JPH07500003A - 顆粒球細胞数を計測するための診断キットおよび方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 顆粒球細胞数を計測するための診断キットおよび方法〔他の出願に対する関係〕 本出願は、１９９１年７月９日提出の出願番号０７／７２７．５８２の一部継続 出願である。

〔発明の分野〕

本発明は、（１）血液試料中に顆粒球が存在しているかどうかを測定するため、 および顆粒球細胞数の計測を行うための新規改良方法、並びに　（ｂ）それらの 測定および分析を行なうための新規キットに関する。

〔発明の背景〕

身体にとって、血液は化学的輸送およびコミュニケーションシステムとして働く 。血液は、構造的および機能的に多様化した多くの細胞成分を含んでいる。その 主要成分は、赤血球、血小板および白血球細胞または白血球である。これらの成 分は、細分化され、顆粒球は白血球の主要分画を含む。顆粒球は生命に必要な成 分で、感染に対して身体の防御を与える。体の感染に対する特徴的な反応のひと つは、白血球数の上昇である。感染には通常白血球数の増加が伴うけれども、特 にバクテリアの侵入が多量であったり、または作因がウィルスであれば低下も起 こりうる。このような白血球数低下は通常は骨髄の一般的な機能低下による。

異なった効果の治療特質をもつ数種の薬が、稀ではあるが生命を脅かす可能性の ある複合となり、骨髄により生産される顆粒球を阻止するようになる。多くの場 合、有毒な副作用が生じる事態は予測不可能であり、重篤な臨床的合併症が発現 するまでは明かにならない。従って、顆粒球形成にける減損を初期に認識するこ とと、適切な防御手段の必要性を警告することが、顆粒球形成を妨害する可能性 があることが知られた薬物を使用する際の危険性を大きく減少させることになろ う。

顆粒球ポピユレーションにおける優勢な成分は、好中球または多形核白血球であ る。好中球は、オプソニンとして知られる蛋白で目標物を予め被覆することによ り促進される食作用によって、外来粒子、例えばバクテリア細胞を飲み込む。

この初期段階に続いて、生物分解酵素および酸素の化学的反応物との複合作用を 伴う細胞内工程によって、飲み込まれた種の分解が起こる。

酸素の反応性生成物が形成される際の重要な成分は、好中球のマーカとして使用 されてきた酵素のミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）である。代謝作用で生成さ れた過酸化水素の存在下で、ＭＰＯが細胞内塩素イオンに作用して次亜塩素酸を 生成し、その次亜塩素酸が外来粒子を分解する。

重要な白血球疾患には主に、白血球の機能的特徴の変化、あるいは循環している 白血球の数における変化の何れかが伴われる。前者の一例は慢性の肉芽腫性疾患 であり、この疾患において顆粒球は、所謂「呼吸的破裂（ｒｅｓｐｉｒａｌｏｒ ７　ｂｕｔｇｌ）　Ｊにおける反応性酸化体種（これは、通常は食細胞によって に飲み込まれた微生物を分解する）を生成する能力の減退を示す。肉芽腫性疾患 に罹患した個人は感染と戦う事が出来ないため通常は天折する。

成る場合には、顆粒球数は通常は感染または白血病状態にともなって増加するよ うだ。逆に、顆粒球数が正常に比べて減少する臨床状態も起こる。このような顆 粒球の減少状態が、薬物または疾病に関連して、感染に対する身体防衛に起こる 変化の最も多い原因である。このような疾患の極端な形態である無顆粒細胞症は 、循環している好中球の数が重篤かっ選択的に減少するのが特徴的であり、患者 を重篤かっ生命を脅かす可能性すらある感染に罹患し易くさせる。如何なる形態 の顆粒球欠乏も重篤な臨床的結果を招く可能性があり、これを初期に同定するこ とは、その欠乏のもたらす結果を防止するために決定的に重要である。

白血球細胞数は、臨床医学において最も一般的に得られる検査値の一つである。

全細胞数は、臨床分析検査室で利用可能な自動電気的装置を使用して得られる。

個々の血液細胞型の定墓的評価（差別化計測）は、染色した血液塗抹標本の手動 顕微鏡的検査によりて、またはコールタ（Ｃｏａｌｌ！ｒ）カウンタ等の自動的 システムによって行われる。しかし、白血球細胞テストを行なうためには、患者 が医者を訪れることが要求され、７ミリリツトルの静脈血液試料が必要とされ、 検査結果を得るまでに最高で３日待たなければならない。不便さに加え、テスト 結果の遅れは患者の経過予測に重大な影響をもたらし得る。

これらの短所は、臨床医学において白血球細胞計測が多分最も一般的に入手可能 な検査値であることによって相殺される。白血球細胞数のデータを入手するため の費用は、テストを頼んだ個人にとっての失われた時間のコストを考慮にいれな くても、テストを受けることを躊躇させる。

いかなる白血球欠乏状態（白血球減少症）の臨床的な関連症状を評価するに際に も、異ったタイプの白血球の相対比率がかなり重要となる。例えば、もし好中球 が全白血球数の少なくとも１５〜２０％を含んでいれば（通常は４０〜７０％の 範囲）、白血球量に著しい減少があってもかなり十分な許容性が与えられること が時々ある。

好中球の状態は、感染に対する防衛に極めて重大な役割を有するためばかりでな く、体内における好中球の平均寿命が赤血球または血小板等の他タイプの血液細 胞よりも遥かに短いと言う理由で、大変重要な診断指標である。その結果、循環 している好中球レベルの低下は、ある疾病状態、或いは薬物治療または放射線被 爆の重篤かつ致死可能性をもった合併症に伴って起きる骨髄機能悪化の初期の警 告を与えることができる。もし、血液の１ミリリットル当りの細胞数が１，５０ ０個よりも減少したら、好中球欠乏状態（好中球減少）が通常存在すると仮定さ れる。しかしながら、循環している白血球数の通常値には相当な範囲がある。多 くの黒人および中東の人口集団は、平均的ヨーロッパ人の人口集団と比べて好中 球数がかなり低い。

ある場合には、好中球減少を予測でき、その危険性を最小限にするため適切な手 段をとることができる。例えば、急性白血病の治療のため化学治療を受けている 患者は、腸管内のバクテリア異常増殖によって惹起される好中球減少性腸炎を起 こしやすい。屡々限定的ではあるが、この状態は腸管の壁に損傷を与え、腸に孔 をあける結果になることさえある。

上記のような抗癌剤の投与量に関係した予測可能な顆粒球減少症の危険性（急速 に増殖している細胞に対する薬物の選択的作用を反映する）とは反対に、無顆粒 細胞症の罹患は実際には千Ｍ１不可能である。無顆粒細胞症は、通常使用される 幾つかの治療剤の稀ではあるが致死可能性をもつ有毒な副作用である。その罹患 率は４０才以上で実質的に増加しているようであり、女性における危険性は明ら かに増加する。

その症候群には、区別できる二つの異なる型がある。アレルギー型は、通常は最 初に薬物に接触した後に急激に現われるが、有毒型は、幾週間または幾ケ月以上 の連続的または間断的な治療で知らない間に罹患する。関係する最も普通の薬理 学的薬剤には、成る種の抗生物質（特にスルホンアミド、クロラムフェニコール ）、アンチサイロイド（ａｎｌｉｌｈ７ｒｏｉｄ）剤（チオウラシルおよびプロ ピルチオウラシル）、金化合物、非ステロイド系抗炎症剤および成る種の精神治 療薬（例えば、クロルプロマジン及びクロザピン（ｃｌｏｘａｐｉｎｃ）　）が ある。

このような明瞭な薬物感作性のメカニズムは判っていない。

患者が無顆粒細胞症を惹起する可能性があると判っている薬剤で治療されている 間、血液モニターをすることは明かに重要なことと考えられ、かつ二つの顕著な ポイントについても考慮すべきである。第一は、白血病状態を日常的にモニター していなければ、感染の兆候（顕著な熱または喉の痛み）が問題の初期兆候と思 われるけれども、無顆粒細胞症の発症は直ちに完全な感染への進展するとは限ら ないことである。一般的に、感染がその兆候を示す段階にまで進展だ後の抗菌剤 治療は有効性に劣り、防御的調停よりもっと攻撃的な手段を必要とするようであ る。これは、特に好中球欠乏あるいは免疫状態欠損の患者の場合に当てはまる。

第二に、兆候の現われない疾病の初期段階で、無顆粒細胞症を惹起する薬物を継 続的に使用すると、患者の状態を重篤に悪化させ得る。従って、これら両方の状 態では、無顆粒細胞症を惹起することが判っている薬物を投与される患者の白血 球の状態を頻繁に調査する必要がある。

一方、白血球細胞数のこのような敏感かつ頻繁なモニターを行なうことには二つ の障害がある。即ち、コストおよび不便さである。現在は未だ利用できないが、 顆粒球数の重篤な低下の初期発見に供される安価なモニター装置あるいは手段が ある。それは無顆粒細胞症等の状態の発症を警告することができ、結果的に、こ のような薬剤、および健康および生命を脅かす様な顆粒球数低下を惹起する傾向 がある他の薬物を採用する治療法の許容性および安全性を増すことになる例えば 、血液１マイクロリツトル当たり１０．０００細胞を越える数にまで好中球の循 環レベルが増加するのは、感染の一般的症状である。細菌は、好中球の活性を増 加させる化学走性の物質を分泌する。この活性は、骨髄のレベルへの刺激作用お よび血管壁のすぐ近くに広く局在している利用しにくい周蓄積する。後者の典型 的な例は、炎症反応の特徴である好中球の浸潤である。

骨髄への微生物前の刺激作用は、循環する好中球の数を大幅に（最高１０倍）上 昇させ得る。ある場合には、このような顕著な反応には未成熟の好中球前駆細胞 の出現が伴う。これは白血病に存在する状態に類似しているので、白血病性反応 と呼ばれている。

ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）は、様々な臨床的状況ＰＯ活性がないことに よって、顆粒球浸潤の程度を反映しての診断、および薬物治療または放射線治療 後のこれら患者における骨髄再生のモニターにも使用できる。

ＭＰＯ活性の測定は、血液塗抹標本の自動化分析のための変化が進行する、酸化 反応感受性染料を使用して簡単に測定できる。色が変化するのは、使用される特 殊な染料の化学的特性による。

その化学的特性の一つの過程は、１９８３　年７月１日付のロシア文献５Ｕ１１ ８０−００１Ａ　（ＩＲＫＵＴ　ＭＥＤＩＣＡＬ　１Ｎ５ＴＩＴＵＴＥ　’）に 開示されている。

白血球数を測定するもう一つの手段は検査用に考案されており、１９７３年６月 ２６日に発行されたアンスリー（Ａｎｓｌｅ７）らの米国特許第３．７４１．８ ７５号「分化した白血球細胞数を計測するための方法および装置」に開示されて いる。このアンスリーらによる方法では、分析される標本中の血液細胞は致死さ れ、細胞内の触媒酵素は固相化にされる。細胞は染色され、染色細胞を計測する のに光度計測カウンタが採用される。

検査用に考案された他の方法と同様に、上記に引用した文献に開示された手段に は、熟練者を必要とし、またインキュベータ、光度カウンタ、細胞化学代替物、 色素沈着カップリング試薬等の特殊な装置および材料を必要とする工程が用いら れている。

グルコースの検出および測定に関する研究の成果（１９５８年８月１９日発行の 米国特許第２．８４８．３０８号の「組成物」参照）において、フリー（ＦｒＣ ｅ）らはペルオキシダーゼ活性によってるための化学的試験」に開示されている このテストでは、白血球および赤血球の両方を含む尿と、過酸化水素およびイン ジケータ化合物を含む診断組成との接触が行われた。もし試料が白血球を含んで いれば、ペルオキシダーゼ酵素が存在し、次の反応が起こるだろう。

ペルオキシダーゼ（酵素＞　＋　Ｈ２０２（基質）−中間体化合物 中間化合物＋ＡＨ２（酸化により色変化を起こす水素供与体、還元された無色型 ） →　ペルオキシダーゼ＋Ｈ２０＋Ａ（酸化された着色型） 色変化を生じるのに必要な時間を測定するか、或いは所定時間内での色の強度の 変化を観察することによって、半定量的結果が得られる。フリーらの工程を白血 球分析に応用する場合は、非常に重要な欠点がある。第一は、ヘモグロビンの干 渉のために、テストを血液に適用できないことである。赤血球および白血球は両 方ともペルオキシダーゼ活性を示す。

両者の主要な相違は、赤血球のペルオキシダーゼ活性はヘモグロビンのペルオキ シダーゼ様活性によるものであり、作用を現わすためにはかなり高い過酸化水素 濃度を必要とするのに対して、白血球のペルオキシダーゼは低濃度の過酸化水素 でも活性であることである。従って、低濃度の過酸化水素における色反応は白血 球の存在によるものであり、高濃度の過酸化水素での色変化は赤血球の存在によ るものである（特に、ミエロペルオキシダーゼは高濃度の過酸化水素によって阻 害される傾向があるので）。

フリーらの方法の第二の大きな欠点は、白血球活性の測定をする前に、試料標本 に存在する可能性のある細胞から酸化反応性をもった物質を放出するために、何 等の対策もなされないことである。この欠点は、問題の物質が細胞表面ではなく 、一般に細胞内に存在しているので重大である。顆粒球のマーカ酵素であるミエ ロペルオキシダーゼはその典型である。

従って、このような物質が何ら放出されなければ、得られる白血球細胞の計測は 殆ど確実に虚偽のものである。

白血球細胞計測に応用するにあたって、フリーらの方法のもう一つの重大な短所 は、他の血液成分からの干渉を排除するための対策がないことである。このよう な最も大きな汚染源は、赤血球中に見られる酵素カタラーゼである。カタラーゼ は、ミエロペルオキシダーゼのような白血球マーカと同様に過酸化水素の分解反 応を促進し得る。結局、このような事態が起こるのを阻止する工程がないので、 フリーによって使用された酸化反応感受性インジケータの色の変化は、分析すべ き標本中の白血球活性の程度を正確に反映したものでなくなってしまう。

要するに、白血球細胞の計測を行うための単純で、安価で、使用し易くかつ信頼 性の高い手段、並びに熟練者または特殊な設備または装置を必要とせず、家庭お よび非病院環境において最小の指示書で使用できる診断キットに対しては、現在 も継続して大きな要求があり、この要求は未だ満足されてはいない。これは一つ の例だが、顆粒球数の変化を反映して選択された治療の有効性をより簡単に確認 できるので、感染の治療を顕著に容易にすることになろう。問題になっている特 徴的な方法は、白血球細胞数に有害な変化を惹起する可能性をもった薬理学的薬 剤の影響を追跡するための能力を著しく増加させるであろう。

先に詳述したように、現場、病院および他の環境において、より高度に訓練され た者によって行なわれる診断およびモニター用プロトコールに有用な、十分に正 確でかつ効果的な方法およびキットに対するかなりの要求が存在している。

〔発明の要約〕

白血球（特に顆粒球）数を計測するための手順およびキットが発明され、ここに 開示されている。

本発明の手順およびキットは、過酸化水素を分解し、酸化感受性染料の視認し得 る色変化を生じる顆粒球から解放されたＭＰＯの過酸化水素に対する作用を利用 する。この反応は、生じた色の強度もしくは所定のレベルまで達するのに要する 時間もしくは色生成のタイプのいずれかによって定量することができる。所定の 正常値範囲からの逸脱は顆粒球の欠乏または過剰を示しており、重篤性のおおよ その徴候および、それ故の臨床状況の緊急性を提示している。

前述の工程を実施するために用いられるキットは、血液サンプルを採取するため の器具；白血球を、顆粒球数の指標である色変化を不明瞭にするか、もしくは誤 差をもたらす血液成分から分離するための手段；酸化感受性指示薬、典型的には 色素供与染料；過酸化物；白血球を破壊し、それらの細胞内ミエロペルオキシダ ーゼ（ＭＰＯ）を放出させる物質；および赤血球細胞からの痕跡量の汚染物質の 活性を阻害する手段を含む。これらの要素は、このキットが、より高度に訓練さ れた人員を活用し得る場、臨床並びにそれに対比し得る場面と同様に、家庭およ び他の非医療環境において最小の指示だけで利用可能であるように設計されてい る。同時に、このキットの要素は、簡便性およびコスト効率の観点から、並びに 信頼し得る結果が容易に、かつ迅速に得られるように選択されている。

ここに開示される手順およびキットの他の利点は、検体が非常に少量であっても よく、例えば、単に指を刺すことによって得られた血液サンプルであってもよい ことである。

健康管理システムに対する潜在的な節約は莫大なものである。

本発明の潜在的な利益には、これに限られるものではないが、以下のものが含ま れる： 免疫系が抑制されているか、もしくは熱および関連症状を示す患者； 救急ルームもしくは家庭における緊急の状況；および異常な白血球レベルを誘発 することが知られている処方薬（抗生物質、抗炎症剤、抗甲状腺剤および抗精神 病薬）の使用者。

本発明の目的、特徴および利点は、前述および添付の請求の範囲、並びに続く詳 細な説明から読者に明らかであろうし、本発明の論議は添付の図面と共にさらに 続く。

〔図面の簡単な説明〕

図１．は、−緒になって本発明の原理を具現する１つの診断キットを示す図ＩＡ およびＩＢの関係を説明する。この図はまた、このキットをどのように用いて顆 粒球を検出し、少なくとも顆粒球レベルを半定量的に評価するかを示す。

図２は、図１に示す診断キットの要素である微小毛細管の断片的な断面。

図３は、診断キットの要素であるアッセイ装置の等角部分断面図。

図４は、アッセイ装置に組み込まれた色標準を詳細に示す。

図５は、−緒になって本発明の原理を具現する第２の診断キットを示す図５Ａお よび５Ｂの関係を示し、かつこのキットをどのように用いて顆粒球を検出し、顆 粒球レベルの指標を得るかを示す。

図６は、図４のキットにおいて用いられるキュベツトおよびシリンジベースのア ッセイユニットの断面。

図７は、本発明の原理を具現する第３のアッセイユニットの断面。

図８は、１つの研究で得られた結果を要約する棒グラフであって、この研究にお いては本発明の原理を具現する方法で顆粒球が検出されている。

図９は、第１の研究において用いられた手順の変法を用いることにより顆粒球レ ベルが決定された第２の研究の結果を要約する棒グラフ。

図１Ｏには、顆粒球を検出し、顆粒球レベルの指標を得るために、本発明の原理 に従って用いられるアッセイ媒体における発色に対するプロトン供与体の効果を 示す一対のグラフが含まれる。

〔発明の詳細な説明〕 上で簡潔に述べたように、ここに開示される顆粒球レベルの新規評価方法は、ミ エロペルオキシダーゼがペルオキシダーゼと酸素感受性染料との酸化還元反応を 促進するという事実を利用する。この染料における色変化の速度および程度は、 この酵素の濃度を反映している。細胞内ミエロペルオキシダーゼは顆粒球中に見 出され、その量は一般に細胞間で一定であり、それ故に、色変化の速度および強 度を被検血液サンプルにおける顆粒球のレベルを正確に反映させるために用いる ことができる。しかしながら、ミエロペルオキシダーゼは顆粒球の細胞間成分と して現われるため、被検サンプル中に存在するこれらの顆粒球は、顆粒球レベル の有意な測定を行なうためには、サンプルをペルオキシダーゼおよび染料で処理 する前に溶解もしくは破壊して酵素を放出させなければならない。

また、血漿および赤血球もペルオキシダーゼ酵素を含有し、さらに赤血球中のヘ モグロビンもまた特定の条件下でペルオキシダーゼ様の活性を有するため、白血 球の溶解とそれに続くアッセイの前に、白血球を可能な限り完全に他の血液成分 から分離する必要がある。白血球は赤血球よりも低張溶解に対する耐性が高い。

したがって、二回蒸留水および市販の瓶詰水を、赤血球細胞を破壊し、潜在的な 妨害血液成分を放出させるために用いることが可能である。放出された妨害血液 成分は、低張溶解試薬と共に、濾過によって白血球から除去される。

塩化アンモニウム、サポニンおよび酢酸／酒石酸混合液のような他の溶解剤もま た、既述の潜在的妨害血液成分の放出の達成に潜在的に利用可能である。

このように放出された、顆粒球の存在および濃度の正確な測定を妨げるであろう 血液成分の分離に用いられるフィルターは非常に重要である。それは、（上述の 予備溶解工程を用いる場合を除いて）血液を微小毛細管からその上に直接移すこ とを可能ならしめるに十分な吸収性を有していなければならない。しかしながら 、フィルターが十分な吸収性を有している場合には、一度血液を移し、溶解剤を 添加したならば、適度の撹拌は溶液中に細胞を分散させることはせず、濾過後に 赤血球は十分に溶解し、白血球はフィルター全面にわたって均等に分布するであ ろう。また、高度な赤色を背景とする発色の定量が困難であるために、およびヘ モグロビンのペルオキシダーゼ様活性の故に、フィルターは遊離のヘモグロビン を吸収しないことが好ましい。細孔径は、白血球（１０−１２ミクロン径）を保 持するには十分小さいが、低張溶解溶液およびその溶質（ｂｕｒｄξｎ）である 放出された血液成分を適度な速度でフィルターを通過させ得るに十分な大きさで なければならない。

潜在的な妨害成分の除去をより有効にするために、陽圧もしくは除圧もしくは陽 圧と除圧との組み合わせを予備溶解血液サンプルに適用することができる。

既述の予備溶解工程によって一度白血球が分離されたならば、フィルター上に残 留する物質に水性過酸化物−および染料含有指示試薬またはアッセイ媒体を加え 、分析される血液サンプル中に顆粒球が存在するか否か、並びに顆粒球レベルの 所望の示度を得る。また、この試薬には、存在するいかなる顆粒球をも溶解して 過酸化物と染料との発色反応の触媒に用いられる細胞内酵素ミエロペルオキシダ ーゼを放出させるための洗浄剤が含まれる。

この目的に有効なのは、トリトン（Ｔｒｉｊｏｎ）の商標で市販されているポリ エチレンエーテル灰浄剤およびヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド である。これらの洗浄剤は、典型的には、約０．００５％の濃度で用いられる。

好ましい過酸化物は、過酸化水素である。しかしながら、過酸化水素尿素（ｕｒ ｅａ　ｂｙｄｒｏｇｅｎ　ｐｅｔｏｘｉｄｅ）またはクメンヒドロペルオキシド もまた、指示試薬が用いられる直前に組み合わせられるグルコースオキシダーゼ およびグルコース成分から構成されるイン・ビトロ過酸化水素生成システムとし て用いることができる。

０、０００５ないし０．０００６５％（３０％保存溶液）の過酸化水素濃度が好 ましく用いられ、この濃度は重要である。より低い濃度が用いられたならば、発 色しないであろう。濃度が非常に高い場合には、過酸化物はたまたま存在してい たヘモグロビンによって触媒され、顆粒球の存在には関係なく青色を生成する可 能性がある。

アッセイ媒体は、血液サンプルを添加した後には、淡い赤褐色気味になるであろ う。これは、実際問題として、他の方法では適切な酸化感受性色素供与染料（ｏ ｘｉｄ［ｉｏｎ　５ｅｎｓＮｉｖｅ、ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ　ｄｏｎｏｒ　ｄ ７ｅｓ　）の使用を問題外のものとする。

これは、それらの染料が、上述のミエロペルオキシダーゼ促進反応において無色 から赤になるためであり、この色変化が血液サンプルが試薬に付与する色によっ て不明瞭になるためである。したがって、好ましい染料は、同じ条件下で無色か ら青になるｏ−トルイジン（ｏ−１ｏｌｉｄｉｎｅ）である。

ｏ−トルイジンは、この染料が組み込まれた試薬のｍ１当り０．０８ないし２． ０ｍｇの濃度で用いられることが好ましい。より高い濃度では、染料が析出して 無効になってしまうか、この染料がミエロペルオキシダーゼ触媒反応を妨害する 結果となる可能性がある。既述のレベルを下回る濃度では、特にサンプル中の顆 粒球濃度が低い場合に、色の変化が検出不可能であり、現われた色が不安定とな る可能性がある。

色素供与染料の他の候補は、３．３’　、　５．５’−テトラメチルベンジジン および２．２′−アジノービス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸 ）である。

分析される血液サンプル中に存在する赤血球細胞を破壊し、それによりアッセイ を妨害し得るそれらの細胞成分を解放するための低張溶液中での血液サンプルの 予備溶解は、次の濾過工程の後に、白血球細胞と共に潜在的な妨害血液成分を残 す結果となることがある。これらの成分の一つはカタラーゼである。ミエロペル オキシダーゼと同様に、この酵素は過酸化水素を分解する能力を有している。し たがって、この酵素を中和しない限り、これもまた酸素感受性染料の色の変化を 生じせしめ、それにより実際に存在する顆粒球よりも高いレベルを反映するアッ セイを引き起こす可能性がある。

この発明においては、この中和は、ベースとなる水性試薬にカタラーゼ阻害剤を 組み込むことにより達成することができる。カタラーゼを阻害するがミエロペル オキシダーゼは阻害しない３−アミノ−１，２，４−トリアゾールが好ましい。

このトリアゾールは、好ましくは、３０−７５　ミリモルの濃度で用いられる。

この濃度は、溶解性の問題を引き起こすことなく酵素を中和するに十分な高さで ある。

先行する段落で論じた妨害の問題は、適当な特性を有するフィルターを用いるこ とによっても取り除くことができる。

例えば、後述のワットマンＧＦ／Ｃガラスマイクロフィルター（Ｗｈａｔｍａｎ 　ＧＦ／Ｃｇｌａｓｓ　ｍ１ｃｒｏ目ｔｉｅｒ）が用いられる場合には、阻害剤 が必要となる。対照的に、ミクロン・セパレーションズ社マグナφナイロン支持 ブレーンフィルター（ＭｉｃｒｏｎＳｅｐａｒａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｃ、　Ｍａｇ ｎａ　Ｎｙｌｏｎ　５ｕｐｐｏｒｔｅｄ　ｐｌａｉｎ　ｆｉｌｔｅｒ）が用いら れる場合には、阻害剤は必要ではない。

蒸留水のような水性媒体を用いる低張溶解もしくは洗浄を、顆粒球濃度について 分析するサンプル中に存在する赤血球の破壊およびサンプルからのヘモグロビン のような潜在的妨害血液成分の除去に用いることもできる。潜在的な妨害成分の 除去をより効果的にするために、血液サンプルに陽圧もしくは陽圧または陽圧と 陽圧との組み合わせを適用することができる。

試験結果の確度をより増進させるために、試薬溶液は、予備溶解血液サンプルに 染料含有試薬が添加され、この試薬中で化学反応が起きた場合に別の理由で生じ るｐＨ変化に対して緩衝されていることが好ましい。ｏ−トルイジン　が色素供 与染料である場合に用いられる５°口ないし　７．０の範囲のｐＨで、４．０な いし５．０の範囲のｐＨを有するクエン酸緩衝剤および６．０ないし７．０、好 ましくは６．０ないし６．５の範囲のｐＨを有するリン酸緩衝剤を用いることが できる。より高いｐＨ範囲を有する緩衝剤は、染料が所望する特徴的な青よりも むしろ明るい褐色に変化してしまうため忌避される。

必要なｐＨ範囲を有する申し分のない特定緩衝剤は、　（１）二塩基性リン酸ナ トリウムおよび一塩基性リン酸カリウムの混合物（リン酸緩衝剤）、並びに（２ ）クエン酸ナトリウムおよびクエン酸の混合物（クエン酸緩衝剤）である。

典型的には、５０ｍＭ濃度の選択された緩衝剤が用いられる。

しかし、これは重要なことではない。重要なのは、濃度が低すぎたり（この場合 には、ｐＨは安定である代わりに変動するであろう）、高すぎたりしないことで ある。後者の場合には、緩衝剤が試薬の他の成分を沈殿させることがある。適切 なｐＨでは、発色は数分間で完了する。そして、現われた色には異なる顆粒球数 の血液サンプルに起因する十分な差異があり、サンプル中の顆粒球レベルを適度 な確度で評価することが可能となる。

特定のｐＨの緩衝剤を有利に用いることができる他の環境は、サンプルが含有す る顆粒球数が増加する環境である。この場合には、酸化感受性染料の最大強度ま での発色が、実際の顆粒球数を正確に反映するように発色を計時することが不可 能な程素早く起こることがある。例えば、顆粒球数の反映として用いられる強度 が１分後に到達するものであり、３０秒後に最大強度に到達するならば、この試 験に意味はない。これらの場合並びにこれらと対比し得る場合には、色変化が選 択された測定期間にわたって実際の顆粒球数を反映する強度のもののみとなるよ うに色変化反応を遅らせるために、ｐＨ５．０のクエン酸緩衝剤のようなより酸 性の低い緩衝剤が用いられる。これは、観察者が異なる顆粒球レベルのサンプル を明瞭に区別することを可能にする。

アッセイ媒体における過酸化物のミエロペルオキシダーゼ促進反応が酸化感受性 染料の色変化を引き起こすポイントを変更することによっても、しばしば最適な 結果を得ることができる。これは、アッセイ媒体にプロトン供与体を添加するこ とによって制御することができる。この性質を有する適切な供与体の一つは、１ ミリモル以下の濃度のアスコルビン酸である。これは、色変化が起こるのが早す ぎたり、変化の結果が損なわれたりしないようにしながら、酸が色変化を過度に 遅らせたり、妨げたりすることさえもないようにするに十分な低さである（濾過 工程からの残渣に指示試薬を添加した後の代表的な時間ｔで、アスコルビン酸プ ロトン供与体が、顆粒球レベルの高低に帰される発色の差違をより大きくする効 果を有することを示す図１Ｏを参照）。

ここで図面に関しては、図１は、本発明の原理を具現化する診断キットを示し、 且つ、顆粒球を検出し、顆粒球レベルの少なくとも半定量的な指標を提供するこ とを意図している。

診断キットの主要な構成要素は、ヤリ２２、微小毛細管２４、キュベツト２６、 及び、具体的には適当な熱可塑性ポリマーで成型された構成要素を備えた使い捨 てアッセイ装置２８である。

ヤリ２２は、具体的には、図ＬＡに示すように被検者の指３０から血液を流させ るために使用される。

定量される血液のサンプル３２は、較正された微小毛細管２４により採取される 。微小毛細管２４は、血液非凝固性のシリコンコーティング３４を有する。代替 案としては、抗凝固剤が入れである微小毛細管またはピペットを使用することで ある。使用可能な抗凝固剤は、Ｋ　ｓ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａおよびヘパリンナトリウ ムを含む。抗凝固剤としてヘパリンを用いて得られたいくらかのサンプル（特に ヘパリン濃度がいくぶん高い場合）がこの試験で不均一な発色を示す傾向にある ことを除いては、これらの抗凝固剤の効果の明らかな違いは認められていない。

これは、公知のヘパリンの白血球に対する凝集効果と一致する。

血液サンプル３２を保持した微小毛細管２４を、標準的な市販で入手可能なアイ テムであるキュベツト２６に入れた。

上述の蒸留水または瓶詰めの水である予備溶解試薬３５を入れ、キュベツトを蓋 ３６で封をした。

同様に図ＩＡに示す手順の次の工程は、封止されたキュベツト２６を激しく振ど うすることである。これは、サンプル中の赤血球の崩壊を促進し、サンプル中に 存在する顆粒球からの潜在的な妨害血液成分の分離を促進する機械的力を起こす 。

予備溶解工程の終わりに、蓋３６を取り除き、キュベツト２６をアッセイ装置２ ８に取り付ける。

図ＩＡ及び図ＩＢに示し、かつ、図３により詳細に示すように、この装置は、穴 を有するベース３８、円筒状突起４０およびベース端部壁４４にスロット４３を 経て達したスライド４２を具備する。このスライドは、ベース３８の側壁４５及 び４６の間に閉じ込められ、図解した「開位置」から図１Ｂおよび３中に矢印７ で示した方向に同様に図ＩＢに示す「閉」位負へ移動可能である。

アッセイ装ｆｆ２８は、突起４０内のキャビティ５２の下端部５０にわたる多孔 質膜４８およびキャビティ５２内の多孔質膜のすぐ上の切頭円錐状の色標準５４ を具備する。

膜４８は、湿潤した場合に構造的完全性を保持し得る微細多孔質材料で組み立て られている。ワットマン（商標）ＧＢ／Ｃガラス微細繊維材料が適切である。

ベース３８内の窪み５６の中に収容された同様のアッセイ装置２８の部品は、吸 収材からなるブロック５８．および、このブロックの下の、脆いかまたは押し潰 すことができるポリマーからなる薄層６０である。

図ＩＢに示すように、組み立てられたキュベツト２６およびアッセイ装置２８を 裏返して、その内容物をキュベツト２６からアッセイ装＠２８へ直接移す。図Ｉ Ｂおよび３に示す開または外位置にあるアッセイ装置のスライド４２により、溶 解された顆粒球が膜４８の上に捕集され、一方、キュベツト内容物の液層はこの 膜を通過し、吸収材からなるブロック５８で吸収される。すなわち、溶解されて いない白血球が、予備溶解試薬および予備溶解工程で試薬に放出される潜在的な 妨害血液成分からなる濾液から分離される。

次に、キュベツト２６をアッセイ装置２８から取り外し、アッセイ装置を裏返し 、スライド４２を閉じる、すなわち、矢印４７で示される方向にベース３８の中 へ移動させる。スライド４２を膜４８の下のベースの中にその内側端部６２がベ ースの末端壁部に達するまで直線的に移動する。これは、スロット４３の底端部 ６６、および、窪み５６の末端部を規定する内壁７２および７４の上側端部６８ および７０により、この通路を通ってガイドされる。窪み５６の内部には、アッ セイ装置のコンポーネント５８および６０が収容されている。

閏じたスライド４２については、溶解された顆粒球がそのＨに捕集された膜４８ を破壊しないことが重要である。破裂は、スライドの上側端部７８の窪み７６お よび吸収材の窪み５６の底にある脆い材料６０により防止される。吸収性材料の ブロック５８が膜４８を通過した液体を吸収し膨張するので、層５８は潰れ、膨 れた吸収性材料が膜を押して破壊するのが防止される。

また同様に図ＩＢに示すように、選択された分量の化学試薬またはアッセイ溶媒 ８０を膜４８の上に注ぎ、顆粒球からの細胞内ミエロペルオキシダーゼの放出を 生じさせて、これにより、ペルオキシダーゼとアッセイ溶媒中の色素生成ドナー 染料との間の色発現反応を促進する。タイマー８２で測定された選択された継続 期間の終了後、次に、化学試薬の変化した色を、色標準５４の上の、始めがゼロ で次いで強さが大きくなる区分８４−１．、．８４−７のうち一つと一致させる 。

これらの区分の夫々は、ゼロ（区分８４−１）がら始まる異なる顆粒球数の計数 に対応する。この結果、以上説明したマツチング工程は、アッセイされた血液の サンプル中の顆粒球計数の少なくとも半定量的な指標を提供する。

その代わりとして、顆粒球数の計数は、指示試液中で発現した色を色標準５４の 特定の区分８４に一致させ、色が発現するのに要する時間を記録することにより 行うことができる。

さらに図面に関しては、図５Ａ、５Ｂ、および６は、半定量的な顆粒球数の計数 を行う手順の工程を示す。この手順は、予備溶解工程の後で血液サンプル中の顆 粒球を分離し、次の顆粒球数の計数を行うための異なるユニットを備えた診断キ ットを使用する点で以上説明した手順と異なる。このアッセイユニットは、参照 符号９０で示す。

図５Ａおよび図５Ｂの両方に示し、さらに図６に詳細に示すように、アッセイユ ニット９ｏは、アダプター９４を備えたシリンジ９２および使い捨て診断装置９ ６を具備する。後者は、例えば、適当な熟成形性ポリマーで成型されたー・部品 モノリス状部材である。段のある中心穴９８が貫通して設けられ、かつ、この部 材の相反する端部１００および１０２に開口する。

診断装置の端部１０２に開口する中心穴９８の区分１０４は、キュベツト２６を 補足しかつ受け取るような寸法にする。

色標準５４は、穴９８の隣接および連通ずる区分１０６の中に収容される。さら に、図６に示す診断装置については色標準の直下であって大区分１０７の中に、 ボアスバンニング（ｂｏｒｅ　ｓｐａｎｎｉｎｇ）、多孔質膜またはフィルタ１ ０８がある。次の連通する区分１１０は、吸収ブロックまたは吸収材５８を収容 し、穴の隣接する最後の区分１１１は、シリンジアダプター９４を受け取るよう な寸法および形状にする。この部品は、ニップル１１２の上に、シリンジ９２の 上端部でかつ診断装置の大区分１１１の中に、診断装置とシリンジとを液密な関 係で備え付けられている。これは、シリンジの内部１１４および診断装置の段の ある穴９８の間の液体伝達を提供する。

以上説明したシステム９ｏを使用する顆粒球計数の手順の最初の工程は、図ＩＡ およびＩＢに示すプロトコールの工程を繰り返す。すなわち、（１）被験者の指 ３ｏをヤリ２２で刺す。；　（２）流れ出した血液の定量サンプルを較正した微 小毛細管２４で刺す。；　（３）この管をキュベツト２６に移す。；　（４）予 備溶解試薬３５をキュベツトに入れる。；（５）蓋３６を取り付ける。；　（６ ）キュベツトを振とうしてサンプル中の赤血球の崩壊を促進する。；（７）ＩＥ ３６を取り外す。次いで、キュベツト２６を、診断装置９６の貫通穴区分１０４ の中に診断装置９６と液密な関係で取り付け、組み立てられたシリンジ９２、診 断装置９６およびキュベツト２６を裏返す（図５Ａ、５Ｂおよび６参照）。

図５Ａおよび５Ｂに示す手順の次の工程は、図５Ａおよび５Ｂを示すように図６ 巾の矢印１１８で示される方向にシリンジ９２のプランジャー１１６を引き出す 。これにより、液体・−予備溶解試薬および試薬により捕捉された何れかの血液 成分・−をキュベツト２６から診断装置９６に移動させるための圧力差により生 じた力、および、膜１ｏ８の上に捕集された顆粒球からの液体の極めて効果的な 分離を提供する。また、圧力差により生じた力は、溶解されていない顆粒球を、 はぼ均一な分布パターンで膜１０８に「固定」する。これは、膜１０８の」二の 細胞の均一な分布の結果、続いてアッセイ溶媒を装置に入れた場合に発現された 色を、斑点のある色に相反するような均一な色にする。

この後、診断装＠９６をシリンジ／アダプター組立体９２／９４から取り外し、 アッセイ溶媒８０を撥水性膜１０８の上に捕集された顆粒球の」−に注いで、細 胞内ミエロペルオキシダーゼを放出させ、タイマー８２で測定された時間の間、 色を試薬中に発現させる。この時間の終わりに、試薬の色を診断装置９６の中の 色標準５４と比較し、所望の顆粒球数の計数を提供する。

本発明の本実施例では、膜１０８は、多孔質撥水性材料で作られている。故に、 この膜は、吸収材５８に移動した液体が膜を通って逆流しないので、膜の上の細 胞を吸収性材料から効率的に分離し、従ってスライドを必要としない。シリンジ ９２は、疎水性膜１０８の性質を越えて圧力差を生じさせて、予備溶解および濾 過工程の終わりまで液体を膜を介して吸収材５８に通過させ続ける。

さらに図面に関しては、図７は、シリンジ−ペースの診断ユニット１３０を示す 。このユニットは、図１の参照符号２６で示すようなスライド−ベースの診断装 置の特徴を備えている。シリンジ−ペースのシステムの診断装置は、図６中に参 照符号９０で示す。すなわち、システム１３０は、シリンジ９２、図３に示す装 置２８と同様の診断装置１３４、および、シリンジと診断装置との間の液体伝達 を提供するアダプター９２を備えている。

はとんどの部分については、診断装置２８と１３４は同じである。同じ参照符号 は、類似した２つの装置のコンポーネントおよび要素が同じものであることを確 認するためにに使用されている。

図７から明らかなように、診断装置１２８および１３４の本質的な唯一の相違は 、絞り部１３８がベース１４２の底壁１４０に形成され、シリンジアダプターを 受け入れる円筒形のカラー１４４が、この絞り部１３８と同心円状に、底壁１４ ４に取り付は若しくは一体的に備え付けられることである。

このシステム１３０を使用した顆粒球数の計数を行う手順は、図ＩＡおよびＩＢ に示され、かつ、キュベツト２６の内容物を診断装置に移すところで上記説明し た工程を繰り返す。

ユニット１３０を使用した手順では、シリンジは、診断装置１３４にカラー１４ ４の中のアダプター９４で取り付けられ、膜４８の上の中空突起４０の中のキャ ビティ５２とシリンジ９２の内部１１４どの間の液体伝達を提供する。次いで、 シリンジ９２のプランジャ１１４が、図７中の矢印１４６で示される方向に移動 される。これにより、膜４８に交差する圧力差が生じ、　（１）キュベツト内容 物の液層および正確な顆粒球数の計数を妨害する可能性がある液層中の物質の膜 の上側からの高効率での分離を提供し、かつ、（２）膜に取り残された顆粒球を 固定する。

この後、スライド４２を閉じて、膜５４から、抽出および吸収されたキュベツト 内容物の液層を内部に捕集した吸収性材料４８を分離し、アッセイ溶媒試薬を入 れる。次いで、上述の手順のように、指示試液を、血液サンプル中の顆粒球を選 択された期間の間に溶解した結果放出される細胞内ミエロペルオキシダーゼと反 応させ、次に、指示試液の色を色標準５４と比較して顆粒球数の計数を行う。

以下の実施例は、本発明の診断手順を使用して血液サンプル中に顆粒球が存在す るか否かを決定し、かつ、顆粒球数を計数する特定の試験を詳細に説明する。

例Ｉ ヒト血液のサンプルを無菌でシリコン化された既知容積のミクロキャピラリー管 に吸い出し、これによって分析される血液の基準量が与えられる。

血液は１．２マイクロメーターの分離能を有するガラスミクロ繊維フィルター上 にスポットされた。ワットマン（登録商標）ＣＦ／Ｃフィルターを使用した。こ のフィルターの材料は以下の特性を有する。

材料−一接着剤のないガラスミクロ繊維粒子保持−一１．２μｍ 流速−−１０，５秒／　１００　ｍ　１重量−−５３ｇ／ｍ２ 水の吸収−−２５０ｍｌ／ｍ２ このフィルターを、濾過のための補助メツシュを取り付けたシリンジに装入する 。シリンジは０°５ｍｌの容量を有する。

このシリンジに水を５ｍｌの目印のところまで満たした。先に議論したように、 顆粒球を無傷のまま残し、水で赤血球を破壊させた。

シリンジのプランジャーを押し下げて、サンプルに持続的に圧力をかけ、「圧力 洗浄」によってサンプル中の赤血球の溶解を促進し、溶解された分の赤血球を排 出する。

溶解されていない赤血球が負荷されている該ガラスミクロ繊維フィルターは、清 浄で乾燥した面に移され、５滴（又は約２５０マイクロリツトル）の試験薬溶液 、若しくは検定媒体を添加した。試験薬溶液は、０．５ｍｌの０．１モル、ｐＨ ５のクエン酸塩バッファー：５０μｍの赤血球を溶解し、ミエロペルオキシダー ゼを放出する０、１％トリトンＸ−１００（商標登録）洗浄剤；３００μｌの１ ００ミリモル３−アミノ−１，２，４）リアゾール水溶液；５０μｍの０．０１ ％過酸化水素；　５０μｍの１０ｍｇ／ｍ１ｏ−）リジン水溶液；及び５０μｌ のＨ２Ｏを混合することによって調製した。これは、１ｍｌの、以下の最終濃度 を有する試験溶液を与えた。リン酸バッファー、５０ｍＭ；トリトンＸ−１００ （登録商標）、０．００５％：３−アミノ−１，２，４トリアゾール、３０ｍＭ ；過酸化水素、０．０００５％；及び〇−トリジン、０．５ｍｇ／ｍ１０ ３０秒後、血液サンプルでスポットされたミクロ繊維フィルターのその領域は青 色に変化した。これは、赤血球が血液サンプル中に存在していることを示してい る。

色の濃さは、図４に示されるような色基準で赤血球の数に関連づけ、少なくとも 半定量的な赤血球数を得た。

例ＩＩ 以下に対応するような、例Ｉに示した試薬溶液又は検定媒体とは異なるものを用 いて、例Ｉで説明した手順を繰り返した。

（１）溶液をリン酸バッファーで処理した。及び（２）試験薬溶液中のｏ−１リ ジンの最終濃度を０−２ｍｇ／ｍｌにした。

スポットした血液サンプルに検定媒体を添加した後、色の発色を５分で評価した 。

より長い時間にわたる色の発色によって、よりよい分解能が得られ、従って、血 液サンプルが高い赤血球数を有するこれらの環境では、より正確な赤血球が計算 される。即ち、この環境では、多数であるが十分に異なった赤血球数を有する２ 種類のサンプルによって短時間に発色された後の指示溶液の状態は区別し得ない 。これは色が、両方の場合で非常に迅速であるからである。色の発色を長時間わ たって記録し、これによって色をゆっくり発色させることによって、低い赤血球 数のサンプルの色が、色の発色の段階の最後でより高い赤血球数を有するサンプ ルの色と同じレベルに発色されることはない。従って、２種類のサンプルを両者 間で区別することができる。

例ＩＩＩ 以下のように変更して例１に示した手順を行った。血液サンプルの容積を１０μ ｍよりも２５μｌにした。また血液サンプルを、Ｐｒｅ−３ｅｐガラスプレフィ ルタ−Ｇ−１５（商標登録）　（Ｍｉｃｒｏｎ　５ｅｐａｒａｔｉｏｎ、Ｉｎｃ ）に移した。次に、血液を導入したフィルターをバイアルに移し、２ｍｌの試験 薬溶液を加えた。生じた色の発色を５分後に測定した。

例ＩＶ ８７５マイクロリツトルの０．１モル、ｐＨ５のクエン酸バッファー；１００マ イクロリツトルの０．１％トリトンＸ−１００（商標登録）洗浄剤；１２５マイ クロリツトルの１ミリモルアスコルビン酸（クエン酸バッファー中で調製した） ；１００フイクロリツトルｃ７）０．０１％Ｈ２ｏ２　；６ｏｏマイクロリツト ルの１．　ＯＯミリモル３−アミノ−１，２，４−トリアゾール；及び２００マ イクロリツトルの１０ｍｇ／ｍ１ｏ−トリジン水溶液を混合することによって調 製された試験薬溶液を５ｍ用いて、例■の手順を繰り返した。これは、以下の最 終濃度を有する２、０ｍｌの試験薬溶液を与えた。

クエン酸バッファー、５０ｍＭ；）リドンＸ−１００（登録商標）、０．００５ ％；アスコルビン酸、６２．５ｍＭ；Ｈ２Ｏ２，０，０００５％；３−アミノ− １，２，４トリアゾール、３０ｍＭ；ｏ−）リジン、１ｍｇ／ｍ１０色の発色は ３０秒、１分及び２分後に測定した。

例Ｖ 以下のように変更した点を除き、例Ｉで説明した手順を繰り返した。

（１）バッファーは、９７０μｌの０．１モル、５のクエン酸塩である。

（２）１ミリモルのアスコルビン酸の容量を３０マイクロリツトルに減少した（ アスコルビン酸の最終濃度は１５ミリモルである）。

血液サンプルがスポットされたフィルターのその領域で発色した青い色を１分後 に評価した。その濃さは基準参照物のものよりも低かった。これは、サンプルの 全細胞数が血液１リツトルあたり２５００個以下の顆粒球であることを意味する 。

例ＶＩ 例■で示した手順を以下のように変更して繰り返した。

（１）１ｍｌの０．１モル、ｐＨ６，５のリン酸バッファーを試験薬溶液に使用 した。

（２）１ミリモルのアスコルビン酸の容積を２５マイクロリツトルに減少した（ １２．５ミリモルの最終濃度を得るために）。

（３）ｏ−トリジンの容量を１００マイクロリツトルに減少した（０．５ｍｇ／ ｍｌの最終濃度を得るために）。

（４）７５マイクロリツトルのＨ２Ｏを加え、検定媒体の最終容積を２．０ｍｌ にした。

１分で評価された生じた色は、青色の対照よりも低かった。

これは、血液サンプル中に１マイクロリツトルあたり２５００個以下の顆粒球を カウントしたことを表している。

本発明の効果は、臨床的にも示される。２種類の異なった試験を行った。１つは 、低い顆粒球レベルを検出するもの（２，５よりも小さい［すべての顆粒球数は 子細胞／ｍｍ３として与えられる）であり、他方は、顆粒球のレベルを評価する ためのものである（試験が厳密に定量的でないので、ある範囲のみとして与えら れる［即ち、２．２〜５．５〜１０゜１０よりも大きい］）。

血液サンプルは、種々の団体から得られ、検定された。検定の結果を、コールタ −カウンターで決定された実際の好中球数と比較した。抗凝固剤としてに３ＥＤ ＴＡを有するＶａｃｕＩａｉｎｅＩ銘柄の試験管を用いて血液サンプルを静脈穿 刺によって得た。このサンプルを検定するまで（通常サンプルを採取した次の日 ）約５°Ｃで保存した。

例ＶＩＩ 血液サンプルをよく混合した。次に、１０マイクロリツトルの血液のアリコート を、２回蒸留した水にわずかに浸したワットマンＣＦ／Ｃガラスミクロ繊維フィ ルター（孔サイズ１゜２マイクロン）上にスポット（デジタルマイクロリットル ピペットを用いて）し、わずかにじみが付き、ミリポアの濾過装置の焼結された ガラス盤に置かれた。次にガラス管を焼結したガラス盤の頂部で留め、これによ ってフィルターを適切に保持し、液体かフィルターのエツジの外側に漏れないよ うにした。約２ｍｌの二度蒸留した水をガラス管に加えた。次に装置全体を約１ −〇秒間振賭し、血液サンプルを懸濁し、赤血球を溶解した。次に焼結したガラ ス盤の下を減圧にし、液体を除去した。この溶解段階を１階繰り返した。次いで 、フィルターをガラスの顕微鏡スライドに移した（フィルターの取り扱いはすべ てピンセットで行った）。５から７滴の指示薬溶液若しくは検定媒体をフィルタ ーに加え、この添加の後１分て色の発色を、図４に示したようなものであるが６ つの異なった濃さの青色（最も薄い青から最も濃い青まで１から６の番号をふっ た）を有する色基準を用いて記録した。

色の発色が、１分で４以上であれば、そのサンプルは２゜５よりも大きい顆粒球 レベルを有すると考えられる。色の発色が１分で３以下であれば、そのサンプル は２．５以下の顆粒球レベルを有する。色の発色が、３と４の間にあると思われ る場合は、この試験では結論がでない（はとんどのこのようなサンプルは、２． ５に近い顆粒球数を有し、従ってボーダーラインになる）。

試験溶液は以下のものを含有する。クエン酸バッファー（５０ｍＭＳｐＨ５，０ ）　、アスコルビン酸（１５ｍＭ）、トリトンＸ−１００（０，００５％）、過 酸化水素（１つの試験で０．０００５％、後の試験で０．０００６２５％、両方 ともストックした溶液が３０％であるという仮定を基にした）、アミノトリアゾ ール（３０ｍＭ）、及びｏ−トリジン（１ｍｇ／ｍｌ）。

２５個のサンプルは、コールタ−カウンター法で測定されたように実際の好中球 数が２．５以下であった。本発明の手順を使用すれば、これらの８つが２．５以 下の顆粒球レベルを有すると同定され、１６個はボーダーラインとみなされ、１ つ（実際の好中球数は２．４）は２．５よりも大きいとみなされた（このサンプ ルは後に再検査され、ボーダーラインであることかわかった）。

２．５よりも小さいとされた１つのサンプルは、実際には、わずかに高かった（ ２．８）。残りの１７２個のサンプルでは、４４個がボーダーラインであるとさ れ、２３個が２．６から３．０の好中球数を有していた。１１個は３．１と３゜ ５の間にあり、２個が３．６と４．０の間にあり、５個が４゜０と５．０の間に あり、３個が５．０よりも大きかった（これらの再度の検定で、これらは２．５ よりも大きい範鴫に属した）。残りの１２８個のサンプルは、２．５より大きい 好中球レベルを有するとされた。６個が２．５と３．０の間の好中球数を有し、 １２２個が３．０よりも大きい好中球数を何していた（表１及び図８を参照）。

サンプルＮｏ、　発色点数　判定　１好中球数２４コく２．５ サンプルＮｏ、　発色点数　判定　好中球数４４　４−　ＢＬ　２．９ ４８　４　２．８ ５４　４−　ＢＬ　５．５ ５４Ｒ４＞　５．５ ５５　４　ン　３，４ サンプルＮｏ、　発色点数　判定　好中球数５８　３＋　ＢＬ　２・９ ６２　４−　ＢＬ　２．５ ６コ　４　〉　コ、コ ロ４　コ＋　ＢＬ　２．７ Ｂ７　４，４４　６．５ サンプルＮｏ、　発色点数　判定　好中球数８８　４＋　＞　６．７ ８９　３＋　ＢＬ　２．４ ９２　４−　ＢＬ　２．８ ９コ　５＋　＞　８．０ ９コＲ５４＞　８．０ ９４　３＋　ＢＬ　１２ ９６　３＋　ＢＬ　２．０ １００Ｒ４＋　＞　３−８ １０１　コ＋　ＢＬ　２ｊ １１　４、コ＋　ＢＬ　３−Ｑ １１６　４　４、５ サンプルＮｏ、　発色点数　付定　好中球数１１６Ｒ４＞　４．５ １１７　５　〉　５．コ １１８　４−　ＢＬ　２・８ １１９　４．３＋　ＢＬ　コ、４ １２０　４．４−　ＢＬ　２．８ １２１、　５　＞　４．９ １２２　５　＞　４．０ １２２Ｒ４＋　＞　４．０ １２：ｌ　４　＞　２Ｊ １２４　５　＞　５−７ １２５　４　＞　４　、３ １２６　４　４．０ １２９　５＋　＞　７．コ １コＩＲ４４＞　６＋２ １３“Ｒ５・　７．Ｏ ｌコ５　３＋　ＢＬ　）、１ １３８　コ＋　ＢＬ　３．６ １４２　コ＋　ＢＬ　２ｊ １４コ　コ＋　ＢＬ　２．０ ：Ｌ４４　４　＞　２．６ サンプルＮｏ、　発色点数　判定　好中球数１４５　４　ＢＬ　Ｌ７ １４６　４．４　ＢＬ　２．４ １４７　４−　、ＢＬ　２．０ １４８　４　＞　２．９ １４９　６、５＋　＞　６，３ ユ５ｏ　４＋、５　＞　５．コ １５１　４−　ＢＬ　２，４ ！５２　４　＞　２．６ ユ５コ　６　＞　９．６ １５４　３＋　ＢＬ　４，４ １５５　４＋　＞　５．０ １５６　５　＞　５　、コ １５７　４　、　＞　３．３ １５８　４＋、５　＞　１．６ １５９　３＋　ＢＬ　１１ １６０　５　＞　５−６ １６１３＋　ＢＬ　２．９ １６２　４＋　＞　５．０ １６１　６　１０．７ １６４　６　６、８ １６４Ｒ６６Ｊ １６５　４　）　コー２ １６６　３◆　ＲＬ　２．２ １６７　４−、３毒　１１Ｌ　コ、２ ！６ａ　５−、４◆　７．４ １７２　３會、４−　ＢＬ　２．７ サンプルＮｏ、　発色点数　判定　好中球数１１　４　＞　２．４ １７コＲコ＋　ＢＬ　２．４ １８０　コ＋　ＢＬ　コ、コ １９０　コ＋　ＢＬ　６，９ １９２　コ＋　ＢＬ　４．２ １９６　コ＋　ＢＬ　４．３ １ｇ７　３＋　ＢＬ　３．０ １９８　］＋　ＢＬ　コ、４ １９９　５　Ｂ・９ サンプルＮｏ、　発色点数　判定　好中球数１９９Ｒ５−，５＞　８．９ ２００　３＋　ＢＬ　２．６ ＞　−２，５００細胞／ｍｍ３よりも大きい＜　−２，５００細胞／　ｍ　ｍ　 ３よりも小さいＢＬ　＝　ボーダーライン Ｒ−再試験サンプル １−　コールタ−カウンター法で決定された例ＶＩ　Ｉ　Ｉ 顆粒球レベルの評価 上述のように得られた血液サンプルを、５０ｍＭのｐＨ５゜０のクエン酸バッフ ァー、６２．５μＭアスコルビン酸、０゜００５％トリトンＸ−１００（登録商 標）　、３０ｍＭアミノトリアゾール、１ｍｇ／ｍ１ｏ−１リジン及び０．００ ０５％過酸化水素（過酸化水素のストック溶液が３０％であると仮定した）を含 有する試験溶液で処理した。色の発色は、試験溶液を添加した後、３０秒、１分 、及び２分で記録した。

各々のサンプルは、以下の基準により好中球数の４種類の範囲（〉２．２〜５． ５〜１０及び〉１０）の１つに割り当てられた。

ｉ、３０秒で色〉３　＝　好中球数〉１０ｉｉ、３０秒で色く３．１分で〉３　 ＝　２〜５の好中球数 ｔｉｉ、３０秒及び１分で色く′３．２分で〉３−２〜５の好中球数 ｉｖ、２分で色く３　＝　好中球数く２範囲ｉｉｉ及びｉｖは、発色点数が３以 上になる直前のときにおける色の発色の濃さを考慮することによって詳細に論じ られた。従って、サンプルが５〜１０の範囲に割り当てられ、発色点数が３０秒 で２＋又は３−である場合、サンプルはおそらく、この範囲の上限の近傍にある 。３０秒で１＋の発色点数によって、好中球数がこの範囲の下限にあることが示 唆される。同様に、２〜５の範囲では、１分で２＋又は３−の発色点数によって 、サンプルがおそらくこの範囲の上限にあることが示され、１＋の発色点数では 、好中球数が範囲の下限近傍にあることが示唆される。

好中球数を評価するこの方法を用いることによって、７つのサンプルが２以下で あるとか示された。これらの内の３つが１．５と２．０の間にあり、３つが２． １と２．５の間にあり、１つが２．６と３．０の間にあった。好中球数が３より 大きいサンプルはこの範囲には検出されなかった。１４３個のサンプルが２と５ の間の好中球数を有することがわかった。これらの内の５つは実際の好中球数が １．５〜２．０であり、４３個が２．１と３．０の間にあり、４２個が３．１と ４．０の間にあり、２５個が４．１から５．０の間にあり、１６個が５．１と６ ．０の間にあり、１２個が６．０をこえていた。４５個のサンプルが５と１０の 間の好中球を有すると評価された。これらの実際の好中球数は、４よりも小さい （２サンプル）、４．０と６．０の間（１５サンプル）、６゜１と８の間（１５ サンプル）、８．１と１０の間（８サンプル）１０．１と１１．０の間（４サン プル）、及び１１．０よりも多い（１サンプル）であった。残りの３つのサンプ ルの好中球数は１０よりも多いと評価された。これらの内の２つは、実際の好中 球数が１０よりも小さく　（８，０と６．８）、１つは１０よりも大きかった（ １２．７）（表２及び図９参照）。

表２．　好中球レベルの評価 サンプルＮ。、　発色点数　評価範囲　好中球数３０秒　１分　２分 ４　１４　２−　３中　２−５　ユＤ ５　１＋　ｌ＋　３＋　２−５Ｌ　１０ＩＩ　１＋　３　４　５−１ＯＬ　＆フ １コ　１◆　２＋、３−　４−　２−５Ｒ５Ａ１４　１４　３−　４４　５−１ ＯＬ　７Ｊコ８　１◆　２　３◆　２．５　Ｍ１ ３９１◆　２−３◆　２−４　ｉ。

４０　１４　２４　４−　２−５ＲＬＬ４１　１４　９　３　２−５Ｌ　ＺＪＩ ４コ　ユ４　２−　コ　２−％Ｍ ４３　１＋　２　３　２−５　２Ｊ ４４　１◆　”　コ　２−５Ｌ　１９ サンプルＮｏ、　発色点数　評価範囲　好中球数３０秒　１分　２分 １０９　９　１　４＋　２−５　工４ ）１０　！＋　２　コ◆　２−５　ユＤｌ工１１＋１◆、２−コ２−５ＸＤ １１２１◆　２◆、３−　４　２−５Ｈω１１コ　１４　２＋　４−　２−５Ｈ ｕユニ４　１◆　２　３◆　２−５　ユΩ１１５　１４　２−　３＋　２−５　 １扇１１６１４２コ２Ｊ４５ １１６Ｒ１４２４４−、コ＋　２−５８　４５１Ｘ７　１＊、２−　コー　４− 　５−４０Ｌ　五コ１１！ｌｌ＋１＋、２−３２−５２Ｊ 工！９　１４　２　３＋　２−５　１４１２０　１４　２　３÷　２−５　２ｊ １２ユ２−コ４Ｓ−１０４９ ユ２コ　２．２−　３−　４　５−１０　４０１２２Ｒ２−３４−５−１０ＪＪ コ １２コ　１◆　２　４−　２−５　２Ｊ１２４１＋、２−３−４５−１０ＬＬフ １２５１４コ４−、コ４２−５４３ １２６　１＋　２．２＋　４　２−５　４０１２９　コー　３４　４◆　５−１ ０　７コ１３０１◆　２−　４−　２−５　４！１３１　１４　２＋　４４　２ −５３（６２１３１ｊｌ　２−　コ、コー　５，４４　５−１０　＆２１コ２　 ユ◆　２，２−　４　２−５　Ｍエコ３　ユ◆　２．２−　４，４−　２−５　 ４４１３４　１＋　２４　４４　２−５１（７４）１コ４Ｒ２−コ、コ−５！； −１０Ｍ ｌコ５　工◆　１中　３◆　２−５Ｌ　ユユユ３６　１◆　２◆　４−　２−５ ８　４２サンプルＮｏ、　発色点数　評価範囲　好中球数３０秒　１分　２分 ｘ４１　１＋　２　４−　２４　４４ １４２　１＋　１＋　３＋　２−５Ｌ　２：１１４３　１＋　１＋　３−　２− ５Ｌ　２Ｊ１４６　１＋　ｉ◆３　２−５Ｌ　２Ｊ１４７　１◆　１◆　３　２ −５Ｌ　２Ｊ）１４８１◆　２　４−　２−５　２３ Ｘ５１　１）　１＋　３＋　２−５Ｋ、　２Ｊ１５２　１＋　９　３４　２−５ Ｌ　２４１５コ　２◆　コ＋　５　５−１０ＨＬ６１Ｓ４１↓　１◆　３＋　２ −５Ｌ　４４１５５　１ｊ、２−　２’　４４　２−５Ｈ５Ｊ）１５６　１◆　 ２◆　４４２−５Ｈ幻 １５７　１＋　１４．２−　４−　２−５　Ｘｊ１５８　１＋　３　Ｓ　Ｓ−１ ０Ｌ　フ、Ｂ１５９　１４　１◆４−　２−５Ｌ　Ｌ１１６０　１．２−　３− 　Ｓ　％−１０Ｌ　Ｌ６１６３　２争　４−　５◆、６　５−１°Ｈｎフユーコ 　１◆、２−　２＋　４−　２−５１４　４４１１１６　１＋　１＋、ｌ　−３ ＋　２−５　２＋１５Ｌ＝範囲の下限 Ｈ＝範囲の上限 Ｒ＝再試験サンプル 先の詳細な議論及び例で明らかなように、顆粒球破壊試薬及び指示薬の作用は、 単一の媒体中で混合されることが好ましい。この媒体は、好ましくは以下のよう にして調製される。

成分　濃度 バッフｙ−（ｐＨ４，０−７，０）　約５０ｍＭ染色供与色素　０．０８〜２． ０ｍｇ／ｍ１３−アミノ−１，２，４−３０〜７５ｍＭトリアゾール （阻害剤が必要な場合） 顆粒球破壊剤　約０．００１６７％〜 ０．０１６７％ 過酸　０．０００５〜 ０．０００６５％ 本発明は、本発明の意図又は本質的な特徴から逸脱することなく、多くの形態で 具体化しつる。従って、ここで述べた実施例は全ての点で例示であり、本発明を 同等制限するものではないと解釈されるべきである。本発明の範囲は、上記の説 明よりもむしろ、添付された請求の範囲によって示される。

従って、請求の範囲と同等の意味及び範囲が、本発明に包含され得るものである 。

ＦＩＧ、６ Ｏｇ　ＯＱ　♀　Ｒｇ：。

フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、　ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、 ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、ＳＤ、５Ｅ （７２）発明者　リチャーズ、ビー・ジーカナダ国、ブイ７ブイ・２ワイ６、プ リチッシュ・コロンビア州、ウェスト・バンク−バー、クィーンズ・アベニュー 　２３４２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．血液サンプル中における顆粒球の存在及びそのレベルを確認する方法であっ て、 パーオキサイド及び酸化感受性インジケータを含む検査培地を提供する工程と、 対照から血液サンプルを取り出す工程と、該血液サンプルを中和し、該サンプル 中における顆粒球の測定を妨害する成分を中和する工程と、この中和工程に続い て、該血液サンプル中の顆粒球を破壊し、該顆粒球中に存在する細胞内ミエロペ ルオキシダーゼを放出させる工程と、 この放出されたミエロペルオキシダーゼに前記検査培地中のパーオキサイド及び インジケータを接触させて、パーオキサイドと酸化感受性インジケータとの間の 反応を触媒することにより、前記インジケータの観察可能な特性を変化させる工 程と、 この反応の後に前記インジケータを検査して、該インジケータの観察可能な特性 の変化を、前記血液サンプル中における顆粒球の存在および／または濃度の証拠 として用いる工程とを具備した方法。 ２．請求項１に記載の方法であって、血液の他の成分に起因した顆粒球の存在確 認および濃度測定の妨害が、前記検査培地中に有効量のカタラーゼ阻害剤を含ま せることによって除去される方法。 ３．請求項２に記載の方法であって、前記カタラーゼ阻害剤が３−アミノ−１， ２，４−トリアゾールである方法。 ４．請求項３に記載の方法であって、前記検査培地中のカタラーゼ阻害剤濃度が 略３０〜７５ミリモルである方法。 ５．請求項１に記載の方法であって、前記サンプル中の顆粒球細胞は、前記検査 培地中の有効量の洗浄剤での処理のみによって破壊され、該細胞から前記ミエロ ペルオキシダーゼが放出される方法。 ６．請求項５に記載の方法であって、前記洗浄剤が臭化ヘキサデシルトリメチル アンモニウムまたはポリエチレンエーテル洗浄剤であり、前記洗浄剤の水溶液中 濃度が、０．００１６７〜０．０１６７パーセントの範囲である方法。 ７．請求項１に記載の方法であって、前記パーオキサイドが、過酸化尿素水素（ ｕｒｅａｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅ）、クメンヒドロパーオキサイド、 過酸化水素、またはグルコースに対するグルコースオキシダーゼの作用によって イン・ビトロで形成されたパーオキサイドである方法。 ８．請求項７に記載の方法であって、前記パーオキサイドが過酸化水素であり、 該過酸化水素は略０．０００５〜０．０００６５パーセントの濃度で前記検査培 地中に存在する方法。 ９．請求項１に記載の方法であって、前記酸化感受性インジケータが色素形成ド ナー染料（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｄｏｎｏｒｄｙｅ）である方法。 １０．請求項９に記載の方法であって、前記染料がＯ−トリジン、２，２′−ア ジノービス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）、または３，３′ ，５，５′−テトラメチルベンジジンである方法。 １１．請求項１に記載の方法であって、酸性ｐＨまたは塩基性ｐＨの化学種が前 記検査培地に添加され或いは前記検査培地中で生成する際の、該培地のｐＨ変化 を阻止するために有効な緩衝液を、前記検査培地中に含ませる工程を具備した方 法。 １２．請求項１１に記載の方法であって、前記緩衝液がリン酸塩混合物またはク エン酸塩混合物を含有する方法。 １３．請求項１２に記載の方法であって、前記緩衝液が、ｐＨ４，０〜５．０の クエン酸緩衝液またはｐＨ６，０〜７，０のリン酸緩衝液である方法。 １４．請求項１３に記載の方法であって、前記インジケータが０−トリジンであ り、また前記緩衝液はＰＨが略５．０のクエン酸緩衝液であり、且つ該緩衝液の 量は、前記インジケータの色変化が顆粒球細胞レベルの低いサンプル中の顆粒球 レベルを正確に反映するような量である方法。 １５．請求項１３に記載の方法であって、前記インジケータがＯ−トリジンであ り、また前記緩衝液はＰＨが略４，０のクエン酸緩衝液であり、且つ該緩衝液の 濃度は、前記インジケータの色変化が顆粒球細胞レベルの高いサンプル中の顆粒 球レベルを正確に反映するような濃度である方法。 １６．請求項１に記載の方法であって、前記検査培地が、該培地中におけるパー オキサイドのミエロペルオキシダーゼ触媒反応によって、前記酸化感受性インジ ケータの観察可能な特性に所定の強さの変化を生じる時点を制御するために有効 な量の水素ドナーを含有する方法。 １７．請求項１６に記載の方法であって、前記プロトンドナーが、１ミリモルよ りも高い濃度のアスコルビン酸である方法。 １８．請求項１に記載の方法であって、前記中和が、前記血液サンプル中の顆粒 球から、前記サンプル中の顆粒球レベルを反映する酸素感受性インジケータの観 察可能な特性の変化を妨害する望ましくない成分を分離することによって行なわ れる方法。 １９．請求項１８に記載の方法であって、前記望ましくない成分が、低張性溶解 によって分離される方法。 ２０．請求項１９に記載の方法であって、前記低張性溶解が、赤血球細胞の溶解 および妨害性の細胞構成物の除去を促進する−方、血液中に存在する顆粒球を残 存させるように、前記サンプルを水性媒質と接触させることによって行なわれる 方法。 ２１．請求項２０に記載の方法であって、前記望ましくない物質の除去が、血液 サンプルの溶解に用いる前記水性媒質に対して陽圧もしくは陰圧の何れか、或い は陽圧および陰圧の両者を適用することによって促進される方法。 ２２．請求項１に記載の方法であって、前記血液サンプル中の顆粒球レベルは、 前記酸素感受性インジケータの観察可能な特性における特定の変化を生じさせる のに必要な時間を観察することによって確認される方法。 ２３．請求項１に記載の方法であって、前記血液サンプル中の顆粒球レベルは、 所定の時間内に生じた、前記酸素感受性インジケータの観察可能な特性の変化を 観察することによって確認される方法。 ２４．請求項１に記載の方法であって、前記サンプルの顆粒球レベルは、前記酸 素感受性インジケータの観察可能な特性を、予め測定された標準値と比較するこ とによって確認される方法。 ２５．請求項１に記載の方法であって、前記インジケータの観察可能な特性が色 である方法。 ２６．請求項１に記載の方法であって、前記血液サンプルは、血液を抜き取り、 血液の凝集を阻止するように処理されたキャビラリーチューブで該血液のサンプ ルを採取することによって得られる方法。 ２７．請求項２６に記載の方法であって、前記キャビラリーチューブは、その内 面をシリコーン化することによって処理される方法。 ２８．請求項２６に記載の方法であって、前記キャビラリーチューブが抗凝血剤 で処理される方法。 ２９．請求項２８に記載の方法であって、前記抗凝血剤がＫ３ＥＤＴＡまたはヘ パリンナトリウムである方法。 ３０．血液サンプル中の顆粒球の存在を検出し、また該サンプル中の顆粒球濃度 を少なくとも半定量的に確認するための診断キットであって、 前記顆粒球の検出および前記顆粒球レベルの確認を妨害する能力をもった血液成 分を中和するための手段と、前記血液サンプル中の顆粒球を、該顆粒球から細胞 内ミエロペルオキシダーゼを放出するように破壊するための化学試薬と、 観察可能で且つ化学的に変化し得る特性をもったインジケータと、 前記ミエロペルオキシダーゼの存在および該ミエロペルオキシダーゼを放出した 顆粒球の存在を反映するようなインジケータの特性変化をもたらす化学反応を生 じるように、前記ミエロペルオキシダーゼによって触媒されることができるパー オキサイドとを具備した診断キット。 ３１．請求項３０に記載の診断キットであって、前記化学試薬、前記インジケー タおよび前記ペルオキサイドが検査培地の成分である診断キット。 ３２．請求項３１に記載の診断キットであって、前記検査培地はまた、酸性ｐＨ または塩基性ｐＨの化学種が前記検査培地に添加され或いは前記検査培地中で生 成する際の、該培地のｐＨ変化を阻止するために有効な緩衝液を含有する診断キ ット。 ３３．請求項３２に記載の診断キットであって、前記緩衝液がリン酸塩混合物ま たはクエン酸塩混合物を含有する診断キット。 ３４．請求項３１に記載の診断キットであって、前記インジケータが色素形成ド ナ−染料（ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｄｏｎｏｒｄｙｅ）であり、また前記検査培 地は、該培地中におけるパーオキサイドのミエロペルオキシダーゼに触媒された 還元によって前記インジケータの色変化が生じる時点を制御するために有効な量 のプロトンドナーを含有する診断キット。 ３５．請求項３０に記載の診断キットであって、対象から血液サンプルを採取す るための手段を具備した診断キット。 ３６．請求項３５に記載の診断キットであって、前記血液サンプルを採取するた めの手段が、対象から抜き取られた血液の凝血を阻止するように処理された目盛 り付きキャビラリーチューブである診断キット。 ３７．請求項３０に記載の診断キットであって、前記妨害する能力をもった血液 成分を中和するための手段が、前記血液サンプルから、該キットを用いて行なわ れる方法により与えられる結果を妨害する能力をもった成分を除去するための手 段を具備した診断キット。 ３８．請求項３７に記載の診断キットであって、前記血液サンプルから妨害する 能力をもった成分を除去するための手段が、前記血液サンプルを水性媒質で洗浄 するための手段を具備した診断キット。 ３９．請求項３８に記載の診断キットであって、前記妨害する能力をもった成分 の前記サンプルからの除去を促進するように、また後に残留する顆粒球を基体に 固定するように、前記水性媒質に対して陽圧もしくは陰圧またはこれらを組み合 わせて適用するための手段を具備した診断キット。 ４０．請求項３０に記載の診断キットであって、前記顆粒球の検出および血液サ ンプル中の顆粒球濃度の評価を容易にするように、前記血液サンプル中の顆粒球 を表面に固定化することができる、湿潤時にも構造的一体性を保持できる材料で 作られた多孔性基体を具備した診断キット。 ４１．請求項３０に記載の診断キットであって、前記インジケータは前記血液サ ンプル中の顆粒球の濃度を反映するように色が変ずる能力をもった色素形成ドナ ー染料であり、 更に、前記血液サンプル中の顆粒球濃度を同定するために、前記色素の発色に合 致したときにその顆粒球レベルを示す色をもつ色標準を具備した診断キット。 ４２．請求項３０に記載の診断キットであって、白血球の検出および顆粒球濃度 の確認を妨害する能力をもった血液成分を中和するための前記手段が、カタラー ゼ阻害剤である診断キット。 ４３．請求項４２に記載の診断キットであって、前記カタラーゼ阻害剤が３−ア ミノ−１，２，４−トリアゾールである診断キット。 ４４．請求項４２に記載の診断キットであって、顆粒球を破壊して細胞内ミエロ ペルオキシダーゼを放出させるための前記手段が、実質的に洗浄剤からなる診断 キット。 ４５．請求項４４に記載の診断キットであって、前記洗浄剤が臭化ヘキサデシル トリメチルアンモニウムまたはポリエチレンエーテル洗浄剤であり、該洗浄剤の 検査培地中濃度が０．００１６７〜０．０１６７パーセントの範囲である方法。 ４６．請求項３０に記載の診断キットであって、前記パーオキサイドが、過酸化 尿素水素（ｕｒｅａｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅ）、クメンヒドロパーオ キサイド、過酸化水素、またはグルコースに対するグルコースオキシダーゼの作 用によって生成したイン・ビトロのパーオキサイドである診断キット。 ４７．請求項４６に記載の診断キットであって、前記パーオキサイドが過酸化水 素である診断キット。 ４８．請求項３０に記載の診断キットであって、前記インジケータが色素形成ド ナー染料である診断キット。 ４９．請求項４８に記載の診断キットであって、前記染料が、Ｏ−トリジン、２ ，２′−アジノービス（３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸）、また は３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジンである診断キット。 ５０．顆粒球のための検査培地であって、頚粒球の細胞内ミエロペルオキシダー ゼを利用可能とするように、機械的補助なしで、血液サンプル中の顆粒球を破壊 するための洗浄剤と、 パーオキサイドと、 色素形成ドナー染料であって、前記洗浄剤により利用可能とされたミエロペルオ キシダーゼが前記バーオキサイドおよび前記染料の間の酸化還元反応を触媒する ことによって、前記染料に、前記サンプル中における顆粒球の存在およびそのレ ベルを反映する色変化が生じるように処方された色素形成ドナー染料とを含有す る検査培地。 ５１．請求項５０に記載の検査培地であって、検査の結果を妨害する能力を有す るサンプル成分の影響を中和する有効長のカタラーゼ阻害剤をも含有した検査培 地。 ５２．請求項５１に記載の検査培地であって、前記カタラーゼ阻害剤が、３−ア ミノ−１，２，４−トリアゾールである検査培地。 ５３．請求項５２に記載の検査培地であって、検査培地中の前記カタラーゼ阻害 剤の濃度が略７５ミリモルである検査培地。 ５４．請求項５０に記載の検査培地であって、顆粒球を破壊するために与えられ る前記洗浄剤が、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムまたはポリエチレン エーテル洗浄剤であり、該洗浄剤の検査培地中濃度が０．００１６７〜０．０１ ６７パーセントである検査培地。 ５５．請求項５０に記載の検査培地であって、前記パーオキサイドが過酸化尿素 水素（ｕｒｅａｈｙｄｒｏｇｅｎｐｅｒｏｘｉｄｅ）、クメンヒドロパーオキサ イド、過酸化水素、またはグルコースに対するグルコースオキシダーゼの作用に よってイン・ビトロで形成されたパーオキサイドである検査培地。 ５６．請求項５５に記載の検査培地であって、前記パーオキサイドが過酸化水素 であり、また該過酸化水素は約０．０００５〜０．０００６５パーセントの濃度 で存在する検査培地。 ５７．請求項５０に記載の検査培地であって、前記色素形成ドナー染料が、０． ０８〜２．０ｍｇ／ｍｌの濃度のＯ−トリジンである検査培地。 ５８．請求項５０に記載の検査培地であって、前記緩衝液がｐＨ４．０〜５．０ のクエン酸緩衝液である検査培地。 ５９．請求項５０に記載の検査培地であって、前記緩衝液がｐＨ６．０〜７．０ のリン酸緩衝液である検査培地。 ６０．請求項５０に記載の検査培地であって、前記パーオキサイドのミエロペル オキシダーゼに促進された反応によって前記色素形成ドナー染料の発色が生じる 時点を制御するために有効な量のプロトンドナーをも含有する検査培地。 ６１．請求項６０に記載の検査培地であって、前記プロトンドナーが、略１ｍＭ の濃度のアスコルビン酸である検査培地。 ６２．下記成分を下記濃度出金有する検査培地。 成分　　　　　　　　　　　　　　濃度緩衝液（ｐＨ４．０−７．０）　　略５ ０ｍＭ色素形成ドナー染料　　　　　　　０．０８−２．０ｍｇ／ｍｌ顆粒球破 壊剤　　　　　　　　　　略０．００１６７−０．０１６７％パーオキサイド　 　　　　　　　　０．０００５−０．０００６５％６３．請求項６２に記載の検 査培地であって、３０〜７５ｍＭの濃度の３−アミノ−１，２，４−トリアゾー ルを含有する検査培地。 ６４．請求項６２に記載の検査培地であって、前記緩衝液がクエン酸緩衝液であ り、４．０〜５．０の範囲のｐＨを有する検査培地。 ６５．請求項６２に記載の検査培地であって、前記緩衝液がリン酸緩衝液であり 、６．０〜７．０の範囲のｐＨを有する検査培地。 ６６．請求項６２に記載の検査培地であって、前記色素形成染料が０．０８〜２ ．０ｍｇ／ｍｌの濃度のＯ−トルイジンである検査培地。 ６７．請求項６２に記載の検査培地であって、前記顆粒球破壊剤が、略０．００ ５パーセントの濃度のポリエチレンエーテル洗浄剤である検査培地。 ６８．請求項６２に記載の検査培地であって、前記白血球破壊剤が、略０．００ ５パーセントの濃度の臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムである検査培地 。 ６９．請求項６２に記載の検査培地であって、前記パーオキサイドが、０．００ ０５〜０．０００６５パーセントの濃度の３０パーセント過酸化水素である検査 培地。