JPH0735754A - 細胞診断用合成マーカー - Google Patents
細胞診断用合成マーカーInfo
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- JPH0735754A JPH0735754A JP17698893A JP17698893A JPH0735754A JP H0735754 A JPH0735754 A JP H0735754A JP 17698893 A JP17698893 A JP 17698893A JP 17698893 A JP17698893 A JP 17698893A JP H0735754 A JPH0735754 A JP H0735754A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 安価で入手が容易な細胞診断用合成マーカー
を提供する。 【構成】 ポリビニルベンジルラクトンアミドに蛍光色
素を固定してなる細胞診断用合成マーカー。この合成マ
ーカーは、特に肝細胞との親和性が高く、肝細胞及び肝
癌診断に使用するのが好ましい。 【効果】 複雑な操作なしで合成できるため、製造コス
トがかからず安価であり容易に入手できる。また、特に
肝細胞表面に存在するアシアロ糖タンパク質レセプター
と、天然リガンドを凌ぐ高い親和性を有しているため、
肝細胞診断に有効使用でき、さらに、肝癌細胞を標識し
た場合、その癌種によって異なった強度の蛍光を発する
ため、肝癌診断及び癌種の識別に非常に有効に使用でき
る。
を提供する。 【構成】 ポリビニルベンジルラクトンアミドに蛍光色
素を固定してなる細胞診断用合成マーカー。この合成マ
ーカーは、特に肝細胞との親和性が高く、肝細胞及び肝
癌診断に使用するのが好ましい。 【効果】 複雑な操作なしで合成できるため、製造コス
トがかからず安価であり容易に入手できる。また、特に
肝細胞表面に存在するアシアロ糖タンパク質レセプター
と、天然リガンドを凌ぐ高い親和性を有しているため、
肝細胞診断に有効使用でき、さらに、肝癌細胞を標識し
た場合、その癌種によって異なった強度の蛍光を発する
ため、肝癌診断及び癌種の識別に非常に有効に使用でき
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、細胞診断用マーカーに
関し、特にフローサイトメトリーでの肝細胞の標識に用
いられる、蛍光物質を固定した糖質を有する合成マーカ
ーに関する。
関し、特にフローサイトメトリーでの肝細胞の標識に用
いられる、蛍光物質を固定した糖質を有する合成マーカ
ーに関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞生物学、細胞免疫学、癌の細胞診断
などの分野において、取り扱う細胞を、その大きさや形
態、生物学的活性等の性質によって分類し、これらを明
確に識別して目的とする細胞群のみを分取することは非
常に重要である。
などの分野において、取り扱う細胞を、その大きさや形
態、生物学的活性等の性質によって分類し、これらを明
確に識別して目的とする細胞群のみを分取することは非
常に重要である。
【０００３】近年、そのような分類を行う有力な手段と
して、フローサイトメトリーが知られている。このフロ
ーサイトメトリーでは、蛍光色素で標識した細胞を、１
個ずつ遊離した形で細管を通過させ、その細胞にレーザ
ー光線等をあてることにより発した蛍光の強弱により、
細胞に関する種々の情報を得ることができる。
して、フローサイトメトリーが知られている。このフロ
ーサイトメトリーでは、蛍光色素で標識した細胞を、１
個ずつ遊離した形で細管を通過させ、その細胞にレーザ
ー光線等をあてることにより発した蛍光の強弱により、
細胞に関する種々の情報を得ることができる。
【０００４】細胞にレーザー光線等を照射した時、照射
光線の軸方向の光である前方散乱光と、軸に直角な方向
に発生した光である側方散乱光の２種の光が検出され
る。この前方散乱光は細胞の大きさを、側方散乱光は細
胞質の状態を反映するものである。また、これらとは別
に、細胞に固定された蛍光色素にレーザー光等があたる
ことによって発生する蛍光も検知され、その蛍光強度は
細胞の生物学的活性を表すものである。
光線の軸方向の光である前方散乱光と、軸に直角な方向
に発生した光である側方散乱光の２種の光が検出され
る。この前方散乱光は細胞の大きさを、側方散乱光は細
胞質の状態を反映するものである。また、これらとは別
に、細胞に固定された蛍光色素にレーザー光等があたる
ことによって発生する蛍光も検知され、その蛍光強度は
細胞の生物学的活性を表すものである。
【０００５】一般に、細胞表面には種々のタイプのレセ
プターが散在しており、それらのレセプターの分布状態
によって細胞の生物学的活性が異なるといわれている。
フローサイトメトリーで測定される細胞表面には、マー
カーあるいは標識剤と呼ばれる物質が結合している。こ
のマーカーは、細胞表面に存在する特定のレセプターと
特異的親和性を有する物質に蛍光色素等の発色団を結合
してなるものである。
プターが散在しており、それらのレセプターの分布状態
によって細胞の生物学的活性が異なるといわれている。
フローサイトメトリーで測定される細胞表面には、マー
カーあるいは標識剤と呼ばれる物質が結合している。こ
のマーカーは、細胞表面に存在する特定のレセプターと
特異的親和性を有する物質に蛍光色素等の発色団を結合
してなるものである。
【０００６】細胞をこのマーカーとともに処理すること
により、細胞表面のレセプターにマーカーが結合し、蛍
光色素で標識される。その標識された細胞の表面蛍光強
度の変化を、上記のフローサイトメーターで測定し、レ
セプターの密度や活性を知ることができる。従って、こ
のマーカーとして用いられる物質としては、目的とする
レセプターに対して特異的な親和性を有するものでなけ
ればならない。
により、細胞表面のレセプターにマーカーが結合し、蛍
光色素で標識される。その標識された細胞の表面蛍光強
度の変化を、上記のフローサイトメーターで測定し、レ
セプターの密度や活性を知ることができる。従って、こ
のマーカーとして用いられる物質としては、目的とする
レセプターに対して特異的な親和性を有するものでなけ
ればならない。
【０００７】そのような特異的結合の一例として抗原−
抗体反応があり、従来から用いられているマーカーは、
その抗原−抗体反応を利用して製造したモノクローナル
抗体に蛍光色素を固定したものであった。しかしなが
ら、モノクローナル抗体は、その製造には非常に手間が
かかり、従ってモノクローナル抗体を使用した従来のマ
ーカーは、極めて高価なため入手が困難であった。
抗体反応があり、従来から用いられているマーカーは、
その抗原−抗体反応を利用して製造したモノクローナル
抗体に蛍光色素を固定したものであった。しかしなが
ら、モノクローナル抗体は、その製造には非常に手間が
かかり、従ってモノクローナル抗体を使用した従来のマ
ーカーは、極めて高価なため入手が困難であった。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】よって、本発明におけ
る課題は、細胞表面のレセプターと特異的親和性を有
し、細胞診断のマーカーとして使用することができ、な
おかつ安価で入手が容易な細胞診断用合成マーカーを提
供することにある。
る課題は、細胞表面のレセプターと特異的親和性を有
し、細胞診断のマーカーとして使用することができ、な
おかつ安価で入手が容易な細胞診断用合成マーカーを提
供することにある。
【０００９】
【課題を解決するための手段】かかる課題は、ポリビニ
ルベンジルラクトンアミドに蛍光色素を固定してなるこ
とを特徴とする細胞診断用合成マーカーによって解決で
きる。
ルベンジルラクトンアミドに蛍光色素を固定してなるこ
とを特徴とする細胞診断用合成マーカーによって解決で
きる。
【００１０】以下に本発明の細胞診断用合成マーカーに
ついて詳細に説明する。本発明の合成マーカーは、下式
で示されるポリビニルベンジルラクトンアミド（以後Ｐ
ＶＬＡと略記する）に蛍光色素を固定してなることを特
徴とする。
ついて詳細に説明する。本発明の合成マーカーは、下式
で示されるポリビニルベンジルラクトンアミド（以後Ｐ
ＶＬＡと略記する）に蛍光色素を固定してなることを特
徴とする。
【００１１】
【化１】
【００１２】本発明の合成マーカーをなすＰＶＬＡは、
スチレン誘導体ポリマーであるポリビニルベンジルアミ
ンを主鎖とし、そのアミノ基とラクトースの末端カルボ
キシル基とがアミド結合して側鎖を形成している。この
ＰＶＬＡは、そのモノマーであるＮ−ｐ−ビニルベンジ
ル−ｏ−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１−４）−Ｄ
−グルコンアミドを単独重合して合成するのが好まし
い。このＰＶＬＡの分子量は、水溶液中に溶解した際に
ミセルを形成し可溶化する程度であれば特に限られるも
のではないが、通常は３万から５万程度のものが用いら
れる。
スチレン誘導体ポリマーであるポリビニルベンジルアミ
ンを主鎖とし、そのアミノ基とラクトースの末端カルボ
キシル基とがアミド結合して側鎖を形成している。この
ＰＶＬＡは、そのモノマーであるＮ−ｐ−ビニルベンジ
ル−ｏ−ｂ−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１−４）−Ｄ
−グルコンアミドを単独重合して合成するのが好まし
い。このＰＶＬＡの分子量は、水溶液中に溶解した際に
ミセルを形成し可溶化する程度であれば特に限られるも
のではないが、通常は３万から５万程度のものが用いら
れる。
【００１３】このＰＶＬＡに、フルオレセインイソチオ
シアネート（ＦＩＴＣと略記）等の蛍光色素を固定す
る。その方法としては、例えば、微量のピリジンを添加
した溶媒にＰＶＬＡを溶解し、その溶液にＦＩＴＣをジ
ブチルスズジラウレート等の触媒とともに加えて加熱す
る。得られた反応混合液からエタノール中で数回再結晶
させて濾過することにより、本発明の合成マーカーを得
ることができる。このＦＩＴＣの含有量は、特に限定さ
れないが、その含有量を多くすると感度良く検知でき
る。好ましくは、ＰＶＬＡ中のラクトース２０〜２００
分子に対してＦＩＴＣ１分子程度、さらに好ましくはラ
クトース４０〜６０分子にＦＩＴＣ１分子とする。ま
た、蛍光色素はＦＩＴＣに限られることはなく、テトラ
メチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣと略
記）やフィコエリトリン（ＰＥと略記）等が好適に用い
られる。
シアネート（ＦＩＴＣと略記）等の蛍光色素を固定す
る。その方法としては、例えば、微量のピリジンを添加
した溶媒にＰＶＬＡを溶解し、その溶液にＦＩＴＣをジ
ブチルスズジラウレート等の触媒とともに加えて加熱す
る。得られた反応混合液からエタノール中で数回再結晶
させて濾過することにより、本発明の合成マーカーを得
ることができる。このＦＩＴＣの含有量は、特に限定さ
れないが、その含有量を多くすると感度良く検知でき
る。好ましくは、ＰＶＬＡ中のラクトース２０〜２００
分子に対してＦＩＴＣ１分子程度、さらに好ましくはラ
クトース４０〜６０分子にＦＩＴＣ１分子とする。ま
た、蛍光色素はＦＩＴＣに限られることはなく、テトラ
メチルローダミンイソチオシアネート（ＲＩＴＣと略
記）やフィコエリトリン（ＰＥと略記）等が好適に用い
られる。
【００１４】本発明の合成マーカーは、特に、肝細胞表
面に存在するアシアロ糖タンパク質レセプターと特異的
に結合し、その結合を仲介として肝細胞と非常に高い親
和性を示す。従って本発明の合成マーカーは、肝細胞表
面のアシアロ糖タンパク質レセプターを標識し、肝細胞
診断に使用するのが好ましい。
面に存在するアシアロ糖タンパク質レセプターと特異的
に結合し、その結合を仲介として肝細胞と非常に高い親
和性を示す。従って本発明の合成マーカーは、肝細胞表
面のアシアロ糖タンパク質レセプターを標識し、肝細胞
診断に使用するのが好ましい。
【００１５】ここで、アシアロ糖タンパク質とは、シア
ル酸を含む糖タンパク質からシアル酸が取り除かれたも
ののことである。一般に、血清糖タンパク質が血流中に
安定に存在するためにはシアル酸が必要であり、シアル
酸を欠いた血清糖タンパク質、即ちアシアロ糖タンパク
質は、肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質レセプターに
特異的に結合した後、肝細胞内に取り込まれて分解され
る。従って、肝細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質
レセプターの活性を検知することは代謝機能診断上非常
に重要である。
ル酸を含む糖タンパク質からシアル酸が取り除かれたも
ののことである。一般に、血清糖タンパク質が血流中に
安定に存在するためにはシアル酸が必要であり、シアル
酸を欠いた血清糖タンパク質、即ちアシアロ糖タンパク
質は、肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質レセプターに
特異的に結合した後、肝細胞内に取り込まれて分解され
る。従って、肝細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質
レセプターの活性を検知することは代謝機能診断上非常
に重要である。
【００１６】本発明の合成マーカーで肝細胞表面のアシ
アロ糖タンパク質レセプターを標識するためには、例え
ば、本発明の合成マーカーをリン酸緩衝液（ＰＢＳと略
記）中に溶解し、その溶液を肝細胞を懸濁したＰＢＳに
加えて、冷却下で時々攪拌すればよい。その混合比は、
１００×１０4個の肝細胞に対し、０．１重量％の合成
マーカー溶液を１００μｌ程度とするのが好ましいが、
特に限られるものではない。
アロ糖タンパク質レセプターを標識するためには、例え
ば、本発明の合成マーカーをリン酸緩衝液（ＰＢＳと略
記）中に溶解し、その溶液を肝細胞を懸濁したＰＢＳに
加えて、冷却下で時々攪拌すればよい。その混合比は、
１００×１０4個の肝細胞に対し、０．１重量％の合成
マーカー溶液を１００μｌ程度とするのが好ましいが、
特に限られるものではない。
【００１７】このようにして、本発明の合成マーカーで
標識した肝細胞は、フローサイトメトリーによって測定
するのが好ましく、それによって特に肝細胞表面に存在
するアシアロ糖タンパク質レセプターの活性、変質、密
度などを定量的に知ることができ、代謝機能の診断に有
効な情報を得ることができる。
標識した肝細胞は、フローサイトメトリーによって測定
するのが好ましく、それによって特に肝細胞表面に存在
するアシアロ糖タンパク質レセプターの活性、変質、密
度などを定量的に知ることができ、代謝機能の診断に有
効な情報を得ることができる。
【００１８】また、本発明の合成マーカーは、肝癌細胞
の標識に使用した場合、その肝癌の種類によって異なっ
た強度の蛍光を発するため、この合成マーカーで標識す
るだけで癌種の識別が可能になる。
の標識に使用した場合、その肝癌の種類によって異なっ
た強度の蛍光を発するため、この合成マーカーで標識す
るだけで癌種の識別が可能になる。
【００１９】本発明の細胞診断用合成マーカーは、従来
のような複雑な操作なしで合成されるため入手が容易で
ある。また、本発明の合成マーカーは、特に肝細胞表面
に存在するアシアロ糖タンパク質レセプターを介して、
肝細胞と高い親和性を有するので、肝細胞及び肝癌の診
断に有効である。
のような複雑な操作なしで合成されるため入手が容易で
ある。また、本発明の合成マーカーは、特に肝細胞表面
に存在するアシアロ糖タンパク質レセプターを介して、
肝細胞と高い親和性を有するので、肝細胞及び肝癌の診
断に有効である。
【００２０】以下に実施例を示し、本発明の合成マーカ
ーを具体的に説明する。 （実施例１）本発明の合成マーカーを、以下のようにし
て合成した。 （１）ＰＶＬＡの合成 まず、モノマーであるＮ−ｐ−ビニルベンジル−ｏ−ｂ
−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１−４）−Ｄ−グルコン
アミドを、公知の方法（小林一清ら、ポリマー・ジャー
ナル、第１７巻、５６７〜５７５ページ、１９８５年）
に従って合成した。次に、このモノマーを単独重合して
ＰＶＬＡを合成した。
ーを具体的に説明する。 （実施例１）本発明の合成マーカーを、以下のようにし
て合成した。 （１）ＰＶＬＡの合成 まず、モノマーであるＮ−ｐ−ビニルベンジル−ｏ−ｂ
−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１−４）−Ｄ−グルコン
アミドを、公知の方法（小林一清ら、ポリマー・ジャー
ナル、第１７巻、５６７〜５７５ページ、１９８５年）
に従って合成した。次に、このモノマーを単独重合して
ＰＶＬＡを合成した。
【００２１】（２）蛍光色素の固定 ３滴のピリジンを添加した５ｍｌの乾燥ジメチルスルホ
キシドに５００ｍｇのＰＶＬＡ（１０×１０-3のモノマ
ーユニットに対応する）を溶解した。その溶液に５０ｍ
ｇのＦＩＴＣ（和光純薬工業製）加え、さらに１５ｍｇ
のジブチルスズジラウレートを加えた後、９０℃で２時
間加熱した。得られた反応混合液からエタノール中で数
回再結晶させて濾過することにより、本発明の合成マー
カーを得た。
キシドに５００ｍｇのＰＶＬＡ（１０×１０-3のモノマ
ーユニットに対応する）を溶解した。その溶液に５０ｍ
ｇのＦＩＴＣ（和光純薬工業製）加え、さらに１５ｍｇ
のジブチルスズジラウレートを加えた後、９０℃で２時
間加熱した。得られた反応混合液からエタノール中で数
回再結晶させて濾過することにより、本発明の合成マー
カーを得た。
【００２２】このようにして合成した本発明の合成マー
カーに固定されたＦＩＴＣ量を、蛍光分光光度計（ＲＦ
−５００、島津製作所製）を用いて測定した。その結
果、ＰＶＬＡポリマー中のラクトース４０分子に付き１
分子の割合で固定されていることがわかった。
カーに固定されたＦＩＴＣ量を、蛍光分光光度計（ＲＦ
−５００、島津製作所製）を用いて測定した。その結
果、ＰＶＬＡポリマー中のラクトース４０分子に付き１
分子の割合で固定されていることがわかった。
【００２３】次に、本発明の合成マーカーを０．１重量
％となるように、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡと略記）
とＮａＮ3を含むＰＢＳに溶解した。肝細胞として、ラ
ット肝実質細胞を用い、それをＰＢＳ中に懸濁し、遠心
して濃縮した。１００×１０4個の細胞を懸濁したＰＢ
Ｓ中に、上記の合成マーカー溶液１００ｍｌを加えた。
その混合液１００ｍｌを、アイスバス中で、時々攪拌し
ながら４０分間、４℃に冷却し、肝細胞を本発明の合成
マーカーで標識した。標識した肝細胞は、ＮａＮ3を含
む冷却したＰＢＳで２回洗浄し、５０×１０4細胞／ｍ
ｌに希釈した。
％となるように、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡと略記）
とＮａＮ3を含むＰＢＳに溶解した。肝細胞として、ラ
ット肝実質細胞を用い、それをＰＢＳ中に懸濁し、遠心
して濃縮した。１００×１０4個の細胞を懸濁したＰＢ
Ｓ中に、上記の合成マーカー溶液１００ｍｌを加えた。
その混合液１００ｍｌを、アイスバス中で、時々攪拌し
ながら４０分間、４℃に冷却し、肝細胞を本発明の合成
マーカーで標識した。標識した肝細胞は、ＮａＮ3を含
む冷却したＰＢＳで２回洗浄し、５０×１０4細胞／ｍ
ｌに希釈した。
【００２４】このようにして、本発明の合成マーカーで
標識した肝細胞の蛍光強度を、フローサイトメーター
（ＦＡＣＳｃａｎ、ベクトン・ディッキンソン・イムノ
サイトメトリー・システム社製）で測定した。その結果
を、横軸に蛍光強度、縦軸に細胞数をとったヒストグラ
ムとして図１（Ａ）に示す。比較のため、未処理の肝細
胞で測定した結果を、同様に図１（Ｂ）に示す。本発明
の合成マーカーで標識した肝細胞（Ａ）は、未処理の肝
細胞（Ｂ）に比較して明らかに蛍光強度が増加してお
り、本発明の合成マーカーが有効に肝細胞を標識してい
ることがわかる。
標識した肝細胞の蛍光強度を、フローサイトメーター
（ＦＡＣＳｃａｎ、ベクトン・ディッキンソン・イムノ
サイトメトリー・システム社製）で測定した。その結果
を、横軸に蛍光強度、縦軸に細胞数をとったヒストグラ
ムとして図１（Ａ）に示す。比較のため、未処理の肝細
胞で測定した結果を、同様に図１（Ｂ）に示す。本発明
の合成マーカーで標識した肝細胞（Ａ）は、未処理の肝
細胞（Ｂ）に比較して明らかに蛍光強度が増加してお
り、本発明の合成マーカーが有効に肝細胞を標識してい
ることがわかる。
【００２５】（実施例２）本発明の合成マーカーが、肝
細胞表面に存在するアシアロ糖タンパク質レセプターに
特異的に結合していることを確認するために、アシアロ
糖タンパク質とそのレセプターの結合形成に不可欠なＣ
ａ2+イオンの有無による蛍光強度の違いを評価した。結
果を図２に示す。図２において、横軸は肝細胞の標識処
理時の合成マーカーの濃度であり、縦軸は、合成マーカ
ー濃度が０．１重量％のときの蛍光強度を１００％とし
て計算した相対蛍光強度である。
細胞表面に存在するアシアロ糖タンパク質レセプターに
特異的に結合していることを確認するために、アシアロ
糖タンパク質とそのレセプターの結合形成に不可欠なＣ
ａ2+イオンの有無による蛍光強度の違いを評価した。結
果を図２に示す。図２において、横軸は肝細胞の標識処
理時の合成マーカーの濃度であり、縦軸は、合成マーカ
ー濃度が０．１重量％のときの蛍光強度を１００％とし
て計算した相対蛍光強度である。
【００２６】Ｃａ2+イオンがある場合（Ａ）は、処理時
のＰＶＬＡ濃度が０．００１重量％であっても高い蛍光
強度を示しているが、Ｃａ2+イオンが無い場合（Ｂ）に
は、全般的に蛍光強度が低く、合成マーカー濃度の減少
にともなう蛍光強度の低下も著しかった。従って、本発
明の合成マーカーによる標識は、肝細胞表面に存在する
アシアロ糖タンパク質レセプターを仲介としてなされて
いることが確認された。
のＰＶＬＡ濃度が０．００１重量％であっても高い蛍光
強度を示しているが、Ｃａ2+イオンが無い場合（Ｂ）に
は、全般的に蛍光強度が低く、合成マーカー濃度の減少
にともなう蛍光強度の低下も著しかった。従って、本発
明の合成マーカーによる標識は、肝細胞表面に存在する
アシアロ糖タンパク質レセプターを仲介としてなされて
いることが確認された。
【００２７】（実施例３）標識すべき肝細胞を、ＰＶＬ
Ａ、アシアロフェツイン、フェツインで前処理した後、
本発明の合成マーカーで標識処理した肝細胞について評
価した。アシアロフェツインとは、アシアロ糖タンパク
質レセプターの天然リガンドであり、フェツインとは、
そのアシアロフェツインにシアル酸が結合したものであ
る。この前処理は、上記各物質を０．０１重量％、ＢＳ
Ａを０．１重量％、及びＮａＮ3を０．１重量％含むＰ
ＢＳ中に肝細胞を懸濁し、４℃で４０分間行った。
Ａ、アシアロフェツイン、フェツインで前処理した後、
本発明の合成マーカーで標識処理した肝細胞について評
価した。アシアロフェツインとは、アシアロ糖タンパク
質レセプターの天然リガンドであり、フェツインとは、
そのアシアロフェツインにシアル酸が結合したものであ
る。この前処理は、上記各物質を０．０１重量％、ＢＳ
Ａを０．１重量％、及びＮａＮ3を０．１重量％含むＰ
ＢＳ中に肝細胞を懸濁し、４℃で４０分間行った。
【００２８】このように前処理した肝細胞を、実施例１
と同様に本発明の合成マーカーで標識処理し、フローサ
イトメトリー測定を行った。その結果を、前処理なしで
標識した肝細胞の蛍光強度に対する相対強度（％）で表
し、表１にまとめて示す。
と同様に本発明の合成マーカーで標識処理し、フローサ
イトメトリー測定を行った。その結果を、前処理なしで
標識した肝細胞の蛍光強度に対する相対強度（％）で表
し、表１にまとめて示す。
【００２９】
【００３０】本発明の合成マーカーをなすＰＶＬＡで前
処理したものは、肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質レ
セプターが、ＰＶＬＡによって塞がれているため、その
後の標識処理で結合する合成マーカー量が減少し、相対
蛍光強度が著しく低下している。それに対して、アシア
ロフェツインで前処理した肝細胞では、蛍光強度の低下
が少なく、フェツインで前処理した肝細胞では蛍光強度
の変化は殆ど見られない。即ち、本発明の合成マーカー
をなすＰＶＬＡは、アシアロ糖タンパク質レセプターに
対して、天然リガンドであるアシアロフェツインよりも
大きな親和性を有していることがわかった。
処理したものは、肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質レ
セプターが、ＰＶＬＡによって塞がれているため、その
後の標識処理で結合する合成マーカー量が減少し、相対
蛍光強度が著しく低下している。それに対して、アシア
ロフェツインで前処理した肝細胞では、蛍光強度の低下
が少なく、フェツインで前処理した肝細胞では蛍光強度
の変化は殆ど見られない。即ち、本発明の合成マーカー
をなすＰＶＬＡは、アシアロ糖タンパク質レセプターに
対して、天然リガンドであるアシアロフェツインよりも
大きな親和性を有していることがわかった。
【００３１】（実施例４）本発明の合成マーカーで標識
した肝癌細胞を用いてフローサイトメーターで測定を行
った。標識処理の方法は実施例１と同様にした。用いた
癌細胞の種類は、ヒト由来のＨｅｐ Ｇ２とＣｈａｎｇ
Ｌｉｖｅｒとした。その結果を、Ｈｅｐ Ｇ２につい
ては図３（Ａ）に、Ｃｈａｎｇ Ｌｉｖｅｒについては
図４（Ａ）に示した。結果は、ラットの通常肝細胞を
０．１重量％の合成マーカーで標識したときの蛍光強度
に対する相対強度で表した。
した肝癌細胞を用いてフローサイトメーターで測定を行
った。標識処理の方法は実施例１と同様にした。用いた
癌細胞の種類は、ヒト由来のＨｅｐ Ｇ２とＣｈａｎｇ
Ｌｉｖｅｒとした。その結果を、Ｈｅｐ Ｇ２につい
ては図３（Ａ）に、Ｃｈａｎｇ Ｌｉｖｅｒについては
図４（Ａ）に示した。結果は、ラットの通常肝細胞を
０．１重量％の合成マーカーで標識したときの蛍光強度
に対する相対強度で表した。
【００３２】比較のため、ＦＩＴＣを固定したアシアロ
フェツインで標識した同様の肝癌細胞についても測定
し、結果を図３（Ｂ）及び図４（Ｂ）に示す。これらの
結果からわかるように、アシアロフェツインで標識した
肝癌細胞は、その種類によらず同様の強度の蛍光を発す
るが、本発明の合成マーカーで標識した場合は、癌種に
よって蛍光強度が異なり、Ｈｅｐ Ｇ２を用いた方がＣ
ｈａｎｇ Ｌｉｖｅｒを用いたものより強い蛍光を発す
ることがわかった。
フェツインで標識した同様の肝癌細胞についても測定
し、結果を図３（Ｂ）及び図４（Ｂ）に示す。これらの
結果からわかるように、アシアロフェツインで標識した
肝癌細胞は、その種類によらず同様の強度の蛍光を発す
るが、本発明の合成マーカーで標識した場合は、癌種に
よって蛍光強度が異なり、Ｈｅｐ Ｇ２を用いた方がＣ
ｈａｎｇ Ｌｉｖｅｒを用いたものより強い蛍光を発す
ることがわかった。
【００３３】これらの結果を定量的に表すため、例え
ば、本発明の合成マーカー０．０１重量％で標識処理し
た場合の相対蛍光強度と、ＦＩＴＣを固定したアシアロ
フェツイン０．００１重量％で標識した場合の相対蛍光
強度を、各々の癌細胞及びラットの通常細胞について表
２に示す。
ば、本発明の合成マーカー０．０１重量％で標識処理し
た場合の相対蛍光強度と、ＦＩＴＣを固定したアシアロ
フェツイン０．００１重量％で標識した場合の相対蛍光
強度を、各々の癌細胞及びラットの通常細胞について表
２に示す。
【００３４】
【００３５】以上の結果より、本発明の合成マーカーで
標識した肝癌細胞は、その癌の種類によって異なった強
度の蛍光を発し、さらにその強度は、通常肝細胞が発す
る強度とも異なっている。従って、本発明の合成マーカ
ーで標識することにより、肝細胞をフローサイトメトリ
ー測定するだけで、発癌の有無や、癌の種類を識別する
ことができることがわかった。
標識した肝癌細胞は、その癌の種類によって異なった強
度の蛍光を発し、さらにその強度は、通常肝細胞が発す
る強度とも異なっている。従って、本発明の合成マーカ
ーで標識することにより、肝細胞をフローサイトメトリ
ー測定するだけで、発癌の有無や、癌の種類を識別する
ことができることがわかった。
【００３６】
【発明の効果】本発明の細胞診断用合成マーカーは、従
来のような複雑な操作なしで合成できるため、製造コス
トがかからず安価であり容易に入手できる。また、本発
明の合成マーカーは、特に肝細胞表面に存在するアシア
ロ糖タンパク質レセプターと、天然リガンドを凌ぐ高い
親和性を有しているため、本発明の合成マーカーを肝細
胞診断に有効使用することができる。さらに、本発明の
合成マーカーで肝癌細胞を標識した場合、その癌種によ
って異なった強度の蛍光を発するため、肝癌診断及び癌
種の識別に非常に有効に使用することができる。
来のような複雑な操作なしで合成できるため、製造コス
トがかからず安価であり容易に入手できる。また、本発
明の合成マーカーは、特に肝細胞表面に存在するアシア
ロ糖タンパク質レセプターと、天然リガンドを凌ぐ高い
親和性を有しているため、本発明の合成マーカーを肝細
胞診断に有効使用することができる。さらに、本発明の
合成マーカーで肝癌細胞を標識した場合、その癌種によ
って異なった強度の蛍光を発するため、肝癌診断及び癌
種の識別に非常に有効に使用することができる。
【図１】 本発明の合成マーカーで標識した肝細胞及び
未処理の肝細胞の発する蛍光強度を表すグラフである。
未処理の肝細胞の発する蛍光強度を表すグラフである。
【図２】 本発明の合成マーカーの、肝細胞に対する親
和性のＣａ2+イオン依存性を示すグラフである。
和性のＣａ2+イオン依存性を示すグラフである。
【図３】 本発明の合成マーカー及びＦＩＴＣを固定し
たアシアロフェツインで標識した肝癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ
２）の蛍光強度を示すグラフである。
たアシアロフェツインで標識した肝癌細胞（Ｈｅｐ Ｇ
２）の蛍光強度を示すグラフである。
【図４】 本発明の合成マーカー及びＦＩＴＣを固定し
たアシアロフェツインで標識した肝癌細胞（Ｃｈａｎｇ
Ｌｉｖｅｒ）の蛍光強度を示すグラフである。
たアシアロフェツインで標識した肝癌細胞（Ｃｈａｎｇ
Ｌｉｖｅｒ）の蛍光強度を示すグラフである。
Claims (4)
- 【請求項１】 ポリビニルベンジルラクトンアミドに蛍
光色素を固定してなることを特徴とする細胞診断用合成
マーカー。 - 【請求項２】 前記蛍光色素がフルオロセインイソチオ
シアネートであることを特徴とする請求項１記載の細胞
診断用合成マーカー。 - 【請求項３】 肝細胞診断で使用されることを特徴とす
る請求項１記載の細胞診断用合成マーカー。 - 【請求項４】 前記肝細胞診断が肝癌診断であることを
特徴とする請求項３記載の細胞診断用合成マーカー。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5176988A JP2989429B2 (ja) | 1993-07-16 | 1993-07-16 | 細胞診断用合成マーカー |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5176988A JP2989429B2 (ja) | 1993-07-16 | 1993-07-16 | 細胞診断用合成マーカー |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0735754A true JPH0735754A (ja) | 1995-02-07 |
| JP2989429B2 JP2989429B2 (ja) | 1999-12-13 |
Family
ID=16023226
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5176988A Expired - Fee Related JP2989429B2 (ja) | 1993-07-16 | 1993-07-16 | 細胞診断用合成マーカー |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2989429B2 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998051326A1 (en) * | 1997-05-16 | 1998-11-19 | Hsc Research And Development Limited Partnership | Inhibition of angiogenesis by verotoxins |
| US6283078B1 (en) | 1998-09-01 | 2001-09-04 | Daihatsu Motor Co. Ltd. | Inertia charge intake manifold for multi-cylinder internal combustion engine and connecting method for branch pipes of intake manifold |
| JP2009013274A (ja) * | 2007-07-04 | 2009-01-22 | Celagix:Kk | 重合体およびその製造方法 |
| US9645154B2 (en) | 2010-12-24 | 2017-05-09 | Arkray, Inc. | Method for detecting cancer cell |
-
1993
- 1993-07-16 JP JP5176988A patent/JP2989429B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998051326A1 (en) * | 1997-05-16 | 1998-11-19 | Hsc Research And Development Limited Partnership | Inhibition of angiogenesis by verotoxins |
| US6283078B1 (en) | 1998-09-01 | 2001-09-04 | Daihatsu Motor Co. Ltd. | Inertia charge intake manifold for multi-cylinder internal combustion engine and connecting method for branch pipes of intake manifold |
| US6371070B2 (en) | 1998-09-01 | 2002-04-16 | Daihatsu Motor Co., Ltd. | Inertia charge intake manifold for multi-cylinder internal combustion engine and connecting method for branch pipes of intake manifold |
| JP2009013274A (ja) * | 2007-07-04 | 2009-01-22 | Celagix:Kk | 重合体およびその製造方法 |
| US9645154B2 (en) | 2010-12-24 | 2017-05-09 | Arkray, Inc. | Method for detecting cancer cell |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2989429B2 (ja) | 1999-12-13 |
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