JPH07506340A

JPH07506340A - 薬剤耐性マラリアに対する駆虫性オリゴヌクレオチドの活性

Info

Publication number: JPH07506340A
Application number: JP5512465A
Authority: JP
Inventors: ラパポート、エリーザー; ザメクニク、ポール　スィー．
Original assignee: ザ　ウースター　ファウンデイション　フォア　バイオメディカル　リサーチ
Priority date: 1991-12-31
Filing date: 1992-12-31
Publication date: 1995-07-13
Also published as: CA2126979A1; US5616564A; WO1993013740A3; WO1993013740A2; EP0619736A1; KR940703677A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】薬剤耐性マラリアに対する駆虫性オリゴヌクレオチドの活性＆訓皇１遣１、免胛段芳１本発明は化学療法用薬剤の使用による病原性感染の処置方法に関する。特に、本発明は薬剤耐性のマラリアのような従来の化学療法用薬剤に耐性を有する病原による感染の処置に関する。

２、ｍ人工１１ＪＩマラリアは最も広まっている人間の病原性感染病の一つであり、高い罹病率と死亡率で知られており、特に、東南アジア、アフリカおよび南米において見られる。これまで、この病気の根絶は蚊の集団密度の管理、予防接種プログラムの設定および抗マラリア剤による治療により部分的にではあるが行われてきた。しかしながら、近年、このような抗マラリア剤への耐性が高まって、この病気の範囲や苛酷さが大幅に息を吹き返してきている。

０ａｋｓ他の「マラリア、障害と機会、マラリアの予防および管理、状況調査および代替的対処法についての研究委員会の報告」　（薬学会、国際健康部門（Ｎａｔｉ。

ｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　Ｐｒｅｓｓ　（１９９１）））においては、この病気やその臨床態様、病因および媒体、ならびに、当該病気管理の困難性や現在底まっているマラリアの他の態様についての最新情報を開示している。

マラリアは人間の寄生性感染病の内で世界規模で広まっている唯一のものである。Ｗｅｂｓｔｅｒは、治療法の薬理学的基礎のセクションＸ　（Ｇｉ　１ｍａｎ他編、第８版、（Ｐａｒｇａｍｍ　Ｐｒｅｓｓ（１９９１））において、一般に集団の成長、群生化、衛生の不備、寄生媒体の不適当な抑制、農業用水管理システムの導入、集団転移の増加、および、化学療法や媒体の抑制に用いる薬剤への耐性の強化等を含む幾つかの因子が寄生性感染の増加に関与すると論じている。

事実、獲得性の薬剤耐性はバクテリアやウィルスを含む種々の感染病原において主要な公共衛生の問題になっている。

当業界においては、抗マラリア性薬剤のインビトロスクリーニングのための実験室的技法が周知である。このような技法は培養した人間の赤血球細胞における熱帯熱性マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ　ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）の無性生殖性赤血球サイクルを利用している。

ＴｒａｇｅｒおよびＪｅｎｓｅｎ　（Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９３　：　６７３−６７５　（１９７６））はインビトロにおける人間マラリア寄生虫の連続的維持を開示している。

また、Ｄｅｓｊａｒｄｉｎｓ他（Ａｎｔｉｍｉｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　ＣｈｅｍｏｔｈｅｒａｐＹ　１６：７１０−７１８　（１９７９））は半自動化マイクロダイリューション法による薬剤のインビトロにおける抗マラリア活性の定量的評価方法を開示している。

一方、Ｃｈｕｌａｙ他（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ　５５：１３８−１４６（１９８３））は［１Ｈ］−ヒボキサンチンの取り込みを計測することによる熱帯熱性マラリア原虫のインビトロにおける成長の評価方法を開示している。さらに、Ｌ　ａｍｂｒｏｓおよびＶａｎｄｅｒｂｕｒｇ　（Ｊｏｕｒｎａ　１ｏｆ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ　６５：４１８−４２０　（１９７９））は培養における熱帯熱性マラリア原虫の赤血球段階における同調化のための手法を開示しており、これによって抗マラリア性薬剤の活性の機構が説明できる。

これらのインビトロシステムは人間のマラリア治療に用いる種々の薬剤に対応する臨床結果から予知できると考えられてきた。Ｂｉｔｏｎｔｉ他（Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２　：１３０１−１３０３　（１９８８））はデシプラミンによる熱帯熱性マラリア原虫におけるクロロキン耐性の逆転についてのインビトロにおける正確な予知方法を開示している。さらに、Ｍ　ａ　ｒ　ｔ　ｉ　ｎ他（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３５二８９９−９０１　（１９８７））はベラピミルによる熱帯熱性マラリア原虫におけるクロロキン耐性のインビトロにおける正確な予知方法を開示している。

一方、多様な抗マラリア性の薬剤が開発されている。

これらの薬剤は殺シゾント剤として無性生殖赤血球段階において作用する。クロロキン、キニーネ、キニジン、メフロキンおよびピリメタミンはマラリア原性寄生虫の酸性の食物空胞において高レベルで蓄積する弱塩基性物質であり、当該寄生虫の種々の細胞活動を阻害し、さらに、その赤血球ホストへの相互作用を阻害する。これらの薬剤はスルホンアミド、スルホンまたはテトラサイクリンと共に使用することができる。さらに、可能な対象の開拓を通して当該マラリア寄生虫の特異的阻害を図ることもできる。Ｈｏ１ｄｅｒ他（Ｎａｔｕｒｅ　３１７：　２７０−２７３　（１９８５））　は熱帯熱性マラリア原虫のメロゾイト（赤血球から発生しかつ未感染赤血球を侵害するマラリア寄生虫の一形態）の３種の主な表面抗原への前駆体の一次構造を開示している。また、Ｈａｄｌｅｙ他（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ、４０：　４５１−４７７　（１９８６））はマラリア寄生虫による赤血球の侵害の細胞的および分子論的な基礎を論じている。Ｑｕｅｅｎ他（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ　Ａｇｅｎｔｓ　ａｎｄ　Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ　３４：１３９３−１３９８　（１９９０））はヌクレオチド代謝を阻害する化合物に対する熱帯熱性マラリア原虫のインビトロな感受性、プリン塩基およびヌクレオチドを得るためのサルベージ経路およびピリミジンのディノボ（新規）合成への熱帯熱性マラリア原虫の排他的依存に基づく感受性を論じている。また、Ｆｅｒｏｎｅ他（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ　５：４９−５９　（１９６９））およびＨｉｔｃｈｉｎｇｓおよびＢｕｒｃｈｅｌｌ（Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　２７：４１７ −４６８（１９６７））はピリメタミンがホストの哺乳類ジヒドロフオレートリダクターゼを阻害するよりもはるかに大きな程度で原虫類のジヒドロフオレートリダクターゼを阻害しかつディノボのピリミジン生合成を阻害するために、ピリメタミンがマラリアに対する化学療法に有用であると教示している。

しかしながら、不幸にも、ピリメタミンのような薬剤は耐性菌株の広範な出現により非効果的であるとされている。Ｐｅｔｅｒｓｏｎ他（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５：９１１４−９１１８　（１９８８））はジヒドロフォレートリダクターゼーチミジレートシンターゼにおける点変異が熱帯熱性マラリアにおいてピリメタミンに耐性を付与することを開示している。また、Ｍａｒｔｉｎ他（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３５：８９９−９０１　（１９８７））は熱帯熱性マラリア原虫におけるクロロキン耐性が当該寄生虫の該細胞障害性薬剤の細胞内蓄積を防止する獲得性能力から生じることを教示している。このような薬剤への耐性はマラリア株である熱帯熱性マラリア原虫のみをとってもマラリアの治療において重大な臨床的問題を起こしている。しかしなから、この種類は人間のマラリアの場合の８５％以上であり、この病気による死亡例の大半を占める。５ｈａｎｚｅｒ他（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　Ｉ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８８：６５８５−６５８９（１９９１））は耐性寄生虫がインビトロ並びにインビボにおいて種々の薬剤に対して交差耐性を維持するので、研究者は薬剤耐性の基になる生化学的機構を同定することが可能となり、かつ、革新的な化学療法によって当該耐性を打破することが可能になることを教示している。

それゆえ、当該熱帯熱性マラリア原虫のような薬剤耐性の寄生虫に対する治療のための新規な化学療法の研究が必要とされている。なお、このような研究はリーシュマニア症やトリパノソーマ症を含む他の原虫感染症の治療においても有用である。

合成オリゴヌクレオチドの外部投与が多種の感染性因子を阻害するための手段として注目されている。Ｚａｍｅｃｎｉｋおよび５ｔｅｐｈｅｎｓｏｎ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７５：２８０−２８４　（１９７８））はひな鳥の胚繊維芽細胞の組織培養における外因性オリゴヌクレオチドによるラウス肉腫ウィルス（Ｒ３Ｖ）の複製および遺伝子発現の阻害とこれによる繊維芽細胞の肉腫細胞への形質転換の防止を論じている。さらに、５ｔｅｐｈｅｎｓｏｎおよびＺａｍｅｃｎｉｋ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７５　：　２８５−２８８　（１９７８））は同一のオリゴヌクレオチドが網状赤血球システムにおけるＲ８Ｖ３０５　ＲＮＡにより特定される蛋白質の無細胞合成を阻害することを教示している。また、Ｚａｍｅｃｎｉｋ他（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８３：４１４３−４１４６　（１９８６））は人間の免疫不全ウィルス（ＨＩ　Ｖ）ゲノムにおける多種の保存領域に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いたインビトロスクリーニングシステムにおけるＨＩＶ複製の阻害を開示している。修飾したヌクレオチド間の架橋フォスフェートの使用により、インビトロＨＩＶ複製における５０％阻害濃度（Ｉ　Ｃｇｏ）が１０ないし１００倍減少した。Ｍａｔｓｕｋｕｒａ他（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４ニア７０６−７７１０　（１９８７））はオリゴヌクレオチドのホスホロチオエートを用いたこの効果について開示している。また、Ａｇｒａｗａ＋他（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ８５ニア０７９−７０８４　（１９８８））はオリゴヌクレオチドのホスホロチオエートおよびホスホロアミデートの場合の類似の効果を示している。さらに、５ａｒｉｎ他（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ８５　ニア４４８−７４５１　（１９８８））はオリゴヌクレオチドのメチルホスホネートを用いたＨＩＶのより効果的な団害を開示している。

このような、上記文献およびＧｏｏｄｃｈｉｌｄ他の米国特許第４８０６４６３号において記載されるレトロウィルス感染を阻害するための外因性オリゴヌクレオチドの使用は潜伏または休止状態の治療を代表するものである。この理由は、当該レトロウィルスのゲノムがホスト細胞のゲノムと一体になり、ホスト細胞の酵素の参加により発現され、かつ、一定の潜伏期間後にのみ作用を示すからである。これに対して、マラリアや他の感染性の寄生虫病、さらに、急性のウィルス性やバクテリア性感染症の治療は即座の治療を要する活発な感染症のための化学療法である。Ｂｚｉｋ他（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１゜Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８４：８３６０−８３６４（１９８７））は熱帯熱性マラリア原虫のジヒドロフォレートリダクターゼーチミジレートシンターゼ遺伝子のヌクレオチドシーケンスを教示している。しかしながら、無細胞翻訳システムにおける熱帯熱性マラリア原虫のｍＲＮＡからのこれら蛋白質の合成を阻害するために外因性オリゴヌクレオチドを用いる最近の試みはマラリアの臨床治療のための手段としての可能性が無いことを示した。すなわち、５ａｒｔｏｒｉｕｓおよびＦｒａｎｋｌｉｎ　（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１９：１６１３−１６１８　（１９９１））はオリゴヌクレオチドを熱帯熱性マラリア原虫のｍＲＮＡに対して使用する前に６５℃で５分間予備アニーリングし、その後、１時間３０℃で冷却処理しないと、このようなシステムにおける蛋白質合成の阻害に全く効果を示さないことを示している。さらに、このように高度に非生理的な条件下であるにも拘わらず、５０％阻害を生じるには３０−４９個のヌクレオチドオリゴマーに対して１５０−１７０μＭという極めて高い濃度が必要であった。而して、これらの結果により、オリゴヌクレオチドによるマラリア性蛋白質合成の阻害は、ホスト赤血球および赤血球内の寄生虫が体温の３７℃に維持される、インビボ環境においては不可能であることが示唆される。

九肌立蓑１本発明は病原性感染の化学療法的処置に関するものであり、人間の病原による活発な感染の処置のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド療法による方法およびその材料を提供する。すなわち、本発明に従う方法は当該病原性感染病を阻害するオリゴヌクレオチドを投与することから成る。該方法は薬剤耐性および薬剤順応性を有する複数の病原に対処する場合に同等に有効である。特に、該方法はマラリア寄生虫のような薬剤耐性および薬剤順応性を有する寄生虫に対して極めて効果的である。また、本発明に従うオリゴヌクレオチドは本発明の方法において有用である。このようなオリゴヌクレオチドは上記病原に対して阻害作用を有する。なお、好ましくは、当該本発明に従うオリゴヌクレオチドの阻害作用は、熱帯熱性マラリア原虫のＰ２Ｏ３やジヒドロフォレートリダクターゼーチミジレートシンターゼ遺伝子のような病原の生体遺伝子に対する生理的条件下において混成するヌクレオチドシーケンスを有するオリゴヌクレオチドから生ずるものである。場合によっては、該オリゴヌクレオチドの阻害作用は当該病原の生体遺伝子に対していかなる既知の相補性とも独立している。さらに、本発明に従うオリゴヌクレオチドは従来知られるオリゴデオキシヌクレオチドであってもよく、また、ヌクレオシド間架橋部若しくはそのいずれかの末端部に一以上の修飾部を有していてもよい。

ましい　、の　な１日本発明は病原体による活発な感染の化学療法的処置に関する。さらに具体的に言えば、本発明は人間の病原による活発な感染の化学療法的処置のための方法および材料を提供する。本発明に従う方法はアンチセンスオリゴヌクレオチド療法として知られている。また、本発明に従う材料はオリゴデオキシヌクレオチド、オリゴヌクレオチドホスホロチオエート、あるいは、修飾されたヌクレオチド間架橋部を有する他のオリゴヌクレオチド、および、オリゴデオキシヌクレオチドの修飾体やオリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエートの修飾体およびその他の修飾されたヌクレオチド間架橋部を有する他のオリゴヌクレオチドの修飾体である。例えば、本発明の目的のための「オリゴヌクレオチド」はホスホジエステルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラミデート、アルキルホスホネート、および／または、ホスホトリエステルのヌクレオチド間架橋部ならびに当該オリゴヌクレオチドの塩基および／または糖分子における修飾体を有するオリゴヌクレオチド含むものとする。

さらに、本発明の目的のためのオリゴヌクレオチドとは、オリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、および、ヌクレオシド間に修飾架橋部を有するオリゴリボヌクレオチドまたはオリゴデオキシリボヌクレオチドを含む。

本発明の第１の態様においては、アンチセンスオリゴヌクレオチド療法を用いるマラリアの処置のための方法を提供する。このアンチセンスオリゴヌクレオチド療法は感染細胞に対して生理的条件下でターゲットシーケンスと混成するヌクレオチドシーケンスを有するオリゴヌクレオチドを供与して当該ターゲットシーケンスの生理機能を阻害することを含む。マラリアの場合、熱帯熱性マラリア原虫からの２種の遺伝子ターゲットが用いられる。これらの第１のものはＰ１９５遺伝子で、メロゾイトの主表面抗原である３種の小蛋白質の蛋白質前駆体をコード化するものであるため、マラリア原虫メロゾイトの発生分化に必要となる。メロゾイトは赤血球から発生して未感染の赤血球を侵害するマラリア寄生虫の形態を有する。このＰ１９５シーケンスはＡＵＧ開始コドンにより始まるオーブンリーディングフレームである第１の２１個のヌクレオチド（Ｐ１９５−１）と、該蛋白質シーケンスにおいてそれぞれ６回および５回生じる２種のトリペプチドシーケンスの交互の繰り返し部分をコード化する１８個のヌクレオチドシーケンス（Ｐ１９５−ｎ）とを含む。第二の遺伝子ターゲットはジヒドロフォレートリダクターゼーチミジレートシンターゼ遺伝子であり、ディノボにおけるピリミジン合成に必要な遺伝子である。

マラリア寄生虫はピリミジンヌクレオチドのディノボ合成に専ら依存しており、予め形成されたピリミジン塩基またはヌクレオチドをサルベージすることができない。

従って、この酵素の生理学的機能を阻害することはマラリア寄生虫にとって致命的なことになる。

当業者においては、当該Ｐ１９５遺伝子またはジヒドロフォレートリダクターゼーチミジレートシンターゼ遺伝子の他の部分に生理条件下において混成するシーケンスを有する他のオリゴヌクレオチドもまた本発明の方法において有用であり、上述のオリゴヌクレオチドの効果を呈することが明らかである。加えて、当該効果により、当業者は、マラリア寄生虫のいずれかの生体遺伝子に生理条件下で混成するヌクレオチドシーケンスを有するオリゴヌクレオチドが本発明の目的の達成条件を満足することを理解する。本発明の目的において、生体遺伝とは、病原体を複製または再生するに要する生理学的機能を有するいずれかの遺伝子を言い、アンチセンスオリゴヌクレオチドによる当該機能の阻害により当該病原体の複製または再生能力が害される。

本発明のこのような態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチド療法はマラリアをインビトロにおいて阻害するに有効であることがわかった。しかしながら、当該インビトロシステムは多種の抗マラリア剤の臨床的効果の予報手段として上記の研究において既に評価されているものである。従って、当該本発明の主要態様はインビトロまたはインビボのいずれにおいてもマラリアを阻害するための有効な方法を提供することである。なお、インビボの処置においては、オリゴヌクレオチドは点滴、注射、経口投与または局所投与により投与することができる。

また、第２の態様において、本発明は従来の化学療法的薬剤に対して獲得性の耐性を有する病原体による感染を処置するための方法を提供する。従来の化学療法的薬剤とは、周知の薬剤であり、特定の病原体の処置に通常使用されるものである。また、当該化学療法的薬剤への耐性は該薬剤が作用する蛋白質をコード化する遺伝子における突然変異により生じる。さらに、このような耐性は細胞障害性の薬剤の細胞内蓄積を防止できる病原体により生じる。本発明に従う方法はこれら両種の耐性を打破することができる。その理由は、オリゴヌクレオチドが蛋白質ではなく遺伝子またはｍＲＮＡのレベルにおいて作用することと、それらが細胞内蓄積から除外されないこととによる。また、この態様においては、当該本発明に従う方法がクロロキン感受性若しくはクロロキン耐性のいずれの熱帯熱性マラリア原虫に対しても同等に有効であることがわかる。一般に、このマラリアにおけるクロロキン耐性は多種の化学療法的薬剤に対する広範な交差耐性の一部であるため、本発明はマラリアにおける薬剤耐性を打破するための有効な方法を提供するとも言える。さらに、Ｗｅｂｓｔｅｒ他は上記治療法の薬理学的基礎（ｐｐ、９５４−９５９　（１９９ｏ））において、人間における寄生虫感染は多くの共通した特徴を有しており、幾つかの駆虫薬剤が多種の人間の寄生虫に対して作用効果があることを教示している。特に、Ｋｏｕｎｉ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ４１　：　８１５−８２０　（１９９１））は住血吸虫症、マラリアおよびトリパノソーマ症に対する交差作用性を示している。

従って、本発明はリーシュマニアやトリパノゾーマのような原虫類および住血吸虫のような非原虫類の寄生虫を含む多種の寄生虫の薬剤感受性または薬剤耐性に対して同等に有効である処置のための方法を提供する。また、本発明に従う方法による処置に特定関与する他の症状としては、カンジダ症、ヒストブラスマ症、クリプトコックス症、プラストミセス症、アルペルギルス症、スポロトリクム症、皮膚糸状菌病、コクシジオイデス症、チフス、ロッキー山熱、クラミジアトラコーマ感染症、性病性リンパ肉芽腫感染症、アメーバ症、チェガス病（Ｃｈｅｇａｓ’　ｄｉｓｅａｓｅ）、）キソブ゛ラスマ症、ニューモチイストス症、ランプル鞭毛虫症、クリプトコックス症、トリコモナス症、ニューモシスティスカリー二肺感染症、回虫症、フィシリア症、旋毛虫症、線虫感染および条虫感染等が挙げられ、その症状は薬剤耐性病原体により引き起こされる。さらに、既知の薬剤耐性のメカニズムにより、オリゴヌクレオチドが一般に薬剤耐性を打破する処置のための方法において有用であることが示唆される。また、他の病原体による薬剤耐性も一般に薬剤により作用される蛋白質の修飾に依存するか、当該薬剤の細胞内蓄積を防止する能力に依存する。したがって、これらのメカニズムにおいてオリゴヌクレオチドが非効果的となるとは考えられない。而して、本発明は薬剤耐性バクテリア（例：結核症）およびウィルスを含む薬剤耐性の病原体を処置する一般的な方法を提供する。

さらに、第３の態様において、本発明は現行法よりも安全なマラリアの処置方法を提供する。例えば、マラリアのクロロキン療法は相当な毒性副作用を生じる程度のクロロキン濃度の投与を必要とする。これに対して、本発明に従う方法では、マラリアの５０％阻害がラットやマウスにおける毒性の副作用を生じるに要する濃度よりも５０倍以上低いオリゴヌクレオチド濃度において観ることができる。なお、当業者においては、当該オリゴヌクレオチドの効果が、当該寄生虫感染症に対する、スルホンアミド、スルホンまたはテトラサイクリンの有無に拘わらず、当該オリゴヌクレオチドとクロロキン、キニーネ、キニジン、メフロキンまたはピリメタミン等の従来の抗マラリア性化学療法用薬剤との共同処置により高められることがわかる。このような共同処置により、使用される現行の化学療法用薬剤の投薬量を減少することができるので、安全性が高まる。

さらに、第４の態様において、本発明は本発明に従う方法において有用なオリゴヌクレオチドを提供する。当該オリゴヌクレオチドは病原体の生体遺伝子と生理的条件下で混成するヌクレオチドシーケンスを有する。このようなオリゴヌクレオチドの例としては、熱帯熱性マラリア原虫のＰ２Ｏ３またはジヒドロフォレートリダクターゼーチミジレートシンターゼ遺伝子と生理的条件下で混成する核酸シーケンスを有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。さらに、当該オリゴヌクレオチドを表Ｉに例示する。なお、本発明に従うオリゴヌクレオチドは従来のオリゴデオキシヌクレオチドでもよく、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートまたはホスホラミデートの架橋部のような修飾された形態の一以上のヌクレオシド間架橋部を有していてもよい。好ましい実施例においては、該オリゴヌクレオチドはホスホロチオエートヌクレオシド間架橋部を有している。加えて、本発明に従うオリゴヌクレオチドはそのいずれかの端部または両端部における分解に対する耐性を高めるための化学的構造を含む付加的な修飾部位を有していてもよい。好ましい実施例においては、３°の大半のヌクレオシド間架橋部としてホスホロブチルアミデートが存在することにより、該オリゴヌクレオチドは核酸分解に対する耐性が付与され、それゆえ、マラリアに対する効果が一層に高い。

さらに、第５の態様において、本発明はマラリア性寄生虫の既知の生体遺伝子のいかなるものに対する相補性にも独立していると考えられる抗マラリア作用を有する新規のオリゴヌクレオチドを提供する。当該オリゴヌクレオチドの例としては、５’　−ＣＴＴＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＣＧＴＧＡＣＡＴ−３°のヌクレオチドシーケンスを有する見かけ上ランダムなオリゴヌクレオチドとして合成されるものが挙げられる。なお、このようなオリゴヌクレオチドの抗マラリア作用のメカニズムはまだ理解されていない。

本発明のさらに好ましい実施例は以下の実験例により一層に明らかとなるが、当該実験例は本発明をより完全に説明し、かつ、この範囲を限定しない目的のものである。

友狡■ユオリゴデオキシヌクレオチド、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートおよびそれ゛の　のＡオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドホスホロチオエートおよびそれら各々の修飾形態の合成および精製を、Ａｇｒａｗａｌ他（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ。

Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ　８６　：　７７９０−７７９４　（１９８９））に記載されるような、周知のＨ−ホスホネート手法に従って行った。この合成において選択したヌクレオチドシーケンスは熱帯熱性マラリア原虫のＰ２Ｏ３およびジヒドロフォーレートリダクターゼーチミジレートシンターゼ遺伝子のコード化シーケンスの５′領域に相補的である。これらの遺伝子のシーケンスは、それぞれ、ＨＯＩｄｅｒ他（Ｎａｔｕｒｅ　３１７：２７０−２７３（１９８５））およびＢｚｉｋ他（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　Ｉ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＩＪＳＡ　８４：８３６０−８３６４（１９８７））において記載されている。さらに、見かけ上ランダムなオリゴヌクレオチドシーケンスを対照として合成した。以下の表１に当該合成オリゴヌクレオチドの化学的構造とターゲット特異性を示す。

表」− 抗マラリア性薬剤として試験したオリゴヌクレオチドの８・　１とターゲット、・ＰＳＩ　５°　−ＴＡＡ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＴＡＴＧＡＴ　ＣＴＴ　ＣＡＴ−３ ’ Ｐ１９５の開始コドンがらのオーブンリーディングフレームの最初の２１個のヌクレオチドとシーケンス的に相補的であるオリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエートＰＳＩＩ　５’−ＡＧＣＡＡＣＴＧＡ　ＧＣＣＡＣＣＴＧＡ−３’ 最初の２種のトリペプチドの繰り返しをコード化するＰ２Ｏ３における１８個のヌクレオチドシーケンスに対してシーケンス的に相補的であるオリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエートＰＮｎ　５°　−ＡＧＣＡＡＣＴＧＡ　ＧＣＣＡＣＣＴＡＧ−３゜Ｐ２Ｏ３におけるｐｓｉと同一のシーケンスに対してシーケンス的に相補的であるオリゴデオキシヌクレオチドホスホモルホリゾートＰＯｎ　５’−ＡＧＣＡＡＣＴＧＡ　ＧＣＣＡＣＣＴＧＡ−３″ Ｐ２Ｏ３におけるＰＳ■と同一のシーケンスに対してシーケンス的に相補的であるオリゴデオキシヌクレオチド（ホスホジエステルのヌクレオシド間結合）ＰＳＩ［［５°　−ＧＴＣＧＣＡ　ＧＡＣＴＴＧＴＴＣＣＡＴ　ＣＡＴ−３’ 開始コドンにより始まるジヒドロフォーレートリダクターゼーチミジレートシンターゼ遺伝子のオーブンリーディングフレームの最初の２１個のヌクレオチドとシーケンス的に相補的であるオリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエートＰＳＮＩＩ［５′　−ＧＴＣＧＣＡ　ＧＡＣＴＴＧＴＴＣＣＡＴ　ＣＡＴ−３゜ＰＳＩＩＩと同一のシーケンスを有しており、エクソヌクレアーゼ活性阻害のためのホスホロブチルアミデートである３゛末端ホスホジエステル結合を有するオリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエートＲ１５°　−ＣＴＴ　ＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＣＧ　ＴＧＡ　ＣＡＴ−３゜見かけ上ランダムンーケンスのオリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエートＲＩＩ　５’−ＡＣＣＴＴＡ　ＴＧＴ　ＡＴＣＡＴＡ　ＣＡＣＡＴＧ−３゜見かけ上ランダムシーケンスのオリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエートＲｍ　５°　−ＡＡＡ　ＡＡＴ　ＡＴＴ　ＴＡＴＴＴＴ　ＣＴＡ　Ａ−３゜見かけ上ランダムシーケンスのオリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエートＲＩＶ　５’−ＣＧＣＧＧＣＧＧＣＣＣＧＣＧＧ　ＣＧＣＣＧＧ−３゜見かけ上ランダムシーケンスのオリゴデオキシヌクレオチドホスホロチオエート大１１引λ λ龍践ユエラリア　のインビトロ立　およびＥ−オリゴヌクレオチドの抗マラリア活性の評価のために、クロロキン耐性を呈示するインドシナクローンであるＷ２およびクロロキン感受性の西アフリカクローンであるＤ６を熱帯熱性マラリア原虫の種株として用いた。当該両種法はウォルターリード陸軍研究所（ＷａｌｔｅｒＲｅｅｄ　Ａｒｍｙ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　Ｄ、Ｃ，）において単離されたものである。さらに、該両種法はＴｒａｇｅｒおよびＪｅｎｓｅｎ　（Ｓｃｉｅｎｃｅ　１９３：６７３−６７５　（１９７６））の方法の変形により培養した。これらの寄生虫を３７℃において３ｍｇ／ｍｌのＴＥＳナトリウム塩、２　ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌのグルコース、１１０μｇ　／　ｍ　１のピルビン酸ナトリウム、３００μｇ／ｍｌのグルタミン、５μｇ　／　ｍ　＋のヒポキサンチン、２５μｇ　／　ｍ　１のゲンタマイシンおよび１０％の人間のプラズマを加えた完全ＲＰＭ１１６４０媒地で５ −８％赤血球懸濁液中を４％酸素、６％二酸化炭素および９０％窒素の雰囲気でフラスコ中に保持した。米国赤十字社から新鮮なＡ型−Ｒｈプラスの血液細胞と人間のプラズマを入手した。次いで、ＬａｍｂｒｏｓおよびＶａｎｄｅｒｂｕｒｇ　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ　６５：４１８−４２０（１９７９））の周知の方法に従って、Ｄ−ソルビトールを伴う処理により寄生虫の同調を行った。

笈覧亘ｌオリゴヌクレオチドの　マラリア　の・熱帯熱性マラリア原虫の非同調培養を７２時間行い、後半の４８時間にオリゴヌクレオチドを共存させた。同調培養はＤ −ソルビトール処理による同調化後２４時間で開始してオリゴヌクレオチドの存在下に進行した。その後、抗マラリア活性を、Ｃｈｕｌａｙ他（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ　５５：１３８−１４６　（１９８３））の方法に従って、寄生虫数の計測または［１Ｈ］−ヒポキサンチンの取り込みによる酸性不溶放射能の計測のいずれかによって定量的に決定した。

この寄生虫計測では、寄生虫に侵された赤血球（０゜５％ないし１％の寄生虫血症）を、１ウエル当たりの全容積を１ｍｌとし５％のへマドクリットで、４８ウエルマイクロカルチヤープレート（Ｇｉｂｃｏ、Ｃｈａｇｒｉｎ　Ｆａｌｌｓ、０ｈｉｏ）により培養した。また、寄生虫血症のレベルはＤｉｆｆ−Ｑｕｉｃｋ ”（Ｂａｘｔｅｒ、ＭｃＧａｗ　Ｐａｒｋ、ｌ１ｌｉｎｏｉｓ）により固定し染色した薄い血液フィルム「スメア（ｓｍｅａｒｓ）Ｊを計数することにより決定した。この結果、少なくとも１０００個の赤血球が計測された。これらの寄生虫はその発生段階により、染料を含まない赤血球のメロフィト反転後の最初の形態であるリング形態（Ｒ）、染料を含む単一核のトロホゾイト（Ｔ）、および２個以上の核を有する発生形態のシオント（Ｓ）に分類した。

また、［８Ｈ］−ヒポキサンチンの取り込みの分析では、該［３Ｈ］−ヒポキサンチンを完全媒地中において２４時間あるいは人間のプラズマとラベル化していないヒポキサンチンとを欠く部分付加媒地において４時間のいずれかで供給した。この場合、ＲＮＡおよびＤＮＡのいずれも合成しない未感染赤血球は［３Ｈ］ −ヒポキサンチンを取り込んで酸性の不溶放射性体にならない。

表２に非同調的に成長するクロロキン耐性熱帯熱マラリア原虫のＷ２株に対する種々のオリゴヌクレオチドの０．１μＭおよび１．ＯｔｔＭにおける抗マラリア活性を示す。

により決定した。Ｒ＋ＴおよびＳはリング、トロホゾイトおよびシゾントの計数をそれぞれ示す。

表■に同調的に成長するクロロキン耐性熱帯熱マラリア原虫のＷ２株に対する種々のオリゴヌクレオチドの０゜１μＭおよび１．０μＭにおける抗マラリア活性を示す。

種々のオリゴヌクレオチドについての５０％阻害濃度（ＩＣ，。）を決定し、その結果をクロロキン耐性熱帯熱マラリア原虫株Ｗ２　（表■）およびクロロキン感受性株Ｄ６（表■）について示した。また、クロロキンを対照として使用した。これらの実験では、寄生虫培養をＤ−ソルビトール処理により同調化した。さらに、シゾントからリング形態への遷移についての作用を調べるために、抗マラリア性化合物の添加を同調化処理後２４時間において開始し、２４時間に亙って行った。さらに、リングからトロホゾイトさらにシゾント形態への遷移についての作用を調べるために、抗マラリア性化合物の添加を同調化処理後４８時間で開始し、２４時間に亙って行った。

次いで、阻害作用を同調化処理後７２時間において［３Ｈ］−ヒポキサンチンの取り込みにより測定した。

以上の結果から、オリゴヌクレオチドホスポロチオエートが熱帯熱性マラリア原虫のクロロキン耐性およびクロロキン感受性株の成長および侵害を阻害する上で同等に有効であることがわかる。さらに、表■および■に示す結果は試験したオリゴヌクレオチドがシゾント変異、メロゾイト遊離、赤血球へのメロゾイト付着、赤血球におけるメロゾイト侵害若しくはリング形成を阻害することを示唆している。このことは、殺シゾント剤として知られるクロロキンに対して対照的である。クロロキンは表■に示すような高濃度でクロロキン耐性株Ｗ２を阻害するが、このような濃度は毒性の副作用が無視できなくなるためにインビボで使用することができない。これに対して、表■および■に示すオリゴヌクレオチドの場合のＩＣｓ。はラットやマウスにおける毒性作用を引き起こすと報告されている濃度に比して少なくとも５０倍低い（参照：Ａｇｒａｗａ　Ｉ　：　ｒ癌およびエイズのアンチセンス核酸療法の見込みＪ　（Ｅ、Ｗｉｃｋｓｔ　ｒｏｍ編、Ｗｉ　１ｅｙ−Ｌｉ　ｓｓ、Ｉｎｃ、、ｐｐ、１４３−１５８　（１９９０）））。

而して、マラリア性ゲノムのセグメントに対する相補的シーケンスを有するすべての試験オリゴヌクレオチドホスホロチオエートは抗マラリア活性を呈示した。

なお、試験した見かけ上ランダムなオリゴヌクレオチドのうちの１種が有意差のある抗マラリア活性を示している。この阻害作用のメカニズムは知られていないが、３°末端の最終ヌクレオチド間フォスフェート部位にブチルホスホロアミデート基を有するオリゴヌクレオチド（ＰＳＮ■）の場合は、同一シーケンスであるが当該ブチルホスホロアミデート基を欠くオリゴヌクレオチド（ｐｓｍ）の場合に比して高い抗マラリア活性が観られる。すなわち、このような化学的修飾はオリゴヌクレオチドの外因性核酸分解を阻害するために、当該オリゴヌクレオチドの安定性が高められてその抗マラリア活性が増大したと考えられる。

また、オリゴヌクレオチドが寄生虫症赤血球に関与するが未感染赤血球には関与しない（データ示さず）ということから、当該オリゴヌクレオチドは当該感染病の血管内治療に使用できると考えられ、この場合、感染細胞へのオリゴヌクレオチドの作用のみを考慮すればよい。

なお、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　（ＦｉｅｌｄｓおよびＫｎｉｐＳ編、Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　（１９９０））には、ウィルス病の場合における感染因子を担持するホスト細胞の透過性を変化する類似手法が記載されている。

而して、この結果は、当該オリゴヌクレオチドが寄生性ウィルスおよびバクテリア感染症等の病原感染症の全身治療に使用することが可能であることを示唆している。

補正書の翻訳文提出書（特許法１８４条の８）平成６年　６月３０日

Claims

【特許請求の範囲】

１．病原体の複製または再生を阻害するオリゴヌクレオチドを投与する段階から成ることを特徴とする病原体による活発な感染を阻害する方法。
２．前記病原体が寄生虫であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
３．前記病原体がバクテリアであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
４．前記病原体がウイルスであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
５．前記寄生虫がマラリア、リーシュマニア、住血吸虫、トリパノソーマから成る群から選択されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
６．前記オリゴヌクレオチドが前記病原体の生体遺伝子に生理的条件下で混成するヌクレオチドシーケンスを有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
７．前記生体遺伝子がＰ１９５およびジヒドロフォーレートリダクターゼーチミジレートシンターゼから成る群から選択され、前記病原体が熱帯熱性マラリア原虫であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
８．前記オリゴヌクレオチドが−以上の修飾されたヌクレオチド間架橋部を有していることを特徴とする請求項１に記載の方法。
９．前記修飾されたヌクレオチド間架橋部がホスホロチオエート架橋部であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
１０．前記修飾されたヌクレオチド間架橋部がホスホロアミデート架橋部であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
１１．前記オリゴヌクレオチドが核酸分解を防止するための化学的構造をその一端部または両端部に有していることを特徴とする請求項１に記載の方法。
１２．前記オリゴヌクレオチドが核酸分解を防止するための化学的構造をその一端部または両端部に有していることを特徴とする請求項９に記載の方法。
１３．前記オリゴヌクレオチドが核酸分解を防止するための化学的構造をその一端部または両端部に有していることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
１４．前記病原体が従来の化学療法的薬剤に対して耐性を有していることを特徴とする請求項１に記載の方法。
１５．前記従来の化学療法的薬剤がクロロキン、キニーネ、キニジン、メフロキンおよびピリメタミンから成る群から選択されることを特徴とする請求項１４に記載の方法。
１６．【配列があります】のヌクレオチドシーケンスを有するオリゴヌクレオチドを投与する段階から成ることを特徴とする寄生虫の複製または再生を阻害する方法。
１７．前記寄生虫が熱帯熱性マラリア原虫であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
１８．前記オリゴヌクレオチドがオリゴヌクレオチドホスホロチオエートまたはオリゴヌクレオチドホスホロジチオエートであることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
１９．３個ないし３０個のヌクレオチド残基と熱帯熱性マラリア原虫の生体遺伝子に生理的条件下で混成するヌクレオチドシーケンスとを有するオリゴヌクレオチドを投与する段階から成ることを特徴とする熱帯熱性マラリア原虫の複製や再生を阻害する方法。
２０．前記オリゴヌクレオチドが一以上の修飾されたヌクレオチド間架橋部を有していることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
２１．前記修飾されたヌクレオチド間架橋部がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、または、ホスホロアミデート架橋部であることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
２２．前記オリゴヌクレオチドが核酸分解に対する耐性を付与するための化学的構造をその一端部または両端部に有していることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
２３．前記オリゴヌクレオチドが核酸分解に対する耐性を付与するための化学的構造をその一端部または両端部に有していることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
２４．前記オリゴヌクレオチドが【配列があります】のヌクレオチドシーケンスを有することを特徴とする請求項１９に記載の方法。
２５．前記オリゴヌクレオチドが−以上の修飾されたヌクレオチド間架橋部を有していることを特徴とする請求項２４に記載の方法。
２６．前記修飾されたヌクレオチド間架橋部がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、および、ホスホロアミデートから成る群から選択されることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
２７．前記オリゴヌクレオチドが核酸分解を防止するための化学的構造をその一端部または両端部に有していることを特徴とする請求項２５に記載の方法。
２８．前記オリゴヌクレオチドが核酸分解を防止するための化学的構造をその一端部または両端部に有していることを特徴とする請求項２６に記載の方法。
２９．前記オリゴヌクレオチドが【配列があります】のヌクレオチドシーケンスを有していることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
３０．前記オリゴヌクレオチドが−以上の修飾されたヌクレオチド間架橋部を有していることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
３１．前記修飾されたヌクレオチド間架橋部がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、および、ホスホロアミデートから成る群から選択されることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
３２．前記オリゴヌクレオチドが核酸分解を防止するための化学的構造をその一端部または両端部に有していることを特徴とする請求項２９に記載の方法。
３３．前記オリゴヌクレオチドが核酸分解を防止するための化学的構造をその一端部または両端部に有していることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
３４．前記オリゴヌクレオチドが【配列があります】のヌクレオチドシーケンスを有していることを特徴とする請求項１９に記載の方法。
３５．前記オリゴヌクレオチドが−以上の修飾されたヌクレオチド間架橋部を有していることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
３６．前記修飾されたヌクレオチド間架橋部がホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、および、ホスホロアミデートから成る群から選択されることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
３７．前記オリゴヌクレオチドが核酸分解を防止するための化学的構造をその一端部または両端部に有していることを特徴とする請求項３４に記載の方法。
３８．前記オリゴヌクレオチドが核酸分解を防止するための化学的構造をその一端部または両端部に有していることを特徴とする請求項３５に記載の方法。
３９．前記オリゴヌクレオチドが核酸分解を防止するための化学的構造をその一端部または両端部に有していることを特徴とする請求項３６に記載の方法。
４０．【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】、【配列があります】から成る群から選択されるヌグレオチドシーケンスを有することを特徴とする抗マラリア性オリゴヌクレオチド。
４１．マラリア、住血吸虫症、カンジダ症、ヒストプラスマ症、クリプトコックス症、ブラストミセス症、アルペルギルス症、スポロトリクム症、皮膚糸状菌病、コウシジオイデス症、チフス、ロッキー山熱、クラミジアトラコーマ感染症、性病性リンパ肉芽腫感染症、アメーバ症、チェガス病（Ｃｈｅｇａｓ′ｄｉｓｅａｓｅ）、トキソプラズマ症、ニューモサイストス症、ランプル鞭毛虫症、クリプトスポリドス症、トリコモナス症、ニューモシスティスカリーニ肺感染症、回虫症、フィラリア症、旋毛虫症、線虫感染および条虫感染から成る群から選択され、薬剤耐性の病原体により引き起こされる症状を治療することを特徴とする方法。