JPH07504819A

JPH07504819A - サーモトガ由来の耐熱性キシラナーゼ

Info

Publication number: JPH07504819A
Application number: JP5516176A
Authority: JP
Inventors: アントラニキアン，ガラベト; スケーホルム，カルステン
Original assignee: ノボ　ノルディスク　アクティーゼルスカブ
Priority date: 1992-03-16
Filing date: 1993-03-15
Publication date: 1995-06-01
Also published as: EP0631621A1; WO1993019171A1; DK34892D0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】サーモトガ由来の耐熱性キシラナーゼ技術分野本発明は、新規酵素に関する。更に詳しくは、本発明はサーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属の微生物から得ることのできる新規キシラナーゼに関する。本発明は又、これらのキシラナーゼの製法、これらのキシラナーゼを含有する薬剤、リグノセルロースバルブの処理のためのこれらのキシラナーゼの使用に関する。

背景技術植物のヘミセルロースの主成分であるキシランは、β−１，４−キンロース結合により連結されたＤ−キシロースのポリマーである。

キンランは、酸又は酵素的加水分解によりキシロースおよびキシロオリゴマーに分解し得る。キシランの酵素的加水分解は、酸と共に形成される副生成物（例えば、フラン）なしで遊離糖を生成する。

バルブおよび紙工業は、漂白されるバルブの輝度を高めるため、漂白工程において用いられる漂白薬剤、例えば塩素の量を減少させるためおよび再循環製紙プロセスにおけるバルブの自由度（ｆｒｅｅｎｅｒｓ）を増加させるためキシラナーゼ組成物を用いる〔エリクリンに、　Ｅ、　Ｌ。

（１９９０）、　Ｗｏｏｄ　５ｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２４７９−１０１　；ベイスＭ、　Ｇ。

バーニルＲ０，およびニラスケＬ、　（１９８８）、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇ、。

３２２３５〜２３９；ボムミーＪ、　Ｃ，、フエンテスＪ、　Ｌ、　、およびゴマＧ。

（１９８９）、　Ｔａｐｐｉ　Ｊｏｕｒｎａｌ、　１８７−１９１〕。

バルブおよび紙工業において広く用いられているプロセスである、クラフトバルブ法は大部分のリグニンを除去するためバルブのアルカリ硫酸塩蒸煮を含む。残存バルブは２〜５％のリグニンを含有し、これはバルブに暗褐色を与えそれはＵｖ光又は酸化により暗色化する傾向を有する。高品質紙に対する白色バルブを得るため、褐色が漂白化学薬品、例えば酸素、過酸化水素、塩素および／又は二酸化塩素を用いる多工程漂白プロセスにより多工程により除去される。

今日、漂白プロセスから発生する毒性化合物の環境汚染について多大の心配がある。酵素は有害な副生成物なしでバルブからリグニンの除去を助成できる。氷中のリグニンはキシランに結合している旨、論文は報告している〔エリクラン０１等（１９８０）、　Ｗｏｏｄ　Ｓｃｉ。

Ｔｅｃｈｎｏｌ、、　１４２６７１７７−１８９）　、キシランの制限された加水分解により、リグニンの多量の放出が漂白中に生じる。従って、漂白前にバルブの酵素的処理により、必要とされる量の化学薬品は一方では減少するであろう〔ピカリ　し１等（１９８６）、　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　３ｒｄＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｐｕ１ｐ　ａｎｄ　ＰａｐｅｒＩｎｄｕｓｔｒｙ、　６７）。

上記プロセスの特徴は、高温度およびプルカリ条件で加水分解活性を表わすことのできるキシラナーゼに対する必要性である。キシラナーゼは、７を超えるｐＨのｐＨ値で実質的量のその活性を示すべきである。

近年、新規耐熱性キシラナーゼが発見された、シンブトンＨ，Ｄ、　。

ハウフェルＵ、　Ｒ，、およびダニエルＲ，Ｍ、　（１９９１）、　Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｊ、、　２７７（２）　４１３−４１８参照。キシラナーゼは菌株サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）ｓｐ、　ＦｊＳＳ３−Ｂ、１．フジで採取された菌株、しかし公衆には入手できない、から得られる［ハウゼルＢ、　Ａ、　、パテルＢ、　Ｋ、　Ｃ，ダニエルＲ，Ｍ、およびモーガンＨ，Ｗ、　（１９８６）、　ＦＥＭＳ　Ｍｉｋｒｏｂｉｏｌ、Ｌａｔｔ、、　３７１２１−１２７］。酵素は５．４に最適ｐＨ１およびｐ１１４．２およびｐ）１６．７にそれぞれ活性限界値の５０％を有する。

発明の要約本発明者等は今や次の内容を見出した：すなわち、属サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）　、Ｔ、　マリチ？　（ｍａｒｉｔｉｍａ）　、Ｔ、ネアボリタナ（ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）　、およびＴ、サーマラム（ｔｈｅｒｍａｒｕｍ）は、新規耐熱性キシラナーゼを生産することができ、これはアルカリｐＨ値で活性に関して改善されている。Ｔ、マリチマおよびＴ、ネアポリタナは、イタリア近くで採取された、海洋生物である。Ｔ、サーマラムは海洋生物ではなくそしてアフリカで採取されている。

Ｔ、マリチマ、Ｔ、ネアボリタナおよびＴ、サーマラムの代表的３種の菌株は、それぞれ基準培養物として寄託されてておりそして従ってドイツチェ　ザンムルグ　フォノ　マイクロオルガニス　メン　ラント　ツエルクルツレン　Ｇ＋ｎｂｉｔ、マツシェルオーデル　ベーク　ｌ　ｂ、Ｄ−３３００ブラウンシエワイク、ドイツから公衆に入手可能である。菌株および受託番号は、Ｔ、マリチマ、ＤＳＭ　３１０９、Ｔ、ネポリタナ、ＤＳＭ　５０６８、およびＴ、サーマラム、ＤＳＭ　５０６９である。

アルカリｐ＋＋てそれらの改善された活性のため、本発明の新規酵素はバルブ紙の製造において使用のため特に良好に適合している。

従って、その第一の面において、本発明は９０℃で２０分後に測定した場合、　４．０〜７．５のｐＨ域に、より好ましくは４．５〜７．５のｐＨ域に、最も好ましくは５．５〜７．５のｐＨ域に５０％を超える残留活性；７０℃で２０分後に測定した場合、４．５〜８．０のｐＨ域に、より好ましくはｐＨ４，５〜７．５のｐＨ域に、最も好ましくは５．５〜７．５のｐＨ域に５０％を超える残留活性；　ｐＨ，６で２０分後に測定した場合、８０℃〜１００℃の範囲内に、より好ましくは８５〜９５℃の範囲内に最適温度を有し、そしてＴ、マリチマ、Ｔ、ネアボリタナ、又はＴ、サーマラムの菌株から得ることができるキシラナーゼを提供する。

より特異的面において、本発明は、９０℃で測定した場合、５．５〜６．５の９１１域に、ｐＨ８，０付近に最適ｐＨ１９０℃で測定した場合、ｐｌ＋７．５で少なくとも５０％の相対残留活性、７０℃で測定した場合、ｐＨ８，０で少なくとも５０％の相対残留活性を有しモしてＴ、マリチマ、Ｔ、ネアポリタナ、又はＴ、サーマラムの菌株から得ることのできるキシラナーゼを提供する。

第二の面において、本発明はキシラナーゼの生産方法を提供し、この方法は炭素および窒素源並びに無機塩を含有する適当な普通培地中でＴ、マリチマ、Ｔ、ネアボリタナ、又はＴ、サーマラムのキシラナーゼ生産株を培養し、次いで得られた酵素を回収することを含んでなる。

第三の面において、本発明は好ましくは無粉塵性粒質物、液体、特に安定化液体、スラリー又は保護された酵素の形で提供されるキシラナーゼを含有する薬剤を提供する。

第四の面において、本発明はリグノセルロースバルブの処理方法に関し、この方法はリグノセルロースバルブを本発明の酵素で処理する。

図面の簡単な記載本発明を添付の図面を参照しつつ更に説明する：図２Ｂは、９０℃で２０分後に測定した、Ｔ、ネアポリタナから得ら発明の詳細な開示本発明のキシラナーゼは、Ｔ、マリチマ、Ｔ、ネアボリタナ、又はＴ、サーマラムの菌株、好ましくは菌株Ｔ、マリチマ、ＤＳＭ　３１０９、Ｔ、ネアポリタナ、ＤＳＭ　５０６８、又はＴ、サーマラム、ＤＳＭ　５０６９、又はそれらの突然変異体又は変異体を、炭素および窒素源並びに無機塩を含有する適当な普通培地中で培養し、次いで得られた酵素を回収することによって生産できる。酵素は又、組換えＤＮＡ工学によっても得ることができる。

９０℃で２０分後に測定した場合、Ｔ、ネアボリタナおよびＴ、サーマラムから得ることのできるキシラナーゼは約ｐＨ４〜約ｐＨ１０の範囲内でキシラン分解活性を有する。活性に対する最適ｐＨは、図２Ｂおよび図３Ｂに示す如＜ｐＨ域５．０〜７．５内において、より詳しくはｐＨ域５．５〜６．５　、ｐＨ６，０付近に検出された。Ｔ、ネアボリタナは、それぞれｐＨ４，５およびｐｌ＋７．５に相対活性の５０％を示した。Ｔ、サーマラムはｐＨ５，５およびｐＨ７，５にそれぞれ相対活性の５０％を示した。

９０℃で２０分後に測定した場合、Ｔ、マリチマから得ることのできるキシラナーゼは、４未満のｐＨから約１．１のｐＨまでキシラン分解活性を有する。活性に対する最ＪｐＨは、図ＩＢに示す如＜ｐ）Ｉ域４．０〜７，０、より詳しくはｐｌ域４．５〜６．５　、ｐＨ５，０付近に検出された。Ｔ、マリチマは４．０未満のｐｌおよび１．５のｐＨにそれぞれ残留活性の５０％を有する。

７０℃で２０分後に測定した場合、Ｔ、ネアボリタナおよびＴ、サーマラムは、４未満のｐＨから１１を超えるｐｌ（までキシラン分解活性を有する。活性に対する最適９Ｈは、図４Ａおよび図４Ｂに示す如くｐＨ域５．０〜７．５、より詳しくはｐＨ域５，５〜６．５　、ｐＨ６，０付近に検出された。双方のキシラナーゼはそれぞれｐＨ４，５およびｐＨ８，５で残留活性の５０％を示した。

Ｔ、ネアボリタナおよびＴ、サーマラムから得ることのできる酵素は、図２Ａおよび図３Ａに示す如く、２０℃未満から１１５℃を超える範囲内にキシラン分解活性を有する。

Ｔ、マリチマから得ることのできるキシラナーゼは、図ＩＡに示す如＜６０℃未満から１００℃を超えるまでキシラン分解活性を示す。

全てのキシラナーゼは、＋１１１６．０で２０分後に測定した場合、８０℃〜１００℃の温度範囲、より詳しくは８５〜９５℃の温度範囲に、９０℃付近に最適温度を有する。

工業的適用アルカリｐＨ値で秀れた残留活性のため、本発明の酵素は、脱リグニン化のためリグノセルロースバルブの処理に対し良好に適合している。

その温度安定性のため、本発明の酵素は過酸化水素又はオゾン漂白の為、バルブプロセスの複雑な段階で適用することもできる。

従って、別の面において、本発明はリグノセルロースバルブの脱リグニン化に対するキシラナーゼの使用に関する。

リグノセルロースバルブの酵素的処理は、バルブの漂白を改善しおよび／又は満足な漂白を簿るために必要な化学薬品の量を減少する。

リグノセルロースバルブの脱リグニンに対する本発明のキシラナーゼの使用に対し、キシラナーゼは好ましくは、粒質物、好ましくは無粉塵性粒質物、液体、特に安定化液体、スラリー又は保護された酵素の形で与えられるべきである。

別の好ましい態様において、薬剤はキシラナーゼを全酵素蛋白質の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％の量で含有する。

キシラン分解活性は、キシラナーゼ単位で測定できる。この明細書において２種の単位が用いられる：　ＦＸＵおよびＥＸＵである。分析方法によりキシラナーゼサンプルをレマゾール（ｒｅｍａｚｏｌ）−キシラン基質と共にインキュベートする。分解に染色基質のバックグランド（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）をエタノールにより沈殿させる。上澄み中の残りの青色はキシラナーゼ活性に比例しており、次いでキシラナーゼ単位を標準反応条件で標準酵素に対し相対的に測定する。

分析方法および標準反応条件は２つの折りたたみ印刷物、ＡＦ２９３．６／１　（ＦＸＵ）および２９３．９／１　（ＥＸＵ）　ニ記載されティる。

ＦＸＵはＤＨ６，０で測定しそしてＥＸＵはｐＨ９，０で測定する。しかし、ＥＸＵおよびＥＸＵは同じ桁の大きさで酵素活性を表わす。２つの折りたたみ印刷物ＡＦ２９３゜６／１および２９３．９／　１は、ノボ　ノルディスクＡ／Ｓ　（デンマーク）に要求により入手可能であり、これら印刷物はそれらの番号を引用して本明細書に加えられる。

適当なキシラナーゼ用量は、１ｋｇの乾燥バルブ当たり１０〜５０００ＦＸＵ又は１ｋｇの乾燥バルブ当たりＩＯ〜５０００ＥＸＵ　、より好ましくは１ｋｇの乾燥バルブ当たり１００〜５０００ＦＸυ又は１ｋｇの乾燥バルブ当たり１００〜５０００ＥＸＵのキシラナーゼ活性に通常相当するであろう。

多くの適用において、腐蝕の問題を防ぐためｐｏはｐＨ７，０超とすべきである。本発明方法の好ましい態様において、酵素処理は７．０を超えるｐＨで、好ましくは８．０を超えるｐＨで、より好ましくは９．０を超えるｐＨで処理される。

本発明方法の他の態様において、酵素処理は５０〜１００℃の温度で、好ましくは６０〜９５℃、より好ましくは７０〜９０℃で行なわれる。

更に本発明方法の別の好ましい態様において、酵素処理は５分〜２４時間内、好ましくは１５分〜６時間内、より好ましくは２０分〜３時間内に行なわれる。

本発明方法の別の好ましい態様において、酵素的処理は３〜３５％、好ましくは５〜２５％、より好ましくは８〜１５％のコンシスチンシーで行なわれる。コンシスチンシーはバルブの乾燥物質含量である。

３５％を超えるコンシスチンシーを有するバルブは、酵素調製品を有効に混合することが困難であり、そして３％未満のコンシスチンシーを有するバルブは多すぎる水を有し、これは経済的見地から不利である。

幾つかの他の好ましい態様において、本発明のキシラナーゼは、例えば国際特許出願ＰＣＴ／ＤＸ９１１００２３９９又ハ国際公開ＷＯ９１１０２８３９に記載されている如く本質的にリグノセルロースバルブの処理のためのプロセスにおいて実行できる。

次の実施例は更に本発明を説明しそしてこれらの実施例は、いがなる場合も請求の範囲の如く本発明の範囲に制限されるものではない。

Ｔ、マリチマ、ＤＳＭ　３１０９、およびＴ、ネアポリタナ、ＤＳＭ　５０６８（７）菌株の各々を、それぞれ、以下の組成（ｌ当たり）を示す培地中で、Ｎ、の連続通気および一定ｐＨ６，５の条件下、１１のガラス発酵槽を用い、８０℃ で嫌気的に培養した；キシラン　５・０ｇ酵母抽出物（ディフコＴＭ）　０．５　ｇＸ）ｌｚＰＯ，０，５ｇＮｉＣｌ＋　；　６Ｈｐ０　２，０ｍｇＮａＣ１２０，Ｏｇ海塩（シグマＴＭ）　１２．５　ｇレサズリン（Ｒｅｓａｚｕｒ　ｉｎ）　１．０ｍｇＮａ、Ｓ　；　９　ｔ（２００，５ｇ微量元素溶液杓　１５．Ｏｍ！蒸留水１１８６．５ ”１下記参照菌株、Ｔ、サーマラム、ＤＳＭ　５０６９を、以下の組成（１当たり）を有する培地中で、Ｎ２での連続通気および一定ｐＨ７，０の条件下、Ｉｌのガラス発酵槽を用い、７０℃で嫌気的に培養した：キシラン　５．０ｇ酵母抽出物（ディフコＴＭ）　０．５　ｇＫｔ＋＋ＰＯ＋　０．５　ｇ微量元素溶液”　１５．０ｍ１（ＮＨ＋）Ｊｌ（ＳＯａ）２３．０１１１ｇＮａＣ１３，４６ｇＭｇＳＯ＝　；　７　Ｈ２Ｏ０，８８ｇＭｇＣ１，；　６Ｈｔ０　０．６９ｇＣａＣ１ｔ　；　２　ＨｔＯ０，１４ｇＫＣＩ　０．０８　ｇＮａＢｒ　１２．５ｍｇ１（、Ｂｏ、　３、’７５ｍｇ５ｒＣ１□；　６　Ｈ２Ｏ１，９ｍｇＫＩ　Ｏ，００６ｍｇＥＤＴＡ、　Ｎａ２Ｏ，７６８ｇレサズリン（Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ）　１．　Ｏｎ＋ｇＮａ２Ｓ　：　９　Ｈ２Ｏ０，５ｇ蒸留水ｐＨ７，０杓微量元素溶液ニトリロ酢酸　１．５ｇＭｇ５Ｏｔ　；　７）１２０　３．０ｇＭｇ５Ｏｔ　；　２Ｈ２００，５ｇＮａＣ１１，０ｇＦｅ５０＋　：　７　Ｈ２Ｏ０，ＩｇＣｏＳＯｔ　；　７Ｈ２００，１８ｇＣａＣ１□：　２Ｈ２００，１ｇＺｎ５Ｏ＋　：　７旧０　０．１８ｇＣｕＳＯ４；　５　Ｈ２Ｏ０，０１ｇＫＡｌ（ＳＯ４）２　；　１２１（□０　０．０２　ｇｔ（＋ＢＯｉ　Ｑ、０１　ｇＮａ、Ｍｏ０ｔ　；　２Ｈ２００，０１ｇＮｉＣｌ２；　６Ｌ０　０．０２５ｇＮａｚＳｅＯ＋　；　５　Ｈ２Ｏ０，３ｍｇ蒸留水　１０００．０ｍｌ最初にニトリロ酢酸を溶解し次いでＫＯＨでｐＨを６．５に調節し、次いで無機物を加える。最終ｐｔ＋７．０　（ＫＯＨで）。

細胞外酵素系を、増殖の遅い指数期／初期の定常期において集めた。

上澄みを５０ｍ１に濃縮し次いで更に特徴化のために用いた。

キシラナーゼを、オートスペルトコムギ（ｏａｔ　５ｐｅｔ）キシラン力）ら放出された還元糖に対する分析によって測定する（ＸＵ−法）分析を、基質として４０ｍ１のブリトン　アンド　ロビンソン（Ｂｒｉｔｔｏｎ＆Ｒｏｂｉｎｓｏｎ）緩衝液中で調製され、使用前１００℃で３０分間熱処理し、次いで目的のｐｌ＋に調節された０、５％のオートスペルトコムギキシラン（シグマ−Ｘ　−０６２７）を用いて行う。

分析は、Ｏ，１００＋ｎｌの酵素溶液および０．１００ｍ１の基質を用（１て行０、双方とも所望の温度に予備加熱する。混合物を所望のｐＨで２０分間インキュベートする。次いで、０．２００ｍ１の溶液Ｉ　（３５，１ｇのＮａ１ＨＰ０４・２　ＬＯ；　ｌｌ０ｍ１のｌ　Ｎ　Ｎａ０１１を加えた５００ｍ１の脱イオン本に懸濁させた４０．０ｇのＫＮａＣｉＨｔＯｇ’　４Ｈ２０；　８．ＯｇのＣｕ５Ｏ＋　・５　Ｈ２Ｏ；　１８０ｇのＮａ□２ＳＯい脱イオン水を加えて全量を１１とする）を添加し、次いで溶液を１００℃に２０分間加熱する。

０、２００ｍ１の溶液ｎ　（９００ｕ＋１の脱イオン水に懸濁させた５０ｇの（ＮＩＬ）６Ｍｏｔｏｚａ　’　４　ＬＯ；　４２ｍ１の濃Ｈ２ＳＯ１；　６．　ＯｇのＮａ２ＨＡＳＯ１；脱イオン水を加えて全量をＩｎとする）を添加する。

２．０ｍｌの脱イオン水を加え、次いで５２０ｎｍで分光光度計（ＰＹＥ　ＵｎｉＣＡＭ　ＰＵ８６００ＵＶ／Ｖｌｓ　。

フリラプス）を用い吸光度を測定する。

還元糖を、キシロース（４０〜４００μｇ／ｍｌ）を用いて作成しｔ二標準曲線から計算する。

餅盾ユ第一の面において、酵素のｐＨに関連した活性を、４０＋ｎＭのブリトンおよびロビンソン緩衝液中可溶性キシラン（ロート（Ｒｏｔｈ））を用（１，４，０〜１１，０のｐＨ域で９０°Ｃで測定した。

この試験において、Ｔ、ネアポリタナおよびＴ、サーマラム力１ら得られるキシラナーゼは、約ｐＨ４〜約ｐＨＩＯの範囲内にキシラン分解活性を示した。活性に対する最適ｐＨは、図２Ｂおよび図３Ｂｊこ示す如く、５．０〜７．５のｐＨ域に、より明確には５．５〜６．５のｐＨ域Ｉこ、ｐＨ６，０付近に検出された。Ｔ、ネアポリタナはｐＨ４，５およびｐＨ７，５でそれぞれ５０％の残留活性を示した。Ｔ、サーマラムはｐＨ５，５およびｐ１７．５でそれぞれ５０％の残留活性を示した。

Ｔ、マリチマから得られた酵素は、４未満のｐ）Ｉから約１１のｐＨまでにキシラン分解活性を示した。活性に対する最適ｐ８は図ＩＢに示す如く、　４．０〜７．０のｐｏ域に、より明確には４．５〜６．５のｐＨ域に、ｐ）１５．０付近に検出された。Ｔ、マリチマは４．０未満のｐＨおよび７．５のｐＨでそれぞれ５０％の残留活性を有する。

第二の試験において、Ｔ、ネアポリタナおよびＴ、サーマラムから得られたキシラナーゼのｐＨに関連した活性は、４０ｍＭのブリトンおよびロビンソン緩衝液中、可溶性キシラン（ロート）を用い、４．０〜１１．０のｐＨ域に７０℃で測定された。

この試験において、双方のキシランはｐ（１４未満ないしｐＨ１１を超える範囲内でキシラン分解活性を示した。活性に対する最適ｐＨを、図４Ａおよび図４Ｂに示す如（ｐ１１域５．０〜７，５、より明確にはｐＨ域５．５〜６．５　、ｐＨ６，０付近に検出した。双方のキシラナーゼはそれぞれｐＨ４，５およびｐＨ８，５で５０％の相対活性を示した。

温度活性第一の面において、酵素の温度に関連した活性を、４０ｍＭのブリトンおよびロビンソン緩衝液中、可溶性キシラン（ロート）を用いて測定した。

Ｔ、ネアポリタナおよびＴ、サーマラムから得られたキシラナーゼは、図２Ａおよび図３Ａに示す如く、２０℃未満から１１５℃超の範囲内にキシラン分解活性を示した。

Ｔ、マリチマから得られた酵素は、図ＩＡに示す如く、６０℃未満から１００℃ 超でキシラン分解活性を示した。

全てのキシラナーゼは、８０〜１００℃の範囲内の温度で、より詳しくは８５〜９５℃で、９０℃付近に最適温度を示した。

基質特異性基質特異性を、下記の表１に示す基質を用いそして上記のｘＵ−法を用いて測定した。

カンノｑオ（ロート）　７７　８８　９９オートスペルトコムギ（フル力）　６６　９４　８５ブナツキ（レンジングＡＧ）　１００　１００　９８カンパ材（ジグ７）　−”　８９　１００オートスペルトコムギ（シグマ）−ｌ＋８７　６３カラマツ材（ＩＣＮ）　−”　８４　７８ＨＥ〜セルロース２１　（メルク） −１＋１０　０１）渭淀せず２）ヒドロキシエチルセルロース表より、本発明の三種の酵素の種々のキシランに対する効果は殆ど同じであることが分かる。

温度（１）温度（１）ｐＨ温度（ｔｌｌ、）ＨＨｐＨ補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成６年９月　（ら日

Claims

【特許請求の範囲】

１．次の特徴（ａ）〜（ｄ）：（ａ）９０℃で２０分後に測定した場合、４．０〜７．５のｐＨ域に、より好ましくは４．５〜７．５のｐＨ域に、最も好ましくは５．５〜７．５のｐＨ域に５ °％を超える残留活性：（ｂ）７０℃で２０分後に測定した場合、４．５〜８．０のｐＨ域に、より好ましくは４．５〜７．５のｐＨ域に、最も好ましくは５．５〜７．５のｐＨ域に５０％を超える残留活性；（ｃ）ｐＨ６．０で２０分後に測定した場合、８０℃〜１００℃の温度範囲内に、より好ましくは８５℃〜９５℃の温度範囲内に最適温度；（ｄ）Ｔ．マリチマ（ｍａｒｉｔｉｍａ）、Ｔ．ネアポリタナ（ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ、又はＴ．サーマラム（ｔｈｅｒｍａｒｕｍ）から得ることのできるものであるを有することを特徴とする、キシラナーゼ。
２．次の特徴（ａ）〜（ｄ）：（ａ）９０℃で２０分後に測定した場合、５．５〜６．５のｐＨ域に、ｐＨ６．０付近に最適ｐＨ；（ｂ）９０℃で２０分後に測定した場合、ｐＨ７．０で少なくとも５０％の相対残留活性；（ｃ）７０℃で２０分後に測定した場合、ｐＨ７．５で少なくとも５０％の相対残留活性；（ｄ）Ｔ．マリチマ、Ｔ．ネアポリタナ、又はＴ．サーマラムから得ることのできるものであるを有することを特徴とする、キシラナーゼ。
３．菌株Ｔ．マリチマ、ＤＳＭ３０１９、Ｔ．ネアポリタナ、ＤＳＭ５０６８、又はＴ．サーマラム、ＤＳＭ５０６９、又はそれらの突然変異体又は変異体から得ることのできる、請求の範囲第１又は２項記載のキシラナーゼ。
４．請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載のキシラナーゼの製造方法であつて、Ｔ．マリチマ、Ｔ．ネアポリタナ、又はＴ．サーマラムのキシラナーゼ生産菌株を、炭素および窒素源並びに無機塩を含有する適当な普通培地中で培養し、次いで所望の酵素を回収することに含んでなる、前記方法。
５．菌株Ｔ．マリチマ、ＤＳＭ３１０９、Ｔ．ネアポリタナ、ＤＳＭ５０６８、又はＴ．サーマラム、ＤＳＭ５０６９、又はそれらの突然変異体又は変異体を培養する、請求の範囲第４項記載の方法。
６．粒質物、好ましくは無粉塵性粒質物、液体、特に安定化液体、スラリー又は保護された酵素の形で提供される、請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載のキシラナーゼを含有する薬剤。
７．キシラナーゼが全酵素蛋白質の少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％を構成する、請求の範囲第６項記載の薬剤。
８．リグノセルロースパルプを、請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載の酵素で処理する、リグノセルロースパルプの処理方法。
９．プロセスを、７．０を超えるｐＨで、好ましくはｐＨ８．０を超えるｐＨで行う、請求の範囲第８項記載の方法。
１０．プロセスを、５０〜１００℃の温度で、好ましくは６０〜９５℃の温度で行う、請求の範囲第８又は９項記載の方法。
１１．プロセスを、５分〜２４時間の時間内、好ましくは１５分〜６時間の時間内、より好ましくは２０分〜３時間の時間内で行う、請求の範囲第８〜１０項のいずれか１項に記載の方法。
１２．プロセスを乾燥物質の３〜３５％の、より好ましくは５〜２５％の、最も好ましくは８〜１５％のコンシステンシーで行う、請求の範囲第８〜Ｈ項のいずれか１項に記載の方法。
１３．酵素用量が１ｋｇの乾燥パルプ当たり１０〜５０００ＦＸＵ又は１ｋｇの乾燥パルプ当たり１０〜５０００ＥＸＵ、より好ましくは１ｋｇの乾燥パルプ当たり１００〜５０００ＦＸＵ又は１ｋｇの乾燥パルプ当たり１００〜５０００ＥＸＵのキシラナーゼ活性に相当する、請求の範囲第８〜１２項のいずれか１項に記載の方法。