− ４０５３　（１９８６）　。

３０、　Ｔｏｎｇ−５ｔａｒｋｓｅｎ、　Ｓ、Ｅ、、　Ｌｕｃｉｗ、　Ｐ、Ａ、 　ａｎｄ　Ｐａｔａｒｌｉｎ　Ｂ、Ｍ。

Ｌ、二皿記ｍよ”’Ｌ　７０２−７０７　（１９８９Ｌ３１、Ｇｏｗｄａ、　Ｓ 、Ｊ、、　５ｔａｉｎ、　Ｂ、Ｓ、、　Ｍｏｈａｇｈｅｇｈｐｏｕｒ、　Ｎ、、 　Ｂａｎ１ｋａ。

Ｃ，Ｊ、　ａｎｄ　Ｅｎｇｌｅｍａｎ　Ｅ、Ｇ、　Ｌ−一皿東ＬＬ４２．７１− ７８０　（１９８９）　。

コ２．　５ｔａｖｅｎｓｏｎ、Ｍ、、Ｓｔａｎｗｉｃｋ、Ｔ、Ｌ、、Ｄｅｍｐｓ ｅｙ、Ｍ、Ｐ、ａｎｄＬａｍｏｎｉｃａ、Ｃ，Ａ、　ｎ年９」工９．　１５５１ −１５６ｏ　（１９９ｏ）。

コ３．　Ｍｏｈａｇｈｅｇｈｐｏｕｒ、Ｎ、、Ｃｈａｋｒａｂａｒ、Ｒ，、５ｔ ａｉｎ　Ｂ、Ｓ、、Ｇｏｗｄａ。

５．０．　ａｎｄ　Ｅｎｇｌａｍａｎ、Ｅ、Ｇ、　、　’　、２６６、　７２コ ３−７２コ８（１９９１）。

３４、　Ｂｒａｓｓｌｅｒ、　Ｐ、、　Ｐａｎｔａｌｅｏ、　Ｇ、　Ｄａｍａｒ ｉａ、　Ａ、　ａｎｄ　Ｆａｕｃｉ、　Ａ、Ｓ。

Ｌ４Ｂ狐■Ｌ１４７．　２２９０−２２９４　（１９９１）。

３５、　Ｍａｌｔｚａｒ、　Ｍ、Ｓ、　ｅｔ　ａｌ　ｍｍｕ　、ｏ　ａ　１１． ２１７−２２３　（１９９０）。

３６、　Ｒｉｂｉｌ　Ｅ−ｔ　１１　Ｃ１１ｎ−ニーｕｎｏ１．　Ｎａｗｓｌａ ｔｔｅｒ　Ｌ　３３−３６．　１９８５Ｆｉｇ　ｌλ Ｆｉｇ　ＩＢ ＰＢ Ｆｉｇ　ＬＤ Ｆｉｇ　Ｌ！ ネ甫正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法　第１８４条の８） 平成７年１月１３日

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトまたは動物体の治療方法において使用するための主要組織適合遺伝子複 合体クラスＩ抗原。
2. ２．免疫不全ウイルスに対するワクチンとして使用するための請求項１に記載の 抗原。
3. ３．前記のウイルスがヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である、請求項２に記載 の抗原。
4. ４．前記のウイルスがＨＩＶ−１である、請求項３に記載の抗原。
5. ５．前記のウイルスがＨＩＶ−２である、請求項３に記載の抗原。
6. ６．ヒトクラスＩ抗原である、請求項１〜５のいずれか１つに記載の抗原。
7. ７．ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢもしくはＨＬＡ−Ｃ抗原、またはβ２ミクログロブ リンである、請求項６に記載の抗原。
8. ８．薬学的に許容される担体または希釈剤、および有効成分としての主要組織適 合遺伝子複合体クラスＩ抗原を含有する医薬組成物。
9. ９．免疫不全ウイルスに対するワクチンとして使用するための医薬の製造におけ る主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ抗原の使用法。
10. １０．有効量の主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ抗原を宿主に投与することか らなる、免疫不全ウイルスに対して宿主をワクチン接種する方法。
11. １１．主要組織適合遺伝子複合体クラスＩ抗原を含有する、免疫不全ウイルスに 対するワクチンとして有用な薬剤。