JPH07267990A - γ−セミノプロテインの分離精製法 - Google Patents
γ−セミノプロテインの分離精製法Info
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- JPH07267990A JPH07267990A JP6082365A JP8236594A JPH07267990A JP H07267990 A JPH07267990 A JP H07267990A JP 6082365 A JP6082365 A JP 6082365A JP 8236594 A JP8236594 A JP 8236594A JP H07267990 A JPH07267990 A JP H07267990A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 前立腺がん患者の血清中に分布し、前立腺が
んの早期発見および治療効果の判定に有効であるγ−セ
ミノプロテインを、ヒト精漿から、簡便に、かつ高収率
で分離精製する方法を提供する。 【構成】 先ず、ヒト精漿をアフィニティクロマトグラ
フィにより処理してγ−セミノプロテイン画分を分離し
て取り出し、次いで、この画分を陽イオン交換クロマト
グラフィとゲルクロマトグラフィとにより処理して、γ
−セミノプロテインを分離して取り出す。
んの早期発見および治療効果の判定に有効であるγ−セ
ミノプロテインを、ヒト精漿から、簡便に、かつ高収率
で分離精製する方法を提供する。 【構成】 先ず、ヒト精漿をアフィニティクロマトグラ
フィにより処理してγ−セミノプロテイン画分を分離し
て取り出し、次いで、この画分を陽イオン交換クロマト
グラフィとゲルクロマトグラフィとにより処理して、γ
−セミノプロテインを分離して取り出す。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、前立腺がん患者の血清
中に分布し、前立腺がんの早期発見および治療効果の判
定に有効であるγ−セミノプロテイン（γ−Ｓｅｍｉｎ
ｏｐｒｏｔｅｉｎ；以下、「γ−Ｓｍ」と略す）の簡便
で収率の高い分離精製法に関する。
中に分布し、前立腺がんの早期発見および治療効果の判
定に有効であるγ−セミノプロテイン（γ−Ｓｅｍｉｎ
ｏｐｒｏｔｅｉｎ；以下、「γ−Ｓｍ」と略す）の簡便
で収率の高い分離精製法に関する。
【０００２】
【従来の技術】γ−Ｓｍがヒト精漿中に含まれているこ
とは公知であり、その分離精製例としては、小柳嘉子ら
（日法医誌、第２６巻（２）７８〜８０ページ、１９７
２年）およびシャーラーら（Ｊ．Ｓｃｈａｌｌｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第１７０
巻，１１１〜１２０ページ，１９８７年）などにより開
示されている。
とは公知であり、その分離精製例としては、小柳嘉子ら
（日法医誌、第２６巻（２）７８〜８０ページ、１９７
２年）およびシャーラーら（Ｊ．Ｓｃｈａｌｌｅｒ ｅ
ｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，第１７０
巻，１１１〜１２０ページ，１９８７年）などにより開
示されている。
【０００３】これらの精製法は、いずれも精製の初期段
階でゲルクロマトグラフィを２回繰り返して用い、続い
て小柳らは等電点電気泳動法により分離精製し、シャー
ラーらは陰イオン交換クロマトグラフィにより分離精製
を行っている。
階でゲルクロマトグラフィを２回繰り返して用い、続い
て小柳らは等電点電気泳動法により分離精製し、シャー
ラーらは陰イオン交換クロマトグラフィにより分離精製
を行っている。
【０００４】
【発明が解決しようとする問題点】このように、上記し
た従来のγ−Ｓｍの分離精製法は、いずれも分離精製工
程が３工程以上もの多工程を必要とし、操作する上で煩
雑であり、時間がかかり、大量処理に不適当である。
た従来のγ−Ｓｍの分離精製法は、いずれも分離精製工
程が３工程以上もの多工程を必要とし、操作する上で煩
雑であり、時間がかかり、大量処理に不適当である。
【０００５】また、ゲルクロマトグラフィは、通常、分
離効率を良くするためには、カラム直径よりも２０〜４
０倍程度の長さを有するカラムを必要とする一方、この
長大なカラムに通す試料の容積は少量であることが重要
である。したがって、ゲルクロマトグラフィを、目的成
分濃度の低い初期精製段階における大量処理に使用する
ことは、極めて効率が悪い。
離効率を良くするためには、カラム直径よりも２０〜４
０倍程度の長さを有するカラムを必要とする一方、この
長大なカラムに通す試料の容積は少量であることが重要
である。したがって、ゲルクロマトグラフィを、目的成
分濃度の低い初期精製段階における大量処理に使用する
ことは、極めて効率が悪い。
【０００６】加えて、上記した従来のγ−Ｓｍの分離精
製法は、いずれもγ−Ｓｍの収率の面で不十分である。
製法は、いずれもγ−Ｓｍの収率の面で不十分である。
【０００７】このようなことから、現在のところ、前立
腺がんの早期発見および治療効果の判定に有効であるγ
−Ｓｍは、高コストを余儀なくされている。
腺がんの早期発見および治療効果の判定に有効であるγ
−Ｓｍは、高コストを余儀なくされている。
【０００８】本発明は、これらの事情を踏まえ、ヒト精
漿を原料として、γ−Ｓｍのより簡便で、より高収率で
の分離精製法を提供することを目的とする。
漿を原料として、γ−Ｓｍのより簡便で、より高収率で
の分離精製法を提供することを目的とする。
【０００９】
【問題を解決するための手段】本発明者らは、上記の目
的を達成するために種々検討を行った結果、本発明者ら
が先に提案している、ヒト精漿を先ず陽イオン交換クロ
マトグラフィにより処理してγ−Ｓｍ画分を取り出し、
この画分を次いでアフィニティクロマトグラフィとゲル
クロマトグラフィとにより処理してγ−Ｓｍを取り出す
方法（特願平５−１９６８６１号明細書参照）におい
て、これら各クロマトグラフィによる処理の順番を変え
て行っても、高収率で、かつ簡便に、γ−Ｓｍを分離精
製し得るとの知見を得た。
的を達成するために種々検討を行った結果、本発明者ら
が先に提案している、ヒト精漿を先ず陽イオン交換クロ
マトグラフィにより処理してγ−Ｓｍ画分を取り出し、
この画分を次いでアフィニティクロマトグラフィとゲル
クロマトグラフィとにより処理してγ−Ｓｍを取り出す
方法（特願平５−１９６８６１号明細書参照）におい
て、これら各クロマトグラフィによる処理の順番を変え
て行っても、高収率で、かつ簡便に、γ−Ｓｍを分離精
製し得るとの知見を得た。
【００１０】すなわち、ヒト精漿を、先ず、アフィニテ
ィクロマトグラフィで処理することによってもγ−Ｓｍ
画分を効率的に分離精製し得ること、およびこの分離精
製したγ−Ｓｍ画分を陽イオン交換クロマトグラフィと
ゲルクロマトグラフィとを併用して処理することによっ
ても精製度をさらに向上させ得ることを見出した。
ィクロマトグラフィで処理することによってもγ−Ｓｍ
画分を効率的に分離精製し得ること、およびこの分離精
製したγ−Ｓｍ画分を陽イオン交換クロマトグラフィと
ゲルクロマトグラフィとを併用して処理することによっ
ても精製度をさらに向上させ得ることを見出した。
【００１１】本発明のγ−Ｓｍの分離精製法は、このよ
うな知見に基づいてなされたものであって、先ず、ヒト
精漿をアフィニティクロマトグラフィで処理してγ−Ｓ
ｍを効率よく取り出し、次いで、この画分を陽イオン交
換クロマトグラフィとゲルクロマトグラフィとで処理し
て精製度を高めることを特徴とする。
うな知見に基づいてなされたものであって、先ず、ヒト
精漿をアフィニティクロマトグラフィで処理してγ−Ｓ
ｍを効率よく取り出し、次いで、この画分を陽イオン交
換クロマトグラフィとゲルクロマトグラフィとで処理し
て精製度を高めることを特徴とする。
【００１２】本発明の精製法における原料であるヒト精
漿は、凍結しておいた健常人の精液を、精製前に解凍
し、これを蒸留水に対して２晩透析した後、遠心分離な
どにより不溶解分を除去したものを用いることができ
る。本発明における“ヒト精漿”とは、ヒト精液に、こ
のような処理を行ったものをいう。
漿は、凍結しておいた健常人の精液を、精製前に解凍
し、これを蒸留水に対して２晩透析した後、遠心分離な
どにより不溶解分を除去したものを用いることができ
る。本発明における“ヒト精漿”とは、ヒト精液に、こ
のような処理を行ったものをいう。
【００１３】本発明の精製法では、上記のような前処理
を施したヒト精液（すなわち、ヒト精漿）を、先ず、第
１段階の処理として、アフィニティクロマトグラフィよ
る処理を行う。この処理により、γ−Ｓｍ画分を容易に
分離して取り出すことができる。
を施したヒト精液（すなわち、ヒト精漿）を、先ず、第
１段階の処理として、アフィニティクロマトグラフィよ
る処理を行う。この処理により、γ−Ｓｍ画分を容易に
分離して取り出すことができる。
【００１４】このアフィニティクロマトグラフィとして
は、コンカナヴァリンＡ（ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ
Ａ；以下、「ＣｏｎＡ」と略す）、ベンザミジン（Ｂｅ
ｎｚａｍｉｄｉｎｅ；以下、「Ｂｅｎｚ」と略す）、ア
ルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ；以下「Ａｒｇ」と略す）
などを、デキストラン、ポリアクリルアミド、アガロー
ス、セルロースなどの高分子物質からなるゲル粒子に、
架橋して結合させたもの用いることができる。
は、コンカナヴァリンＡ（ｃｏｎｃａｎａｖａｌｉｎ
Ａ；以下、「ＣｏｎＡ」と略す）、ベンザミジン（Ｂｅ
ｎｚａｍｉｄｉｎｅ；以下、「Ｂｅｎｚ」と略す）、ア
ルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ；以下「Ａｒｇ」と略す）
などを、デキストラン、ポリアクリルアミド、アガロー
ス、セルロースなどの高分子物質からなるゲル粒子に、
架橋して結合させたもの用いることができる。
【００１５】これらの化合物を架橋したゲルをカラムに
充填し、０．０００１〜０．１モル／リットル（以下、
「Ｍ」と略し、ミリモル／リットルを「ｍＭ」と略
す）、リン酸緩衝液、０．０００１〜０．１Ｍトリス−
塩酸緩衝液、または０．０００１〜０．２Ｍクエン酸緩
衝液（いずれもｐＨは３．０〜８．５にあることが望ま
しい）などの溶出溶液で予め平衡化しておく。
充填し、０．０００１〜０．１モル／リットル（以下、
「Ｍ」と略し、ミリモル／リットルを「ｍＭ」と略
す）、リン酸緩衝液、０．０００１〜０．１Ｍトリス−
塩酸緩衝液、または０．０００１〜０．２Ｍクエン酸緩
衝液（いずれもｐＨは３．０〜８．５にあることが望ま
しい）などの溶出溶液で予め平衡化しておく。
【００１６】このカラムに、前処理したヒト精液（ヒト
精漿）を注入し、非吸着物質が溶出し終わった後に、塩
化ナトリウム、塩化カリウムなどの塩、あるいはメチル
−α−Ｄ−グルコピラノシド、メチル−α−Ｄ−マンノ
ピラノシドなどの糖を加えた前述の緩衝液で、吸着物質
（γ−Ｓｍ画分）を溶出させる。このときの塩または糖
による溶出法には、濃度勾配法または段階法のいずれを
用いてもよい。
精漿）を注入し、非吸着物質が溶出し終わった後に、塩
化ナトリウム、塩化カリウムなどの塩、あるいはメチル
−α−Ｄ−グルコピラノシド、メチル−α−Ｄ−マンノ
ピラノシドなどの糖を加えた前述の緩衝液で、吸着物質
（γ−Ｓｍ画分）を溶出させる。このときの塩または糖
による溶出法には、濃度勾配法または段階法のいずれを
用いてもよい。
【００１７】次の第２段階の処理あるいは第３段階の処
理として行われる陽イオン交換クマトグラフィには、市
販されているカルボキシメチル−セファデックス（以
下、「ＣＭ−セファデックス」と略す）、スルフォプロ
ピル−セファロース（いずれもファルマシア社製）のカ
ラムを使用することができる。
理として行われる陽イオン交換クマトグラフィには、市
販されているカルボキシメチル−セファデックス（以
下、「ＣＭ−セファデックス」と略す）、スルフォプロ
ピル−セファロース（いずれもファルマシア社製）のカ
ラムを使用することができる。
【００１８】この処理における目的物（γ−Ｓｍ）の溶
出は、溶出液として０．００１〜０．５Ｍリン酸緩衝
液、０．００１〜０．３Ｍトリス−塩酸緩衝液、０．０
０１〜０．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、０．００１〜
０．５Ｍクエン酸緩衝液などを用い、濃度勾配法により
行われる。このときの濃度勾配は、０〜１Ｍの範囲の塩
化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸ナトリウムなどの
塩類を用いて付けられる。
出は、溶出液として０．００１〜０．５Ｍリン酸緩衝
液、０．００１〜０．３Ｍトリス−塩酸緩衝液、０．０
０１〜０．５Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液、０．００１〜
０．５Ｍクエン酸緩衝液などを用い、濃度勾配法により
行われる。このときの濃度勾配は、０〜１Ｍの範囲の塩
化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸ナトリウムなどの
塩類を用いて付けられる。
【００１９】また、やはり第２段階の処理あるいは第３
段階の処理として行われるゲルクロマトグラフィは、市
販されている高性能ゲルクロマトグラフィ用カラムを使
用して行うことができる。例えば、セファデックス、セ
ファロース、スーパーロース（いずれもファルマシア社
製）、ＴＳＫ−ゲル（東ソー社製）、セルロファイン
（生化学工業社製）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ（Ｂｉｏ Ｒａｄ
社製）などが使用できる。
段階の処理として行われるゲルクロマトグラフィは、市
販されている高性能ゲルクロマトグラフィ用カラムを使
用して行うことができる。例えば、セファデックス、セ
ファロース、スーパーロース（いずれもファルマシア社
製）、ＴＳＫ−ゲル（東ソー社製）、セルロファイン
（生化学工業社製）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ（Ｂｉｏ Ｒａｄ
社製）などが使用できる。
【００２０】このとき、目的物（γ−Ｓｍ）の溶出は、
溶出液としてリン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、クエ
ン酸緩衝液などを用いて行われる。
溶出液としてリン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、クエ
ン酸緩衝液などを用いて行われる。
【００２１】以上の陽イオン交換クロマトグラフィおよ
びゲルクロマトグラフィは、どちらを先に行ってもよい
が、不純物を取り除くためには、陽イオン交換クロマト
グラフィを先に（すなわち、第２段階のとして）行い、
ゲルクロマトグラフィを後に（すなわち、第３段階の処
理として）行うことが望ましい。
びゲルクロマトグラフィは、どちらを先に行ってもよい
が、不純物を取り除くためには、陽イオン交換クロマト
グラフィを先に（すなわち、第２段階のとして）行い、
ゲルクロマトグラフィを後に（すなわち、第３段階の処
理として）行うことが望ましい。
【００２２】
【実施例】以下の実施例で使用した酵素標識抗体、モノ
クローナル抗体、ポリクローナル抗体は、既に知られて
いる一般的な方法により作製した。すなわち、酵素標識
抗体は、石川栄治著（続生化学実験講座５、免疫生化学
研究法、日本生化学会編、東京化学同人、１９８６年）
などの方法により、モノクローナル抗体およびポリクロ
ーナル抗体は、富山朔二ら著（単クローン抗体実験マニ
ュアル、講談社サイエンティフィク、１９８７年）、キ
ャンベル（Ａ．Ｍ．Ｃａｍｂｅｌｌ）著（大沢利昭監
訳、生化学実験法１０、モノクローナル抗体、東京化学
同人、１９８９年）、川島紘一郎著（新基礎生化学実験
法６、生物活性を用いる方法、丸善株式会社、１９８８
年）などの方法により、作製した。
クローナル抗体、ポリクローナル抗体は、既に知られて
いる一般的な方法により作製した。すなわち、酵素標識
抗体は、石川栄治著（続生化学実験講座５、免疫生化学
研究法、日本生化学会編、東京化学同人、１９８６年）
などの方法により、モノクローナル抗体およびポリクロ
ーナル抗体は、富山朔二ら著（単クローン抗体実験マニ
ュアル、講談社サイエンティフィク、１９８７年）、キ
ャンベル（Ａ．Ｍ．Ｃａｍｂｅｌｌ）著（大沢利昭監
訳、生化学実験法１０、モノクローナル抗体、東京化学
同人、１９８９年）、川島紘一郎著（新基礎生化学実験
法６、生物活性を用いる方法、丸善株式会社、１９８８
年）などの方法により、作製した。
【００２３】また、以下の実施例におけるγ−Ｓｍの活
性は、次の方法により測定し、すべての液体クロマトグ
ラフィ、遠心分離、透析、限外濾過などの操作は、４℃
にて実施した。
性は、次の方法により測定し、すべての液体クロマトグ
ラフィ、遠心分離、透析、限外濾過などの操作は、４℃
にて実施した。
【００２４】〔γ−Ｓｍの活性の測定法〕 （１）液体クロマトグラフィの各画分のγ−Ｓｍの定性
分析：９６穴のタイタープレートの各穴に、１４５ｍＭ
塩化ナトリウム含有１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．２；以下、「ＰＢＳ」と略す）で、適当な希
釈系列による予備テストによって設定した適正倍率（以
下、単に「適正倍率」と略す）に希釈したγ−Ｓｍ含有
の試料（液体クロマトグラフィの画分）を、５０マイク
ロリットル（以下、「μＬ」と記し、ミリリットルを
「ｍＬ」と記す）ずつ注入して、室温で３時間振盪して
試料中のγ−Ｓｍ抗原をタイタープレートに吸着させ
た。
分析：９６穴のタイタープレートの各穴に、１４５ｍＭ
塩化ナトリウム含有１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．２；以下、「ＰＢＳ」と略す）で、適当な希
釈系列による予備テストによって設定した適正倍率（以
下、単に「適正倍率」と略す）に希釈したγ−Ｓｍ含有
の試料（液体クロマトグラフィの画分）を、５０マイク
ロリットル（以下、「μＬ」と記し、ミリリットルを
「ｍＬ」と記す）ずつ注入して、室温で３時間振盪して
試料中のγ−Ｓｍ抗原をタイタープレートに吸着させ
た。
【００２５】各穴の溶液を抜取り、１％ウシ血清アルブ
ミンおよび１４５ｍＭ塩化ナトリウム含有１０ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２；以下、「１％ＢＳＡ
／ＰＢＳ」と略す）を、各穴に、４００μＬずつ注入し
た後、室温で３時間静置してブロッキングを行った。３
時間後、各穴から溶液を抜取り、ＰＢＳで５回洗浄し
た。
ミンおよび１４５ｍＭ塩化ナトリウム含有１０ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２；以下、「１％ＢＳＡ
／ＰＢＳ」と略す）を、各穴に、４００μＬずつ注入し
た後、室温で３時間静置してブロッキングを行った。３
時間後、各穴から溶液を抜取り、ＰＢＳで５回洗浄し
た。
【００２６】常法で製造され、１％ＢＳＡ／ＰＢＳで適
正倍率に希釈した、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ
（以下、「ＨＲＰ」と略す）と結合した抗γ−Ｓｍ抗体
を、各穴に、５０μＬずつ注入した後、室温で３時間振
盪して抗原−抗体反応を行わせた。各穴から溶液を抜取
り、ＰＢＳで８回洗浄した。
正倍率に希釈した、西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ
（以下、「ＨＲＰ」と略す）と結合した抗γ−Ｓｍ抗体
を、各穴に、５０μＬずつ注入した後、室温で３時間振
盪して抗原−抗体反応を行わせた。各穴から溶液を抜取
り、ＰＢＳで８回洗浄した。
【００２７】次に、各穴に、オルソフェニレンジアミン
（以下、「ＯＰＤ」と略す）溶液（１０ｍｇのＯＰＤと
１００μＬの１．２％過酸化水素水を、使用直前にｐＨ
４．５の１０ｍＬのクエン酸緩衝液に溶解した溶液）を
５０μＬずつ注入し、室温暗所にて１５分間振盪して発
色させた。１５分後、各穴に、４規定の硫酸を５０μＬ
ずつ添加して反応を停止させた後に、４９０ｎｍの波長
で吸光度を測定し、この吸光度からγ−Ｓｍの存在を定
性的に評価した。
（以下、「ＯＰＤ」と略す）溶液（１０ｍｇのＯＰＤと
１００μＬの１．２％過酸化水素水を、使用直前にｐＨ
４．５の１０ｍＬのクエン酸緩衝液に溶解した溶液）を
５０μＬずつ注入し、室温暗所にて１５分間振盪して発
色させた。１５分後、各穴に、４規定の硫酸を５０μＬ
ずつ添加して反応を停止させた後に、４９０ｎｍの波長
で吸光度を測定し、この吸光度からγ−Ｓｍの存在を定
性的に評価した。
【００２８】（２）γ−Ｓｍを含む各画分集合液の濃縮
物のγ−Ｓｍの定量分析：液体クロマトグラフィにおい
て、γ−Ｓｍを含有する画分を集合し、遠心力を利用す
る簡易濃縮機（アミコン社製商品名“Ｃｅｎｔｒｉｃｏ
ｎ−３”）または限外濾過機（アミコン社製商品名“Ｐ
Ｍ−２”）により濃縮し、この濃縮液のγ−Ｓｍの含有
量は、酵素免疫法により次のようにして測定した。
物のγ−Ｓｍの定量分析：液体クロマトグラフィにおい
て、γ−Ｓｍを含有する画分を集合し、遠心力を利用す
る簡易濃縮機（アミコン社製商品名“Ｃｅｎｔｒｉｃｏ
ｎ−３”）または限外濾過機（アミコン社製商品名“Ｐ
Ｍ−２”）により濃縮し、この濃縮液のγ−Ｓｍの含有
量は、酵素免疫法により次のようにして測定した。
【００２９】すなわち、適正倍率に希釈した濃縮液およ
び標準γ−Ｓｍ溶液（２００、１００、５０、１０、２
および０ｎｇ／ｍＬに予め調整しておく）を、２０穴の
プレートに２５μＬずつ注入し、さらに予めＨＲＰを結
合させた抗γ−Ｓｍ抗体を適正倍率に希釈して２５０μ
ｌを、それぞれの穴に注入した。
び標準γ−Ｓｍ溶液（２００、１００、５０、１０、２
および０ｎｇ／ｍＬに予め調整しておく）を、２０穴の
プレートに２５μＬずつ注入し、さらに予めＨＲＰを結
合させた抗γ−Ｓｍ抗体を適正倍率に希釈して２５０μ
ｌを、それぞれの穴に注入した。
【００３０】次に、予め抗γ−Ｓｍ抗体を吸着させてお
いたポリスチレン製ビーズを１個ずつ入れ、１時間静置
した。１時間後に、このビーズを蒸留水で洗浄し（３ｍ
Ｌ×３回）、水分を除去し、１個ずつ別の試験管に移し
た後、ＯＰＤおよび過酸化水素水を、それぞれ１．０ｍ
ｇ／ｍＬおよび０．０２０％になるように使用直前に
０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解
して、それぞれの試験管に２５０μＬずつ加えて室温暗
所にて３０分間静置し、発色させた。３０分後に、１規
定の硫酸を加えて反応を停止させ、その４９０ｎｍにお
ける吸光度を測定した。
いたポリスチレン製ビーズを１個ずつ入れ、１時間静置
した。１時間後に、このビーズを蒸留水で洗浄し（３ｍ
Ｌ×３回）、水分を除去し、１個ずつ別の試験管に移し
た後、ＯＰＤおよび過酸化水素水を、それぞれ１．０ｍ
ｇ／ｍＬおよび０．０２０％になるように使用直前に
０．１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ５．０）に溶解
して、それぞれの試験管に２５０μＬずつ加えて室温暗
所にて３０分間静置し、発色させた。３０分後に、１規
定の硫酸を加えて反応を停止させ、その４９０ｎｍにお
ける吸光度を測定した。
【００３１】標準γ−Ｓｍ溶液の濃度に対する吸光度を
検量線として、この液体クロマトグラフィ集合液濃縮物
のγ−Ｓｍ濃度を求め、希釈倍率と溶液体積から全γ−
Ｓｍの量を算出した。
検量線として、この液体クロマトグラフィ集合液濃縮物
のγ−Ｓｍ濃度を求め、希釈倍率と溶液体積から全γ−
Ｓｍの量を算出した。
【００３２】〔蛋白質の定量〕ローリーらの方法（Ｏ．
Ｈ．Ｌｏｗｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，１９３巻、２６５〜２７５ページ、１９５１年）
に基づいて、液体クロマトグラフィにおけるγ−Ｓｍ画
分集合液濃縮物を適正倍率に希釈して蛋白質量の測定を
行い、希釈倍率と溶液体積から全蛋白質量を算出した。
Ｈ．Ｌｏｗｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．，１９３巻、２６５〜２７５ページ、１９５１年）
に基づいて、液体クロマトグラフィにおけるγ−Ｓｍ画
分集合液濃縮物を適正倍率に希釈して蛋白質量の測定を
行い、希釈倍率と溶液体積から全蛋白質量を算出した。
【００３３】〔ヒト精液の前処理〕凍結保存しておいた
健常人のヒト精液を集合し、４℃で２晩蒸留水に対して
透析した後に、遠心分離（１００００ｒｐｍ×６０ｍｉ
ｎ×４℃）を行って不溶解分を除去した。
健常人のヒト精液を集合し、４℃で２晩蒸留水に対して
透析した後に、遠心分離（１００００ｒｐｍ×６０ｍｉ
ｎ×４℃）を行って不溶解分を除去した。
【００３４】このようにして前処理したヒト精液（ヒト
精漿）を液体クロマトグラフィの初期緩衝液に対して透
析し、遠心分離した後に、以下の実施例で述べるように
液体クロマトグラフィにより分離精製を行った。
精漿）を液体クロマトグラフィの初期緩衝液に対して透
析し、遠心分離した後に、以下の実施例で述べるように
液体クロマトグラフィにより分離精製を行った。
【００３５】〔液体クロマトグラフィのモニター〕液体
クロマトグラフィにおける蛋白質の溶出状況は２８０ｎ
ｍにおける紫外線吸収スペクトル（以下、「ＵＶ−２８
０」と略す）で、塩濃度は電気伝導度計で、それぞれモ
ニターした。また、液体クロマトグラフィ終了後、各画
分に含まれるγ−Ｓｍの定性分析を行った。
クロマトグラフィにおける蛋白質の溶出状況は２８０ｎ
ｍにおける紫外線吸収スペクトル（以下、「ＵＶ−２８
０」と略す）で、塩濃度は電気伝導度計で、それぞれモ
ニターした。また、液体クロマトグラフィ終了後、各画
分に含まれるγ−Ｓｍの定性分析を行った。
【００３６】実施例１ 内径１．６ｃｍ、高さ１２ｃｍのカラムに、Ｂｅｎｚ−
セファロ−ス（ファルマシア社製）（アフィニティクロ
マトグラフィ）を充填し、１ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ＝７．０）で充分平衡化しておいた。このカラ
ムに、同じ緩衝液で透析した０．７ｍＬのヒト精漿を注
入し、分離を行った。
セファロ−ス（ファルマシア社製）（アフィニティクロ
マトグラフィ）を充填し、１ｍＭリン酸ナトリウム緩衝
液（ｐＨ＝７．０）で充分平衡化しておいた。このカラ
ムに、同じ緩衝液で透析した０．７ｍＬのヒト精漿を注
入し、分離を行った。
【００３７】このリン酸緩衝液において蛋白質が溶出し
終わった後に、０．４Ｍの塩化ナトリウムを含む０．１
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ＝４．０）を用いて吸着されている
成分を溶出させた。このときのクロマトグラムを図１に
示す。
終わった後に、０．４Ｍの塩化ナトリウムを含む０．１
Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ＝４．０）を用いて吸着されている
成分を溶出させた。このときのクロマトグラムを図１に
示す。
【００３８】図１において、破線１は２８０ｎｍにおけ
る吸光度（ＵＶ−２８０のモニター結果、蛋白質を表
す）、実線２は４９０ｎｍにおける吸光度（γ−Ｓｍの
活性を表す）、一点鎖線３は電気伝導度の値（塩化ナト
リウムの濃度を表す）を示す。
る吸光度（ＵＶ−２８０のモニター結果、蛋白質を表
す）、実線２は４９０ｎｍにおける吸光度（γ−Ｓｍの
活性を表す）、一点鎖線３は電気伝導度の値（塩化ナト
リウムの濃度を表す）を示す。
【００３９】次に、γ−Ｓｍの活性を示す画分を集合
し、直ちに１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝
７．０）に対して透析を行い（４℃、１４時間）、次い
で限外濾過機（アミコン社製商品名“ＹＭ−２”）を用
いて限外濾過を行い、８．４ｍＬの無色透明の溶液（こ
の溶液を「イ」と呼ぶ）を得た。
し、直ちに１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝
７．０）に対して透析を行い（４℃、１４時間）、次い
で限外濾過機（アミコン社製商品名“ＹＭ−２”）を用
いて限外濾過を行い、８．４ｍＬの無色透明の溶液（こ
の溶液を「イ」と呼ぶ）を得た。
【００４０】なお、本例において、カラムの流速は０．
５ｍＬ／ｍｉｎ．、１画分は１．８ｍＬとした。
５ｍＬ／ｍｉｎ．、１画分は１．８ｍＬとした。
【００４１】実施例２ 実施例１で得た無色透明溶液（イ）のうち７．８ｍＬ
を、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）で透析し
（４℃、１４時間）、ＣＭ−セファデックス（ファルマ
シア社製）（陽イオンクロマトグラフィ）が充填されて
いる内径１．０ｃｍ、高さ７．５ｃｍのカラム（このカ
ラムは、予め同じクエン酸緩衝液で充分平衡化されてい
る）に供給し、分離を行った。
を、５０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）で透析し
（４℃、１４時間）、ＣＭ−セファデックス（ファルマ
シア社製）（陽イオンクロマトグラフィ）が充填されて
いる内径１．０ｃｍ、高さ７．５ｃｍのカラム（このカ
ラムは、予め同じクエン酸緩衝液で充分平衡化されてい
る）に供給し、分離を行った。
【００４２】このクエン酸緩衝液で蛋白質が溶出された
後に、溶出液を０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ
クエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）に交換し、この緩衝液
による蛋白質の溶出が終わるまでこの緩衝液を流し続け
た。このときの蛋白質の溶出パターンと塩濃度とを図２
に示した。
後に、溶出液を０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ
クエン酸緩衝液（ｐＨ＝５．０）に交換し、この緩衝液
による蛋白質の溶出が終わるまでこの緩衝液を流し続け
た。このときの蛋白質の溶出パターンと塩濃度とを図２
に示した。
【００４３】図２において、破線４、実線５、一点鎖線
６は、それぞれ２８０ｎｍにおける吸光度（蛋白質）、
４９０ｎｍにおける吸光度（γ−Ｓｍの活性）、電気伝
導度（塩化ナトリウムの濃度）を示す。
６は、それぞれ２８０ｎｍにおける吸光度（蛋白質）、
４９０ｎｍにおける吸光度（γ−Ｓｍの活性）、電気伝
導度（塩化ナトリウムの濃度）を示す。
【００４４】このγ−Ｓｍの活性画分を集合し、１０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．０）に対して透
析し、次に限外濾過機（アミコン社製商品名“セントリ
コン−３”）を用いて溶液を濃縮し、無色透明の溶液を
２．３ｍＬ（この溶液を「ロ」と呼ぶ）を得た。
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．０）に対して透
析し、次に限外濾過機（アミコン社製商品名“セントリ
コン−３”）を用いて溶液を濃縮し、無色透明の溶液を
２．３ｍＬ（この溶液を「ロ」と呼ぶ）を得た。
【００４５】なお、本例において、カラム内の緩衝液の
流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎ、１画分は１．３ｍＬとし
た。
流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎ、１画分は１．３ｍＬとし
た。
【００４６】実施例３ 実施例２で得た無色透明溶液（ロ）のうち１．７ｍＬ
を、予め０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で充分平衡化しておいたセ
ファデックスＧ−１００（ゲルクロマトグラフィ）を充
填している内径１．０ｃｍ、高さ５４ｃｍのカラムに注
入し、分離を行った。この蛋白質の溶出パターンとγ−
Ｓｍの活性を図３に示した。
を、予め０．２Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍトリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で充分平衡化しておいたセ
ファデックスＧ−１００（ゲルクロマトグラフィ）を充
填している内径１．０ｃｍ、高さ５４ｃｍのカラムに注
入し、分離を行った。この蛋白質の溶出パターンとγ−
Ｓｍの活性を図３に示した。
【００４７】図３において、破線７および実線８は、そ
れぞれ２８０ｎｍ（蛋白質を表す）および４９０ｎｍ
（γ−ｓｍを表す）における吸光度を示している。
れぞれ２８０ｎｍ（蛋白質を表す）および４９０ｎｍ
（γ−ｓｍを表す）における吸光度を示している。
【００４８】この画分を集合し、１０ｍＭリン酸ナトリ
ウム緩衝液に対して透析し、次に実施例２と同じ限外濾
過機を用いて溶液を濃縮し、無色透明の溶液２．５ｍＬ
（この溶液を「ハ」と呼ぶ）を得た。
ウム緩衝液に対して透析し、次に実施例２と同じ限外濾
過機を用いて溶液を濃縮し、無色透明の溶液２．５ｍＬ
（この溶液を「ハ」と呼ぶ）を得た。
【００４９】なお、本例において、カラムの液流速は
０．２ｍＬ／ｍｉｎ．、１画分は２．５ｍＬとした。
０．２ｍＬ／ｍｉｎ．、１画分は２．５ｍＬとした。
【００５０】実施例１〜３で得た溶液（イ），（ロ），
（ハ）の蛋白質量およびγ−Ｓｍ量を表１に示した。表
１から明らかなように、第１精製段階（すなわち、溶液
（イ））における回収率が８９％と高く、また最終精製
段階（すなわち、溶液（ハ））において実質的に純度１
００％に近いものが得られており、実施例１〜３の各工
程を経れば、収率、純度ともに優れたγ−Ｓｍを得るこ
とができ、先ずアフィニティクロマトグラフィ（Ｂｅｎ
ｚ−セファロース）による処理、次いで陽イオン交換ク
ロマトグラフィ（ＣＭセファデックス）による処理、続
いてゲルクロマトグラフィによる処理を行うと言う組合
せが非常に効果的であることが判る。
（ハ）の蛋白質量およびγ−Ｓｍ量を表１に示した。表
１から明らかなように、第１精製段階（すなわち、溶液
（イ））における回収率が８９％と高く、また最終精製
段階（すなわち、溶液（ハ））において実質的に純度１
００％に近いものが得られており、実施例１〜３の各工
程を経れば、収率、純度ともに優れたγ−Ｓｍを得るこ
とができ、先ずアフィニティクロマトグラフィ（Ｂｅｎ
ｚ−セファロース）による処理、次いで陽イオン交換ク
ロマトグラフィ（ＣＭセファデックス）による処理、続
いてゲルクロマトグラフィによる処理を行うと言う組合
せが非常に効果的であることが判る。
【００５１】
【表１】
【００５２】実施例４ 実施例３で得た無色透明溶液（ハ）を、シャーラー
（Ｊ．Ｓｃｈａｌｌｅｒ）らの方法に基づいて精製した
標準γ−Ｓｍ溶液のローリー法における蛋白質量をもと
に、２００、１００、５０、１０、２および０ｎｇ／ｍ
Ｌになるように希釈し、前述したγ−Ｓｍの活性の測定
法（２）の項で示した方法で、各濃度における吸光度を
比較した。その結果を、表２に示した。
（Ｊ．Ｓｃｈａｌｌｅｒ）らの方法に基づいて精製した
標準γ−Ｓｍ溶液のローリー法における蛋白質量をもと
に、２００、１００、５０、１０、２および０ｎｇ／ｍ
Ｌになるように希釈し、前述したγ−Ｓｍの活性の測定
法（２）の項で示した方法で、各濃度における吸光度を
比較した。その結果を、表２に示した。
【００５３】
【表２】
【００５４】表２において、本発明の精製法により精製
したγ−Ｓｍの各濃度における吸光度は、シャーラーら
の方法に基づいて精製したγ−Ｓｍの吸光度と、測定の
バラツキの範囲内で殆ど一致している。したがって、本
発明の精製法によるγ−Ｓｍは、γ−Ｓｍの定量法にお
ける標準抗原としても使用可能であることが明らかであ
る。
したγ−Ｓｍの各濃度における吸光度は、シャーラーら
の方法に基づいて精製したγ−Ｓｍの吸光度と、測定の
バラツキの範囲内で殆ど一致している。したがって、本
発明の精製法によるγ−Ｓｍは、γ−Ｓｍの定量法にお
ける標準抗原としても使用可能であることが明らかであ
る。
【００５５】
【発明の効果】本発明の精製法によれば、ヒト精漿を原
料として先ずアフィニティクロマトグラフィを用いて効
率よくγ−Ｓｍを分離精製することができ、大量処理が
可能である。また、この方法で得られたγ−Ｓｍ画分を
さらに陽イオン交換クロマトグラフィとゲルクロマトグ
ラフィを併用して処理することにより、γ−Ｓｍの純度
を上げることができる。さらに、本発明の精製法で得ら
れるγ−Ｓｍは、血清中のγ−Ｓｍの定量法の標準抗原
として効果的に用いることができる。
料として先ずアフィニティクロマトグラフィを用いて効
率よくγ−Ｓｍを分離精製することができ、大量処理が
可能である。また、この方法で得られたγ−Ｓｍ画分を
さらに陽イオン交換クロマトグラフィとゲルクロマトグ
ラフィを併用して処理することにより、γ−Ｓｍの純度
を上げることができる。さらに、本発明の精製法で得ら
れるγ−Ｓｍは、血清中のγ−Ｓｍの定量法の標準抗原
として効果的に用いることができる。
【図１】ヒト精漿をアフィニティクロマトグラフィによ
り処理したときのクロマトグラムである。
り処理したときのクロマトグラムである。
【図２】ヒト精漿をアフィニティクロマトグラフィで処
理した後に、陽イオン交換クロマトグラフィで処理した
ときのクロマトグラムである。
理した後に、陽イオン交換クロマトグラフィで処理した
ときのクロマトグラムである。
【図３】ヒト精漿をアフィニティクロマトグラフィで処
理した後に、陽イオン交換クロマトグラフィ処理し、さ
らにゲルクロマトグラフィで処理したときのクロマトグ
ラムである。
理した後に、陽イオン交換クロマトグラフィ処理し、さ
らにゲルクロマトグラフィで処理したときのクロマトグ
ラムである。
１，４，７ ２８０ｎｍにおける吸光度 ２，５，８ ４９０ｎｍにおける吸光度 ３，６ ＮａＣｌの濃度（Ｍ）
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 30/48 Ｒ (72)発明者 小林 拓也 埼玉県幸手市権現堂1134−２ 株式会社コ スモ総合研究所研究開発センター内
Claims (1)
- 【請求項１】 ヒト精漿を原料として、γ−セミノプロ
テインを分離精製する方法において、 先ず、ヒト精漿をアフィニティクロマトグラフィにより
処理してγ−セミノプロテイン画分を分離して取り出
し、 次いで、この画分を陽イオン交換クロマトグラフィとゲ
ルクロマトグラフィとにより処理して、γ−セミノプロ
テインを分離して取り出すことを特徴とするγ−セミノ
プロテインの分離精製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6082365A JPH07267990A (ja) | 1994-03-29 | 1994-03-29 | γ−セミノプロテインの分離精製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6082365A JPH07267990A (ja) | 1994-03-29 | 1994-03-29 | γ−セミノプロテインの分離精製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07267990A true JPH07267990A (ja) | 1995-10-17 |
Family
ID=13772566
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6082365A Pending JPH07267990A (ja) | 1994-03-29 | 1994-03-29 | γ−セミノプロテインの分離精製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07267990A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008503725A (ja) * | 2004-06-16 | 2008-02-07 | バイオ−ラッド・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド | マルチケミストリ分画 |
-
1994
- 1994-03-29 JP JP6082365A patent/JPH07267990A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008503725A (ja) * | 2004-06-16 | 2008-02-07 | バイオ−ラッド・ラボラトリーズ・インコーポレーテッド | マルチケミストリ分画 |
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