JPH07503069A - 患者内の選ばれた癌腫の生物学的能力の推定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 患者内の選ばれた癌腫の生物学的能力の推定方法技術分野 本発明は、一般的に癌腫の分析に、そしてさらに特に、癌腫、特に前立腺癌腫の 生物学的能力の推定方法に、関する。

発明の背景 はとんどのタイプの癌の首尾よい治療が、正確で且つタイムリーな診断を受けた 患者の生存率を劇的に増加させる外科的及び化学療法技術の形態において、容易 に利用されることができる。不幸なことに、たとえ、内科医が患者の腫瘍が”良 性（ｂｅｎｉｇｎ）”又は”悪性（ｍａｔ　ｉｇｎａｎｔ）”であるかどうか予 言することができたとしても、この予言の信頼性及び有意性は、不確かである。

最も一般的には、悪性腫瘍の診断は、患者から採取された生検又は他の組織サン プルの顕微鏡分析により決定される組織病理学的発見に依存する。癌の組織病理 学的診断は、多くの主要な欠点を現し、その中の重要なのは：１）最新利用可能 技術を使用においては、腫瘍の悪性腫瘍の組織病理学的評価が、しばしば、多く の場合において低い病的状態のサンプリング技術、例えば、ニードル生検（ｎｅ ｅｄｌｅ　ｂｉｏｐｓｙ）が臨床的に有用なやり方で適用されることができない ような、比較的広範な組織サンプリングを必要とすること；　ｉｉ）悪性腫瘍に ついての組織病理学的マーカーが、典型的に、誤差についての広いマージン及び サンプル評価におけるそれぞれの病理学者の間の不一致を残しながら、定量的に 評価されること；そして１１）悪性腫瘍についての組織病理学的マーカーが、様 々な形態の癌の間で非常に広く変動し、標準的な分析方法を実行不可能にするこ と、である。この状況のため、個々の組織病理学者は、癌の特異的形態を巧妙に 診断する特別なトレーニングを必要とすることができ、又は広い範囲の癌を診断 することについて不十分に資格を与えられることができる。はとんどの形態の癌 のついて、用語”悪性腫瘍（ｍａｌ　ｉｇｎａｎｃｙ）”は、実際には、広いス ペクトルの疾患状態、又はいわゆる悪性腫瘍の”等級（ｇｒａｄｅｓ）”を包含 する。様々な学校の教示は、同一形態の癌に異なる等級システムを適用すること ができ、一方、様々な癌形態の等級システムは、完全に比較されないことができ る。これらの状況は、癌の定量的な組織病理学的診断にさらなる不確かさを追加 している。

たとえ、腫瘍の悪性腫瘍の予言方法が、かなり容易になり、そして危険が少なく なり、そして誤差が少なくなったとしても、癌の診断方法は、臨床的に欠陥があ るであろう。なぜなら、腫瘍の悪性腫瘍がどのように、腫瘍の転移能力、又はそ の元の部位からの拡がりに関係するのかが未だはっきりとしないからである。′ 良性な”腫瘍が転移の少しの恐れを又はその恐れを全く有していないこと、並び に低い及び高い等級の悪性腫瘍の腫瘍がそれぞれより少ないか又はより大きな転 移の恐れを有していることが一般的に受け入れられているけれども、転移の生物 学的能力と悪性腫瘍の等級との間の信頼でき且つ正比例関係がすべての形態の癌 について目立って存在していない。これは、細胞分化以外の要因が腫瘍細胞の転 移能力の原因であるということを示唆している（Ｋｒａｍｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｃａｎ５ｅｒ　４８：　２７１−２７３．１９８１）。また、これらの状況は 、中間の等級の悪性腫瘍のかなりのパーセンテージが実際には予知できずに低い 生物学的能力を有していることを含意している。不幸にも、このような場合にお いては、内科医は、手術、照射、又は化学療法のような治療を使用を強要される かもしれない。但し、このような治療は、実際に、患者の生存のチャンスを減少 させ又はかなりの転移をもたらすことができる。反対に、救命治療が、しばしば 、実際には高い転移能力を有する低い等級の悪性腫瘍を有する患者から取り出さ れることができる。癌診断のためのより有効なツールを提供するために、癌腫の 生物学的能力を直接的に測定する技術を開発することが、それ故に必要である。

このような技術は、生物学的能力の関連”マーカー”の発見、及びこれらのマー カーを評価し且つ測定するためのツールの開発を要求する。この種の最適技術は 、最小の危険及び転移を伴って広範な癌に適用可能であり、そして定量的であり 、再現性可能であらなければならず、そして時間及び専門技術の最小費用を要求 する。

癌腫の生物学的能力を測定するためのこのような診断の開発する従来の試みは、 患者におけるリンパの転移の存在又は非存在により初期腫瘍内の悪性腫瘍の等級 を比較する研究から始まった（例えば、は、悪性腫瘍等級と転移との間の大まか な相関を示唆し、そして生物学的能力は、最も一般的な中間等級の腫瘍内の悪性 腫瘍の等級に無関係のようであった。さらに、これらの研究は、典型的には、外 科手術により得られた臓器の全体又は大きな組織サンプルの組織病理学的分析を 包含していた。

この討議から、患者内の肉腫の生物学的能力を推定するための臨床的に有用な方 法についての必要性が存在することは明らかである。

本発明は、この必要性を満たし、そして他の関連の利点を提供する。

本発明の要約 簡単に言えば、本発明は、患者内の、選択された癌腫、特に前立腺癌腫の生物学 的能力の推定方法を提供する。特に、前立腺癌腫内の微細血管（ｍｉｃｒｏｖｅ ｓｓｅｌ）密度が、病的段階、及びそれ故、転移能力の、独立した予言者（ｐｒ ｅｄｉｃｔｏｒ）である。このような方法は、治療のタイプに対する患者、特に 、低い腫瘍の微細血管密度をもつ患者の層化を可能にする。本発明の１つの態様 内においては、患者内の前立腺癌腫の生物学的能力の推定方法であって：（ａ） 患者から前立腺癌腫の組織サンプルを得て；そして（ｂ）その組織サンプルの血 管質（ｖａｓｃｕｌａｒｉ　ｔｙ）を定量し、そしてそれからその前立腺癌腫の 生物学的能力を推定する、ような段階を含んで成る方法を、提供する。

このような組織サンプルは、例えば、マニュアル又はコンピューター支援の形態 計測定量化（＋ｏｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ　ｑｕａｎｔｉｆｉｃａＬｉｏｎ）を 含む様々な方法により定量化されることができる。

本発明の関連態様内においては、患者内の選択癌腫の生物学的能力の推定方法で あって：（ａ）ニードル生検、内視鏡検査法（ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ）、腹腔鏡検 査法（Ｉａｐａｒｏｓｃｏｐｙ）　、及び膀胱鏡検査法（ａｙｓ　ｔｏｓｃｏｐ ｙ）がら成る群から選ばれた方法により癌腫から生検試料を得て：そして（ｂ） その生検試料の血管質を定量し、そしてそれから、その癌の生物学的能力を推定 する、ような段階を含んで成る方法を、提供する。このような癌腫の代表的な例 は、頭及び首の腫瘍、ＣＮＳ腫瘍、メラノーマ及び他の皮膚腫瘍、リンパ腫、柔 組織肉腫、並びに、胸、嚢、膵臓、結腸、ｕｒｏｔｈｅｌ　ｉａｌ、精巣、子宮 頚（ｃｅｒｖｉｃａｌ）、子宮（ｕｔｅｒｉｎｅ）、腎臓、卵巣、肝臓、肺、食 道、及び胃の癌腫を含む。

これらの及び他の態様は、以下の説明及び添付図面を参照して明らかになるであ ろう。

図面の簡単な説明 図１は、ディジタル化された前立腺癌腫の領域からの因子Ｖｌｌｌ染色血管の写 真の対である。上の写真中に、分析前の未変更ディジタル化画像を示す。下の写 真中に、オペレーター操作及びＯＰＴＩＭＡＳ画像分析ソフトウェア−の適用の 後の同一画像を示す（１００％）。

図２は、良性の前立腺の腺組織（ｇｌａｎｄｕｌａｒ　ｔｉｓｓｕｅ）の写真の 対であり。上の写真中、（ａ）ヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌ　ｉｎ）及 びエオシン（ｅｏｓｉｎ）（Ｈ及びＥ）染色セクションを示す。下の写真中、（ ｂ）因子Ｖｌｌ＋に対する抗体により染色された次のセクションを、示す。介在 ストロマ内の幾つかの大きな血管（ｖｅｓｓｅｌ）をもつ腺に隣接したキャピラ リーの正常な分布が存在する（１１５ｘ）。

図３は、因子Ｖｌｌ＋に対する抗体により染色された良性の前立腺の腺の写真の 対である。上の写真は、基底上皮細胞に隣接した高い密度の毛細血管をもつ正常 な円柱の上皮を含む腺の一部を描写している。周囲のストロマ内に血管は存在し ない。下の写真（ｂ）は、非栄養性の（ａｔｒｏｐｈｉｃ）低い立方骨の（ｃｕ ｂｏｉｄａｌ）上皮をもつ、低密度の隣接毛細血管をもつ、膨張した腺の一部を 示している（３１２ｘ）。

図４は、浸潤性の高い等級の癌腫が侵入した前立腺ストロマの写真の対である。

上の写真（ａ）は、■及びＥ染色セクシジンを示す。

下の写真（ｂ）は、因子Ｖｌ１１抗体により染色された同一領域内にあり、癌腫 内の多数の毛細血管を示している（１００ｘ）。

図５は、因子Ｖｌ１１に対する抗体により染色された高い等級の癌腫の写真であ り、高い密度の小さな毛細血管を示している。小さな又は目立たない管腔（ｌｕ ｍｅｎｓ）をもつ幾つかの免疫応答性内皮細胞をもつ毛細血管形態学の変異性が 在る（３４０Ｘ）。

発明の詳細な説明 先に述べたように、本発明は、患者内の前立腺癌腫の生物学的能力の推定方法で あって＝（ａ）患者から前立腺癌腫の組織サンプルを得て：そして（ｂ）その組 織サンプルの血管質を定量し、そしてそれからその前立腺癌腫の生物学的能力を 推定する、ような段階を含んで成る方法を、提供する。本発明の文脈内において は、′生物学的能力（ｂｉｏｌｏｇｉｃ　ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）″は、新形質（ ｎｅｏｐｌａｓｍ）が周囲の構造物に侵入し又は離れた部位に拡がる能力を示す と理解されるべきである。

例えば、生物学的能力は、新形質、例えば、前立腺癌腫が転移する能力、又は神 経膠腫（ｇｌ　ｉｏｍａｓ）が周囲の組織に侵入する能力をいう。

分析のために患者から組織サンプルを得ることに先立って、前立腺肉腫の存在に ついて患者を検査することが最も一般的に好ましい。

典型的には、患者は、様々な臨床的方法により、例えば、前立腺の指の／触診法 （ｐａｌｐａｔｉｏｎ）により、又はＰＳＡ（前立腺特異的抗原（Ｐｒｏｓｔａ ｔｅ　５ｐｅｃｉｆｉｃ　Ａｎｔｉｇｅｎ）　、”ｐ３０”ともいわれる）の上 昇レベルについての彼の血清の分析により、前立腺癌の存在について最初に、評 価される。血清中のＰＳＡのレベルを検出し且つ分析するテスト・キットは、様 々な源から得られることができる（例えば、Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ　Ｉｎｃ、、　 Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡ；　Ａｂｂｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　 Ｃｈｉｃａｇｏ。

ＩＬ）（また、米国特許第Ｒｅ、、　３３．４０５号を参照のこと。）。次に、 前立腺癌の存在を、例えば、ニードル生検、尿道を通しての切除又は尿道を通し ての生検により得た前立腺組織の組織病理学的分析により、確認することができ る。

前立腺癌腫の生物学的能力を推定するために、組織サンプルを、患者から得なけ ればならない。先に述べたように、前立腺癌腫の組織サンプルは、例えば、ニー ドル生検、尿道を通しての生検、尿道を通しての切除（ｔｒａｎｓ−ｕｒｅｔｈ ｒａｌ　ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ（ＴＵＲＰ））、単純開放前立腺切開術を含む様々 な方法により、又は前立腺の全体切開により、得られることができる。

簡単に言えば、組織サンプルをニードル生検により得る場合には、サンプルは、 普通には、指又は超音波の案内下に皮膚又は直腸のいずれかを通して（１８又は ２０ゲージの針を含む）スプリング充填ガン（ｓｐｒｉｎｇ　１ｏａｄｅｄ　ｇ ｕｎ）により、採取さレル。

組織サンプルを尿道を通しての生検により得る場合には、膀胱鏡検査法を前立腺 尿道を可視化するために使用することができ、そして前立腺の一部を生検ピンセ ットを使用して取り出す。あるいは、また、切除鏡（ｒｅｓｅｃｔｏｓｃｏｐｅ ’）を、前立腺の一部を取り出すために使用することができる。組織を尿道を通 しての切除（ＴＵＲＰ）により得る場合には、前立腺の中心部分のすべて又は転 移領域を、切除鏡を使用して取り出す。得られた前立腺の”チップ（ｃｈｉｐｓ ）″（サイズ約０．５また、組織サンプルを、単純開放前立腺切開術、又は前立 腺の部分的若しくは全体の外科的摘出により、得ることができる。簡単に言えば 、単純開放前立腺切開術のためには、腹部（ａｂｄｏｍｅｎ）又は会陰部（ｐｅ ｒｉｎｅｕｍ）内で切開を行い、そして前立腺の転移領域を前立腺カプセルを通 して取り出す。同様に、前立腺の全体を取り出すためには、腹部又は会陰部内で 切開を行い、そして前立腺の全体及び周囲の組織を切除する。

患者から得られた組織サンプルを、次に、よく確立された技術（一般的には、” Ｐｒｏｓｔａｔｅ　Ｂｉｏｐｓｙ　Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ″、　Ｅｐｓ ｔｅｉｎ（ｅｄ、）。

Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８９；　Ｇｌｅａｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ 、　Ｕｒｏｌ、ＩＩＩ：　５Ｂ−６４，１９７４；Ｇｌｅａｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ 、、　”Ｕｒｏｌｏｇｉｃ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：　Ｔｈｅ　Ｐｒｏｓｔａｔｅ 、”Ｔａｎｎｅｎｂａｕｎ＋ｅｄ、、　Ｌｅａ　ａｎｄ　Ｆｅｂ：ｇｅｒ、　Ｐ ｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、　１９７７を参照のこと。）を使用して前立腺癌腫の 存在について分析することができる。簡単に言えば、サンプルを、そのサンプル がその後の処理の間に構造的及び物理化学的完全性を維持するように、最初に” 固定（ｆｉｘｅｄ）″することができる（一般的には、”Ｔｈｅｏｒｙ　ａｎｄ 　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｈｉｓｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ″Ｈｅｅｈａｎ　 ａｎｄ　Ｈｒａｐｃｈａｋ（ｅｄｓ、）、　Ｃ，■、Ｍｏ５ｂｙ　Ｃｏ、、　１ ９８０（これを、引用により本明細書中に取り込む。）を参照のこと。）。様々 なよく知られた方法であって、例えば、様々なアルコール、ホルムアルデヒド及 びグルタルアルデヒドを含む方法を、その組織を固定するために使用することが できる。

次に、サンプルを、顕微鏡により観察することができる薄い（例えば、１〜ｌＯ μのセクション、及び一般的には約５μセクシヨンの）試料に薄片化（ｓｅｃｔ 　１ｏｎｅｄ）する。このサンプルを、様々な方法であって、例えば、固体マト リックス、例えば、パラフィン又はプラスチック中にサンプルを最初に包埋し、 その後そのサンプルを分けることにより、薄片化することができる。

他の態様内においては、組織サンプルを、標準的な低温固定（ｃｒｙｏｆ　１ｘ ａｔｉｏｎ）技術に従って固定する（一般的には、”Ｔｈｅｏｒｙ　ａｎｄＰｒ ａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｈｉｓｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ″Ｈｅｅｈａｎ　ａｎｄ 　Ｈｒａｐｃｈａｋ（ｅｄｓ、）、　ＣＪ。

Ｍｏ５ｂｙ　Ｃｏ、、　１９８０を参照のこと。）。サンプルを凍結した後、そ れを、クリオスタット（ｃｒｙｏｓｔａｔ）により、薄片化することができる。

この方法は、免疫組織化学的技術が使用されるとき好ましく、それは、生来のタ ンパク質が化学固定技術により変成されないということを必要とする。

組織サンプルを、次に、慣用の又は倒立光学顕微鏡による使用に好適な透明な（ 例えば、ガラス又はＰｌｅｘｉｇｌａｓｓ）スライドの上に載せることができる 。載せることは、単に、未処理スライドの直接上の水又は他の液体中に組織サン プルを浮かべることにより、行うことができる。あるいは、組織サンプルを、様 々な細かい操作装置（例えば、ループ（ｌｏｏｐｓ）又はアプリケーター）を使 用して手によりスライド上に置くことができる。選んだ処理手順に依存して、特 定の化学的処理の下でそのセクション又は試料のより良好な接着を提供する”コ ートされた（ｃｏａｔｅｄ）”スライド上に組織サンプルを載せることも、有用 である。好適なスライドコーティング剤の例は、レクチン、アルブミン、及びポ リ−アミノ酸、例えば、ポリーＬ−リジンを含む。

次に組織サンプルを、組織病理学的検査のために染色することができる。典型的 には、その組織サンプルは、適当な溶媒、例えば、キシレン又は１ｌｉｓｔｏｃ ｌｅａｒを含む包埋媒質（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ　ｍｅｄｉｕｍ）　から最初に” 清澄化（ｃｌｅａｒｅｄ）”される（低温固定組織は、薄片化に先立って包埋さ れていない）。組織サンプルを、次に、一般的な組織病理学のために処理し、そ して典型的には、脱水、再水和及び１回の又は多数の染色及び脱染色の手順を含 む、ある範囲の加工処理に供する。前立腺組織サンプルの一般的な染色方法は、 ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ及びＥ）の使用を含む（一般的には、”Ｔｈｅ ｏｒｙ　ａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ　ｏｆ　Ｈｉｓｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”　 Ｈｅｅｈａｎ　ａｎｄ　Ｈｒａｐｃｈａｋ（ｅｄｓ、）、　Ｃ，Ｖ。

Ｍｏ５ｂｙ　Ｃｏ、、　１９８０を参照のこと。）。

組織の脈管構造（ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）を可視化するために、ある者は、組 織化学的又は免疫組織化学的な染色を使用することができる。簡単に言えば、組 織化学的又は免疫組織化学的な染色は、組織成分のさらにより正確な同定を可能 にする特定の組織標識手順の使用を包含する。

一般的に、血管は、多くにユニークなタンパク質及び炭水化物部分を含む。これ らの部分に対して反応するリガンドを、血管を染色するために使用することがで きる。このようなリガンドの代表的な例は、レクチン、例えば、υＥＡ−１（υ ｔｅｘ　ｅｒｏｐａｅｕｓ−１）　、及び血管成分に対して反応する抗体を、含 む。特定の態様内においては、因子Ｖｌｌｌｉ：対する抗体（ＤＡＫＯ，Ｃａｒ ｔｉｎｔｅｒｉａ、　ＣＡ）を血管表面をマークするだめに使用する。このよう な抗体は、その血管表面が可視化されることができるように、それ自体を標識さ れるか、又は第二抗体若しくは標識と反応するかのいずれかであってもよい。多 種多様な標識であって、例えば、ホースラデイシュ・ペルオキシダーゼ、フルオ レセイン・イソチオシアネート、及びローダミンを含むものを、この意味で使用 することができる。

好ましい態様内においては、薄片組織サンプルを、脱パラフイン化し、そして等 級アルコールを通して再水和させる。正常ウマ血清によるブロッキングの後、抗 −因子Ｖｌｌ＋抗体を、適用し、そしてそのセクションを、５℃において一部イ ンキユベートした。第二抗体（ビオチン化ヤギ抗−ウサギ）、その後、ペルオキ シダーゼ・アビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ，Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｓ、　Ｉ ｎｃ、）を、適用した。色をジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を使用して顕色し、 そしてスライドに永久化のためにカバーグラスをかけた。

組織サンプルを、次に、前立腺癌の組織サンプルが得られたことを確認するため に、可視化することができる。このような検査技術は、本分野においてよく知ら れている（一般的には、”ｐｒｏｓｔａｔｅｂｉｏｐｓｙ　Ｉｎｔｅｒｐｒｅｔ ａｔｉｏｎ″、　Ｅｐｓｔｅｉｎ　（ｅｄ、）、　Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ、１ ９８９を参照のこと。）。前立腺癌腫のための最も一般的な等級システムは、Ｇ ｌｅａｓｏｎシステム（Ｇｌｅａｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｕｒｏｌ、１ １１：５８−６４．１９７４；Ｇｌｅａｓｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、”Ｕｒｏｌｏｇ ｉｃ　ｐａｔｈｏｌｏｇｙ：　Ｔｈｅ　ｐｒｏｓｔａｔｅ″、Ｔａｎｎｅｎｂａ ｕｍｅｄ、、　Ｌａｅ　ａｎｄ　Ｆｅｂｉｇｅｒ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ 、　１９７７；　Ｍｉｌｌｉｎｇｅｒ　ｅｔ　ａｔ、。

Ｊ、　Ｕｊｏｌ、　９７：３３］−３３７，１９６７を参照のこと。）に基く。

簡単に言えば、このシステムは、比較的低い倍率で腫瘍の腺パターンを等縁付け する。第一の（優勢な）及び第二の（二番目に最も有力な）建築学的パターンに 基き、その腫瘍を、ｌから５までの等級に指定する。

一旦、前立腺の組織サンプルが得られたら、サンプルの血管質を、その癌腫の生 物学的能力を推定するために、定量する。

様々な方法であって、血管成分又は血管の成長と関係する因子を測定する間接法 、及びマニュアル若しくはコンピューター支援形態測定法を通して血管を直接的 に測定する直接法の両方を含む方法を、血管質を定量するために使用することが できる。血管質を測定するための間接法は、例えば、吸引ニードル生検、ニード ル生検、尿道を通しての生検若しくは切除、単純前立腺切開術、又は前立腺の全 体切除を含む様々な方法により得られた、腹水液、又は組織サンプルの抽出物を 、使用することができる。例えば、タンパク質、炭水化物、又は他の因子であっ て血管成分又は血管の成長に関連するものを含むようなサンプル中で、多種多様 な因子を定量することができる。代表的な例は、フィブリン又はフィブリノーゲ ン（Ｓｖａｎｂｅｒｇ。

Ｃａｎｃｅｒ　３５：　１３８２．１９７５を参照のこと。）、並びに多くの” 血管形成因子”であって血管成長に関連するもの（例えば、血管形成性ヘパリン −結合内皮細胞成長因子、アンジオゲニン、トランソフォーミング成長因子、及 び他の血管形成因子）（Ｆｏｌｋｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　５ｃｉｅｎｃｅ２３５ ：　４４２−４４７を参照のこと。）を包含する。

マニュアル又はコンピューター支援のいずれかの形態計測定量化のために、先に 討議したように組織を調製しそして染色することが最初に必要である。１つの態 様内においては、組織サンプルを、次に、光学顕微鏡下にスライドを置き、そし て血管の数を計数することにより、マニュアルで計数することができる。

良性前立腺組織内の微小循環の組織学的パターンは、一般的にすべての場合にお いて類似している。簡単に言えば、平滑筋ストロマのバルクは、非常に少ないキ ャピラリーをもつ、幾つかの動脈及び静脈を含む。これに反し、上皮基底膜に直 に隣接したストロマは、良性の腺及び管のそれぞれを包囲するキャピラリーの富 裕なネットワークを含む。腺−ストロマの間の隣接キャピラリー管の間隔は、与 えられた腺のいずれにおいても非常に規則正しいが、異なる形態の豚房（ａｃｉ ｎｉ）の間でいくぶん変化する。嚢胞性の膨張した（Ｃｙｓｔｉｃａｌｌｙ　ｄ ｉｌａｔｅｄ）、非栄養性の腺であって平たい又は立方骨の上皮細胞と並んだも のが少なくなればなる程、丈夫な円柱状の分泌性上皮をもつ過形成性の腺よりも より広くキャピラリーが間隔を空けた。

また、詰り、重なった上皮をもつ前立腺の上皮間断形成（ＰＩＮ）の腺及び変化 した段階の細胞学的異型性が、過形成において見られるものと類似の、隣接スト ロマ内のキャピラリー網と関係している。腺から離れたストロマの組織内の密度 は一般的に低いけれども、より高い血管密度をもつ病巣領域が幾つかの過形成ス トロマ小節（ｎｏｄｕｌｅｓ）内で見られることができる。

微細循環の外観は、良性組織と比べて癌腫内で異なっている。癌腫はそれらの成 長パターンにおいてかなり変化するけれども、良性組織を特徴付ける腺とストロ マとの界面におけるキャピラリーの繊細な局在化は、癌腫内には存在しない。癌 腫内では、キャピラリーの数における一般化した増加が在り、そして悪性の腺及 び細胞に関する明らかな配向は全くない。非常に密に詰められた悪性の腺の視野 においては、僅かのストロマの隔膜（ｓｅｐｔａ、）が、悪性の腺の外形に直に 隣接したキャピラリーを含むが、それらは、良性組織内で、見られるような規則 正しいパターンにおける豚房を取り囲んでいない。小孔質の（ｃｒｉｂｒｉｆｏ ｒ＋ｎ）の癌腫内の上皮の複雑な島内には、毛細管は、全く存在しないが、明確 な線周囲の毛細管網が在る。したがって、癌腫内の微細循環の構造の主要な差異 は、かなり均一に分布した増加した数の毛細管であるようであり、良性組織を特 徴付ける腺の豚房の周りの明らかに不斉の配向を欠いている。

癌腫内の個々の血管の形態も、良性組織とは異なっている。良性組織においては 、その毛細管は、サイズ及び管腔内径において均一である。これに対し、癌腫内 の毛細管は、サイズにおいて変化することができ、非常に小さな毛細管の芽が小 さな又は目立たない管腔をもっている。

先に述べたように、また、血管質を、様々なディジタル化装置（例えば、ＯＰＴ ＩＭＡＳ、　Ａｍｅｒｉｃａｎ　１ｎｎｏｖｉｓｉｏｎ、及びＮＥＸＴ）を使用 して、コンピューター支援形態計測法を使用して定量化することができる。

好ましい態様内においては、スライドを、ビデオ・カメラにより監視するために 実験室顕微鏡の下に置く。次に、ビデオ画像を、生の画像がディジタル分析のた めの単一フレームとして凍結されることを可能にするコンピューター内のフレー ム捕獲ディジタル化ボードにより、捕獲する。

画像分析ソフトウェア・パッケージ（ＯＰＴＩＭＡＳ、　Ｂｉｏｓｃａｎ　Ｉｎ ｃ、。

Ｅｄｍｏｎｄｓ、　ＷＡ）は、凍結画像からのデータを操作し且つ集めるために 特に好ましい。簡単に言えば、ＯＰＴＩＭＡＳ画像分析パッケージは、画像を分 析するためにユーザーがあつらえの°マクロ（ｍａｃｒｏ）’を書くことができ るように設計されている。このマクロは、それ自体、ＯＰＴＩＭＡＳパッケージ 内に提供されている′オブジェクト（ｏｂ　ｊｅｃｔｓ）’及び°ファンクショ ン（ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）’を使用するコンピュータ・プログラムである。ファ ンクション及びオブジェクトは、表現されたタスク、例えば、ファイルを開は又 はディジタル画像上で数学的操作を走らせることのために書かれたコンピュータ ・プログラムである。

これらの°　キヤツト（ｃａｎｎｅｄ）’　プログラムは、コンピューター・コ ードを書く必要を伴わずにユーザーがタスクの多数の列から選ぶことを可能にす る。これらのファンクション及びオブジェクトは、本質的に、特定のタスク、例 えば、組織セクション上の血管を計数し、又は製造された部材内のクラックを検 出するために、マクロ・プログラムを構築するときに使用することができるツー ルである。マクロを書くとき、そのタスクのために必要なファンクション及びオ ブジェクトは、それらが必要とされるときにそのファンクション及びオブジェク トをコールするプログラムを構築するための標準的なｌｃｌ言語プログラミング ・コードにより組み合わされる。

（別添資料Ａ中により詳細に述べるような）代表的な血管計数マクロは、ユーザ ーが現存データ・ファイルを開け、又は新たなファイルを開けることができるよ うにすることにより開始される。望ましい画像を、次に、獲得し、ディジタル・ フレームとして凍結し、そしてコントラスト及び輝度について調整する。マクロ が走るとき、ユーザーは、その血管を定める前景の境界を調整する。血管の数を 正確に示すために必要なものとして修正（ｒｅｔｏｕｃｈｉｎｇ）を行い、そし てフィルターを、さらにその計数の精度を確保するために走らせる。

最後に、血管を自動的に計数し、そしてその数を分析されるべき組織の領域と一 緒にデータ・ファイル中に入れる。好ましい態様内においては、最終的な血管の 密度値を、組織のｌ＋ｎｍ　”の薄片面積当たりの血管において表現する。統計 的な分析を、次に、表計算プログラム（例えば、Ｅｘｃｅｌ）並びにより強力な 統計分析プログラム（例えば、５ｙｓｔａｔ、　５ｙｓｔａｔ、Ｉｎｃ、）を使 用して行うことができる。

一旦、血管密度が測定されたら、それを、癌腫の生物学的能力を推定するために 使用することができる。一般的には、与えられた領域のより高い数の血管は、よ り大きな生物学的能力を示したものである。説明する如く、ｌ＋ｎｍ　”の薄片 領域について、７５未満の血管が、比較的低い生物学的能力を示し、７５〜１５ ０血管が、中間レベルの生物学的能力を示し、そして１５０を超える血管が、よ り高いレベルの生物学的能力を示す。しかしなか、単位面積当たりの血管以外の 測定標準を、開発することもできることに、留意しなければならない。

例えば、特定サイズの血管又は管腔内径のみを、計数することができる。同様の やり方で、明らかな配向を欠き、又は標準的な円形の若しくは楕円形の形状とは 異なる血管のみを、計数することができる。このような異常型の血管の比較を、 癌腫の生物学的能力を推定するために同様に使用することができる（例えば、よ り高い”異常型の（ａｂｅｒｒａｎｔ）”血管計数は、より大きな生物学的能力 をもたらす。・、先に述べたように、本発明の関連態様内においては、選択され た癌腫の生物学的能力を推定するための方法を提供する。選択された癌腫の代表 的な例は二頭及び首の腫瘍、ＣＮＳ腫瘍、メラノーマ及び他の皮膚腫瘍、リンパ 腫、柔組織肉腫、並びに、胸癌腫、嚢癌腫、膵臓癌腫、結腸癌腫、ｕｒｏｔｈｅ ｌｉａｌ癌腫、精巣癌腫、子宮１（ｃｅｒｖｉｃａｌ）癌腫、子宮（ｕｔｅｒｉ ｎｅ）癌腫、腎臓癌腫、卵巣癌腫、肝臓癌腫、肺癌腫、食道癌腫、及び胃の癌腫 を含む。

簡単に言えば、の態様は、本発明のこの態様内においては、組織標本を、ニード ル生検、内視鏡検査法（ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ）　、腹腔鏡検査法（ｌａｐａｒｏ ｓｃｏｐＹ）　、及び膀胱鏡検査法（ｃｙｓｔｏｓｃｏｐｙ）から成る群から選 ばれた方法を使用して患者内に在る（すなわち、′インビボにおける”）選択さ れた癌腫から得る。次に、この試料を、先に述べたように調製する。次にこの組 織サンプルの血管質を、選択された癌腫の生物学的能力を推定することができる ような、先に述べた手順を使用して定量する。ニードル生検における血管の数を 測定するための代表的な計数マクロを、添付資料Ｂ中に記す。当業者は、より高 い生物学的能力を示す血管の相対数が特定の癌に依存して変化するであろうとい うことを、理解するであろう。この点において、ある者は、微細管密度と生物学 的能力との間の正確な関係を確認するために、微細管密度を、生物学的能力の他 の指標、例えば、腫瘍等級（ｔｕｍｏｒ　ｇｒａｄｅ）　、腫瘍段階（ｔｕｍｏ ｒ　ｓｔａｇｅ）　、腫瘍容量及び患者の臨床的な進行と、比較するであろう。

以下の実施例は、説明により提供され、そして限定によるものではない。

実施例 実施例１ 患者材料 徹底的な前立腺切開術を経験した３２人の患者からの及び尿道を通しての切除試 料（ＴＵＲＰ）からの５人からの組織を、検査した。ケースを、Ｇｌｅａｓｏｎ 等級を変化させる組織学的パターンのスペクトルを現すように選んだ。ヘマトキ シリン及びエオシン染色薄片を、２人の組織病理学者により検査し、そしてＧｌ ｅａｓｏｎ等級を指定した。徹底的な前立腺切開術の３２ケース及びＴＵＲＰの ５ケースのそれぞれにおいて、５分野の癌腫を測定した。ケースの全体としての 等級を表す、少なくとも１の視野サイズ及び均一等級の領域を、切除された試料 からのそれぞれのブロックのＨ＆Ｅ染色薄片を調べることによりでたらめに選ん だ。これらの領域内においては、調査のための分野も、でたらめに選んだ。

癌のほとんどは、Ｇｌｅａｓｏｎ等級の変化を伴った組織学的外観のスペクトル を含むけれども、研究のための領域を、がなり均一なＧｌｅａｓｏｎパターンを もつ癌腫の少なくとも５つの低出力の顕微鏡視野（５０ｘ）が存在するように、 選んだ。これらのケースについての臨床データを、腫瘍等級ＣＧＩｅａｓｏｎ　 ５ｃｏｒｅ＞　、腫瘍面積及び血清ＰＳＡレベルに関して、表１中に要約する。

表　１ Ｇｌｅａｓｏｎスコア　腫瘍面積ＣＣ）ｌ！、）　ＰＳＡ（ＮＧ／ＭＬ）病的段 階　平生とと？」■王権　グ　旦王権どど）　ＳＤ境界内胸罎肛ＱＣ）　６．４ ２　９〜１０　１，１７　０，７４　０．２−１．８　０．４２　６．５５　１ ．２−２１．３　５．５９陽性マージン（Ｃ２）　７．３３　６〜８　０．７１ 　２．１５　０．２−４．７　１．５２　９．４２　３．４−３３．６　９．３ ０・叶盤リンノ勺市（ＤＩ）　８．００　７〜９　１．１．５　３．８２　２． １−８．３　２．９９　９．３３　６．４−１５．９　４．４V 骨格転移（Ｃ２）　９．４０　９〜１００．５５ＮＡ　ＮＡ　ＮＡ　ＮＡ　ＮＡ 　ＮＡＭ−腫瘍面積及び血ΔＷＳＡは、ＴｔｌＲＰｔｉｍについては利用出来な かった。

実施例２ 免疫組織化学 免疫組織化学を、アビジン−ビオチン複合体の技術を使用して行った。簡単に言 えば、それぞれのケースからの組織を、日常的に加工し、１０％中性バッファー 化ホルマリン中で固定し、そしてパラフィン内に包埋した。保管したブロックを ５ミクロンの薄片にスライスし、そしてポリ−し一リジン・コート・スライド上 に載せた。薄片を、Ｈｉｓｊｏｃｌｅａｒ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｄｉａｇｎｏｓ ｔｉｃｓ、　Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、　ＮＪ）中で脱パラフイン化し、等級エタ ノールを通して再水和させ、０．３％Ｈ２０２中で３０分間クエンチさせ、そし て５ｘ正常ヤギ血清により３０分間被覆した。プロナーゼ（ｐｒｏｎａｓｅ）（ ０，１％）（Ｓｉｇｍａ、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）中での１５分間の消 化の後、ヒトｖａｎ　Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ　Ｆａｃｔｏｒ、　（Ｆａｃｔｏｒ 　ｖ■Ｉ）（Ｄａｋｏ、　Ｓａｎ＋ａ　Ｂａｒｂａｒａ、　ＣＡ）に対するポリ クロナール・ウサギ抗体を、１：６００の希釈において９０分間室温において、 又は４℃において一夜、薄片に適用した。ＰＢＳ中で洗浄した後、この薄片を、 ウサギ免疫グロブリンに対するビオチン化ヤギ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ。

Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、　ＣＡ）と共に３０分間室温においてインキュベートし た。

ＰＢＳにより洗浄した後、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ複合体（ＡＢ ＣＥｌｉｔｅ、　Ｖｅｃｅｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を、製造者の指示 に従ってその薄片に適用した。このスライドを、０．０１％塩化ニッケルを含む ジアミノベンジジン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、　Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ、　 ＰＡ）を使用して顕色させ、黒色の反応生成物を作り、そしてメチル・グリーン により僅かに対比染色した。調整した薄片を、測定されるべき腫瘍の正確な領域 を測定するために、免疫組織学的に染色された調製物と比較するためのＨ＆Ｈに より、染色した。

実施例３ 定量的形態測定 血管計数を、コンピューター分析のための焦点面が同一の画像を得るために、複 合顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ、　Ｇａｒｄｅｎ　Ｃ１ｔｙ、　ＮＹ）であってビデオ・ チューブ（Ｏｐｔｅｃ、Ｉｎｃ、、　Ｌｏｗｅｌｌ、　ＭＡ）を介して外部画像 コントローラー（Ｄａｇｅ−ＭＴＩ　ＣＣＤ７２．　Ｍｉｃｈｉｇａｎ　Ｃ１ｔ ｙ、ＩＮ）をもつ白黒ＣＣＤビデオ・カメラと結合されているものを使用して、 行った。この画像を、内部フレーム捕獲ボード（ＰＩＰ６４０．　Ｍａｔｒｏｘ 　［！１ｅｃｔｒｏｎｉｃ　Ｓｙｓｔｅｍ、　Ｌｔｄ、。

Ｄｏｒｖａｌ、　Ｑｕｅｂｅｃ）及びマウス（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、　Ｒｅｄｍ ｏｎｄ、　ＷＡ）を備えたモデル３８６−２５　ＶＧＡ：Ｉンビューター（ＡＧ Ｉ　Ｃｏｍｐｕｔｅｒ　Ｉｎｃ、、　Ｆｒｅｍｏｎｔ、　ＣＡ）を使用してディ ジタル化した。この画像を、高分解能ＲＧＢディスプレイ・モニター（Ｓｏｎｙ 　Ｃｏｒｐ、　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ、　Ｐａｒｋ　Ｒｉｄｇｅ、　ＮＪ）上で 可視化した。ＯＰＴＩＭＡＳ画像分析ソフトウェア−・パッケージ（Ｂｉｏｓｃ ａｎ。

Ｅｄｒｎｏｎｄｓ、　ＷＡ）を、画像の対話式操作及びデータ収集のために使用 した。マクロは、添付資料Ａ中に記したものである。データ分析を、Ｅｘｃｅｌ 　ソフトウェア−（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ　Ｃｏｒｐ、、　Ｒｅｄａ＋ｏｎｄ、　 ＷＡ）を使用して行った。統計モデル化を、５ｐｓｓソフトウェア−・パッケー ジ（ＳＰＳＳＩｎｃ、、　Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ）を使用して行った。

コンピューター支援形態測定定量化の方法は、黒に染色された免疫応答性（血） 管と薄い対比染色剤（例えば、メチル・グリーン）により染色された背景との間 を区別する能力に基く。背景から前景を分離する限界レベルは、ディジタル画像 の肉眼検査によりオペレーターにより決定される。このシステムは、対話式であ り、顕微鏡下の視野を比較することによりオペレーターが画像を修飾することを 可能にし、これにより、内因性ペルオキシダーゼ又はスライド上の他の人工産物 により生じた非特異的な黒色スポットを”消す（ｅｒａｓｉｎｇ）”。また、穏 やかな免疫応答性の領域内のコントラストを、顕微鏡視野のオペレーターの評価 に適合するように増強する。陽性の免疫応答性と背景対比染色剤との間の最適区 別の限界レベルは、オペレーターにより設定され、そして灰色のスケール画像を 、黒色及び白色の２成分の画像に変換した。この２成分画像に、ツクトウエアー ”フィルター（ｆｉｌｔｅｒ）”を適用し、場合により一連の明確な点として現 れる単一の血管を取り除くように画像を僅かにぼかす回旋を平均化する３に３画 素グレースケールを形成し、そして単一の計数された対象中の単一画素の互いの ブレンド内に対象を形成する。

ずれをも結合させなかった。発色した前景対象（血管）を、次に、コンピュータ ーにより自動的に計数した。

徹底的な前立腺切開術の３２人ケース及びＴＵＲＰからの５ケースのそれぞれに おいて、５つの分野の癌腫を、５つの分野の良性前立腺組織と比較した。癌腫の 分野を、組織学の均一なＧｌｅａｓｏｎパターンに基づいて選んだ。このパラタ ーン内では、調査のために視野は、でたらめであり、そして特に高い又は低い微 細管計数をもつ病巣を測定する試みは全くなかった。真言組織及び前方の繊維筋 ソトロマを除外した後、また、良性組織の視野を、スライドを横切る単一方向に おいてそれぞれの他の視野をでたらめに含んで成るように選択した。

コンピューター支援定量化技術の正当性をテストするために、眼により得られた マニュアルの計数を、因子Ｖｌｌ＋に対する抗体と反応した前立腺組織の同一薄 片上で、コンピューター・システムにより得られた計数と、比較した。８つの異 なるケースからの２０の視野であって、良性及び悪性の両方の組織領域を含むも のを比較した。薄片を、２頭顕微鏡上で１００Ｘにおいて検査した。それぞれの 計数血管についての２つの観察により、同意に達した。この測定の後、同一領域 を、ＯＰＴＩＭＡＳソフトウェア−を使用して分析した。この画像アナライザー は、眼によるよりもかなり速く、そして非常に再現性がある。２つの方法を比較 した結果を、表２中に表す。［ａ］　＝０．０５のレベルにおいては、２つのデ ータ・セットの間に有意な差異は全く無かった。画像分析法において僅かに正の バイアスが在り、平均パーセント誤差は、＋２．８％であった。このパーセント 誤差の標準偏差は、７．９である。

表　２ 癌　２０４　２１３　９（４，４％） 良性　３７　３２　−５（−１３，５％）癌　２２６　２２５　１（−０，４％ ）癌　２０５　２０５　０ 癌　＋９５　１９５　０ 良性　８７　８２　−５（−５，８％）癌　８１　７２　−９（−１１，１％） 癌　８７　９３　６（６，９％） 癌　１７５　２０９　３４（１９，４％）良性　８４　７８　−６（−７，１％ ）良性　４２　４６　４（９，５％） 良性　８５　８５　０ 癌　１４３　１４２　−１（−０，７％）癌　１０４　１０４　０ 良性　１１８　１２５　７（５，９％）癌　１９８　２００　２（１，０％） 良性　１８０　２０６　２６（１４，４％）癌　１７２　１８５　１３（７，６ ％）癌　１０９　１１１　２（１，８％） 癌　２００　２０３　３　（１，５％）平均　１３６．６　１４０．６　４．０ （２，８％）１５の代表的な前立腺切開術試料において、癌腫の血管質を、コン ピューター支援形態計測定量化を使用してそれぞれの試料内の良性前立腺組織の 血管質と比較した（表３）。この微細血管密度は、それぞれのケースにおいて良 性領域内のよりも癌腫領域内でより高かったが、１つのケースにおいては、その 差異は、統計的に有意でなかった。

良性組織内の５　ｘ　１０−’＋＋１ｍ’当たりの微細血管の平均数は、７２（ ＳＤ・３０、９）であり、ケース当たり３４〜１０９のレンジであった。癌腫は 、平方ミリメーター当たり１３６の総平均微細血管計数をもっていた（ＳＤ＝４ ９．１）。良性組織と比べた癌腫内の血管の平均比は、２．０２（ＳＤ・０、６ ５）であり、そして全体として。癌腫の視野は、良性組織よりも有意に多い血管 があった（ｐ＜０．００１）。

表　３ １　癌（３）　６６　６．７ 良性　４８７．２１．３７　Ｐ＜、００５２　癌（３’）　１８０　２５．０ 良性　９２　５．５　１．９６　Ｐ　＜、００１３　癌（３）　１６３　４５． ８ 良性　１０３　２２．０　１．５８　Ｐ＜、０５４　癌（２）　１５０　３０． ２ 良性　１０９　１９．６　１．３８　Ｐ　＜、０５５　癌（３）　１０３　１６ ．４ 良性　４８　１０．４　２．１４　Ｐ＜、００１６　癌（４）　１３９　１２． ４ 良性　７８２５．６　１．７６　Ｐ＜、００１７　癌（３’）　１１２　１８． ７ 良性　３４　１３．４　３，２８　Ｐ　＜、００１８　癌（３）　１１０　１３ ．５ 良性　７８　３６．４　１．４１　ＮＳ９　癌（３）　１２４　４２．６ 良性　３８　９．０　３，１４　Ｐ＜、００５１Ｏ癌（３）　１７５　４８．６ 良性　９４　２２．２　１．８６　Ｐ　＜、０１１１　癌（２）　１３０　２６ ．０ 良性　８２　３０．２　１．６０　Ｐ　＜、００５１２　癌（２）　２０５　４ ０．１ 良性　９７　２３．７　２．１２　Ｐ＜、００１１３　癌（３）　８６　１４． ６ 良性　６６　７．１　１．３２　Ｐ＜、０５１４　癌（３）　２０４　２７．８ 良性　７６　２９．７　２．６８　Ｐ　＜、００１１５　癌（４）　９０　９． ３ 良性　３６　５．９　２．５３　Ｐ　＜、００１Ｂ、　境界内臓器（ｏｒｇａｎ 　ｃｏｎｆｉｎｅｄ）対転移前立腺癌腫の血管質コンピューター支援形態測定定 量化により測定された血管質を、１２３節又は骨及び／又は体の他の部分に転移 した前立腺癌腫の１３゛）代表的な試料（表４）と境界内臓器に残った１４の代 表的な前立腺繕腫試料（表５）との間で比較した。これらの試料を、徹底的な前 立腺切開術（ＲＰ）、又は尿道を通しての前立腺の切除（Ｔ）により得た。

境界内臓器ケースにおいては、癌腫は、慣用の組織病理学的検査方法により測定 されるように、完全に前立腺に閉じ込められていた。

転移ケースにおいては、癌腫は、患者のリンパ節（ＤＩ）、又は骨及び／又は患 者の体の他の部分（Ｄ２）のいずれかに転移していた。また、試料の組織学的等 級を、Ｇｌｅａｓｏｎ等級システムを使用して測定した。

転移ケースにおける全体としての微細血管密度は、境界内臓器ケースにおけるよ りもより高かった。転移ケースにおける５　Ｘ　１０−”ｍｍ’当たりの微細血 管の平均数は、平方ミリメーター当たり１３４微細血管であり、ケース当たり５ ５〜３０６のレンジにあった。境界側臓器癌腫をもつケースについての平均微細 血管密度は、１０６であり、５５〜１５０のレンジにあった。

表　６ 微細血管密度 病的段階　平　均　レンジ　旦 境界内臓器　８１．１９　４５．７−１１６．９　２０．３７陽性マージン　１ ０８．６７　８０．６−１４１．１４　１８．６８骨盤リンパ節転移　１１４． １７　９７．５−１５４．４　２７．１８骨格転移　１５４．６３　１２２．３ −２４０．９　５０．２０実施例４ ニードル生検試料内の癌腫前立腺組織の血管質ニードル生検試料を、超音波ガイ ダンスの下、スプリング充填生検ガンを使用した直腸を通しての生検により５人 の患者から得た。

６までのニードルを、その癌が適当にサンプリングされたことを確認するために それぞれの患者から得た。癌組織をもつ生検ニードルからの薄片を、薄片化し、 そして先の実施例１及び２の下に記載したように因子Ｖｌｌ＋について染色した 。さらに、Ｈ＆Ｈにより染色した薄片を、癌領域を決定するために使用した（実 施例１を参照のこと）。

癌領域内の血管質を、添付資料Ｂ中のマクロを使用してコンピューター支援形態 計測定量化により測定し、これは、不規則領域内の血管の計数を可能にし、そし てその計数をｌ闘２に標準化する。５人の患者からのデータを、表７中に示す。

表　７ ３２８８−９Ｉ　Ｃ／３　９６０．７９７１２０．４９１１４．５９Ｃ／３　７ ５０．６９０１０８．６９　８．３４２２０８−９１　Ｄ／３　８６０．７５４ １１４．１０１２５．７７Ｄ／３　９６０．９４４１０１．６８３１．５９Ｇ／ ３　６００．３７１１６１．５３ ６８５−９２１　Ａ／３　１３４０．７６３１７２．９８１５１．０１Ａ／３　 ８６０．７１１１２１．０１　２３．５１Ａ／３　７６０．５９８１３０．５０ Ｂ／３　１０２０．６０３１６５．８０Ｂ／３　９２０．５４６１６４．７４ 表７ 旧／４　９０　０．６８８４　１２９．２８　２．９０　２６．９３Ｅ／４　６ ９　０．８４７８　８２．５７　１１８．６０Ｅ／４　６８　０．５６７８　１ １９．７６　３１．３４Ｅ／４　４６　０．２９６７　１６５．７６Ｅ　／　４ 　９４　０．７８０９　１２６．７８Ｅ／４　９３　０．９４１８　９８．７５ Ｆ／４　７３　０．９６０７　７５．９９　９５．４０Ｆ　／　４　８１　０． ８６６８　９３．４５　２０．６８Ｆ／４　１２０　０．９０６７　１３０．１ ４Ｆ／４　９０　０．９７０７　９２．７２Ｆ／４　７２　０．８５０２　８４ ．６８１１６　１．０７６　１０７．８５　１４．９８　３６．１１Ｆ１５　１ ２２　０．７７７　１５７．０５　１５７．０５実施例５ 片化し、そして実施例１及び２中に記載したように因子Ｖｌｌ＋について染色し た。さらに、Ｈ＆已により染色した薄片を、癌領域を決定するために使用した（ 実施例１を参照のこと）。それぞれのケースについて、癌及び良性腫瘍の幾つか の分野における血管質を、添付資料Ａ中のマクロを使用してコンピューター支援 形態計測定量化により測定した。表８中に説明するように、微細血管密度は、結 腸、腎臓、及び胸について良性腫瘍領域内よりも癌領域内でより高かった。

結腸、腎臓、及び胸について、平均微細血管密度は、それぞれ、８９、５０．３ ８１．６７、及び１７３．７８血管／ｒｎｒｎ　２であった。対応する良性組織 については、平均微細血管密度は、それぞれ、５３．００．１４Ｂ、５０、及び １１６．７５血管／ｆｆ１Ｉ１１２であった。肺においては、微細血管密度は、 癌領域内よりも良性領域内でより高く、それぞれ、６８．３８及び２１２．３８ 血管／ｍｍ　”であった。

表　８ ％血管質：　計数： 組　織　スライド　癌　良　性　癌　良　性結腸３５７９−９１＃３　２．５０ 　１．１７　９２　５４２．４１　１．７１　７９　７７ ３５７９−９１＃ｌＯ１，９０１，３３７５３９３，０６５，５５１０８４３ ３，０７６，５９３３１ ３，８３２，２７１２６６３ ３６２３−９１Ａ９　１．２２　０．４０　７２　５１０．５７　０．３５　８ ９　４８ ０．７５　０．５２　８５　４４ ２８５３−９２　４．３６　０．６９　８３　５９３．４１　２．７５　７９　 ５８ ８．２７　３．１５　９３　６９ 平均　２．９５　２．２０　８９．５０　５３．００標準偏差　２．０５　２． ０２　１５．０９　１３．０９表−■ （続き） 腎臓１３８４−９１＃６　５．３２　０，７７　３３４　１１２５．９５　１． ０８　３８６　１００ 肺　２１９７−９２　１．４７　２．０９　１１２　１２７１．１８　１．７７ 　８８　１２４ １８８１−９１Ｄ２　３．５１　１１．６１　５１　３０８２．８２　８．１９ 　８９　２５９ 胸　１０４２−９０＃３　１．５５　０．９２　１３８　８５１．３１　１３２ °元の癌領域はｌ＋ｎｍ２未満でありデータを１ｍｍ”に標準化した。

以上から、本発明の特定の態様を説明の目的をもって本明細書中に記載したが、 様々な変更を本発明の核心及び範囲から逸れることなく行うことができるという ことが、理解できよう。したがって、本発明は、添付の請求項による以外では限 定されない。

添付資料Ａ ／″Ｔｈ１ｓ　Ｍａｃｒｏ　ｉｓ　ｄｅｓｉｇｎｅｄ　ｔｏ　ｃｏｕｎｔ　ｂｌ ｏｏｄ　ｖｅｓｓｅｌｓ　５ｔａｉｎｅｄ　ｗｉｔｈ　ａｎ狽堰|Ｆａｃｔｏｒ 　ＶＩＩＩ 凹ｔｉｂｏｃｌｙ。

“／ ＰｏｓｉｔｉｏｎＷｉｎｄｏｗぐ’Ｍａｃｒｏ”、４７３，１５３，１６８，１ ９８）；ＤａｚａＣｏｌｌｅｃｘｉｏｎ　（−１）；ＰｏｓｉｔｉｏｎＷｉｎｄ ｏｗぐＯＦｎＭＡＳ”、１０，１３，３６７．１００）；ＰｏｓｉｔｉｏｎＷｉ ｎｄｏｗ　（Ｄａｔａ”、　３９１．１３，９８，１１８）；Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｏｄｅ　＝　ＴＲＵＥ；ＡｈｅａＣＮＶＦａｃｔｏｒｓ［６］　＝　−１；Ａ ｒｅａＣＮＶＦａｃｔｏｒｓ［７］　＝　１；５ｅｔＥｘｐｏｒｔ　（ＡｒＡｒ ｅａ、１．ＴＲＴＪＥ）；５ｅｔＥｘｐｏｒｔ　（ＡＲＢｒｅａｄｔｈ、１．Ｔ ＲＵＥ）；５ｅｔＥｘｐｏｒｔ　（ＡｒＣｉｒｃｕｌａｒｉｔｙ、１．ＴＲＴＪ Ｅ）；５ｅｔＥｘｐｏｒｔ　（ＡｒＭａｊｏｒＡＸＪｓＬｅｎｇ＋ｈ、１．ＴＲ ＵＥ）；５ｅｔＥｘｐｏｒｔ　（ＡｒＰｅｒｉｍｅｔｅｒ、１　、ＴＲＵＥ）； ５ｅｔＥｘｐｏｒｔ　（ＡｒＲｅｃｔａｎｇｕｌａｒｉｔｙ、１．ＴＲＩＪＥ） ；／”　Ａｓｋ　ｔｈｅ　ｕｓｅｒ　ｔｏ　ｃｈｏｏｓｅ　ｔｈｅ　ｄａｔａ　 ｆｉｌｅ　”　／ＤａｔａＦｉｌｅぐｔｅｓｔ、ｏｐｓ”、ＴＲＵＥ）；Ｆｒｅ ｅｚｅ　□； ５ｅｌｅｃｒＦｕｌｌＳｃｒｅｅｎ□；Ｉｆ（Ｐｒｏｍｐｔ（”Ａｃｃｅｐｔ　 ｄｅｆａｕｌｔ　Ｒｅｇｉｏｎ　０ｆＩｎｔｅｒｅｓｔ？″））Ｃ１ｅａｒＳｃ ｒｅｅｎ□； ５ｅｌｅｃｔＲＯＩ（５００：　１２５０　：　１５００　：　２５０）；１ｓ ｅ Ｃ１ｅａｒＳｃｒｅｅｎ□； ５ｅｌｅｃｆＲＯＩ　□； ｃｌｅｌｔａ　＝　ＡＥＳ（ＲＯＩ０，１−ＲＯＩ［１，］）；ＲＯＩＡｒｅａ 　＝　ｄｅｌｔａ［０］　”　ｄｅｌｔａ［１］Ｔｈｒｅｓｈｏｌｃｌ□；　／ ’　ｆｉｒｓｔ山ｒｅｓｈｏｌｄ　”／Ｃｏｎｖｏｌｖｅ　（０，０：２０．９ ８９　：２８．０：０．０，３，３，１：１：１：１：１：１：１：１：１，９ ）；　／″３ｘ３　ａｖｅｒａｇｅ　ｆｉｌｔｅｒ　”／Ｃｒｅａ＋ｅＡｒｅａ 　（、、ＴＲＵＥ）；ＭｕｈｉｐｌｅＥｘｔｒａｃｔ□； ／　’　Ｅｌｉｍｉｎａｔｅ　ｄａｔａ　ｐｏｉｎｔｓ　ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ 　ｏｆ　ｔｗｏ　ｏｒ山ｒｅｅ　ｐｉｘｅｌｓ　”１０ｂｊｅｃｔＬｉｓｔ　＝ 　ＧｅｔＳｃｒｅｅｎｌｔｅｍＨａｎｄｌｅｓ□；ＢａｄＯｂｊｅｃｃｓ　＝　 ○ｂｊｅｃｔＬｉｓｔ［ｍＡｒＡｒｅａ＜０．５］；Ｃ１ｅａｒＳｃｒｅｅｎ（ ＢａｄＯｂｊｅｃｔｓ）；／／○ｂｊｅｃｔＷｉｌｄＣａｒｄＬｉｓｔ（”ｍ、 ”、２）；ＵｐｄａｔｅＡ１１Ｃ１ａｓｓＤａｔａ□；／″ＣａＪｃｕＪａｔｅ 　ｐｅｒｃｅｒｕ　ｖａｓｃｕｌａｒ　ａｒｅａ　ａｎｄ　ｔｏｔａｌ　ｃｏｕ ｎｔ、　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ａｒ■≠刀@ｔｏｕｃｈｉｈｇ山Ｃ ＲＯＩ″／ Ｐｅｒｃｅｎｔ　＝（（Ｓｕｍ　（ｍＡｒ／ｖｅａ）　）　／　ＲＯＬＡｒｅａ ）　”　１００ＭａｃｒｏＭｅｓｓａｇｅ　Ｃ％Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ａｒｅａ　 ＝　”、Ｐｅｒｃｅｎｔ、　”Ｘｎ　Ｔｏｔａｌ　Ｃｏｕｎｔ　＝″、Ｔｏ狽≠ 撃sａｌｌｙ）； ／’　Ｒｅｃａｌｃｕｌａ＋ｅ、　ｅｘｃｌｕｄｉｎｇ　ａｒｅａｓ　ｔｏｕｃ ｈｉｎｇ　ｔｈｅ　ＲＯＩ　”　／ＡｒｅａＣＮＶＦａｃ＋ｏｒｓ［６］　＝　 ］；ＣｒｅａｔｅＡｒｅａ　（、、ＴＲＵＥ）；ＭｕｌｔｉｐｌｅＥｘｔｒａｃ ｔ□； Ｃ１ａｓｓｉｆｙ　（）； ／　’　Ｅｌｉｍｊｎａｔｅ　ｄａｔａ　ｐｏｉｎｔｓ　ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ 　ｏｆ　ｔｗｏ　ｏｒ山ｒｅｅ　ｐｉｘｅｌｓ　”１０ｂｊｃｃｔＬｉｓ＋　＝ 　Ｇｅ＋５ｃｒｅｅｎｌ＋ｅｍＨａｎｄｌｅｓ　０１ＢａｄＯｂｊｅｃ＋ｓ　＝ ○ｂｊｅｃｔＬｉｓｔ［ｍ＃ＡＪｅａ＜０．５］；Ｃ１ｅａｒＳｃｒｅｅｎ（Ｂ ａｄＯｂｊｅｃＬｓ）；／／○ｂｊｅｃｔＷｉｌｄＣａｒｄＬｉｓｔ（”ｍ、” 、２）；ＵｐｄａｔｅＡｌＩＣＩａｓｓＤａｔａ□；ＭａｃｒｏＭｅｓｓａｇｅ 　（’Ｔｏｔａｌ　Ａｒｅａ　＝　”、　ＲＯＬＡｒｅａ、　”Ｘｎ　Ｔｏｔａ ｌ　Ｃｏｕｎｔ　＝　”、　Ｔｏ狽≠撃sａｌｌｙ）； “／ ＰｏｓｉｔｉｏｎＷｉｎｄｏｗぐ°Ｍａｃｒｏ”、４７３，１５３，１６８，１ ９８）；ＯｐｅｎＣｏｎｆ５ｇｕｒａｔｉｏｎぐ°Ｃ，１０ＰＴＴＭＡＳ３／Ｆ ＯＵＲＸ、ＣＦＧ”）。

Ｃａ１ｉｂｒａｔｅ　（ｆｏｕｒｘｃ記市）。

Ｍｕｌ＋ｉｐｌｅＭｏｄｅ　＝　ＴＲＵＥ；ＡｒｅａＣＮＶＦａｃｔｏｒｓ　＝ 　１０００．０　：　０．０００２６８０７５　：　−１，０：　６４．０１０ ００．０　：　０．００２６８１・−１，０：　１．０　：　−１，０；ＲＥＡ ＬｒＰＮＢＡｒｅａ； ｒＮＴＥＧＥＲ１Ｖｓｓｌ； ｒＮＴＥＧＥＲ１Ｖｓｓｌｃｏｒｒ； Ｃ）ＬＡＲｃＰＮＢｇｒａｄｅ； ５ｅｔＥｘｐｏｒｔ　（ＴｏｔａＪＴａｌｌｙ、　０．）；５ｅｔＥｘｐｏｒｔ 　（ＡｒＡｒｅａ、　Ｏ，）；Ｐｒｏｍｐｔ（”５ｅｌｅｃｔ　ａ　Ｄａｔａ　 Ｆｉｌｅ″）。

ＤａｔａＦｉｌｅ□； Ｌｏａｄ　Ｆｒ　ｏ　ｍ　０円−ｆｉｌｅ（”ｆｏｕｒｘ、ｃｆｇ”、　”ｆｏ ｕｒｘｃａＪ市°”）。

Ｃａ１ｉｂｒａｔｅ　（ｆｏｕｒｘｃａｌ市）。

Ｒｅｔｏｕｃｈｉｎｇ□； Ｐｏｓ出ｏｎＷｉｎｄｏｗ　ＣＲｅｔｏｕｃｈｉｎｇ”、　８，１３５．３０４ ．１９１）；ｗｈｉｌｅ　（Ｐｒｏｍｐｔ　（”Ｗｏｕｌｄ　ｙｏｕ　１ｉｋｅ 　ｔｏ　ｅｘａｍｉｎｅ　ａ　ｓａｍｐｌｅ９°°））ｃＰＮＢｇｒａｄｅ　＝ 　Ｐｒｏｍｐｔ　（”Ｅｔｕｅｒ　ＰＮＢ　１ｅｕｅｒ　（Ａ−Ｆ）　ａｎｄ　 ｇｒａｄｅ”、”ＣＨＡＲ”）；Ａｃｑｕｉｒｅ　（ＦＡＬＳＥ）； Ｃｏｎｔｒａｓｔ　（ＦＡＬＳＥ）； Ｆｒｅｅｚｅ　□； Ｐｒｏｍｐｔ　（”５ｅｌｅｃｔ　ａ　ｎｅｗ　Ｒｅｇｉｏｎ○ｆ　Ｉｎｔｅｒ ｅｓ＋”）；Ｃ１ｅａｒＳｃｒｅｅｎ□； ５ｅｌｅｃｌＲＯＩ□： Ｃｒｅａ＋ｅＡｒｅａ□： Ｅｘ＋ｒａｃｔ　□。

ｒＰＮＢ、Ａｒｅａ　＝　ＡｒＡｒｅａ；Ｔｈｒｅｓｈｏｂｊ□； Ｌｏ　＝　ＩｒｎＣｏｎｆｉｇＤａｔａ［３４］；／”　ｒａｎｇｅ　ｏｆ　ｔ ｈｒｅｓｈｏｌｄ　ｉｓ　５ｔｏｒｅｄ　ｈｅｒｅ　”　／Ｈｉ　＝　ＩｎｔＣ ｏｎｆｉｇＤａｔａ［３５］；ＣｒｅａｔｅＡｒｅａ　（、ＦＡＬＳＥ、　ＴＲ ＩＪＥ）；Ｔａ１ｌｙＥｘｐｏｒｔ□； １Ｖｓｓｌ　＝　ＴｏｔａＪＴａｌｌｙ；ｒＶｅｓｓｌ　＝　１Ｖｓｓｌ； ＭａｃｒｏＭｅｓｓａｇｅ　（’Ｔｏｔａｌ　Ａｒｅａ　＝　”、　ｒＰＮＢＡ ｒｅａ、”ｍｍ２”。

゛へｎＴｏｔａｌ　ｏｆ″、ｒＶｅｓｓｌ、　”Ｖｅｓｓｅｌｓ”、）；１Ｖｓ ｓｌｃｏｒｒ　＝　Ｐｒｏｍｐｔ　（”Ｅｎｔｅｒ　ｖｅｓｓｅｌ　ｃｏｕｍ　 ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ”、”ＩＮＴＥＧＥＲ”）；Ｅｘｐｏｒｔ　（ｃＰＮＢｇ ｒａｄｅ、１Ｖｓｓｌ、ｒＰＮ、Ａｒｅａ、１Ｖｓｓｌｃｏｒｒ）；Ｄｅｌｅｔ ｅ　（ｃＰＮＢｇｒａｄｅ、１Ｖｓｓｌ、ｒＰＮＢＡｒｅａ、１Ｖｓｓｌｃｏｒ ｒ）；Ｆｉｇｕｒｅ　Ｉ Ｆｉｇｕｒｅ　３ Ｆｉｇｕｒｅ　２ Ｆイｎｑｔｒｏ　Ａ Ｆｉｇｕｒｅ　５ ｉ 国際調査報告　ＤＩ−Ｔ／ＩＩ（ＱＶＯＯ４４９

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．患者内の前立腺癌腫の生物学的能力の推定方法であって：患者から得られた 前立腺癌腫の組織サンプルの血管質を定量し、そして、それからその前立腺癌腫 の生物学的能力を推定する、ことを含んで成る方法。
2. ２．組織サンプルが１以上のニードル生検試料から成る、請求項１に記載の方法 。
3. ３．組織サンプルが尿道を通しての前立腺の切除により得られた前立腺癌腫の１ 以上の組織薄片から成る、請求項１に記載の方法。
4. ４．組織サンプルが尿道を通しての前立腺の生検により得られた前立腺癌腫の１ 以上の組織薄片から成る、請求項１に記載の方法。
5. ５．組織サンプルが前立腺の部分的又は全体的な外科的摘出により得られた前立 腺癌腫の１以上の組織薄片から成る、請求項１に記載の方法。
6. ６．血管質の定量化の段階が組織サンプル内の血管成分のマニュアルの形態計測 定量化を含んで成る、請求項１に記載の方法。
7. ７．血管質の定量化の段階が組織サンプル内の血管成分のコンピューター支援の 形態計測定量化を含んで成る、請求項１に記載の方法。
8. ８．組織サンプルがニードル生検、尿道を通しての前立腺の切除、又は外科的摘 出により得られた１以上の、前立腺の癌腫の組織断片から成る、請求項１に記載 の方法。
9. ９．愚者内の選ばれた癌腫の生物学的能力の推定方法であって：ニードル生検、 内視鏡検査法、腹膜鏡検査法、及び膀胱鏡検査法から成る群から選ばれた方法に よりインビボにおいて癌腫から組織試料を得て；そして その生検試料の血管質を定量し、そして、それからその選ばれた癌腫の生物学的 能力を推定する、 ことを含んで成る方法。
10. １０．血管質の定量化の段階が生検試料内の血管成分のマニュアルの形態計測定 量化を含んで成る、請求項９に記載の方法。
11. １１．血管質の定量化の段階が生検試料内の血管成分のコンピューター支援の形 態計測定量化を含んで成る、請求項９に記載の方法。
12. １２．癌腫が、頭及び首の腫瘍、ＣＮＳ腫瘍、メラノーマ及び他の皮膚腫瘍、リ ンパ腫、柔組織肉腫、胸癌腫、嚢癌腫、膵臓癌腫、結腸癌腫、ｕｒｏｔｈｅｌｉ ａ１癌腫、精巣癌腫、子宮頸癌腫、子宮癌腫、腎臓癌腫、卵巣癌腫、肝臓癌腫、 肺癌腫、食道癌腫、及び胃癌腫から成る群から選ばれている、請求項９に記載の 方法。