JPH07501694A

JPH07501694A - 免疫グロブリン生産のアイソタイプ特異的抑制のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド

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Publication number: JPH07501694A
Application number: JP5509534A
Authority: JP
Inventors: チャン　ツェ　ウェン
Original assignee: タノックス　バイオシステムズ　インコーポレイテッド
Priority date: 1991-11-18
Filing date: 1992-11-18
Publication date: 1995-02-23
Also published as: CA2122132A1; EP0641353A4; AU3143993A; EP0641353A1; WO1993010138A1

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】免疫グロブリン生産のアイソタイプ特異的抑制のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド発明の背景ヒト及び多くの哺乳動物では、５つのクラスの免疫グロブリン、すなわぢＩｇＤ、）ｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＥが合成される。抗体モノマーはに及びλの２つのアイソタイプのいずれかである２つの同一のＬＲと、δ、μ、γ、α及び εの５つのアイソタイプの１つである２つの同一のＨｆｉとを有する。これらのアイソタイプのいくつかはサブクラスを有する０例えば、ヒトではγはγ１、γ ２、γ３及びγ４のサブクラスを有する。

抗体は、個々に固有の結合部位によって特徴づけられる非常に多様な結合特異性を有する。それぞれのＨ鎖及びＬ鎖は、それぞれに固有の可変領域セグメント並びにアイソタイプ及びサブクラスを規定する定常領域セグメントを有する。成熟し、免疫的に活性な静止Ｂ細胞はＨ６Ｉｋ及びＬ鎖の可変領域をコードする再構成された遺伝子を有し、従って、規定された抗原特異性を有する。しかしながら、活性化及びクローン的増殖の過程において、Ｂ細胞はさらに成熟する二とができ、５つのクラスの免疫グロブリンの１又は２以上を発現する細胞に分化することができる。この場合、それらの免疫グロブリンは全て同一の可変領域及び抗原特異性を有する。

同一の可変領域及び同一の抗原特異性をおそらく有することができる５つの抗体サブクラスは、異なる免疫機能を有し、免疫系関連疾患の病原性に異なる関与の仕方をする。ＴｇＭは５量体として存在し、多価であり、補体を有効に固定する。ＩｇＧは一般的に抗体依存性細胞毒性を媒介するのに最も有効であり、胎盤を通って胎児に入る。ＩｇＡは粘膜表面にとって最も重要である。ＩｇＥは、薬理学的媒介物質の遊離においてマスト細胞及び好塩基球の感作について主な役割を果たす、ＩｇＤはＢ細胞上に存在し、おそらくＢ細胞活性化過程において重要である。

５つの抗体サブクラスのうち、ＩｇＧアイソタイプは、リウマチ性関節炎、全身性紅斑性狼瘉、グレープス病、橋本甲状腺炎、重症性筋無力症、尋常性天庖癒及び中毒性血小板減少紫斑病のような自己免疫疾患における自己抗体として最も顕著に関与する。ＩｇＥはアレルギー性鼻炎、外因性喘息、薬物及び食品アレルギー並びにアトピー性皮膚炎を引き起こす直接型過敏症の主な原因である。

自己免疫疾患やアレルギー性疾患のようなある種の疾病を治療するためには４その疾病を引き起こす抗体を抑制することが望ましい、ＩｇＧは多くの自己免疫疾患の原因であり、ＴｇＥは直接型過敏症の主な原因であるので、抗体の抑制はアイソタイプ特異的であることが望ましい、そうすることによって、免疫系に対する悪影響を最少化することができる。アイソタイプ特異的抑制を研究するための多くの実験的な方法が提案されている。１つの方法は、アイソタイプ特異的すスイッチングに関与するリンホカインを阻害することを含む１例えば、ＩｇＥ合成を阻害する試みとして抗インターロイキン４モノクローナル抗体を用いた実験が行われている。もう１つの方法は、特定のアイソタイプを生産している標的Ｂ細胞に特異的な膜結合免疫グロブリンに対して特異的なモノクローナル抗体を用いることである６本発明は、特定のアイソタイプのｍＲＮＡ前駆体及びアイソタイプの特定のサブクラスをさえ標的にしたアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる。

アンチセンス技術は、ＲＮＡ又はＤＮＡの鍵となるセグメントに結合することができる、適正に設計されたオリゴヌクレオチド又はその類似体が細胞内に入ることができ、ｍＲＮＡ、その前駆体ＲＮＡ又はＤＮＡの重要な要素に結合し、そのＲＮＡ又はＤＮＡ種の機能を有効に阻害するという原理に基づく、＃乳動物においては、ＤＮＡは一般に２つの相補鎖から成る二重らせんとして存在し、ヒストンのような核タンパクと複合化し、極めて複雑であるが秩序立った構造ユニットを形成しており、この構造ユニットが集まって染色体を形成している。ＤＮＡ鎖は、側鎖の塩基、すなわち、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びグアニン（Ｇ）によって区別される、遺伝する何百万もの４種類のデオキシリボ核酸の配列である。ＤＮＡ鎖は機能的には信子もの遺伝子が直線状に延びたものであり、遺伝子のうちのいくつかは構造的なポリペプチドをコードし、また、他のいくつかは調節的な情報又は機能を担っている。

メツセンジャーＲＮＡはＤＮＡ中のセグメント、一般的には遺伝子の転写産物である、メツセンジャーＲＮＡは、Ａ、　Ｃ，Ｇ及びウラシル（Ｕ）塩基を有するリボヌクレオチドの配列である。＠乳動物においては、ＲＮＡは一般的に一本鎖であり、従って、二本ｔ［ＤＮＡの２つの鎖のいずれがのみのセグメントに対して相補的である。天然のｍＲＮＡ及びそれに相補的なりＮＡ鎖が［センス」鎖である。生体外又は生体内で合成された、人工的に設計されたセグメントが［アンチセンス」頗である。

二重らせんの各頗間又は［アンチセンス」セグメントとセンスセグメントとの間の相補性の化学的な基礎は、２本鎖における２つの隣接するＡとＴ　（ＲＮＡの場合にはり）及びＧとＣがそれぞれ安定な水素結合を形成することにある。ＤＮＡ及びＲＮＡ鎖は方向性を有しており、ヌクレオチドのりボシルモノサッヵライド背骨上の水酸基の結合により、５′末端及び３″末端と呼ばれる末端を有する転写過程（ＲＮＡの生産）において、一群の調節タンパク及び酵素が、遺伝子の調節領域において、ＤＮＡのセンス鎖をその相補鎖から分離し、ＲＮＡポリメラーゼがその遺伝子中のＤＮＡ配列に従ったＲＮＡ分子を組み立てることを可能にする。新たに合成されたＲＮＡ前駆体は他の一群のタンパク質及び酵素によって加工されて成熟ｍＲＮＡ種が形成される。これは次いで核から細胞質に輸送される。翻訳過程において、一群の調節タンパク質及び酵素がｍＲＮＡの５′末端付近の制御セグメントに結合し、ｍＲＮＡの配列に沿って（５′末端から３″末端に）情報を読み取り、アミノ酸を組み立てて固有のポリペプチド鎖を形成する［アンチセンスＪの概念を適用するにあたり、重要なウィルスタンパク質若しくは生産物又は発ガン性タンパク質（感染症及び癌において使用可能）の生産を阻害するオリゴヌクレオチドは、標的特異性により２つのカテゴリーに分類される。

　Ｃｏｈｅｎ、　Ｊ、Ｓ、　Ｔｒｅｎｄｓ　Ｐｈａｒｍ、　Ｓｃｉ、　ｌｏ：４３５（＋９８９）；　ＬｅＤｏａｎ、　Ｔ、　ｅｔ　ａ戟A　Ｂｕｌｌ。

Ｃａｎｃｅｒ　７６：８４９（１９８９）；　Ｔａｋａｙｍａ、　ＬＭ、　ａｎｄ　Ｉｎｏｕｙｅ、　Ｍ、　Ｃｒ１ｔ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏモ■■香A　Ｍｏｆ、　ｂｉｏｌ、　２５：ｌ５５（１９９０）；　Ｒｏｔｈｅｒｎｂｅｒｇ、　Ｍ、　ｅＬ　ａｌ、、　Ｊ、　ｎａｉｌ、　Ｃａｎｃｅｒ@Ｉｎ５ｔ、　８１：１５３９　（１９８９）；　Ｅｇｕｃｈｉ、Ｙ、ｅｔ　ａｌ、、八ｎｎ、Ｒｅｖ、ｂｉｏｃｈｅｍ、６０：６３１　（１９９１）　、　第P のグループはｍＲＮＡ又はＲＮＡ前駆体の制御領域を標的とし、ｍＲＮＡ種の適正な発現を妨害するものである。アンチセンス化合物は、前駆体ＲＮＡ転写物の正常な成熟を妨害することができ、前駆体ＲＮＡが機能的なｍＲＮＡになることを防止することができる。それらはまた、遺伝子の調節成分を妨害して翻訳過程に影響を与えることもできる。それらはまたｍＲＮＡの安定性に影響を与えてＲＮａｓｅに対する感受性を高めることもできる。アンチセンス化合物のもう１つのグループは遺伝子の調節領域を標的とするものであり、従って転写過程を阻害する。後者の場合には、ＤＮＡの２本鎖が開いた際にオリゴヌクレオチドがＤＮＡの一本の鎖に結合し、外見上「三重」構造を形成する。

オリゴヌクレオチドの類似体を合成する方法が開発されたために、医薬用途のアンチセンス技術がこ二２．３年でかなり進歩した０本来のヌクレオチドから合成されるオリゴヌクレオチドは、高度に帯電しているので、原形質膜を非常に通過しにくい、それらはまた血液中でのヌクレアーゼによる消化を非常に受けやすい、修飾オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートオリゴマー、メチルホスホネートオリゴマー、α−アノメリックオリゴマー及びその他を包含する。これらのオリゴヌクレオチドは相補的ＲＮＡ又はＤＮＡセグメントに対して同様に良くハイブリダイズする。しかしながら、それらは親水性がより低く、より親油性であるので、より有効に細胞内に入ることができる。それらはまた、本来のヌクレオチドに比べてヌクレアーゼによる開裂をはるかに受けにくい。

アンチセンス化合物を設計するための、前駆体ＲＮＡ又は成熟ｍＲＮＡ中のセグメントの同定については、　「有効な」標的セグメントを含むであろう多くの領域が存在する。多くのｍＲＮＡ及び前駆体ＲＮＡ標的を用いた実験に基づき、最も可能性の高い領域は５゛調節領域、スプライス部位及びｍＲＮＡの安定性を制御する３′末端非翻訳領域である。コード領域のセグメントでさえ、アンチセンス化合物の標的を与えることができる。広く用いられている１つの方法は、上述した領域の部分を覆う、１０〜２０ヌクレオチド長の数種のオリゴヌクレオチドを合成し、コードされるタンパク質の発現を阻害するか否かを試験することである。オリゴヌクレオチドが有意な阻害を示したならば、長さ及び領域内の位置をわずかに変えた更なるオリゴヌクレオチドを合成し、試験することができる。最適の効果を有するものが選択されるであろう。

一般的に、嘆乳動物においては、ＤＮＡ遺伝子はペプチド配列をコードするセグメント（エクソン）のみならず、分散した、非コードＤＮＡセグメント（イントロン）をも有する。転写においては、最初に転写されたＲＮＡは、５′末端の調節領域、エクソン及びイントロンを包含する全配列に対応するものである。二のＲＮＡ前駆体が一連の過程において加工される。すなわち、イントロンが切り出され、エクソンが連結されて成熟ｍＲＮＡが形成される。成熟ｍＲＮＡはポリペプチドをコードする連続的なコード配列を、５′末端及び３′末端に隣接する調節要素と共に含む。

ｍＲＮＡスプライシングのメカニズムは複雑である。これには、Ｕｌ及びＵ２を含有する小さなＲＮＡ−タンパク質複合物（ＩＪｌ、Ｕ２ｓｎＲＮＰ）が関与し得る。ＵＩＲＮＡはその５°末端に、エクソンの５′スプライス部位の９個のヌクレオチドから成るコンセンサス配列と完全に相補的な配列を有する。Ｕｌ−ｓｎＲＰが５′スプライス部位に結合することにより、５′スプライス部位が切断される。この切断は、ＡＴＰの加水分解を通じて行われ、イントロンの５′末端のＧ残基と、イントロンの３′末端の上流約３０ヌクレオチドの部位との間の、珍しい２’　−５’　ホスホジエステル結合の形成を伴う、これにより、中間的なＲＮＡの投げ織構造が形成され、ここでは必ずＡ残基が分岐点を形成する。

スプライス反応中に、Ｕ２ｓｎＲＮＰはイントロン分岐部位と会合し、一方、ＵｌｓｎＲＮＰは５′スプライス部位と相互作用し、さらに、いくつかの他の成分がｍＲＮＡ前駆体の３′スプライス部位に結合する。これらの全ての結合は、秩序立った経路に沿って組み立てられているように見える。ｌｌ１４乳動物のｍＲＮＡ前駆体のスプライシングにとって重要な信号は、スプライス部位に直接存在する、＠乳動物の遺伝子のイントロン配列の解析により、ｍＲＮＡ前駆体のエクソン−イントロン境界領域は非常に変異が少ないことが示されている。この保存された配列は一般的にｍＲＮＡスプライス部位であるとみなされ、これらは配列番号１及び２に示されている。

配列番号１には９個のヌクレオチドから成る５″スプライス位のコンセンサス配列が示されており、スプライス部位は３つ目のＧと４つ目のＧの間にある。

従って、９個のヌクレオチドのうち、３個がスプライス点よりも上流にあり、６個が下流にある。配列番号１の５′末端のＣはＡであってもよく、また、５′末端から６個目のＡはＧであってもよい。

配列番号２に関し、３″スプライス位は、ピリミジン塩基に富む種々の長さの（もっとも、常に１０ヌクレオチドを超える）領域を包含する。配列番号２ではＣはＴであってもよい、このピリミジンに富む領域の後には、スプライス点の上流にわずか３ヌクレオチド、下流に１ヌクレオチドから成るコンセンサス配列が続き、上記スプライス部位は３′末端の２個のＧの間にある。

３゛及び５゛スプライス位の両方において、保存配列はエクソン側よりもイントロン側に長く延び、それによって成熟ｍＲＮＡ配列に対する制約が最少化されていることに気づく。

Ｃ）１１領域中の３′スプライス部位の上流のイントロンの配列及びヒト免疫グロブリンγｌ、γ２、γ３、γ４、δ、ａｌ、α２、ε及びμの定常領域のエクソンの５°末端の配列がそれぞれ配列番号３．４．５．６．７．８，９．１０及び１１に示されている。

配列番号３，４．５．６．７．８．９．１０及び１１を調べると、３′イントロン−エクソン境界には常にＡＧジヌクレオチドが存在し１分岐点のＡは３′スプライス部位の３２残基上流（ＩｇＧ、ＩｇＤ及びＩｇＥの場合）又は３２残基上流（Ｉ　ｇＡの場合）又は３４残基上流（ＩｇＭの場合）に存在する。これらの不変的な残基の間には、異なるアイソタイプの免疫グロブリンではかなり異なっているヌクレオチド配列が横たわっている。５゛　スプライス部位と分岐点との間のイントロン配列はスプライス反応にとって不要であるので、スプライスをうまく妨害できるオリゴヌクレオチド配列は、３′スプライス部位の上流約３０ヌクレオチドの領域に対して相補的な配列であろう。

生殖系列の構造では、５０又はそれ以上の可変領域（Ｖ）の遺伝子群と、Ｈ鎖定常領域遺伝子の群とは異なる染色体上に存在する。Ｂ細胞の体細胞的成熟過程の間の、あるブレＢ細胞の段階でＶ遺伝子が定常領域遺伝子群と再構成される。

Ｈｉｎｄｓ、　Ｋ、Ｒ，とＬｉｔｍａｎ、　Ｇ、Ｗ、　Ｎａｔｕｒｅ　３２０：５４６（＋９８６）；　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、　Ｔ、に、　≠獅пO１ｔ、　Ｆ、Ｗ、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、　２３：６０５　（＋９８９）　、ヒトのＨ頗群はμ、δ、γ３、Ｙｌ、α１．　Ｙ２、γ４、ε及びα２の順に配列されている。　Ｆｌａｎａｇｏｎ、　Ｊ、Ｇ、とＲａｂｂ１ｔｔｓ、　Ｔ、Ｈ，Ｎａｔｕｒｅ　３００ニア０９　（１９８２）、さらなる成熟過程において、融合されたＶＤＪセグメントがγ、α又はεに切り換えられることがあり、この切り換えはあるＴ細胞因子及びまだ解明されていない他の因子によって制御される。このように、特定のアイソタイプ及びサブクラスを発現するＢ細胞では、ＶＤＪセグメントが特定のＨ鎖定常領域遺伝子セグメントに隣接している１例えば、ＩｇＧ１　を発現するＢ細胞では、ＶＤＪセグメントはγ１の定常領域遺伝子に隣接していると考えられている。

ゲノムの構造では、ペプチド配列をコードする領域はエクソンであり、これはイントロンによって分離されている。一般的に、Ｈ鎖免疫グロブリン遺伝子では、リーダー配列が小胞体における分泌シグナルとして働く、融合ＶＤＪセグメント、個々の定常領域ドメイン（ＣＨＩ、ＣＨ２及びＣＨ３並びにμ、ε、ＣＨ４を包含する）及び膜固定ペプチド領域は全て、イントロンによって分断された別々のエクソンにコードされる。δ頗については、免疫グロブリンのヒンジ領域はまた別のエクソンにコードされる。転写及び翻訳の制御領域は、リーダー配列のエクソンの５゛側に隣接する。転写終結配列は、膜エクソンの３″側に隣接する免疫グロブリンＨ鎖の転写過程中に、ゲノム構造の５′末端の制御領域から３′末端の転写終結シグナル配列までの全長に相補的なＲＮＡ転写物が生成される、このＲＮＡ前駆体は、スプライス過程においてイントロンが切り出され、ペプチドをコードするエクソンが連結されて成熟ｍＲＮＡとなる。このＲＮＡスプライシング過程において、あるエクソンの３″末端は次のエクソンの５″末端に連結される９例えば、融合ＶＤＪセグメントの３′末端はＣＨＩエクソンの５′末端に連結される。

上述のように、Ｂ細胞が成熟する過程において、同一のＶＤＪが種々のＨ鎖アイソタイプの定常領域遺伝子と再構成されることがある９本発明の１つの具体例においては、ＶＤＪエクソンとアイソタイプ特異的ＣＨＩエクソンとの連結が、ＣＨＩエクソンの５°側領域にあるスプライシング認識配列又はＣＨＩのスプライス部位に連結するアンチセンスオリゴヌクレオチドによって阻害される。以下、本発明をさらに説明する。

発明の概要本発明は、免疫グロブリン遺伝子の１又は２以上のＯＨ領域中の、特定の免疫グロブリンＨ鎖に対するｍＲＮＡ前駆体のスプライス認識領域に相補的なオリゴヌクレオチドを包含する。さらに詳細に説明すると、これらのオリゴヌクレオチドは、３゛スプライス位の上流で分岐点Ａ残基に向かう配列の一部に相補的か又は３′スプライス部位の上流及び下流の配列の一部に相補的である。オリゴヌクレオチドは一般的に、安定的に結合するために、これらの配列の少なくとも１２個の連続するヌクレオチドセグメントに対して相補的であるべきである。所望ならば、より長いセグメントを用いることもできる。

本発明のヌクレオチドは、配列番号３〜３３の下線部の一部又は全てに対して相補的であり、及び／又はこれらの部分のいくつかと３′スプライス部位の下流及びエクソン領域（太字で示す）のいくつかの部分と相補的である。下線部分は、オリゴヌクレオチドの保存領域を示す、これらの配列において、エクソンは太字で示されており、イントロンは通常のタイプ文字で示されている。３′　スプライス点は、これらの領域の境界である０分岐点Ａ残基もまた太字で示す。

これらのオリゴヌクレオチドはスプライス認識領域とハイブリダイズし、ｍＲＮＡの成熟を阻害するであろう、これは完全な免疫グロブリンをコードするｍＲＮＡの生成を妨害し、従って、ｍＲＮＡは機能する免疫グロブリンに翻訳されないであろう。

オリゴヌクレオチドは、生体外で、Ｂ細胞系又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）上でその活性を試験することができ、所望の特定のクラスの抗体の生産を阻害する能力があるか否かを決定することができる。オリゴヌクレオチドが有意な活性を持つことが示された場合には、標的セグメントを覆う長さの異なる更なるオリゴヌクレオチドを合成し試験することができ、生産物の候補として最適の長さ及び配列を選択することができる。

この開示は、種々の免疫グロブリン領域のスプライス部位を標的セグメントとしてアンチセンス化合物を設計することに焦点が当てられている。ｍＲＮＡ種の安定性を調節することが知られている。それぞれの抗体アイソタイプの３°非翻訳領域もまたアンチセンス化合物で調節するための魅力的な標的である。アンチセンス化合物のための効果的な標的を同定するための系統だった方法は、約１５ヌクレオチドの長さの重複するオリゴヌクレオチドを、３′非翻訳領域の全長にわたって合成することである。これらのオリゴヌクレオチドは、隣接するオリゴヌクレオチドと５ヌクレオチド以下互いに重複する。オリゴヌクレオチドを合成機で合成する方法は確立されているので、１０００ないし２０００ヌクレオチドの長さの遺伝子領域を覆う重複するオリゴヌクレオチドを合成することは容易である。これらのオリゴヌクレオチドは次いで、生体外でＢ細胞系又はＰＢＭＣに対して試験することができ、特定のクラスの抗体の生産を阻害する能力を有するか否かを決定することができる。最も良く生産を阻害するものが選択されるであろう。

生体治療のために本発明のオリゴヌクレオチドを適用する場合に、１度に１種類のオリゴヌクレオチドを適用することにより、特定のアイソタイプの免疫グロブリンのみを抑制することができる。これは、体液の免疫の１つのアイソタイプのみを選択的に削除して治療を行うことができるので有利である。あるいは、異なる特異性を有する数種のオリゴヌクレオチドを用いて総合的な体液免疫抑制を引き起こすこともできる。

この選択的な免疫グロブリンアイソタイプの抑制は、自己免疫疾患およびアレルギーの治療に相応しい、ＩｇＧおよびＴｇＭは、自己免疫疾患、とりわけリウマチ性関節炎に付随している。ＩｇＧ及び／又はＩｇＭの生産を抑制することはリウマチ性関節炎の治療に有用であり、そしておそらくまた、全身性紅斑性狼狽、強皮症および重症性筋無力症を包含する他の自己免疫疾患の治療にも有用であろう。

直接型過敏症クラスのアレルギーは全てＩｇＨにより媒介される８本発明の適当なオリゴヌクレオチドを用いてＩｇＥを抑制することによりアレルギー反応が阻害され又は防止されるであろう。

本発明のオリゴヌクレオチドのもう１つの用途はモノクローナル抗体の生産である。オリゴヌクレオチドは、不死化セルラインとの融合の前に免疫動物から抽出されたＢ細胞による、又は融合後のハイプリドーマによる種々の免疫グロブリンアイソタイプの生産を選択的に阻害するために用いることができる。これによす、特定の所望のアイソタイプの免疫グロブリンの生産又は特定のアイソタイプの免疫グロブリンの生産の防止が可能になる。その結果、これらのアイソタイプのモノクローナル抗体は生産されないであろう。

好ましい態様の詳細な説明本発明は、多数の臨床症状を治療するために、アイソタイプ特異的に抑制することを達成するアンチセンス化合物に関する。免疫グロブリンの５″調節領域および可変領域は非常に変異しており、かつ、特定のアイソタイプについて固有のものではないので、これらの領域はアンチセンス化合物の標的としては適当ではない。

免疫グロブリンｍＲＮＡ又は前駆体ＲＮＡにおける最も適当な標的はスプライス部位および３″末端非翻訳領域である。コード領域および非翻訳領域の他の領域もまたアイソタイプによる妨害の標的を提供するがもしれない、これらの他の領域ははるかに長いので、精密に標的領域を決定するためにより多数のオリゴヌクレオチドが必要になるかもしれない。

標的セグメントを同定し、該セグメントに対するアンチセンス化合物を設計する方法の例として、ヒトε鎖の３′末端非翻訳領域を考えることができる。配列番号３４に示される、第４の定常領域の末端にある停止コドンＴＧＡとポリＡシグナルトノ間の領域は１２６ヌクレオチド長である。　５ｅｎｏ　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　ｌｌニア１９−７２７　（１９８３）、長さが１５ヌクレオチドで、５ヌクレオチドずつ重複する２３種類の相補的オリゴヌクレオチドのセットを合成する。これらのオリゴヌクレオチドを、０．１〜２００μｇ／ｍｌの濃度で５ＫＯ−００７細胞（ＡＴＣＣ、メリーランド州ロックビル）に作用させることにより、ＩｇＨの生産に対する効果を試験する。これらのＩｇＥ発現細胞を、阻害剤の候補と共に１〜３日間インキュベートし、培地に分泌されたＩｇＥを２例えばＳｕｎ　Ｌ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　１４６：　１９９−２０５（１９９１）に記載されたような標準的なＩｇＥ　ＥＬＩＳＡにより分析する。この試験はまた。高血清ｒｇＥ（アトピー患者）から分離したＰＢＭＣを用いることによっても行うことができる。

あるオリゴヌクレオチド又は隣接するオリゴヌクレオチドが５ＫＯ−００７細胞によるＩｇＥ合成の阻害を引き起こしたならば、それによって有効な領域が同定される１次いで、１０〜１２ヌクレオチド長で１個か２個だけ重複する、同定された領域を覆う更なるオリゴヌクレオチドのセットを合成し、ＩｇＥ生産に対する効果を試験する。そうすることにより、最適の配列および長さを有するセグメントを同定することができる。より高い親油性およびＲＮａｓｅに対する抵抗性を有する、オリゴヌクレオチドの類似体を合成し、試験することもできる。このようにして、最適のオリゴヌクレオチドを同定することができる。

ε遺伝子の他の領域および他の免疫グロブリンアイソタイプの抑制のためのアンチセンスを見つけるために同様な系統的方法を行うこともできる。同様な方法はまた、γ頗の４つのサブクラスの３゛末端非翻訳領域を標的にするアンチセンス化合物の設計にも用いることができる。ＡＴＧ停止コドンとＡＡＴＡＡシグナルの間の領域は、γｌ　（配列番号３５）では１００ヌクレオチド長であり、γ２、γ３およびγ４では１０１ヌクレオチド長である（それぞれ配列番号３６．３７．３８　）　、　Ｈｕｃｋ　Ｓ、　ｅｔ　ａｔ、、　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　１４：１７７９−１７８９　（１９８６）参照、■ れらの領域は、４つのサブクラス間でわずか２．３のヌクレオチドが相違しているだけである。それぞれのサブクラスに対する１８種類のオリゴヌクレオチドのセットを合成することができ、この場合、オリゴヌクレオチドのほとんどはサブクラス間で共用することができる。これらのオリゴヌクレオチドは、ＩｇＧの特定のサブクラスを分泌するセルラインを阻害する能力について試験することができる。

本発明のアンチセンス化合物はまた、スプライス部位又はスプライシングに関わることが知られているセグメントをも標的にする。これらのオリゴヌクレオチドは、配列番号３ないし３３の下線部分の領域の少なくとも連続する約１２ヌクレオチドに対して相補的である。配列番号３〜１１で表される配列については上述のとおりである。配列番号１２．１３．１４及び１５は、それぞれ、γｌ、γ２、γ３及びγ４のＣＨ２領域の３″スプライス位の近傍のイントロン及びエクソン配列である。配列番号１６．１７．１８及び１９は、それぞれ、γｌ、γ２、 γ３及びγ４のＣＨ３領域の３′スプライス部位の近傍のイントロン及びエクソン配列である。配列番号２０及び２１は、それぞれ、δのＣＨ２及びＣＨ３領域の３′スプライス部位の近傍のイントロン及びエクソン配列である。配列番号２２及び２３は、それぞれ、δのヒンジｌ及びヒンジ２領域の３°スプライス部位の近傍のイントロン及びエクソン配列である。配列番号２４及び２５は、それぞれ、αｌのＣＨ２領域及びＣＨ３領域の３′スプライス部位の近傍のイントロン及びエクソン配列である。配列番号２６及び２７は、それぞれ、α２のＣＨ２領域及びＣＨ３領域の３′スプライス部位の近傍のイントロン及びエクソン配列である。配列番号２８．２９及び３０は、それぞれ、εのＣＨ２領域、Ｃ，）（３領域及びＣＨ４領域の３°スプライス部位の近傍のイントロン及びエクソン配列である。配列番号３１．３２及び３３は、それぞれ、μのＣＨ２領域、ＣＨ３領域及びＣＨ４領域の３′スプライス部位の近傍のイントロン及びエクソン配列である。エクソンは太字で、イントロンは通常のタイプ文字で示されている。３″ スプライスはこれらの領域の境界点である０分岐点Ａ残基もまた太字で示されている。

一般に１本発明のオリゴマーの長さは約１２ヌクレオチドと短くても良いが、１５ヌクレオチドが好ましい、上述のように、本発明のオリゴマーは３°スプライス部位の上流（配列表の下線部分）のセグメント及び／又はこのセグメントの一部及び３′スプライス部位の下流セグメントの連続部分（配列表で太字で示す）とハイブリダイズする。従って、本発明のオリゴヌクレオチドはＲＮＡ　（ＤＮＡのＴに代えてＵを有する）又はＤＮＡのいずれであっても良い。

本発明のオリゴヌクレオチドは、３″スプライスの上流３２又は３５ヌクレオチドの全体とハイブリダイズするものであっても良いし、さらには３゛スプライスの下流部分とさえハイブリダイズするものであっても良い、もつとも、これらはまた、１２ヌクレオチド又は１２ヌクレオチド未満の長さであっても良い、短いオリゴヌクレオチドもまた、３′スプライス点の上流のみを包含するものであっても良いし、上流部分と下流部分（エクソン）の一部を包含するものであっても良い、１２ヌクレオチドよりもはるかに短いセグメントの欠点は、安定にハイブリダイズしないかもしれないことである。１５ヌクレオチドよりもはるかに長いセグメントの欠点は、合成の費用が高いこと及び細胞膜を通って細胞質に入ることが容易ではないかもしれないことである。

本発明のオリゴヌクレオチドは全て、例えばＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　３８ＯＡ合成機等のこの分野において周知の技術により合成することができる。

上述のように、本発明のオリゴヌクレオチドは、自己免疫疾患及びアレルギーの治療並びに体液性免疫抑制を引き起こすのに有用である。自己免疫疾患の治療のためには、配列番号３．４．５．６．１１．１２．１３．１４．１５，１６．１７．１８．１９．３０．３１．３２及び３３の適当な部分に相補的なオリゴヌクレオチドが好ましい、なぜなら、これらはＩｇＧ及びＩｇＭの生産を抑制するであろうからである。ＩｇＧについては、ＣＨＩ領域をコードする配列（配列番号３．４．５．６）と、ＣＨ２領域をコードする配列（配列番号１２．１３．１４．１５）の間にヒンジ領域遺伝子が存在する。３°スプライス部位の上流のヒンジ領域配列の部分、または３′スプライス部位の上流及びこれと連続する下流部分と相補的なオリゴヌクレオチドもまた本発明のオリゴヌクレオチドとして用いることができるであろう。

アレルギー治療のためには、配列番号１０．２７．２８及び２９の適当な部分に相補的なオリゴヌクレオチドが用いられるであろう、なぜなら、これらはＩｇＥの生産を抑制するからである０体液性免疫抑制を読起するためには、配列番号３〜３３の適当な部分に相補的なオリゴヌクレオチドが用いられるであろう、なぜなら、それらは全ての免疫グロブリンの生産を抑制するからである。上述のように、投与されるオリゴヌクレオチドは、それが標的セグメントに相補的でこれとハイブリダイズできる限り、ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれであっても良い。

本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾することな（生体外及び生体内で用いることができる。あるいは、それらの疎水性を高めてより親油性にするために、それらを化学的に修飾することもできる０例えば、それらをホスホロチオエート、メチルホスホネート又はαアノメリックオリゴヌクレオチドに代えることができる。これらの修飾を行う方法はこの分野において周知である。

本発明のオリゴヌクレオチドを生体内で用いるためには、大過剰量のオリゴヌクレオチドを患者に投与することができる。それらは静脈内投与により、そしておそらく経口的に投与することが可能であろう、投与量は容易に計算することができる。抑制したいアイソタイプに応じて、当該アイソタイプを生産するＢ細胞の合計数を計算することができ、個々のＢ細胞の適当な遺伝子セグメントに結合する十分な量のオリゴヌクレオチドを次いで投与する。

本発明のオリゴヌクレオチドを生体外で、すなわちモノクローナル抗体の生産において用いる場合には、抑制したいアイソタイプを生産するＢ細胞を抑制するのに十分な量のオリゴヌクレオチドが投与されるであろう、ハイプリドーマを生産するために不死化セルラインと融合する前にこれを行うことが好ましい、もつとも、これは融合後に行うこともできる。

上述の用語及び表現は説明のためのものであって、限定的なものではなく１本発明は、下記のクレームにおいてのみ定義され、これらのクレームのあらゆる均等な主題を包含する。

配列表（１）一般情報（ｉ）　出ＩＮ人：チャン・ツエ・ウエン（１、発明の名称：免疫グロブリン生産のアイソタイプ特異的抑制のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ｉｉｉ）配列の数：３８（ｉｖ）あて名（Ａ）名宛人：タノソクス・バイオシステムズ・インコーポレーテ・ノド（Ｂ）番地ニステラ　１ルク　ロード　１０３０１（Ｅ）国、米国（Ｆ）郵便番号＋７７０２５（Ｖ）コンピューター読み取り可能形態（Ａ）媒体タイプ、３．５インチディスケ・ノド（Ｂ）コンピューター：ＩＢＭ　ＰＳ／２（Ｃ）オペレーティングシステム：ＤＯ３３，３０（Ｄ）ソフトウェア、ワードパーフェクト５．１（ｖｉ）本願のデータ：（Ａ）出願番号・（Ｂ）出願口：（Ｃ）分類４（ｖｉｉ）先願のデータ（Ａ）出願番号二〇７７９４．３９５（Ｂ）出願口：　１Ｌ１８９１（ｖｉｉｉ）代理人情報：（Ａ）氏名　エリツク・ピー・ミラヘル（Ｂ）登録番号・３１．２１１（Ｃ）整理番号：　ＴＮＸ９１−６−ＰＣＴ（ｉｘ）電話連絡情報（Ａ）電話・（７１３）６６４−２２８８（Ｂ）ファクシミリ：　（７１３）６６４−８９１４（２）配列番号１についての情報（ｉ）配列の性質（＾）長さ：９ヌクレオチド（Ｂ）型、核酸（Ｃ）鎖の数二二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｌ）配列：配列番号ＩＣＡＧＧＴＡＡＧＴ　９（２）配列番号２についての情報（ｉ）配列の性質（＾）長さ：４ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数二二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号２ＡＧＧ　４（２）配列番号３についての情報（１）配列の性質（Ａ）長さ　５５ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数二二本鎖（Ｄ）トポロジー二面鎖状（ｘｌ）配列：配列番号３（２）配列番号４についての情報（１）配列の性質（＾）長さ：５５ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数二二本鎖（Ｄ）トポロジー、直鎖状（ｘｉ）配列・配列番号４（２）配列番号５についての情報（１）配列の性質（Ａ）長さ　５５ヌクレオチド（Ｂ）型　核酸（Ｃ）鎖の数、二本鎖（Ｄ）トポロジー　直鎖状（２）配列番号６についての情報（１）配列の性質（Ａ）長さ　５５ヌクレオチド（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖の数、二本鎖（Ｄ）トポロジー　直鎖状（ｘｌ）配列：配列番号６（２）配列番号７についての情報（ｉ）配列の性質（＾）長さ：５５ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数・二本鎖（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｘｌ）配列：配列番号７（２）配列番号８についての情報（１）配列の性質（Ａ）長さ・５５ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数二二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号８（２）配列番号９についての情報（ｉ）配列の性質（Ａ）長さ＝５５ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列・配列番号９（２）配列番号ＩＯについての情報（１）配列の性質（Ａ）長さ・５４ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数、二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｌ）配列：配列番号１０（２）配列番号１１についての情報（１）配列の性質（＾）長さ、５６ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数二二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号１１（２）配列番号１２についての情報（１）配列の性質（Ａ）長さ＝５５ヌクレオチド（Ｂ）型、核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー６直鎖状（Ｘｌ）配列・配列番号１２（２）配列番号１３についての情報（ｉ）配列の性質（Ａ）長さ・５２ヌクレオチド（Ｂ）型、核酸（Ｃ）鎖の数二二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｌ）配列・配列番号１３（２）配列番号１４についての情報（ｉ）配列の性質（＾）長さ：５５ヌクレオチド（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖の数、二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号１４（２）配列番号１５についての情報（１）配列の性質（Ａ）長さ＝５５ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数　二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｌ）配列・配列番号１５（２）配列番号１６についての情報（ｉ）配列の性質（＾）長さ＝５４７クレオチド（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖の数・二本鎖（Ｄ）トポロジー　直鎖状（Ｘｌ）配列：配列番号】６（２）配列番号１７についての情報（１）配列の性質（＾）長さ・５５ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数二二本鎖（Ｄ）トポロジー　直鎖状（ｘｉ）配列・配列番号１７（２）配列番号１８についての情報（１）配列の性質（Ａ）長さ：５５ヌクレオチド（Ｂ）型、核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｌ）配列：配列番号１８（２）配列番号１９についての情報（１）配列の性質（＾）長さ、５５ヌクレオチド（Ｂ）型　核酸（Ｃ）鎖の数二二本鎖（Ｄ）トポロン−直鎖状（ｘｌ）配列　配列番号１９（２）配列番号２０についての情報（１）配列の性質（Ａ）長さ・５５ヌクレオチド（Ｂ）型、核酸（Ｃ）鎖の数二二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｌ）配列：配列番号２０（２）配列番号２１についての情報（１）配列の性質（＾）長さ：５５ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー　直鎖状（ｘｉ）配列・配列番号２１（２）配列番号２２についての情報（ｉ）配列の性質（Ａ）長さ＝５５ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数二二本鎖（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｘｉ）配列・配列番号２２（２）配列番号２３についての情報（ｉ）配列の性質（Ａ）長さ＝５５ヌクレオチド（Ｂ）型・核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列・配列番号２３（２）配列番号２４についての情報（１）配列の性質（＾）長さ・５５ヌクレオチド（Ｂ）型、核酸（Ｃ）鎖の数二二本鎖（Ｄ）トポロジー　直鎖状（ｘｌ）配列・配列番号２４（２）配列番号２５についての情報（１）配列の性質（＾）長さ：５５ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数、二本鎖（Ｄ）トポロジー・直鎖状（Ｘｌ）配列、配列番号２５（２）配列番号２６についての情報（１）配列の性質（＾）長さ・５５ヌクレオチド（Ｂ）型　核酸（Ｃ）鎖の数二二本鎖（Ｄ）トポロジー　直鎖状（ｘｉ）配列、配列番号２６（２）配列番号２７についての情報（１）配列の性質（Ａ）長さ：５５ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号２７（２）配列番号２８についての情報（ｉ）配列の性質（Ａ）長さ、５５ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｌ）配列、配列番号２８（２）配列番号２９についての情報（ｉ）配列の性質（Ａ）長さ＝５５ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｌ）配列；配列番号２９（２）配列番号３０についての情報（ｉ）配列の性質（Ａ）長さ：５５ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数二二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（Ｘｌ）配列　配列番号３０（２）配列番号３１についての情報（１）配列の性質（Ａ）長さ、５８ヌクレオチド（Ｂ）型　核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー、直鎖状（ｘｌ）配列、配列番号３１（２）配列番号３２についての情報（ｉ）配列の性質（＾）長さ、５７ヌクレオチド（Ｂ）型　核酸（Ｃ）鎖の数・二本鎖（Ｄ）トポロジー°直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号３２（２）配列番号３３についての情報（ｉ）配列の性質（Ａ）長さ・５６ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数二二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号３３（２）配列番号３４についての情報（ｉ）配列の性質（Ａ）長さ：１２６ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数、二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号３４（２）配列番号３５についての情報（１）配列の性質（Ａ）長さ：１００ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｌ）配列：配列番号３５（２）配列番号３６についての情報（ｉ）配列の性質（Ａ）長さ＝１０１ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数二二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号３６（２）配列番号３７についての情報（ｉ）配列の性質（Ａ）長さ：１０１ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列：配列番号３７（２）配列番号３８についての情報（ｉ）配列の性質（＾）長さ、１０１ヌクレオチド（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数、二本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｉ）配列；配列番号３８

Claims

【特許請求の範囲】

１．特定の免疫グロブリンＨ鎖のｍＲＮＡ転写物前駆体のスプライス認識領域に相補的なオリゴヌクレオチド。
２．ＲＮＡ又はＤＮＡである請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
３．ＣＨエクソンの上流約３０ヌクレオチドまでの領域、ＣＨのイントロン−エクソンスプライス部位の上流約３０ヌクレオチドまでの領域又はＣＨエクソン若しくはイントロン−エクソンスプライス部位の上流及びそれに連続する下流領域の連続する少なくとも１２ヌクレオチドに対して相補的な請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
４．ＣＨエクソンがＣＨ１である請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
５．免疫グロブリンＨ鎖がε、α又はμである請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
６．オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエート、メチルホスホネート、α−アノメリックオリゴマー又は他のタイプの疎水化オリゴマーである請求項１記載のオリゴヌクレオチド。
７．配列番号３〜１１の下線部分の連続する少なくとも１２ヌクレオチド、又は下線部分の一部とこれに連続する太字部分のセグメントに対して相補的な請求項４記載のオリゴヌクレオチド。
８．配列番号８、９、１０、１１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０３１、３２又は３３の下線部分の連続する少なくとも１２ヌクレオチド，又は下線部分の一部とこれに連続する太字部分のセグメントに対して相補的な請求項５記載のオリゴヌクレオチド。
９．配列番号３、４、５、６、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９の下線部分の連続する少なくとも１２ヌクレオチド、又は下線部分の一部とこれに連続する太字部分のセグメントに対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む、ＩｇＧ生産の抑制を引き起こすための組成物。
１０．配列番号１１、３０、３１、３２又は３３の下線部分の連続する少なくとも１２ヌクレオチド、又は下線部分の一部とこれに連続する太字部分のセグメントに対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む、ＩｇＭ生産の抑制を引き起こすための組成物。
１１．配列番号１０、２７、２８又は２９の下線部分の連続する少なくとも１２ヌクレオチド、又は下線部分の一部とこれに連続する太字部分のセグメントに対して相補的なオリゴヌクレオチドを含む、ＩｇＥ生産の抑制を引き起こすための組成物。
１２．請求項１のオリゴヌクレオチドを投与することから成る特定の免疫グロブリンアイソタイプの生産を抑制する方法。
１３．請求項８、９、１０又は１１のオリゴヌクレオチドの１又は２以上を投与することから成る請求項１２記載の方法。