JPH0731493A

JPH0731493A - 糖脂質の製造方法

Info

Publication number: JPH0731493A
Application number: JP10208291A
Authority: JP
Inventors: Shigeyuki Takenishi; 繁行竹西; Hirobumi Nakano; 博文中野; Sumio Kitahata; 寿美雄北畑; Yoshio Tominaga; 嘉男富永; Kenji Ando; 健司安藤; Yumi Kiku; 夕美規矩; Yuji Kawashima; 右次川嶋
Original assignee: New Japan Chemical Co Ltd; Osaka City
Current assignee: New Japan Chemical Co Ltd; Osaka City
Priority date: 1991-04-05
Filing date: 1991-04-05
Publication date: 1995-02-03

Abstract

(57)【要約】【目的】酵素的合成法により、穏和な条件下で糖脂質
を製造し得る方法を提供する。【構成】ヒドロキシアルキルグリコシドとカルボン酸
とをリパーゼを用いてエステル化して糖脂質を製造す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、糖脂質の製造方法、更
に詳しくはリパーゼを用いることにより短い工程で容易
に糖脂質を製造する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】糖脂質は、脂溶性部分に糖の結合した複
合脂質のグループに属するものであり、その脂溶性部分
の種類によってグリセロ糖脂質とスフィンゴ糖脂質に大
きく分類される。これらの化合物は、各々グリセリン及
びスフィンゴシンを介して糖と脂肪酸とが結合してい
る。

【０００３】グリセロ糖脂質は、主に植物や細菌類に見
い出される。ところが、セミノリピド（硫酸化ガラクト
シルアシルアルキルグリセロール）が、豚精巣の主要糖
脂質であることが判明して以来、動物細胞においてもグ
リセロ糖脂質に何らかの機能があるものと考えられるよ
うになってきた。

【０００４】一方、スフィンゴ糖脂質については、この
ものが動物界において多用な働き、即ち細胞膜外層に分
布し生体膜の脂質二重層の流動性の調節や細胞間認識等
の役割を担っていることが古くから知られていた。

【０００５】これらの糖脂質の合成法に関しては、化学
的方法と酵素的方法の二通りが考えられる。化学的方法
に関しては、いくつかの糖脂質についてその合成方法が
確立されている。例えば、グリセロ糖脂質については、
グリコシド交換反応を行った後にエステル化を行う方法
［J.Amer.Oil Chem.Soc.,50,155 (1973)、J.Amer.Oil C
hem.Soc.,51,486 (1974)］、スフィンゴ糖脂質について
は、官能基の保護、縮合反応、脱保護の繰り返しの反応
［Carbohydr. Res. ,66,C7 (1980)、Carbohydr. Res.,1
35,C5 (1985)］等が存在する。ところが、このような化
学的合成方法は、多段階の反応を要し経済的に実用化が
困難であったり、実用化が可能であっても高温下で反応
するため製品が着色するといった問題点を有している。

【０００６】一方、酵素的合成法では、反応条件は穏和
であり、酵素を用いるため消費エネルギーが少ないとい
った利点を有しており、これまでに、糖と脂肪酸、糖ア
ルコールと脂肪酸等を原料とし、酵素を用いてエステル
を合成する方法が数多く提案されている［J.Amer.Chem.
Soc.,108,6421 (1986)、J.Amer.Chem.Soc.,109,3977(19
87)、J.Amer.Chem.Soc.,110,584 (1988)、J. C. S.,Che
m. Comm.,1989,934］。これらの反応においては減圧下
で水分を留去しながらの反応（特開昭62−289190号）と
か有機溶媒中での反応（特開昭61−268192号）、又、不
均一系（水／有機溶媒）での反応（特開昭62−296884
号）等が存在する。しかしながら、グリセロ糖脂質とか
スフィンゴ糖脂質等のリンカーを介して糖と脂肪酸とが
結合している糖脂質の酵素合成は例がない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、かか
る事情に鑑み、糖脂質の簡素な合成法を鋭意検討した結
果、ヒドロキシアルキルグリコシドを基質とし、リパー
ゼを用いてエステル化することにより所期の目的が達成
されることを見い出し、かかる知見に基づいて本発明を
完成するに至った。

【０００８】即ち、本発明は、酵素を用いた新規有用な
糖脂質の製造方法を提供することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明に係る糖脂質の製
造方法は、ヒドロキシアルキルグリコシドとカルボン酸
とをリパーゼを用いてエステル化することを特徴とす
る。

【００１０】本発明におけるヒドロキシアルキルグリコ
シドは、例えば糖類とポリオールとを原料とし、ガラク
タナーゼ等の酵素を用いて容易に調製される化合物であ
る（特開平1−296995号、特開平2-308798号、Agric.Bio
l.Chem.,52,1913 (1988)、J.Biol.Chem.,237,2047 (196
2)］。

【００１１】かかる糖類としては、置換基を有していて
も良い、少なくとも２個以上の水酸基を有する炭素数５
〜７の単糖類及びかかる単糖類を構成成分としてなるオ
リゴ糖が例示される。以下にその具体例を示す。

【００１２】５単糖（ペントース）：アラビノース、リ
ボース、キシロース、キシリロース、リブロース、２−
デオキシリボース。

【００１３】６単糖（ヘキソース）：グルコース、ガラ
クトース、フルクトース、マンノース、ソルボース、タ
ロース、２−デオキシグルコース、６−デオキシガラク
トース、６−デオキシマンノース、２−デオキシガラク
トース、フコース。

【００１４】７単糖（ヘプトース）：グルコヘプトー
ス、セドヘプツロース、マンノペプツロース、グルコペ
プツロース。

【００１５】置換基を有する糖：Ｎ−アセチルグルコサ
ミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−アセチルマン
ノサミン、グルコサミン、ガラクトサミン。

【００１６】その他、重合度２〜６程度のオリゴ糖（こ
の場合、糖の結合様式は１−４、１−６等いずれでもよ
い）：マルトース、シュークロース、マルトトリオー
ス、ラフィノース、セロトリオース、マンニノトリオー
ス、マルトテトラオース、マルトペンタオース。

【００１７】一方、ポリオールとしては、例えばエチレ
ングリコール、プロピレングリコール、１，３−プロパ
ンジオール、１，２−ブタンジオール、１，３−ブタン
ジオール、１，４−ブタンジオール、２，３−ブタンジ
オール、１，５−ペンタンジオール、２，４−ペンタン
ジオール、１，６−ヘキサンジオール、２，５−ヘキサ
ンジオール、エリスリトール、グリセリン、ジグリセリ
ン、トリグリセリン、等のポリグリセリン、トリメチロ
ールエタン、トリメチロールプロパン、ネオペンチルグ
リコール、リビトール、キシリトール、アラビトール、
ソルビトール、マンニトール等が挙げられる。

【００１８】上記の方法は、酵素的なヒドロキシアルキ
ルグリコシドの合成方法であるが、このものは化学合成
法により調製することも可能である［J.Amer.Oil Chem.
Soc.,40,76 (1963)］。

【００１９】上記諸法で得られるヒドロキシアルキルグ
リコシド中の糖とポリオールとの結合形式はα型、β型
のいずれでもよい。又、糖はＤ体、Ｌ体のいずれでもよ
い。

【００２０】本発明に係るカルボン酸としては、置換基
を有していてもよい炭素数２〜２２の飽和若しくは不飽
和カルボン酸が例示され、その具体例として、以下の化
合物が挙げられる。即ち、

【００２１】酢酸、プロピオン酸、カプロン酸、カプリ
ル酸、カプリン酸、ウンデカン酸、ラウリル酸、トリデ
カン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン
酸、ヘプタデカン酸、ステアリン酸、イソステアリン
酸、アラキン酸、ヘベリン酸等の飽和カルボン酸；

【００２２】アクリル酸、クロトン酸、メタクリル酸、
バレリン酸、２−メチルバレリン酸、ソルビン酸、ミリ
スチン酸、オレイン酸、リノール酸、カプロレイン酸、
リンデル酸、ミリストレイン酸、パルミトレイン酸、オ
レイン酸、カドレイン酸、エルカ酸、デカジエン酸、リ
ノール酸、ヒラゴ酸、リノレイン酸、エイコサトリエン
酸、ドコサトリエン酸、ヘキサデカトリエン酸、ステア
リドン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、エイコ
サペンタエン酸等の不飽和カルボン酸；

【００２３】サビニン酸、イプロール酸、ヤラピノール
酸、リシノール酸、フェロン酸等のヒドロキシカルボン
酸；

【００２４】マロン酸、マレイン酸、コハク酸、グルタ
ル酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライ
ン酸、セバシン酸、テトラデカンジオン酸、マレイン
酸、フマル酸、シトラコン酸、メサコン酸等の飽和又は
不飽和の多価カルボン酸。

【００２５】リパーゼには微生物由来のものと動物由来
の２種が存在するが、本発明においてはそのどちらも利
用することができる。具体的には、微生物由来のものと
して、アスペルギルスニガー（Aspergillus niga
r）、ムコール属（Mucor）、ムコールミーヘイ（Muco
r miehei）、リゾプスジャポニクス（Rhizopus japon
icus）、リゾプスデレマー（Rhizopus delemar）、キ
ャンディダシリンドラセ（Candida cylindracea）、
シュードモナス属（Psudomonas sp.）、ジオトリカム
キャンディダム（Geotrichum candidum）等がある。動
物起源のものとしては豚すい臓由来のパンクレアチン等
がある。これら酵素は必ずしも単離している必要はな
く、例えばパンクレアチンのような粗酵素のままで、又
はリパーゼを含む市販の酵素製剤をそのまま使用するこ
とができる。

【００２６】更に、固定化担体、例えばポリプロピレン
膜、イオン交換膜の如き各種重合体や、セライト、ガラ
スビーズ、ゼオライト、ベントナイト等の無機材料等に
上記リパーゼを固定した乾燥固定化酵素を利用すること
も可能である。この場合、これらの担体に上記リパーゼ
を固定化することにより基質とリパーゼの接触面を拡大
することが可能となり、リパーゼ粉末を用いるよりも反
応を進行させる上で有利となる。担体に酵素を固定化し
て使用する場合にはその比活性は高いものほど好まし
く、担体１ｇ当り1,000〜30,000単位程度のリパーゼを
担持した担体を例示することができる。

【００２７】本発明に係る糖脂質の製造方法は、有機溶
媒の存在下で行うこともできる。ここで用いることがで
きる有機溶媒は、反応温度において液状をなし、リパー
ゼ活性を安定的に維持するものであればよい。

【００２８】その具体例として以下のものが挙げられ
る。即ち、ｎ−ヘプタン、ｎ−ペンタン、ｎ−ヘキサ
ン、石油エーテル、イソオクタン等の脂肪族炭化水素；
ベンゼン、トルエン、キシレン等の芳香族炭化水素；ア
セトン、メチルイソブチルケトン等のケトン類；アセト
ニトリル、２−ニトロプロパン、ピリジン、ジメチルホ
ルムアミド等の含窒素系溶媒；ジメチルエーテル、ジエ
チルエーテル、テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエ
ーテル系溶媒；四塩化炭素、クロロホルム、塩化メチレ
ン等のハロゲン系炭化水素；ジメチルスルフォキシド等
のスルフォキシド系溶媒；tert−ブチルアルコール、te
rt−アミルアルコール、ジアセトンアルコール、３−メ
チル−３−ペンテノール等のアルコール類。これらの中
で、芳香族炭化水素類、脂肪族炭化水素類等が特に好ま
しい。又、２種以上の溶媒を適宜組み合わせて使用する
こともできる。

【００２９】次に、本発明において有機溶媒を使用しな
い場合は、カルボン酸とヒドロキシアルキルグリコシド
とを液状の混合物としてリパーゼを作用させればよい。

【００３０】本発明においてヒドロキシアルキルグリコ
シドとカルボン酸との混合モル比やリパーゼの使用量、
有機溶媒の使用量等は、適宜に選択可能であり、最もよ
く反応を促進し高い収率が得られ、かつ反応操作のしや
すい条件を採用すればよい。以下に具体的な条件を例示
する。

【００３１】出発反応液中のヒドロキシアルキルグリコ
シドに対するカルボン酸の添加重量比としては、１０：
１〜１：１０、好ましくは５：１〜１：５の範囲がよ
い。

【００３２】リパーゼの使用量に関しては、反応条件や
用いる酵素の種類やその力価にもよるが基質の合計重量
の０．１〜５０重量％程度がよい。

【００３３】有機溶媒を用いる際の使用量に関しては、
用いる溶媒や基質の種類、それらの濃度にもよるが、各
々の基質が反応液中を自由に移動し反応が促進される程
度に有機溶媒を添加するのがよく、特に制限はないが例
えば反応系の１〜９９重量％、好ましくは１０〜９５重
量％程度加えればよい。

【００３４】リパーゼを使用する際の反応系のＰＨとし
ては、４〜９の範囲が例示でき、好ましくは５〜８程度
である。かかるＰＨは、リン酸水溶液や酢酸水溶液等の
従来公知の緩衝液を用いて調整することができる。

【００３５】本発明における反応系の水分含量は、３０
％重量程度以下、より実用的には５〜１５重量％程度が
推奨され、形成されたエステルが再度加水分解されるこ
とを回避するためには、できるだけ低い水分含量である
ことが好ましい。

【００３６】本発明方法におけるエステル生成反応の温
度としては、０〜９０℃程度を例示されるが、好ましく
は２０〜７０℃の範囲内である。

【００３７】反応時間は、反応条件、酵素量及び力価に
左右されるが、通常、１〜１２０時間程度である。

【００３８】本発明に係る製造方法の具体例な処方を以
下に示す。即ち、所定量のカルボン酸、リパーゼ及びヒ
ドロキシアルキルグルコシドとリン酸緩衝液からなるバ
ッファー懸濁液の３成分を均等に混合した後、２０〜６
０℃で１０〜３０時間程度インキュベートする（反応の
終了は薄層クロマトグラフィー若しくはＨＰＬＣ等によ
り確認可能である。）。

【００３９】続いて、反応混合液中にエタノール若しく
はメタノールを加えて静置すると不溶物が析出する。こ
の際沈澱物がエステルを取り込んでいる可能性があるの
で、この沈澱物をよくつぶすか超音波を照射して粉砕す
ることが好ましい。続いて上澄液を減圧下で濃縮後、こ
の残査に水及びエーテルを加えて抽出する。エーテルの
代わりに酢酸エチル、クロロフォルム、塩化メチレン等
の有機溶媒を用いても抽出可能である。

【００４０】飽和食塩水若しくは水を用いて有機層を洗
浄後、適当な乾燥剤（硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウ
ム等）により有機層を脱水する。続いて有機層を減圧下
で濃縮し、目的とするエステルを得る。場合によっては
シリカゲルクロマトグラフィー若しくは活性炭クロマト
グラフィー、ＨＰＬＣを用いて精製してもよい。

【００４１】本発明に係る糖脂質は、安全性の高い界面
活性剤、乳化剤等に応用可能である。更に、糖の種類を
いろいろ検討することによって、リボゾームへの応用も
可能である。

【００４２】

【実施例】以下に実施例を掲げ、本発明を詳しく説明す
る。尚、実施例におけるエステル合成率は、生成エステ
ル量をヒドロキサム酸鉄塩法により定量（オレイン酸メ
チル基準）して算出した。

【００４３】実施例１１−Ｏ−β−ガラクトシルグリセロール２．５ｇオレイン酸２．５ｇリパーゼ（Candida Cylindracea由来，700−1500U/mg、以下同様）１．５ｇ０．５Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ＝７．０）０．１ｍｌ上記のガラクトシルグリセロール、オレイン酸及びリ
パーゼのリン酸緩衝液の懸濁液を均等に混ぜ、４０℃で
２０時間インキュベートし、エステル化を行なった。次
いで、反応液中にエタノールを加え、沈澱物が析出する
まで静置し、得られた析出物について超音波処理を行っ
た。続いて上澄液を減圧下で濃縮後、残査中へ水及びエ
ーテルを加えた。エーテル層を飽和食塩水で洗浄後、硫
酸マグネシウムにより乾燥し、次いでエーテルを減圧下
に留去した。その結果、目的物がエステル合成率４０％
で得られた。

【００４４】実施例２１−Ｏ−β−ガラクトシルグリセロール２．５ｇパルミチン酸２．５ｇリパーゼ１．５ｇ０．５Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ＝７．０）０．１ｍｌ上記の各成分を実施例１と同様に処理して、エステル合
成率６５％で目的物を得た。

【００４５】実施例３１−Ｏ−β−ガラクトシルグリセロール２．５ｇオレイン酸２．５ｇリパーゼ１．５ｇ０．５Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ＝７．０）０．１ｍｌ上記のカルボン酸、ガラクトシルグリセロールのリン酸
バッファー懸濁液、リパーゼの３つを均等に混合し、６
０℃で２０時間インキュベートした。以下、実施例１と
同様に処理して、エステル合成率５０％で目的物を得
た。

【００４６】実施例４１−α−グリコシルグリセロール２．５ｇオレイン酸１．５ｇリパーゼ１．０ｇ０．５Ｍリン酸緩衝液（ＰＨ＝７．０）０．１ｍｌ水０．４ｍｌ上記の各成分を実施例１と同様に処理して、エステル合
成率３２％で目的物を得た。

【００４７】実施例５Ｏ−α−グリコシルトリメチロールプロパン２．５ｇオレイン酸１．５ｇリパーゼ１．０ｇ０．５Ｍリン酸緩衝液０．１ｍｌ上記の各成分を実施例１と同様に処理して、エステル合
成率５５％で目的物を得た。

【００４８】実施例６Ｏ−α−グルコシルトリメチロールプロパン２．５ｇオレイン酸２．５ｇリパーゼ１．０ｇ０．５Ｍリン酸緩衝液０．１ｍｌ水０．４ｍｌ上記の各成分を実施例１と同様に処理して、エステル合
成率８７％で目的物を得た。

【００４９】実施例７１−Ｏ−α−グルコシルトリメチロールプロパン２．５ｇカプリル酸１．０ｇリパーゼ１．０ｇ０．５Ｍリン酸緩衝液０．１ｍｌ上記の各成分を実施例１と同様に処理して、エステル合
成率８５％で目的物を得た。

【００５０】実施例８カルボン酸成分をカプロン酸に代えた他は、実施例７と
同様に処理して、エステル合成率８０％で目的物を得
た。

【００５１】実施例９カルボン酸成分をラウリル酸に代えた他は、実施例７と
同様に処理して、エステル合成率７５％で目的物を得
た。

【００５２】実施例１０ガラクトシルトリメチロールプロパン２．５ｇオレイン酸１．５ｇリパーゼ１．０ｇ０．５Ｍリン酸緩衝液０．１ｍｌ上記の各成分を実施例１と同様に処理して、エステル合
成率８５％で目的物を得た。

【００５３】実施例１１１−Ｏ−α−グルコシルトリメチロールプロパン２．５ｇステアリン酸１．０ｇリパーゼ１．０ｇ０．５Ｍリン酸緩衝液０．１ｍｌ水０．１ｍｌ上記の各成分を反応温度６０℃に於て反応した後実施例
２と同様に処理して、エステル合成率８０％で目的物を
得た（反応温度が４０℃においてはエステル合成率は８
％程度である）。

【００５４】実施例１２１−Ｏ−α−グルコシルトリメチロールプロパン２．５ｇミリスチン酸１．０ｇリパーゼ１．０ｇ０．５Ｍリン酸緩衝液０．１ｍｌ水０．１ｍｌカルボン酸、リパーゼ、グリコシルトリメチロールプロ
パンのバッファー懸濁液の混合物を６０℃で２０時間イ
ンキュベートした。以下、実施例１と同様に処理して、
エステル合成率６５％で目的物を得た（反応温度が４０
℃においてはエステル合成率は４％であった）。

【００５５】［発明の効果］本発明に係る製造方法によ
り、従来の化学合成法では経済的に実用化が難しかった
糖脂質を非常に安価に供給できる。更に、本発明では化
学的方法で用いられるような有毒な反応触媒を用いる必
要がなく、極めて穏和な条件下で反応が進行するため、
糖やポリアルコール等の構造に変化を及ぼすことがな
く、非常に安全な製品が調製可能である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者富永嘉男大阪府大阪市西淀川区歌島２丁目７番２号 (72)発明者安藤健司京都府京都市伏見区葭島矢倉町13番地新日本理化株式会社内 (72)発明者規矩夕美京都府京都市伏見区葭島矢倉町13番地新日本理化株式会社内 (72)発明者川嶋右次京都府京都市伏見区葭島矢倉町13番地新日本理化株式会社内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒドロキシアルキルグリコシドとカルボ
ン酸とをリパーゼを用いてエステル化することを特徴と
する糖脂質の製造方法。