JPH072693A

JPH072693A - 肝炎処置用医薬組成物

Info

Publication number: JPH072693A
Application number: JP4074377A
Authority: JP
Inventors: G Mattoknick Milton; ジー．マットクニックミルトン
Original assignee: Wayne State University
Current assignee: Wayne State University
Priority date: 1992-03-30
Filing date: 1992-03-30
Publication date: 1995-01-06
Anticipated expiration: 2010-06-07
Also published as: JPH0753668B2

Abstract

(57)【要約】（修正有）【目的】チモシンを含有する、哺乳動物、特にヒトの
ウイルス誘発Ｂ型肝炎処置用の医薬組成物を提供する。【構成】この組成物はチモシンアルファ₁を含有す
る子牛チモシンフラクション５あるいは子牛または合
成のチモシンアルファ₁を包含し、慢性Ｂ型肝炎の処
置に特に有効である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ウイルス誘発肝炎の後
退が生じる期間にわたって、チモシンを哺乳動物に投与
することにより、この病気を患っている哺乳動物を処置
するための医薬組成物に関するものである。特に、本発
明は慢性ウイルスＢ型肝炎処置用の医薬組成物に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】慢性肝臓病として一般的な慢性Ｂ型肝炎
は肝硬変、肝不全および肝細胞癌に進行する危険が高い
（ＳｅｅｆｆＬ．Ｂ．等、ＳｅｍＬｉｖｅｒＤｉ
ｅ，６：１１〜２２（１９８６））。Ｂ型肝炎ウイルス
（ＨＢＶ）感染肝細胞のクリアリングにおける宿主細胞
の免疫機構の減退作用性が慢性ＨＢＶ感染の進行の説明
に定義されている（ＴｈｏｍａｓＨ．Ｃ．等、Ｓｅｍ
ＬｉｖｅｒＤｉｓ，６：３４−４１（１９８
６））。この病気の処置においては抗ウイルス剤が使用
されており、この中で、アルファ−インタフェロン（Ｉ
ＦＮ−α）が現在まで、最も有効なものとして開発され
た（ＨｏｏｆｎａｇｌｅＪ．Ｈ．等、Ｇａｓｔｒｏｅ
ｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，９５：１３１８−１３２５（１９
８８）；およびＰｅｒｉｌｌｏＲ．Ｐ．等、Ａｎｎ
ＩｎｔＭｅｄ，１０９：９５−１００（１９８
８））。不幸なことに、ＩＦＮ−αは治療の中止が求め
られるような重大な副作用を生じさせることができる
（ＨｏｏｆｎａｇｌｅＪ．Ｈ．等、Ｇａｓｔｒｏｅｎ
ｔｅｒｏｌｏｇｙ，９５：１３１８−１３２５（１９８
８）；ＰｅｒｉｌｌｏＲ．Ｐ．等、ＡｎｎＩｎｔ
Ｍｅｄ，１０９：９５−１００（１９８８）；およびＲ
ｅｎａｕｌｔＰ．Ｆ．等、ＳｅｍＬｉｖｅｒＤｉ
ｓ，９：２７３−２７７（１９８９））。

【０００３】慢性ＨＢＶの処置に臨床実験的に使用され
ている免疫調節剤、たとえばインタロイキン２（ＩＬ
２）およびレバミソール（ｌｅｖａｍｉｓｏｌｅ）は結
論がでていないか、または無効の結果に終っている（Ｋ
ａｋｕｍａＳ．等、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，８：４８
７−４９２（１９８８）；ＦａｔｔｏｖｉｃｋＧ．
等、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，９１：６９２
−６９６（１９８６））。

【０００４】胸腺抽出物または胸腺由来ペプチドはチモ
シンと化学的に異なっており、これらは慢性Ｂ型肝炎の
処置に使用されていた。研究の一つにおいて（Ｒｏｍｅ
ｏＦ．等、Ａｒｚｈｅｉｍ−Ｆｏｒｓｈ／ＤｒｕｇＲ
ｅｓ．，３７：４５０−４５６（１９８７））、牛胸腺
の抽出物であるチモスチムリンが臨床的、生化学的およ
び組織学的な改善をもたらした。しかしながら、ＨＢＶ
マーカーに対する処置効果は報告されていない。同様の
応答がチモペプチドを使用する別の研究（Ｚｈａｎｇ
Ｄ．Ｆ．等、ＣｈｉｍｅｓｅＭｅｄ．Ｊ．，９９：７
９１−７９８（１９８６））および胸腺因子Ｘを使用す
る別の研究（ＤａｂｒｏｗｓｋｉＭ．Ｐ．等、Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，１
６：２９７−３０７（１９８０））で報告されている。

【０００５】ＴＦ５は少なくとも４０のペプチド成分を
含有し、その中の２０が均質に、またはほぼ均質に精製
されている牛胸腺の部分的精製抽出物である（Ｌｏｗ
Ｔ．Ｌ．Ｋ．等、Ｔｈｙｍｕｓ，６：２７−４２（１９
８４））。Ｔ−アルファ₁を含むこれらのペプチドのう
ちの数種は、配列決定され、また化学的に合成されてい
る（ＷｅｔｚｅｌＲ．等、Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９：６
０９６−６１０４（１９８０）；およびＬｏｗＴ．
Ｌ．Ｋ．等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５４：９８
１−９８６（１９７９））。

【０００６】前述の研究において、チモシン分画５は、
インビトロにおいて、ＣＡＨＢの患者の自発的細胞媒介
細胞毒性を減少させ（ＭｕｔｃｈｎｉｃｋＭ．Ｇ．
等、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ
ｏｌ．，１６：４２３−４３７（１９８０））、そして
またこれらの患者からのＰＢＭ中のＣｏｎＡ誘発サプ
レッサー細胞機能を高める（ＭｕｔｃｈｎｉｃｋＭ．
Ｇ．等、Ｄｉｇ．ＤｉｓＳｃｉ．，２８：３２８−３３
４（１９８３））ことが証明された。

【０００７】チモシン分画５（ＴＦ５）およびチモシン
アルファ₁（Ｔ−α₁）は、リンパ球における成熟現
象の引き金になり、Ｔ細胞機能を増大させ、かつまた免
疫不全の再構成を促進することが証明されている（Ｌｏ
ｗＴ．Ｌ．Ｋ．等、Ｔｈｙｍｕｓ，６：２７−４２
（１９８４））。従って、これらの組成物は免疫調整剤
である。

【０００８】ＴＦ５およびＴ−α₁はＴ細胞の強力な誘
導物質であり、免疫調整性Ｔ細胞機能に影響をおよぼす
ことができる（ＬｏｗＴ．Ｌ．Ｋ．，等、Ｔｈｙｍｕ
ｓ６：２７−４２（１９８４）；Ｌｏｗ，Ｔ．Ｌ．
Ｋ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５４：９８１−９８
６（１９７９）；Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｇ．Ｄ．，等、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１２６：７４１−７４４（１９８
１）；およびＭｕｔｃｈｎｉｃｋ，Ｍ．Ｇ．等、Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２
３：６２６−６３３（１９８２））。ＴＦ５およびＴ−
α₁はＴ４細胞機能を高め、ヒトリンパ球によるＩＦＮ
−α、ＩＦＮ−γおよびＩＬ２産生を促進し、かつまた
リンパ球ＩＬ２レセプター発現を増大させることが示
されている（Ｌｏｗ，Ｔ．Ｌ．Ｋ．等、Ｔｈｙｍｕｓ，
６：２７−４２（１９８４）；ＳｚｔｅｉｎＭ．
Ｂ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ，８３：６１０７−６１１１（１９８６）；Ｓｅｒｒ
ａｔｅＳ．Ａ．等、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３９：
２３３８−２３４３（１９８７）；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ
Ｃ．Ｎ．等、Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍ．，１３：１３
３−１４１（１９８７）；ＳｖｅｄｅｒｓｋｙＬ．
Ｐ．等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：２４４−
２４７（１９８２））。

【０００９】免疫不全または癌に被患している患者にお
ける主要または補助治療として、臨床実験で使用された
ＴＦ５およびＴ−α₁は、これらの薬物が免疫応答を高
め、かつまたリンパ球機能を特異的に増大させることを
示した（ＡｚｔｅｉｎＭ．Ｂ．等、ｓｐｒｉｎｇｅｒ
ＳｅｍｉｎＩｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，９：１−
１８（１９８６））。さらにまた、これらの胸腺ペプチ
ド類は比較的正常な免疫パラメーターを非特異的に高め
るというよりはむしろ、免疫不全を再構成するものと見
做される。これらの組成物がＨＢＶの処置に使用された
ことはなかった。

【００１０】

【発明の開示】従って、本発明の目的は、哺乳動物、特
にヒトにおけるＢ型肝炎の後退を生じさせる組成物およ
び方法を提供することにある。さらに、本発明の目的
は、慢性Ｂ型肝炎に対して特に効果的な組成物および方
法を提供することにある。これらの目的およびその他の
目的は以下の記載を参考にすることによって、ますます
明白になるであろう。

【００１１】Ｆｉｇ１は、ＡＬＴウイルスの増大を示
した後に、先ず血清ＨＢｅＡｇを、次いでＨＢＶＤＮ
Ａをクリアランスした１人の患者におけるＴＦ５（９０
ｍｇ／Ｍ²）に対する応答を示すグラフである。そのす
ぐ後に抗ＨＢｅが発現するが、血清ＨＢｓＡｇは存続す
る。初期および６ケ月後の肝臓生検試料中に存在するＨ
ＢＶＤＮＡ分子型およびＨＢｃＡｇは１２ケ月後の生
検試料中には見い出されなかった。

【００１２】Ｆｉｇ２は、患者群における末梢血液中
の（Ａ）リンパ球、（Ｂ）ＣＤ３および（Ｃ）ＣＤ４の
絶対値に係る一連の分析結果を示す。ＴＦ５／Ｔ−α₁
群□とプラセボ群●との比較、および健康な協力者のパ
ネル（ｎ＝６７）に対する比較を、平行線で示されてい
る９５％信頼限界をもって、行なった。＊ｐ＜０．０
５、＊＊ｐ＜０．０１の場合の各数値はＳｔｕｄｅｎ
ｔ’ｓペアーｔテストによって、初期値に対して比
較した。▲は処置の開始時を示し、そして▼は処置の完
了時を示す。

【００１３】Ｆｉｇ３は、ＴＦ５／Ｔ−α₁群□およ
びプラセボ群●から得られたＰＢＭによるＩＦＮ−γ産
生の一連の分析値を示している。平行線によって区分さ
れているように、９５％の信頼限界をもって、患者群間
および健康な協力者（ｎ＝６７）に対する比較がなされ
ている。＊ｐ＜０．０５の場合の数値はＳｔｕｄｅｎ
ｔ’ｓペアーｔテストにより初期値と比較した。▲
は処置の開始時を示し、そして▼は処置の完了時を示
す。

【００１４】Ｆｉｇ４は、プラセボを与えられた非応
答者とチモシンで処置された応答者とにおける各肝臓生
検試料のＨＢＶＤＮＡ交雑研究の結果を示している。
プラセボで処置された患者からのレーンＡ、ＢおよびＣ
においては、予想形態のＨＢＶＤＮＡ複製型中間体の
全部が多量に存在し、１２ケ月の研究期間にわたり変化
しないことが、サザン法によって見い出される（Ａ：初
期、Ｂ：６ケ月目；Ｃ：１２ケ月目）。類似の複製型が
Ｔ−α₁を与えられた患者にも初期に存在したが（レー
ンＤ）、６ケ月目（レーンＥ）および１２ケ月目（レー
ンＦ）には、超ラセン形でゆるやかな円形のフリーゲ
ノムだけが存在していた。

【００１５】一般的説明本発明は、哺乳動物におけるウイルス誘発肝炎処置用の
組成物および方法に関し、この組成物は、チモシンア
ルファ₁およびチモシンアルファ₁を有効量で含有す
る子牛抽出物からなる群から選ばれるチモシンの有効量
を哺乳動物に投与し、これによって哺乳動物における肝
炎の後退を生じさせるものである。本発明の組成物は、
ヒトにおける慢性Ｂ型肝炎に対し、特に有効である。

【００１６】好適なチモシンはチモシンアルファ₁お
よびチモシンアルファ₁を有効量で含有するチモシン
類の混合物であるチモシン分画５である。チモシン分画
５は牛胸腺から誘導され、そしてチモシンアルファ₁
は前記で引用した文献に示されているように、化学的に
合成することができる。チモシンは好ましくは、重炭酸
ナトリウムなどの稀釈剤中に入れて、皮下投与する。こ
のような稀釈剤は当業者にとって周知である。

【００１７】ヒトにおける投与量は、ヒトにおけるチモ
シンアルファ₁に係り、身体面積の一平方メートル当
りで、好ましくは約６００〜１２００マイクログラム、
最も好ましくは９００マイクログラムである。チモシン
分画５は、ヒトにおいて、身体面積の一平方メーター当
りで、好ましくは約６０〜１２０ｍｇ、最も好ましくは
９０ｍｇの量で使用する。投与量は、ウイルス後退の点
で、最適の結果が得られるように選択する。動物におけ
る投与量は匹敵する量である。

【００１８】詳細な説明慢性活性Ｂ型肝炎の患者１２人における、無作為の二重
盲験、プラスボ−対照評価試験において、チモシン分画
５およびチモシンアルファ₁安全性および効果を評価
した。患者はいづれも、処置前の少なくとも６ケ月間、
活性肝臓病の組織学的および生化学的徴候を有してお
り、かつまた血清Ｂ型肝炎ウイルスデオキシリボ核酸
およびＢ型肝炎表面抗原に係り陽性であった。

【００１９】７人の患者には、チモシン分画５またはチ
モシン−α₁を、そして５人の患者には、プラスボを、
週２回の投与で６ケ月間与えた。この研究の終了時（１
年後）に、チモシン処置患者における血清アミノトラン
スフェラーゼレベルは有意に改善されていたが、プラ
セボ群では改善されていなかった。

【００２０】チモシン処置患者のうちの６人（８６％）
およびプラセボを与えられた患者のうちの１人（２０
％）では、血清からＢ型肝炎ウイルスデオキシリボ核
酸がクリアランスされていた（ｐ＜０．０４、Ｆｉｓｈ
ｅｒの完全試験）。処置後に、複製型のＢ型肝炎ウイル
スデオキシリボ核酸が５人のプラセボ処置患者のうち
の４人からの肝試料に存在していたが、チモシン処置患
者７人の場合には、１人だけに存在していた（ｐ＜０．
０４、Ｆｉｓｈｅｒの完全試験）。チモシン治療に対す
る応答は末梢血液リンパ球、ＣＤ３およびＣＤ４値で、
およびまた初期値にまさるインタフェロンガンマ−の
インビトロ産生で、有意の改善を示した。チモシンを投
与された患者において、重大な副作用は見い出されなか
った。チモシンに対して応答する患者における、臨床
的、生化学的および血清学的改善は、引続いて２６±３
ケ月の間、維持された。これらの結果は、チモシンが病
気の軽快を促進し、かつまたＢ型肝炎ウイルスによる慢
性活性肝炎の患者におけるＢ型肝炎ウイルスの複製を止
めることを示している。

【００２１】

【実施例】

方法患者：下記の条件の下に、慢性Ｂ型肝炎を患う、１８才
〜７０才の患者を対象にした：少なくとも６ケ月間、Ｂ
型肝炎表面抗原が存在し、かつまた血清アラニンアミ
ノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルが高い；Ｂ型肝
炎ウイルスＤＮＡ（ＨＢＶＤＮＡ）に係る血清試験が
陽性；無作為選別前の３ケ月以内のＣＡＨの組織学的証
拠（ＫｎｏｄｏｌｌＲ．Ｇ．等、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇ
ｙ，１：４３１−４３５（１９８１））；および代償性
肝臓疾患の証拠（プロトロンビンの延長時間が対照値よ
りも４秒より小さい、血清アルブミン≧３ｇｍ／ｄｌお
よび血清総ビルビリン≧４ｍｇ／ｄｌ）。

【００２２】追加の条件には、ヘモグロビン≧１０ｇ
ｍ、血小板数≧７０，０００／ｍｍ³、白血球数（ＷＢ
Ｃ）≧３０００／ｍｍ³、多形核数（ＰＭＮ）≧１５０
０／ｍｍ³および血清クレアチン≦１．４ｍｇ／ｄｌが
含まれていた。肝性脳症、食道出血または胃静脈瘤症、
事前の抗ウイルス処置または免疫抑制処置を有する患者
は除外した。不適格と見做した追加の条件には、静脈薬
物乱用の経歴、Ｄ型肝炎抗体の存在、悪性、妊娠、同性
愛者およびヒト免疫不全ウイルスに係る試験で陽性、が
含まれた。女性には、研究期間中（１年）、避妊の実施
および受胎調節医療の使用の回避の同意を得た。

【００２３】研究計画この３種の研究において、患者には、コンピューター作
成プログラムによって、無作為に指定して、週２回で６
ケ月間、ＴＦ５（９０ｍｇ／身体表面積ｍ²）、Ｔ−α
₁（９００μｇ／身体表面積ｍ²）またはプラセボを皮
下（ＳＣ）注射によって投与した。ＴＦ５、合成Ｔ−α
₁およびプラセボ（１．４％重炭酸ナトリウム）はＡｌ
ｐｈａＯｎｅＢｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，
ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ．から入手した。患者に
はＳＣ注射による自己投与を指示し、承諾は看護婦によ
って毎週、調べた。患者は２週間の間隔で６ケ月間診察
し、引続く６ケ月間は１ケ月毎に診察した。診察時毎
に、臨床的および実験室的評価を行ない、この評価は、
ＨＢｓＡｇ，ＨＢｓＡｇに対する抗体（抗ＨＢｓ）、Ｂ
型肝炎の抗原および抗体（ＨＢｅＡｇおよび抗ＨＢ
ｅ）、ＨＢＶＤＮＡ、ＡＬＴ、アスパルテートアミ
ノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、総ビリルビ、アルカ
リホスファターゼ、血液尿素窒素（ＢＵＮ）、クレア
チニン、コレステロール、尿酸および総タンパク質を包
含していた。１ケ月毎に、血清アルブミン、ヘモグロビ
ン、ＷＢＣ、ＰＭＮ、リンパ球および血小板測定値を得
た。プロトメンビン時間は、１ケ月毎に、慣用の尿分析
によって行なった。免疫学的検査は処置の前およびその
後の研究期間（１年）の間は１ケ月毎に行なった。

【００２４】末梢血液リンパ球の分析には、従来開示さ
れている方法（ＭｕｔｃｈｎｉｃｋＭ．Ｇ．等、Ｃｌｉ
ｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｔｈｏｌ．，
４７：８４−９２（１９８８））の変法を用いる関節免
疫蛍光染色による、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１
およびＮＫサブセットの絶対数、コンカナバリンＡ（Ｃ
ｏｎＡ）およびフィトヘマグルチニン−Ｐ（ＰＨＡ−
Ｐ）誘発リンパ球変形および固体総放射免疫検定法を用
いるＩＦＮ−γの末梢血液単核細胞（ＰＢＭ）産生［Ｉ
ＭＲＸＩｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−γ ＲＩＡ，Ｃｅｎｔ
ｏｃｏｒＩｎｃ．，Ｍａｌｖｅｒｎ，ＰＡ；（Ｍｕｔ
ｃｈｎｉｃｋＭ．Ｇ．等、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．，４７：８４−９２
（１９８８））］が含まれた。

【００２５】成人した健康な協力者から採取した血液試
料を上記の各検査に含ませ、統計学的分析に用いる正常
値のパネルを作成した。経皮肝臓生検は、大部分の患者
において、６ケ月目に反復し、全患者において、１年後
に反復した。処置に対する応答に関して、１年後の時点
で、血清ＨＢＶＤＮＡおよびＨＢｅＡｇ（初期に存在
している場合）の消失およびＡＬＴおよびＡＳＴレベル
の正常化または正常に近い状態が見られた場合に、陽性
であると決定した。上記計画はＨｕｍａｎＩｎｖｅｓ
ｔｉｇａｔｉｏｎＣｏｍｍｉｔｔｅｅｏｆＷａｙｎ
ｅＳｔａｔｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｃｈｏｏｌ
ｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅによって承認されたものであ
り、全患者から得た、書面による同意により充分にイン
ホームされたものである。

【００２６】ウイルスマーカー類血清ＨＢｓＡｇおよび抗−ＨＢｓは放射免疫検定法（Ｒ
ＩＡ）によって、およびまたＨＢｅＡｇおよび抗ＨＢｅ
抗体は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）によって
測定した。デルタウイルスに対する抗体はＲＩＡによ
って、そしてまたＣ型肝炎ウイルスに対する抗体はＥＬ
ＩＳＡによって測定した。

【００２７】肝臓生検試料の組織学的評価ヘマトキシリン−エロシンおよびトリクロムで染色した
全部の肝臓生検試料を、無症状慢性活性肝炎に係り案出
されたシステム（ＫｎｏｄｅｌｌＲ．Ｇ．等、Ｈｅｐ
ａｔｏｌｏｇｙ，１：４３１−４３５（１９８１））に
したがい、１人の観察者による判断（ｃｏｄｅ）の下に
評価した。このシステムは、周辺壊死およびブリッジン
グ壊死の４種の特徴、小葉内損傷（壊死を含む）、門炎
症、および線維形成（硬変を含む）をそれぞれ評価する
ものである。各特徴はスコアで表わした。これらの全ス
コアの総合から、組織学的活性指数を得た。試料はまた
パーオキシダーゼ抗パーオキシダーゼ技法（ＰＡＰ）を
使用して、Ｂ型肝炎核（ｃｏｒｅ）抗原（ＨＢｃＡｇ）
に関して染色した。可能な場合には、肝臓生検組織の一
部を、液状窒素中で素早く凍結させ、ＨＢＶＤＮＡ分
子型に係り雑種形成によって試験した。

【００２８】ＨＢＶ雑種形成試験血清を、以前に報告されたスポット雑種形成法（Ｌｉｅ
ｂｅｒｍａｎＨ．Ｍ．，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３：
２８５−２９１（１９８３））によって、ＨＢＶＤＮ
Ａ配列の存在に係り分析した。ただし、プロティナーゼ
Ｋ消化工程は行なわない。これは、この検定の感度を１
０のアクターで高め、また陰性の対照血清によるバック
グラウンド放射能を僅かに高める。この検定法は、毎５
μｌ中で、単純スポットとして適用された０．０５〜
０．１０ｐｇほどの少ない量の精製ＨＢＶＤＮＡを検
出するものである。この直接スポット雑種形成法で陰性
の血清は、各２００μｌから全部の核酸を抽出し、全抽
出物を１個のスポットとして適用することによって、陰
性として確認した（ＬｉｅｂｅｒｍａｎＨ．Ｍ．，Ｈ
ｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３：２８５−２９１（１９８
３））。これらの研究において、フィルターに適用され
た対照プラスミドＤＮＡ（ｐＢＲ３２２）０．１μｇ
によって、陽性の雑種形成シグナルを生じない、高度に
精製されたＨＢＶＤＮＡプローベを使用することは必
須である。

【００２９】肝臓生検組織を、５０ｍＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ pＨ７．５）−１５０ｍＭＮａＣｌ−２５ｍＭ
ＥＤＴＡ中で、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーにおいて
均質化し、次いでＳＤＳ−プロティナーゼＫ消化、フェ
ノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈殿によっ
て、ＤＮＡを単離した。ランダムプライマーエック
ステンションによって、精製ＨＢＶＤＮＡ（３２００
ｂｐ）を［³²Ｐ］により高比活性（２〜８×１０⁸ｃｏ
ｎ．ｇＤＮＡ）まで標識した。ＤＮＡ１０マイクロ
グラムを制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄ IIIまたは
ＥｃｏＲ１によって消化した後または消化前のどちらか
に、０．８％アガロースゲルを通して電気泳動に付し
た。このＤＮＡをＧｅｎｅＳｃｒｅｅｎフィルター
に移し、１分間のＵＶ照射により、このフィルターに固
定させた。各実験毎に、陽性および陰性の対照試料を含
ませた。

【００３０】予備雑種形成を、５×ＳＳＣ−０．１％Ｓ
ＤＳ−５０％ホルムアミド−５×Ｄｅｎｈａｒｄｔの溶
液−２００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ中で４２℃に
おいて、一夜にわたり行なった。雑種形成は［³²Ｐ］標
識プローベを添加して、類似条件の下に４８時間、行な
った。各フィルターを室温において、２×ＳＳＣ−０．
１％ＳＤＳで各５分間を２回、６５℃において１×ＳＳ
Ｃ−１％ＳＤＳで各３０分間で２回、次いで室温におい
て、０．１×ＳＳＣ−０．１％ＳＤＳで１５分間、洗浄
した。これらのフィルターを次いで、２個のスクリーン
を用いて、−７０℃において、ＫｏｄａｋＸＡＲ−５
フィルムにさらした。

【００３１】統計群平均はＳｔｕｄｅｎｔの両側検定ｔ試験によって比
較した。初期値と引続く測定時点の測定値との間の変化
を、Ｓｔｕｄｅｎｔの両側検定ｔ試験によって比較し
た。

【００３２】結果このパイロット試験においては、１２人の患者を評価し
た。無作為に、４人の患者にはＴＦ−５を投与し、３人
の患者にはＴ−α₁を投与し、そして５人の患者にはプ
ラセボを投与した。ＴＦ５が投与された患者のうちの２
人は注射部位に局所的不快感を体験したので、１ケ月以
内にＴ−α₁に変えた。最終的被験群はＴＦ−５または
Ｔ−α₁を投与された７人の患者（チモシン群）および
プラセボを与えられた５人の患者からなる。初期（封入
時）に、チモシン群と対照群とを、性別、年令、生化学
的パラメーターおよび血清学的パラメーターに関して比
較した（表１）。被験患者の中で、デルタ抗体に対して
陽性の者は存在せず、Ｔ−α₁処置に応答した１人の患
者だけはＣ型肝炎に対する抗体に関して陽性であった。

【００３３】

【表１】表１：被験群の初期特徴

【００３４】実験の終了時点（１２ケ月）におけるＨＢ
ＶＤＮＡ、ＨＢｅＡｇおよびＨＢｓＡｇのクリアラン
ス率を表２に示す。この表２は、プラセボ群に比較し
て、チモシン群における有意に高いＨＢＶＤＮＡクリ
アランス率を示している（それぞれ、８６％対２０％；
Ｆｉｓｈｅｒの完全試験による）。６ケ月の処置期間の
間で、チモシンに応答する６人の患者の全員に、血清Ｈ
ＢＶＤＮＡレベルの減少が見られた。処置中の４人の
患者および処置終了後の２ケ月および６ケ月の時点でそ
れぞれ残る２人の患者において、血清ＨＢＶＤＮＡは
消失した。

【００３５】

【表２】表２：開始時および１２ケ月目のＨＢＶマーカー血清
陽性反応

【００３６】ＴＦ５またはＴ−α₁により処置された患
者は、１年の時点で正常もしくは正常に近いＡＬＴおよ
びＡＳＴ値を示した。この数値はプラセボにより処置し
た患者における相当する数値よりも格別に低い。しかし
ながら、１時的なＡＬＴ上昇（初めの数値の２〜６倍）
がチモシン応答者６人のうちの５人に見られた。これら
のＡＬＴ増加の存続期間は４．６±０．６週間であって
（ｎ＝５）。各場合においてＨＢＶＤＮＡのクリアラ
ンスが先行した（Ｆｉｇ１）。

【００３７】

【表３】表３：被験期間中のアミノトランスフェラーゼレベ
ル

【００３８】チモシン群の長期間追跡検査（２７±３ケ
月）では、永続的陰性血清ＨＢＶＤＮＡが６人の応答者
に見られ、そしてまたＡＬＴレベルの正常化が７人全員
の患者に見られた（２９±５ＩＵ／Ｌ）。１４ケ月の
追跡検査によって、２人のチモシン応答者（２９％）
で、血清ＨＢｓＡｇおよび生成抗−ＨＢｓが消失した。

【００３９】無作為選別前に、１２人の患者は、末梢血
液リンパ球（ｐ＜０．０１）、ＣＤ３（ｐ＜０．０
２）、ＣＤ４（ｐ＜０．０５）およびＣＤ１１（ｐ＜
０．０５）数値に関して、健康な協力者に比較して有意
の減少を示していた。ＣＤ８およびＮＫの数値あるいは
ＣＤ４／ＣＤ８比に関しては、患者も健康な協力者との
間に差はなかった。リンパ球、Ｔ細胞サブセットまたは
ＮＫの数値に関して、初期においては、チモシン群とプ
ラセボ群との間に有意の差は見られなかったが、処置し
た群では、健康な協力者に比較して、リンパ球、ＣＤ３
およびＣＤ４の数値は有意に低下していた（表４）。

【００４０】

【表４】表４：末梢血液中のリンパ球およびＴ細胞サブセット
の絶対数（細胞数／ｍｍ³；平均値±ＳＥＭ）

【００４１】Ｆｉｇ２には、初めの処置の１ケ月以内
に、チモシン群がプラセボ群の初めの数値に比較して、
リンパ球、ＣＤ３およびＣＤ４測定値について、一般に
高い数値を示したことが示されている。これらの増加は
一般に、６ケ月の引続く期間にわたって持続された。プ
ラセボ群においては、これらのパラメーターに関して有
意の変化は認められなかった。初期に、被験群間または
被験群と健康な協力者との間で、インビトロＩＦＮ−
γ産生あるいはＣＯＡおよびＰＨＡ−Ｐリンパ球増殖検
査に関して、差違は見い出されなかった（Ｆｉｇ
３）。開始後に、チモシン群におけるＩＦＮ−γのＰＢ
Ｍ合成は、健康な協力者の場合に見い出されるレベル以
上のレベルに上昇したが、プラセボ群におけるこのレベ
ルは一般に低下した（Ｆｉｇ３）。肝臓生検組織学的
活性スコアの結果を表５に示す。

【００４２】

【表５】表５：肝臓生検試料の組織学的評価（平均スコア±Ｓ
Ｄ）

【００４３】１２ケ月の研究期間の間に、７人のチモシ
ン処置患者のうちの６人では、組織学的活性スコアは減
少したが、７人目の患者では、僅かに増加した。プラセ
ボ群の４人の患者では、この組織学的スコアは増加した
が、５人目の患者では、減少した。１２人のＣＡＨＢの
患者は全員が、初期生検の時点で硬変を有しており、ま
たチモシン処置した患者の７人のうち６人およびプラセ
ボ処置した患者の５人のうち４人に、最後の生検で依然
として硬変が見い出されたことから、スコアにおける変
化は、ほとんど完全に、炎症活性および小葉損傷による
変化によるものであった。これらの結果は、ｐ＜０．０
１レベルで有意であった（表５）。１２ケ月目に、チモ
シンに対する６人の応答者からの肝臓生検試料では、Ｐ
ＡＰ染色によるＨＢｃＡｇは検出されなかった。プラセ
ボを投与された患者の１人において、彼は自発性軽快を
体験した。しかしながら、ＨＢｃＡｇはチモシン処置に
応答しなかった１人およびプラセボ患者の残りの４人で
確認された。

【００４４】肝臓におけるＨＢＶＤＮＡ分子型を、チ
モシン処置した患者のうちの３人において検査した。組
織試料は処置前、６ケ月目および１２ケ月目に採取し
た。１人の患者（チモシン処置に対して応答しなかった
唯一の１人）は、３種全部の試料で、複製型のＨＢＶ
ＤＮＡを有していた。残りの２人の患者においては、チ
モシンによる処置が、初期試料に見い出されたＨＢＶ複
製型の消失を示した。これらの患者のうちの１人では、
最終試料中にＨＢＶＤＮＡ分子型は確認されなかった
が、他の１人では、最終の１２ケ月目の試料に、超ラセ
ンでゆるやかな円形のゲノムが残留していた（Ｆｉｇ
４）。

【００４５】チモシンに対して応答した他の２人の患者
は、超ラセン型ＨＢＶＤＮＡを示したが、６ケ月目お
よび１２ケ月目の試料ではそれぞれ、複製型は存在して
いなかった。その処置前の凍結肝臓は入手できなかっ
た、２人の患者において、チモシン処置中のＨＢＶＤ
ＮＡ複製の停止が、組織学的研究に使用されたパラフィ
ン埋め込み組織のその場での雑種形成によって証明され
た。従って、サザン法またはその場での雑種形成検定の
どちらかによる、肝臓組織のＨＢＶ複製の停止に係る明
白な証拠を、チモシン処置に対して、血清学的に、およ
びまた組織病理学的に応答した患者の全員で得た。５人
のプラセボ群の患者のうちの１人は、処置前および１２
ケ月目の生検試料の両方で、複製型のＨＢＶＤＮＡを
有していた（Ｆｉｇ４、非応答者）。プラセボ群の残
りの患者（自発性軽快）は、１２ケ月目の試料におい
て、ＨＢＶＤＮＡ分子型に係るサザン法によって、陰
性であった。

【００４６】ＴＦ５およびＴ−α₁による治療は、重大
な副作用を付随しなかった。３人の患者が、初めの２週
間の間、ＴＦ５注射部位で局所的不快感を報告した。こ
れらの患者のうちの２人は、別段の問題もなくＴ−α₁
に変え、３人目の患者はＴＦ５の継続を主張した。後
刻、局所的不快感は引続き重大になることなく消失し
た。Ｔ−α₁投与の場合には、局所的不快感は一般に、
出現しなかった。処置期間および引続く期間を通して、
血液学的状態、生化学的パラメーターあるいは心臓機能
に関して、変化は見い出されなかった（データは示され
ていない）。７人の患者（処置した５人とプラセボの２
人）は無作為選別前に、多少ないし中程度の疲労感をう
ったえていた。１２ケ月の研究の終了時点で、処置患者
の１人（非応答者）およびプラセボ患者の１人は依然と
して疲労感を体験していた。

【００４７】ＴＦ５およびＴ−α₁は抗ウイルス性を有
するものとは考えられない（Ｚａｖ’ｙａｌｏｖＶ．
Ｐ．等、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２２：１７３−
１８１（１９８９））。本研究の結果は、これらの薬剤
に対する有益な応答は、これらのペプチドの免疫調節作
用から誘導されたものであることを示唆している。チモ
シン処置した患者に見い出された、リンパ球、ＣＤ３お
よびＣＤ４の測定値の有意の増加は、以前に報告された
チモシンのインビトロ効果と一致している（Ｂａｘｅｖ
ａｎｉｓＣ．Ｎ．等、Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍ．，１
３；１３３〜１４１（１９８７））。

【００４８】研究に参加した、ＣＡＨＢの患者からのＰ
ＢＭによるＩＦＮ−γ産生は、以前に報告されている対
照の健康な協力者と異なっていなかった（Ｄａｖｉｓ
Ｇ．Ｌ．等、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，８
６：１３１５（１９８４）およびＩｎｏｕｅＭ．等、
Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２：４００６〜４０１１
（１９８９））。従って、１２ケ月の研究期間中に、チ
モシン処置患者においてはＰＢＭによるＩＦＮ−γの産
生が増加するが、プラセボ処置患者においては増加しな
いという結果は、免疫調節機能に対するインビボチモシ
ン作用を示すものということができ（Ｍｕｔｃｈｎｉｃ
ｋＭ．Ｇ．等、Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕ
ｎｏｐｈａｔｈｏｌ．，２３：６２６〜６３３（１９８
２）；ＳｅｒｒａｔｅＳ．Ａ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．，１３９：２３３８〜２３４３（１９８７）；およ
びＢａｘｖａｎｉｓＣ．Ｎ．等、Ｉｍｍｕｎｏｐｈａ
ｒｍ．１３：１３３〜１４１（１９８７））、あるいは
ＩＦＮ−γ産生の上昇調整をもたらすＴリンパ球ＩＬ２
産生の調節作用を多分、示すものということができる
（ＳｖｅｄｅｒｓｋｙＬ．Ｐ．等、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．，１２：２４４〜２４７（１９８２））。

【００４９】チモシンによる免疫調節に対する作用のメ
カニズム（１種または２種以上）は不明であるが、Ｔ−
α₁がＩＦＮ−αと同様の様相で作用しうることを示唆
する証拠は存在している。ＩＦＮ−αのＣ末端配列は、
Ｔ−α₁の前駆形であるプロチモシンアルファと相同
性を有する（３６％）（Ｚａｖ’ｙａｌｏｖＶ．Ｐ．
等、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２２：１７３〜１８
１（１９８９））。抗ウイルス活性に関与しうる、ＩＦ
Ｎ−αのＮ−末端ドメインとは異なり、Ｃ末端ドメイン
はＩＦＮ−αの免疫調節活性に関与する可能性がある。
さらにまた、ＩＦＮ−α₂とＴ−α₁との間の最高の相
同領域に相当するオクタペプチドは、ＣｏＡの存在の下
における増殖の誘発に寄与する胸腺細胞で同一レセプタ
ーと競合する（Ｚａｖ’ｙａｌｏｖＶ．Ｐ．等、Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２２：１７３〜１８１（１９
８９））。

【００５０】大部分の場合に、病気の解消およびＨＢＶ
複製の消失が一般に生じた。チモシンに応答した、６人
の患者の中で、血清ＨＢＶＤＮＡが再現した者は無か
った（２６±３ケ月）。これらの６人の患者はいずれ
も、正常なＡＬＴ値を示した（２６±５ＩＵ／Ｌ）。
処置患者の１２ケ月目肝臓生検試料における組織学的改
善は、炎症、肝細胞損傷および壊死の減少を示唆してい
る（表５）。

【００５１】雑種形成研究は、チモシン治療を受けた者
の最後の肝臓生検試料（１２ケ月）中に、ＨＢＶＤＮ
Ａ分子型または残留フリーゲノムは見られず、また複
製型も見られないことを示した。これに対して、プラセ
ボ処置患者においては、自発的軽減を示した１人の患者
を除いて、肝臓組織中に複製性のＨＢＶＤＮＡが依然
として存在していた。Ｆｉｇ４に示されている、Ｔ−
α₁に応答した患者（レーンＤ、ＥおよびＦ）は６ケ月
のＴ−α₁の処置期間中に、血清ＨＢｓＡｇおよびＨＢ
ＶＤＮＡが陰性になり、かつまた抗ＨＢｓが発現する
時点である引続く６ケ月の処置の間、陰性のままであっ
た。このことは、残留ＨＢＶＤＮＡはフリーゲノム
型で肝臓組織中に存在するが、ウイルスタンパク質産
生（ＨＢｓＡｇ）も、活性ウイルス複製（ＨＢＶＤＮ
Ａ）も存在しなかったことから、ＨＢＶ感染が潜在性に
なったことを示唆している。

【００５２】この研究に参加した患者は、同性愛者では
なく、静脈注射薬物常習ではなく、あるいはＨＩＶ陽性
ではないという点で、比較的均一であった。全部の患者
が活性硬変の組織学的徴候を有していた。上述の結果
は、ＴＦ−５およびＴ−α₁が使用投与量で無毒性であ
り、かつまたＣＡＨＢの患者における疾患活性の解消を
促進することを示している。さらにまた、臨床的、免疫
学的および組織学的パラメーターの改善は、ＨＢＶ複製
の停止およびまた肝臓組織からのＨＢＶＤＮＡの消失
もしくは感染の潜在形への移行をともなう複製型からフ
リーゲノム型への変化と組合されている。

【００５３】前記記載は本発明を説明しようとするもの
であり、本発明は前記特許請求の範囲によってだけ制限
されるものと解釈されるべきである。

【００５４】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＡＬＴ値の増大を示した後に、先ず血清ＨＢｅ
Ａｇの、次いでＨＢＶＤＮＡのクリアランスを示した
患者の１人のＴＦ−５（９０ｍｇ／Ｍ²）に対する応答
を示すグラフ。

【図２】各被験患者群の末梢血液中のリンパ球（ａ）、
ＣＤ３（ｂ）およびＣＤ４（ｃ）の絶対測定値を示すグ
ラフ。

【図３】ＴＦ−５／Ｔ−α₁処置群およびプラセボ処置
群から得たＰＢＭによるＩＦＮ−γ産生を示すグラフ。

【図４】プラセボ処置非応答患者およびチモシン処置応
答患者の各肝臓生検試料のＨＢＶＤＮＡのスポット雑
種形成結果。

【手続補正書】

【提出日】平成５年１０月２０日

【手続補正４】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図４

【補正方法】変更

【補正内容】

【図４】基板上に形成された微細なパターンを表す写真
であって、プラセボ処置非応答患者およびチモシン処置
応答患者の各肝臓生検試料のＨＢＶＤＮＡのスポット
雑種形成結果を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】活性成分として、チモシンアルファ₁
およびチモシンアルファ₁を含有する子牛抽出物から
なる群から選ばれるチモシンを有効量で含有することを
特徴とする哺乳動物におけるウイルス誘発肝炎処置用医
薬組成物。
【請求項２】哺乳動物がヒトである請求項１の医薬組
成物。
【請求項３】ウイルスがＢ型肝炎ウイルスである請求
項２の医薬組成物。
【請求項４】チモシンがチモシンアルファ₁である
請求項１の医薬組成物。
【請求項５】チモシンがチモシン分画５である請求項
１の医薬組成物。
【請求項６】哺乳動物におけるウイルス複製が停止す
るまで投与される請求項１の医薬組成物。
【請求項７】皮下注射によって投与される請求項１の
医薬組成物。
【請求項８】チモシンがチモシンアルファ₁であ
り、そして投与量が週２回の皮下投与で、ヒトの身体面
積の一平方メートル当り約６００〜１２００マイクログ
ラムである請求項３の医薬組成物。
【請求項９】チモシンがチモシン分画５であり、そし
て投与量が週２回の皮下投与で、ヒトの身体面積の一平
方メートル当り約６０〜１２０ｍｇである請求項３の医
薬組成物。
【請求項１０】肝炎が慢性である請求項１の医薬組成
物。
【請求項１１】チモシンが化学的に合成されたチモシ
ンアルファ₁である請求項１の医薬組成物。