JPH07303475A - 硫化水素生成が低減された酵母とこの酵母を用いたビール製造法 - Google Patents
硫化水素生成が低減された酵母とこの酵母を用いたビール製造法Info
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- JPH07303475A JPH07303475A JP6099855A JP9985594A JPH07303475A JP H07303475 A JPH07303475 A JP H07303475A JP 6099855 A JP6099855 A JP 6099855A JP 9985594 A JP9985594 A JP 9985594A JP H07303475 A JPH07303475 A JP H07303475A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 硫化水素発生量が少ないサッカロミセス酵
母、及びそれを用いるビールの製造方法の提供。 【構成】 構成的な発現をする遺伝子のプロモーター及
び当該プロモーターの制御下にあるＯ−アセチルホモセ
リンサルフハイドリレースの構造遺伝子（ＭＥＴ２５）
を導入したことにより硫化水素生成量が減少したサッカ
ロミセス属の酵母、及び該酵母を用いるビールの製造方
法。 【効果】 硫化水素の発生量が親株の２％程度に減少す
るため、品質が向上し、且つ、後発酵又は貯酒期間の短
縮が可能となる。
母、及びそれを用いるビールの製造方法の提供。 【構成】 構成的な発現をする遺伝子のプロモーター及
び当該プロモーターの制御下にあるＯ−アセチルホモセ
リンサルフハイドリレースの構造遺伝子（ＭＥＴ２５）
を導入したことにより硫化水素生成量が減少したサッカ
ロミセス属の酵母、及び該酵母を用いるビールの製造方
法。 【効果】 硫化水素の発生量が親株の２％程度に減少す
るため、品質が向上し、且つ、後発酵又は貯酒期間の短
縮が可能となる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＯ−アセチルホモセリン
サルフハイドリレースの構造遺伝子を構成的に発現させ
ることによって、ビール製造中の硫化水素生成量を低減
させた酵母に関する。
サルフハイドリレースの構造遺伝子を構成的に発現させ
ることによって、ビール製造中の硫化水素生成量を低減
させた酵母に関する。
【０００２】
【従来の技術】我が国で主に市販されているピルスナー
タイプの淡色ビールの製造に用いられているビール酵母
（下面酵母）は主発酵工程中に硫化水素を生成する特性
を有する。この硫化水素はビールの品質上好ましくない
若ビール臭の原因のひとつであり、これを閾値以下に低
減するための対策として後発酵ないし貯酒期間の延長が
行なわれている。
タイプの淡色ビールの製造に用いられているビール酵母
（下面酵母）は主発酵工程中に硫化水素を生成する特性
を有する。この硫化水素はビールの品質上好ましくない
若ビール臭の原因のひとつであり、これを閾値以下に低
減するための対策として後発酵ないし貯酒期間の延長が
行なわれている。
【０００３】ビール中の硫化水素低減のために従来から
硫化水素生成に影響する因子に関する研究 (Jangaard,
N. O., Gress, H. S. and Coe, R. W. ; Amer. Soc. Br
ew.Chem. Proc., p46, 1973 : Kuroiwa, Y. and Hashim
oto, N. ; Brew. Dig., 45,44, 1970 : Hysert, D. W.
and Morrison, N. M. ; J. Amer. Soc. Brew. Chem., 3
4, 25, 1976)や、突然変異法あるいは細胞融合法を用い
た硫化水素低生成酵母の育種研究 (Molzahm, S. W. ;
J. Amer. Soc. Brew. Chem., 35, 54, 1977)が報告され
ている。
硫化水素生成に影響する因子に関する研究 (Jangaard,
N. O., Gress, H. S. and Coe, R. W. ; Amer. Soc. Br
ew.Chem. Proc., p46, 1973 : Kuroiwa, Y. and Hashim
oto, N. ; Brew. Dig., 45,44, 1970 : Hysert, D. W.
and Morrison, N. M. ; J. Amer. Soc. Brew. Chem., 3
4, 25, 1976)や、突然変異法あるいは細胞融合法を用い
た硫化水素低生成酵母の育種研究 (Molzahm, S. W. ;
J. Amer. Soc. Brew. Chem., 35, 54, 1977)が報告され
ている。
【０００４】これらの方法はいずれも単に酵母の硫化水
素生成量を減少させるだけでなく、酵母の他の醸造特性
（発酵速度、ビール香味）にまで影響するため、ビール
醸造用酵母として好適な酵母は現在まで得られていな
い。近年、遺伝子操作技術を利用した醸造用酵母の育種
も行なわれるようになり、特開平５−２４４９５５号公
報ではシスタチオニンβ−シンターゼをコードするＤＮ
Ａ断片を導入したビール酵母が硫化水素生成を低減させ
ることが開示されている。しかしながら低減の程度は軽
微で、形質転換株の硫化水素の生成量はなお親株の生成
量の６０〜８０％程である。
素生成量を減少させるだけでなく、酵母の他の醸造特性
（発酵速度、ビール香味）にまで影響するため、ビール
醸造用酵母として好適な酵母は現在まで得られていな
い。近年、遺伝子操作技術を利用した醸造用酵母の育種
も行なわれるようになり、特開平５−２４４９５５号公
報ではシスタチオニンβ−シンターゼをコードするＤＮ
Ａ断片を導入したビール酵母が硫化水素生成を低減させ
ることが開示されている。しかしながら低減の程度は軽
微で、形質転換株の硫化水素の生成量はなお親株の生成
量の６０〜８０％程である。
【０００５】酵母の物質代謝において、硫化水素は培地
中から取り込まれた硫酸イオン（ＳＯ4 2- ）が還元され
る過程で生成する。この代謝系はメチオニンやシステイ
ンなどの含硫アミノ酸生合成経路であり、各段階の酵素
及びその遺伝子（ＭＥＴ２５遺伝子）について詳細な報
告がある (Tabor, H. and Tabor, C. W. (eds.) ; Meth
ods in Enzymology Vol. 17B, Academic Press, Londo
n, 1971 : Jakoby, W.B. and Griffith, O. W. (eds.)
; Methods in Enzymology Vol. 143, AcademicPress,
London, 1987）。
中から取り込まれた硫酸イオン（ＳＯ4 2- ）が還元され
る過程で生成する。この代謝系はメチオニンやシステイ
ンなどの含硫アミノ酸生合成経路であり、各段階の酵素
及びその遺伝子（ＭＥＴ２５遺伝子）について詳細な報
告がある (Tabor, H. and Tabor, C. W. (eds.) ; Meth
ods in Enzymology Vol. 17B, Academic Press, Londo
n, 1971 : Jakoby, W.B. and Griffith, O. W. (eds.)
; Methods in Enzymology Vol. 143, AcademicPress,
London, 1987）。
【０００６】Ｏ−アセチルホモセリンサルフハイドリレ
ースは、硫化水素から硫黄原子をＯ−アセチルホモセリ
ンに転移する酵素であり、ＭＥＴ２５遺伝子によってコ
ードされている。当該酵素はまた、Ｏ−アセチルセリン
に硫黄原子を転移する活性も持っている。いずれにして
もＯ−アセチルホモセリンサルフハイドリレースは硫化
水素を基質とする酵素であるから、酵母菌体内の当該酵
素活性を上昇せしめることにより、基質である硫化水素
の消費を高め、硫化水素の生成量を低減することが期待
された。
ースは、硫化水素から硫黄原子をＯ−アセチルホモセリ
ンに転移する酵素であり、ＭＥＴ２５遺伝子によってコ
ードされている。当該酵素はまた、Ｏ−アセチルセリン
に硫黄原子を転移する活性も持っている。いずれにして
もＯ−アセチルホモセリンサルフハイドリレースは硫化
水素を基質とする酵素であるから、酵母菌体内の当該酵
素活性を上昇せしめることにより、基質である硫化水素
の消費を高め、硫化水素の生成量を低減することが期待
された。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、硫化水素を
基質とする酵母のＯ−アセチルホモセリンサルフハイド
リレースをコードする遺伝子（ＭＥＴ２５）を改良し、
酵母内で構成的に発現させることにより、ビール醸造工
程における硫化水素生成の大幅な低減を目的とするもの
である。
基質とする酵母のＯ−アセチルホモセリンサルフハイド
リレースをコードする遺伝子（ＭＥＴ２５）を改良し、
酵母内で構成的に発現させることにより、ビール醸造工
程における硫化水素生成の大幅な低減を目的とするもの
である。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明は、酵母の構成的
に発現する遺伝子のプロモーターを酵母Ｏ−アセチルホ
モセリンサルフハイドリレースの構造遺伝子の上流に挿
入した組換えベクターによって酵母を形質転換し、Ｏ−
アセチルホモセリンサルフハイドリレースを構成的かつ
大量に発現せしめ、ビール製造工程における硫化水素生
成量が大幅に減少したサッカロミセス属の酵母、および
当該育種酵母を用いたビール製造法に関する。
に発現する遺伝子のプロモーターを酵母Ｏ−アセチルホ
モセリンサルフハイドリレースの構造遺伝子の上流に挿
入した組換えベクターによって酵母を形質転換し、Ｏ−
アセチルホモセリンサルフハイドリレースを構成的かつ
大量に発現せしめ、ビール製造工程における硫化水素生
成量が大幅に減少したサッカロミセス属の酵母、および
当該育種酵母を用いたビール製造法に関する。
【０００９】サッカロミセス・セレビジエー（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、菌体
内でメチオニンやシステインを生合成する際、培地中や
麦汁中の硫酸イオンを還元して硫化水素を生成する。Ｍ
ＥＴ２５遺伝子産物であるＯ−アセチルホモセリンサル
フハイドリレースは硫化水素を基質とし、ホモシステイ
ンやシステインを合成する酵素であるが、ＭＥＴ２５遺
伝子の発現は培地中のメチオニンによって抑制される。
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、菌体
内でメチオニンやシステインを生合成する際、培地中や
麦汁中の硫酸イオンを還元して硫化水素を生成する。Ｍ
ＥＴ２５遺伝子産物であるＯ−アセチルホモセリンサル
フハイドリレースは硫化水素を基質とし、ホモシステイ
ンやシステインを合成する酵素であるが、ＭＥＴ２５遺
伝子の発現は培地中のメチオニンによって抑制される。
【００１０】本発明者らはサッカロミセス・セレビジエ
ーＸ２１８０−１Ａ株由来の染色体ＤＮＡからＭＥＴ２
５遺伝子をポリメレースチェインリアクション（ＰＣ
Ｒ）法によって増幅・単離し、この遺伝子の構造遺伝子
部分の上流に酵母で構成的に発現する遺伝子のプロモー
ターを挿入したプラスミドＤＮＡを作成した。得られた
プラスミドＤＮＡを酵母に導入し、ＭＥＴ２５遺伝子を
構成的に発現する育種株を作成した。ビール試験醸造に
おける硫化水素生成量を調べたところ、育種株では親株
の２％程度に硫化水素生成量が減少していることが明ら
かとなった。
ーＸ２１８０−１Ａ株由来の染色体ＤＮＡからＭＥＴ２
５遺伝子をポリメレースチェインリアクション（ＰＣ
Ｒ）法によって増幅・単離し、この遺伝子の構造遺伝子
部分の上流に酵母で構成的に発現する遺伝子のプロモー
ターを挿入したプラスミドＤＮＡを作成した。得られた
プラスミドＤＮＡを酵母に導入し、ＭＥＴ２５遺伝子を
構成的に発現する育種株を作成した。ビール試験醸造に
おける硫化水素生成量を調べたところ、育種株では親株
の２％程度に硫化水素生成量が減少していることが明ら
かとなった。
【００１１】この方法の宿主酵母としては、醸造用酵
母、例えばビール酵母、例えばサッカロミセス・セレビ
ジエー、ＢＨ８４、ＩＦＯ１９５１、ＩＦＯ１９５２、
ＩＦＯ１９５３、ＩＦＯ１９５４等が使用できる。構成
的に発現させるためのプロモーターとしては、酵母由来
のものであればいずれも利用可能で、グリセルアルデヒ
ド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）
遺伝子のプロモーター、３−フォスフォグリセレートキ
ナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子のプロモーターなどが利用可能
である。ＰＧＫ遺伝子はすでにクローニングされてお
り、例えばTuite, M. F.ら、EMBO J. Vol.１, p603 (19
82) に詳細に記載されており、これらの既知の方法によ
り容易に入手することができる。
母、例えばビール酵母、例えばサッカロミセス・セレビ
ジエー、ＢＨ８４、ＩＦＯ１９５１、ＩＦＯ１９５２、
ＩＦＯ１９５３、ＩＦＯ１９５４等が使用できる。構成
的に発現させるためのプロモーターとしては、酵母由来
のものであればいずれも利用可能で、グリセルアルデヒ
ド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）
遺伝子のプロモーター、３−フォスフォグリセレートキ
ナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子のプロモーターなどが利用可能
である。ＰＧＫ遺伝子はすでにクローニングされてお
り、例えばTuite, M. F.ら、EMBO J. Vol.１, p603 (19
82) に詳細に記載されており、これらの既知の方法によ
り容易に入手することができる。
【００１２】酵母に導入する際に用いるベクターとして
は、多コピー型（ＹＥｐ型）、単コピー型（ＹＣｐ
型）、染色体ＤＮＡ組み込み型（ＹＩｐ型）のいずれも
が利用可能である。例えば、ＹＥｐ型ベクターとしては
ＹＥｐ５１ (Broach J. R.ら、Experimental Manipulat
ion of Gene Expression, Academic Press, New York,
1983, p83) 、ＹＣｐ型ベクターとしてはＹＣｐ５０ (R
ose, M. D. ら、Gene, Vol. 60, p237 (1987)) 、ＹＩ
ｐ型ベクターとしてはＹＩｐ５ (Struhl, K.ら、Proc.
Natl. Acad. Sci. USP, Vol. 76, p1035 (1979))が知ら
れており、容易に入手することができる。
は、多コピー型（ＹＥｐ型）、単コピー型（ＹＣｐ
型）、染色体ＤＮＡ組み込み型（ＹＩｐ型）のいずれも
が利用可能である。例えば、ＹＥｐ型ベクターとしては
ＹＥｐ５１ (Broach J. R.ら、Experimental Manipulat
ion of Gene Expression, Academic Press, New York,
1983, p83) 、ＹＣｐ型ベクターとしてはＹＣｐ５０ (R
ose, M. D. ら、Gene, Vol. 60, p237 (1987)) 、ＹＩ
ｐ型ベクターとしてはＹＩｐ５ (Struhl, K.ら、Proc.
Natl. Acad. Sci. USP, Vol. 76, p1035 (1979))が知ら
れており、容易に入手することができる。
【００１３】形質転換の際に用いる選択マーカーとして
は、醸造用酵母の場合は栄養要求性マーカーが利用でき
ないので、Ｇ４１８耐性遺伝子（Ｇ４１８r ）、銅耐性
遺伝子（ＣＵＰ１）(Marin, M.ら、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, Vol. 81, p337 (1984)) 、セルレニン耐性遺
伝子（ｆａｓ２ｍ、ＰＤＲ４）（猪腰淳嗣ら、生化学、
64巻、p660 (1992), Hussain, M.ら、Gene Vol. 101, p
149 (1991)) などが利用可能である。
は、醸造用酵母の場合は栄養要求性マーカーが利用でき
ないので、Ｇ４１８耐性遺伝子（Ｇ４１８r ）、銅耐性
遺伝子（ＣＵＰ１）(Marin, M.ら、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, Vol. 81, p337 (1984)) 、セルレニン耐性遺
伝子（ｆａｓ２ｍ、ＰＤＲ４）（猪腰淳嗣ら、生化学、
64巻、p660 (1992), Hussain, M.ら、Gene Vol. 101, p
149 (1991)) などが利用可能である。
【００１４】
【発明の効果】本発明に於ては、麦汁中のメチオニンに
よる抑制を受けず、構成的に発現する遺伝子のプロモー
ター及び当該プロモーターの制御下にあるＯ−アセチル
ホモセリンサルフハイドリレースの構造遺伝子をビール
酵母に導入するので、発酵の全工程においてＯ−アセチ
ルホモセリンサルフハイドリレースの酵母内での高発現
が維持される。この結果、Ｏ−アセチルホモセリンサル
フハイドリレースが硫化水素を基質として速やかに消費
するため硫化水素生成量およびビール中の硫化水素濃度
が低く抑えられる。
よる抑制を受けず、構成的に発現する遺伝子のプロモー
ター及び当該プロモーターの制御下にあるＯ−アセチル
ホモセリンサルフハイドリレースの構造遺伝子をビール
酵母に導入するので、発酵の全工程においてＯ−アセチ
ルホモセリンサルフハイドリレースの酵母内での高発現
が維持される。この結果、Ｏ−アセチルホモセリンサル
フハイドリレースが硫化水素を基質として速やかに消費
するため硫化水素生成量およびビール中の硫化水素濃度
が低く抑えられる。
【００１５】
【実施例】以下に本発明を実施例によってさらに詳細に
説明するが、本発明は以下実施例に限定されるものでは
ない。実施例１ ．ＭＥＴ２５遺伝子のクローニング 酵母サッカロミセス・セレビジエーのＭＥＴ２５遺伝子
は既にクローニングされており、その塩基配列が報告さ
れている（Kerjan, P., Cherest, H., and Surdin-Kerj
an, Y., Nucl. Acids Res., 14, 7861, 1986）。この情
報をもとにＭＥＴ２５遺伝子をポリメレースチェインリ
アクション（ＰＣＲ）によって増幅、単離した。研究用
酵母Ｘ２１８０−１Ａ株 (University of California a
t Berkley, Yeast Genetic Stock Center)から染色体Ｄ
ＮＡを抽出し、これをＰＣＲの鋳型とした。
説明するが、本発明は以下実施例に限定されるものでは
ない。実施例１ ．ＭＥＴ２５遺伝子のクローニング 酵母サッカロミセス・セレビジエーのＭＥＴ２５遺伝子
は既にクローニングされており、その塩基配列が報告さ
れている（Kerjan, P., Cherest, H., and Surdin-Kerj
an, Y., Nucl. Acids Res., 14, 7861, 1986）。この情
報をもとにＭＥＴ２５遺伝子をポリメレースチェインリ
アクション（ＰＣＲ）によって増幅、単離した。研究用
酵母Ｘ２１８０−１Ａ株 (University of California a
t Berkley, Yeast Genetic Stock Center)から染色体Ｄ
ＮＡを抽出し、これをＰＣＲの鋳型とした。
【００１６】ＰＣＲ用のプライマーとして２５Ｂ（ＡＴ
Ｇ）(5'-CTGGATCCCCCATCCATACAATGCCAT-3') （配列番
号：１）、２５ＨＲ(5'-GAGGCAAGCTTTAAATTGTC-3')（配
列番号：２）、２５Ｈ(5'-GACAATTTAAAGCTTGCCTC-3')
（配列番号：３）、及び２５ＢＲ(5'-CCGGATCCCGCGAAGT
TTTCCTGATTT-3') （配列番号：４）の合成ＤＮＡを用い
た。プライマー２５Ｂ（ＡＴＧ）と２５ＨＲの組み合わ
せによりＭＥＴ２５遺伝子の塩基番号−１４〜１１２０
が、プライマー２５Ｈと２５ＢＲの組み合わせによりＭ
ＥＴ２５遺伝子の塩基番号１１２１〜１７１２が増幅さ
れ、それぞれ、約１．２kbのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII
断片と約５８０bpのＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ断片とが
得られた（図１）。
Ｇ）(5'-CTGGATCCCCCATCCATACAATGCCAT-3') （配列番
号：１）、２５ＨＲ(5'-GAGGCAAGCTTTAAATTGTC-3')（配
列番号：２）、２５Ｈ(5'-GACAATTTAAAGCTTGCCTC-3')
（配列番号：３）、及び２５ＢＲ(5'-CCGGATCCCGCGAAGT
TTTCCTGATTT-3') （配列番号：４）の合成ＤＮＡを用い
た。プライマー２５Ｂ（ＡＴＧ）と２５ＨＲの組み合わ
せによりＭＥＴ２５遺伝子の塩基番号−１４〜１１２０
が、プライマー２５Ｈと２５ＢＲの組み合わせによりＭ
ＥＴ２５遺伝子の塩基番号１１２１〜１７１２が増幅さ
れ、それぞれ、約１．２kbのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII
断片と約５８０bpのＨｉｎｄIII −ＢａｍＨＩ断片とが
得られた（図１）。
【００１７】合成ＤＮＡの配列中に制限酵素部位が設け
てあるので、増幅されたＤＮＡ断片は制限酵素で消化し
た後、汎用のプラスミドベクターにクローニングするこ
とができる。約１．２kbのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII 断
片を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）用のプラスミドｐＵＣ１９
（宝酒造社製）へ、約５８０bpのＨｉｎｄIII −Ｂａｍ
ＨＩ断片をプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造社製）へ挿入
して、それぞれｐＵＣ／２５ＢＨ、およびｐＵＣ／２５
ＨＢとした（図１）。
てあるので、増幅されたＤＮＡ断片は制限酵素で消化し
た後、汎用のプラスミドベクターにクローニングするこ
とができる。約１．２kbのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄIII 断
片を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）用のプラスミドｐＵＣ１９
（宝酒造社製）へ、約５８０bpのＨｉｎｄIII −Ｂａｍ
ＨＩ断片をプラスミドｐＵＣ１８（宝酒造社製）へ挿入
して、それぞれｐＵＣ／２５ＢＨ、およびｐＵＣ／２５
ＨＢとした（図１）。
【００１８】得られたＭＥＴ２５遺伝子のＤＮＡ塩基配
列をサンガーの方法（Sanger, F.,Science, 214, 1205,
1981）で調べ、報告されているＭＥＴ２５遺伝子の配
列と同一であることを確認した。ｐＵＣ２５ＢＨおよび
ｐＵＣ２５ＨＢから再度ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII で
ＭＥＴ２５遺伝子部分を切り出し、これらをＢａｍＨＩ
で切断したｐＵＣ１１９プラスミド（宝酒造社製）へク
ローニングすることにより、完全な形のＭＥＴ２５遺伝
子（ｐＵＣ／ＭＥＴ２５）を取得した（図１）。
列をサンガーの方法（Sanger, F.,Science, 214, 1205,
1981）で調べ、報告されているＭＥＴ２５遺伝子の配
列と同一であることを確認した。ｐＵＣ２５ＢＨおよび
ｐＵＣ２５ＨＢから再度ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄIII で
ＭＥＴ２５遺伝子部分を切り出し、これらをＢａｍＨＩ
で切断したｐＵＣ１１９プラスミド（宝酒造社製）へク
ローニングすることにより、完全な形のＭＥＴ２５遺伝
子（ｐＵＣ／ＭＥＴ２５）を取得した（図１）。
【００１９】実施例２．プラスミドｐＹＧ１の構成 Ｇ４１８耐性の構造遺伝子を含むプラスミドｐＧＲ１
は、Agric. Biol. Chem.vol.54, No.10, p2689-2696 (1
990)に記載されている方法で取得でき、これをＥｃｏＲ
Ｉ及びＰｖｕIIで切断して得られるＧ４１８耐性の構造
遺伝子にＳａｌＩリンカーをつけてＥｃｏＲＩ−Ｓａｌ
Ｉ切断とし、これをｐＹＥ２２ｍのＧＡＰＤＨ遺伝子の
プロモーターとターミネーターの間に挿入し、ｐＹＧ１
を得た（図２）。プラスミドｐＹＥ２２ｍの作成方法
は、特開平４−２２８０７８号公報に詳しく記載されて
いる。
は、Agric. Biol. Chem.vol.54, No.10, p2689-2696 (1
990)に記載されている方法で取得でき、これをＥｃｏＲ
Ｉ及びＰｖｕIIで切断して得られるＧ４１８耐性の構造
遺伝子にＳａｌＩリンカーをつけてＥｃｏＲＩ−Ｓａｌ
Ｉ切断とし、これをｐＹＥ２２ｍのＧＡＰＤＨ遺伝子の
プロモーターとターミネーターの間に挿入し、ｐＹＧ１
を得た（図２）。プラスミドｐＹＥ２２ｍの作成方法
は、特開平４−２２８０７８号公報に詳しく記載されて
いる。
【００２０】実施例３．プラスミドｐＥＧ２５の構成 プラスミドｐＥＧ２５は、酵母２μｍプラスミドの複製
起点を持つＹＥｐ型のプラスミド（Beggs, J. D., Natu
re, 275, 104, 1978）であり、酵母中で自己複製が可能
であって、グリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲ
ナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のプロモーター（Holland, J. P.
and Holland, M. J., J. Biol. Chem.254, 9839, 197
6)に連結されたＯ−アセチルホモセリンサルフハイドリ
レースをコードするＭＥＴ２５遺伝子を有し、形質転換
マーカーとしてＴＲＰ１遺伝子及び薬剤耐性遺伝子であ
るＧ４１８耐性遺伝子（Oka, A., Sugisaki, H., and T
akanami, M., J. Mol. Biol., 147, 217, 1981）を有す
る。
起点を持つＹＥｐ型のプラスミド（Beggs, J. D., Natu
re, 275, 104, 1978）であり、酵母中で自己複製が可能
であって、グリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲ
ナーゼ（ＧＡＰＤＨ）のプロモーター（Holland, J. P.
and Holland, M. J., J. Biol. Chem.254, 9839, 197
6)に連結されたＯ−アセチルホモセリンサルフハイドリ
レースをコードするＭＥＴ２５遺伝子を有し、形質転換
マーカーとしてＴＲＰ１遺伝子及び薬剤耐性遺伝子であ
るＧ４１８耐性遺伝子（Oka, A., Sugisaki, H., and T
akanami, M., J. Mol. Biol., 147, 217, 1981）を有す
る。
【００２１】具体的には酵母の発現プラスミドｐＹＥ２
２ｍのＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ部位に、プラスミドｐＹ
Ｇ１からＨｉｎｄIII 及びＳａｌＩ消化によって調製し
た約２．５kbのＧ４１８耐性遺伝子のＤＮＡ断片を挿入
して、ｐＹＥＧを作成した。挿入に際して約２．５kb断
片のＨｉｎｄIII 部位は、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝
酒造社製）による平滑化とＢａｍＨＩリンカーの結合に
よってＢａｍＨＩ部位に変換した（図３）。得られたｐ
ＹＥＧをＢａｍＨＩで切断し、実施例１記載のプラスミ
ドｐＵＣ／ＭＥＴ２５から調製したＭＥＴ２５遺伝子を
含む約１．８kbのＢａｍＨＩ断片をライゲーションして
ｐＥＧ２５を得た（図３）。
２ｍのＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ部位に、プラスミドｐＹ
Ｇ１からＨｉｎｄIII 及びＳａｌＩ消化によって調製し
た約２．５kbのＧ４１８耐性遺伝子のＤＮＡ断片を挿入
して、ｐＹＥＧを作成した。挿入に際して約２．５kb断
片のＨｉｎｄIII 部位は、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（宝
酒造社製）による平滑化とＢａｍＨＩリンカーの結合に
よってＢａｍＨＩ部位に変換した（図３）。得られたｐ
ＹＥＧをＢａｍＨＩで切断し、実施例１記載のプラスミ
ドｐＵＣ／ＭＥＴ２５から調製したＭＥＴ２５遺伝子を
含む約１．８kbのＢａｍＨＩ断片をライゲーションして
ｐＥＧ２５を得た（図３）。
【００２２】実施例４．酵母の形質転換 ビール酵母ＢＨ８４株（ミュンヘン工科大学 Veihenste
phan.164（保育菌株Ｎｏ．１６４））を酢酸リチウム処
理し、プラスミド溶液とポリエチレングリコール４００
０を加えて、３０℃で３０分保持した後、４２℃で５分
処理し、ＹＰＤ液体培地（酵母エキス１％、ポリペプト
ン２％、グルコース２％）を２ml加えて３０℃で６時間
振盪培養した後、遠心して菌体を１０倍濃縮し、Ｇ４１
８を３００ppm 含むＹＰＤ平板培地（ＹＰＤ液体培地＋
２％寒天）に塗布し、３０℃で３〜５日間培養して、増
殖してきたコロニーを拾い、形質転換体とした。形質転
換された酵母菌株をＢＨ Ｍ３８−２と命名した。
phan.164（保育菌株Ｎｏ．１６４））を酢酸リチウム処
理し、プラスミド溶液とポリエチレングリコール４００
０を加えて、３０℃で３０分保持した後、４２℃で５分
処理し、ＹＰＤ液体培地（酵母エキス１％、ポリペプト
ン２％、グルコース２％）を２ml加えて３０℃で６時間
振盪培養した後、遠心して菌体を１０倍濃縮し、Ｇ４１
８を３００ppm 含むＹＰＤ平板培地（ＹＰＤ液体培地＋
２％寒天）に塗布し、３０℃で３〜５日間培養して、増
殖してきたコロニーを拾い、形質転換体とした。形質転
換された酵母菌株をＢＨ Ｍ３８−２と命名した。
【００２３】実施例５．形質転換株に於けるＭＥＴ２５
のｍＲＮＡ発現量の解析 親株ＢＨ８４株と形質転換株ＢＨ Ｍ３８−２株を２％
グルコースを含むYeast Nitrogen Base (Difco) 、又
は、２％グルコース及び５mMメチオニンを含むYeast Ni
trogen Base １０mlで３０℃、１７時間培養した。酵母
菌体を集菌、洗浄し、０．２mlのＬＥＴＳバッファー
（０．１Ｍ ＬｉＣｌ，１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ，０．２
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４），０．０１Ｍ ＥＤ
ＴＡ）に懸濁し、０．４ｇのグラスビーズを加えて、ビ
ーズビーターで３分間処理をして菌体を破砕した。
のｍＲＮＡ発現量の解析 親株ＢＨ８４株と形質転換株ＢＨ Ｍ３８−２株を２％
グルコースを含むYeast Nitrogen Base (Difco) 、又
は、２％グルコース及び５mMメチオニンを含むYeast Ni
trogen Base １０mlで３０℃、１７時間培養した。酵母
菌体を集菌、洗浄し、０．２mlのＬＥＴＳバッファー
（０．１Ｍ ＬｉＣｌ，１％（Ｗ／Ｖ）ＳＤＳ，０．２
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（pH７．４），０．０１Ｍ ＥＤ
ＴＡ）に懸濁し、０．４ｇのグラスビーズを加えて、ビ
ーズビーターで３分間処理をして菌体を破砕した。
【００２４】得られた菌体破砕液を１００００×ｇ、１
０分間遠心して上清を得、フェノール処理を３回施した
後に、エタノールを加え、−２０℃で全ＲＮＡを沈殿さ
せた。遠心後、沈殿を７０％エタノールでリンスし乾固
させて、蒸留水に溶解し全ＲＮＡ液とした。得られた全
ＲＮＡ４０μｇを常法どおりホルムアルデヒドゲル電気
泳動で展開後、メンブレンにトランスファーして３２Ｐ
−ラベルしたＭＥＴ２５遺伝子のＤＮＡフラグメントを
プローブとして用い、ハイブリダイゼーションを行っ
た。
０分間遠心して上清を得、フェノール処理を３回施した
後に、エタノールを加え、−２０℃で全ＲＮＡを沈殿さ
せた。遠心後、沈殿を７０％エタノールでリンスし乾固
させて、蒸留水に溶解し全ＲＮＡ液とした。得られた全
ＲＮＡ４０μｇを常法どおりホルムアルデヒドゲル電気
泳動で展開後、メンブレンにトランスファーして３２Ｐ
−ラベルしたＭＥＴ２５遺伝子のＤＮＡフラグメントを
プローブとして用い、ハイブリダイゼーションを行っ
た。
【００２５】発現量の強さはイメージングプレート（富
士写真フイルム社製、ＢＡＳ ２０００）を用いて測定
した。結果はメチオニン非存在下での親株ＢＨ８４株の
値を１００％として表１に示す。
士写真フイルム社製、ＢＡＳ ２０００）を用いて測定
した。結果はメチオニン非存在下での親株ＢＨ８４株の
値を１００％として表１に示す。
【００２６】
【表１】
【００２７】親株ＢＨ８４株のＭＥＴ２５遺伝子の発現
が培地中のメチオニンによる抑制を受けているのに対
し、形質転換株ＢＨ Ｍ３８−２株では、メチオニンの
存在、非存在に関わらず親株の３〜４倍のＭＥＴ２５
ｍＲＮＡを発現していることが確認された。
が培地中のメチオニンによる抑制を受けているのに対
し、形質転換株ＢＨ Ｍ３８−２株では、メチオニンの
存在、非存在に関わらず親株の３〜４倍のＭＥＴ２５
ｍＲＮＡを発現していることが確認された。
【００２８】実施例６．ビール試験醸造に於ける硫化水
素放出量の解析 親株ＢＨ８４株、並びに形質転換株ＢＨ Ｍ３８−２株
を用いた発酵試験を表２の条件下で行った。但し、ＢＨ
Ｍ３８−２株に用いた麦汁にのみ選択薬剤であるＧ４
１８を１０ppm の濃度で添加した。
素放出量の解析 親株ＢＨ８４株、並びに形質転換株ＢＨ Ｍ３８−２株
を用いた発酵試験を表２の条件下で行った。但し、ＢＨ
Ｍ３８−２株に用いた麦汁にのみ選択薬剤であるＧ４
１８を１０ppm の濃度で添加した。
【００２９】
【表２】
【００３０】発酵中の硫化水素の定量は発酵ガス中の硫
化水素を酢酸亜鉛溶液で一旦トラップした後、メチレン
ブルーを生成させ、ＯＤ６６８を測定することにより行
った(Jangaard, N. O., Gress, H. S. and Coe, R. W.
; Amer. Soc. Brew. Chem.Proc., p46, 1973) （図
４）。また、発酵中の酵母増殖量（ＯＤ６６０）（図
５）、エキスの消費経過（図６）を調べ、ビールの成分
分析も行った（表３）。
化水素を酢酸亜鉛溶液で一旦トラップした後、メチレン
ブルーを生成させ、ＯＤ６６８を測定することにより行
った(Jangaard, N. O., Gress, H. S. and Coe, R. W.
; Amer. Soc. Brew. Chem.Proc., p46, 1973) （図
４）。また、発酵中の酵母増殖量（ＯＤ６６０）（図
５）、エキスの消費経過（図６）を調べ、ビールの成分
分析も行った（表３）。
【００３１】その結果、図４に示すように、ＭＥＴ２５
遺伝子を導入した形質転換株ＢＨＭ３８−２株では２０
０時間の硫化水素生成量は親株の約２％に減少してい
た。一方、その際の酵母菌体の増殖には異常は認められ
ず（図５）、発酵経過にも親株との差はほとんど認めら
れなかった（図６）。さらに、ビール成分の分析値も形
質転換株ではＳＯ2 が減少していること以外、親株によ
るビールとの差異は認められなかった（表３）。また、
官能的にも育種株によるビールに対して異臭は全く感じ
られなかった。
遺伝子を導入した形質転換株ＢＨＭ３８−２株では２０
０時間の硫化水素生成量は親株の約２％に減少してい
た。一方、その際の酵母菌体の増殖には異常は認められ
ず（図５）、発酵経過にも親株との差はほとんど認めら
れなかった（図６）。さらに、ビール成分の分析値も形
質転換株ではＳＯ2 が減少していること以外、親株によ
るビールとの差異は認められなかった（表３）。また、
官能的にも育種株によるビールに対して異臭は全く感じ
られなかった。
【００３２】
【表３】
【００３３】以上の結果から、本発明は発酵工程で生ず
る硫化水素を減少させ、その結果ビール品質の向上や後
発酵または貯酒期間の短縮に有効であることが確認され
た。
る硫化水素を減少させ、その結果ビール品質の向上や後
発酵または貯酒期間の短縮に有効であることが確認され
た。
【００３４】
配列番号：１ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： CTGGATCCCC CATCCATACA ATGCCAT 27
【００３５】配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： GAGGCAAGCT TTAAATTGTC 20
【００３６】配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： GACAATTTAA AGCTTGCCTC 20
【００３７】配列番号：４ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：合成ＤＮＡ 配列： CCGGATCCCG CGAAGTTTTC CTGATTT 27
【図１】図１はＰＣＲによるＭＥＴ２５遺伝子の単離及
びＭＥＴ２５遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ／ＭＥＴ２
５の構成を示す図である。
びＭＥＴ２５遺伝子を含むプラスミドｐＵＣ／ＭＥＴ２
５の構成を示す図である。
【図２】図２はプラスミドｐＹＧ１の構成を示す図であ
る。記号：Ｇ４１８r 、ＧＡＰＤＨ遺伝子プロモーター
の制御下にＧ４１８に耐性を与える遺伝子。ＰＧＡＰＤ
Ｈ、ＧＡＰＤＨ遺伝子プロモーター。Ａｐr 、アンピシ
リン耐性遺伝子。ＴＲＰ１、トリプトファン要求性回復
遺伝子。ＩＲ１、逆位の繰り返し配列。
る。記号：Ｇ４１８r 、ＧＡＰＤＨ遺伝子プロモーター
の制御下にＧ４１８に耐性を与える遺伝子。ＰＧＡＰＤ
Ｈ、ＧＡＰＤＨ遺伝子プロモーター。Ａｐr 、アンピシ
リン耐性遺伝子。ＴＲＰ１、トリプトファン要求性回復
遺伝子。ＩＲ１、逆位の繰り返し配列。
【図３】図３はプラスミドｐＥＧ２５の構成を示す図で
ある。
ある。
【図４】実施例６において、ＭＥＴ２５遺伝子を導入し
た形質転換株の２００時間の硫化水素生成量の変化を示
すグラフである。○は親株ＢＨ８４株、●は形質転換株
ＢＨ Ｍ３８−２の場合である。
た形質転換株の２００時間の硫化水素生成量の変化を示
すグラフである。○は親株ＢＨ８４株、●は形質転換株
ＢＨ Ｍ３８−２の場合である。
【図５】実施例６における発酵中の酵母増殖量（ＯＤ６
６０）を示すグラフである。
６０）を示すグラフである。
【図６】実施例６における発酵中のエキスの消費経過を
示すグラフである。
示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 中谷 和夫 大阪府三島郡島本町若山台１丁目１番１号 サントリー株式会社ビール研究所内
Claims (3)
- 【請求項１】 構成的な発現をする遺伝子のプロモータ
ー及び当該プロモーターの制御下にあるＯ−アセチルホ
モセリンサルフハイドリレースの構造遺伝子（ＭＥＴ２
５）を導入したことにより硫化水素生成量が減少したサ
ッカロミセス属の酵母。 - 【請求項２】 前記構成的な発現をする遺伝子のプロモ
ーターがグリセロアルデヒド−３−ホスフェートデヒド
ロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）遺伝子のプロモーター、又は
３−ホスホグリセロートキナーゼ（ＰＧＫ）遺伝子のプ
ロモーターである、請求項１に記載の酵母。 - 【請求項３】 請求項１又は２に記載の酵母を用いた、
硫化水素が少なく、発酵期間が短縮されたビールの製造
法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09985594A JP3514507B2 (ja) | 1994-05-13 | 1994-05-13 | 硫化水素生成が低減された酵母とこの酵母を用いたビール製造法 |
| CA 2149171 CA2149171C (en) | 1994-05-13 | 1995-05-11 | Recombinant yeast producing a decreased amount of hydrogen sulfide in beer production |
| AU20022/95A AU2002295A (en) | 1994-05-13 | 1995-05-11 | Decreased hydrogen sulfide formation in beer production |
| DE1995627681 DE69527681T2 (de) | 1994-05-13 | 1995-05-12 | Verringerter Schwefelwasserstoffbindung bei der Bierherstellung |
| EP19950303211 EP0699748B1 (en) | 1994-05-13 | 1995-05-12 | Decreased hydrogen sulfide formation in beer production |
| DK95303211T DK0699748T3 (da) | 1994-05-13 | 1995-05-12 | Reduceret hydrogensulfiddannelse under ølproduktion |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP09985594A JP3514507B2 (ja) | 1994-05-13 | 1994-05-13 | 硫化水素生成が低減された酵母とこの酵母を用いたビール製造法 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07303475A true JPH07303475A (ja) | 1995-11-21 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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|---|---|
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Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007026956A1 (ja) | 2005-09-01 | 2007-03-08 | Suntory Limited | 低温発酵性及び／又は冷凍耐性を増強させる遺伝子及びその用途 |
| WO2007026958A1 (ja) | 2005-09-01 | 2007-03-08 | Suntory Limited | トリプトファントランスポーター遺伝子及びその用途 |
| WO2007086592A1 (ja) * | 2006-01-24 | 2007-08-02 | Kirin Holdings Kabushiki Kaisha | 亜硫酸高生産酵母の育種方法及び該酵母を用いた酒類の製造方法 |
| WO2007097113A1 (en) | 2006-02-24 | 2007-08-30 | Suntory Limited | Gene encoding protein responsible for flocculation property of yeast and use thereof |
| WO2007099751A1 (en) | 2006-02-28 | 2007-09-07 | Suntory Limited | Gene encoding glycogen synthase and use thereof |
| WO2007105350A2 (en) | 2006-02-28 | 2007-09-20 | Suntory Limited | Catalase gene and use thereof |
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| JP4231170B2 (ja) * | 1999-10-26 | 2009-02-25 | サントリー株式会社 | 酵母の育種方法 |
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| JP2008530977A (ja) * | 2005-08-22 | 2008-08-14 | サントリー株式会社 | Ｏ−アセチルホモセリンサルフハイドリレース遺伝子及びその用途 |
-
1994
- 1994-05-13 JP JP09985594A patent/JP3514507B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-05-11 AU AU20022/95A patent/AU2002295A/en not_active Abandoned
- 1995-05-11 CA CA 2149171 patent/CA2149171C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-05-12 EP EP19950303211 patent/EP0699748B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-12 DE DE1995627681 patent/DE69527681T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-12 DK DK95303211T patent/DK0699748T3/da active
Cited By (7)
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|---|---|---|---|---|
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| WO2007097113A1 (en) | 2006-02-24 | 2007-08-30 | Suntory Limited | Gene encoding protein responsible for flocculation property of yeast and use thereof |
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Also Published As
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| EP0699748A2 (en) | 1996-03-06 |
| EP0699748B1 (en) | 2002-08-07 |
| AU2002295A (en) | 1995-11-23 |
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| CA2149171C (en) | 2007-10-23 |
| EP0699748A3 (en) | 1998-07-29 |
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