JPH07236474A - 活性化ｔ細胞の製造法およびそのための培地 - Google Patents
活性化ｔ細胞の製造法およびそのための培地Info
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- JPH07236474A JPH07236474A JP6033884A JP3388494A JPH07236474A JP H07236474 A JPH07236474 A JP H07236474A JP 6033884 A JP6033884 A JP 6033884A JP 3388494 A JP3388494 A JP 3388494A JP H07236474 A JPH07236474 A JP H07236474A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 抗ＣＤ３抗体、ＬＰＳ刺激Ｂ細胞およびリン
ホカインの存在下で、リンパ球を培養して、活性化Ｔ細
胞を得る。 【効果】 例えばＣＤ４+ 、ＣＤ８+ （活性化）Ｔ細胞
などの活性化Ｔ細胞が効率よく、しかも大量に製造され
る。したがって、活性化Ｔ細胞を利用した療法の臨床へ
の応用の途が開けたことになる。すなわち、該療法によ
る感染防御、抗アレルギー、癌転移抑制、癌療法補助と
しての利用が大いに期待できる。
ホカインの存在下で、リンパ球を培養して、活性化Ｔ細
胞を得る。 【効果】 例えばＣＤ４+ 、ＣＤ８+ （活性化）Ｔ細胞
などの活性化Ｔ細胞が効率よく、しかも大量に製造され
る。したがって、活性化Ｔ細胞を利用した療法の臨床へ
の応用の途が開けたことになる。すなわち、該療法によ
る感染防御、抗アレルギー、癌転移抑制、癌療法補助と
しての利用が大いに期待できる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、活性化Ｔ細胞の製造法
およびそのための培地に関し、詳しくは感染防御剤、抗
アレルギー剤、癌転移抑制剤および癌療法補助剤などと
して有用な活性化Ｔ細胞を製造する方法、および該Ｔ細
胞を製造するための培地に関する。
およびそのための培地に関し、詳しくは感染防御剤、抗
アレルギー剤、癌転移抑制剤および癌療法補助剤などと
して有用な活性化Ｔ細胞を製造する方法、および該Ｔ細
胞を製造するための培地に関する。
【０００２】
【従来の技術】近年の免疫学の進歩に伴い、種々の免疫
担当細胞による免疫学的監視機構が明らかにされつつあ
り、該機構の機能を高めることによって、腫瘍細胞や日
和見感染細菌などの抗原を破壊する免疫療法が開発され
ている。例えば、患者から採取、分離されたリンパ球を
インターロイキン（ＩＬ）−２やＩＬ−４の存在下で培
養して、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞を誘
導し、このＬＡＫ細胞を再び患者の体内に戻すＬＡＫ療
法（養子免疫法）が開発されている。
担当細胞による免疫学的監視機構が明らかにされつつあ
り、該機構の機能を高めることによって、腫瘍細胞や日
和見感染細菌などの抗原を破壊する免疫療法が開発され
ている。例えば、患者から採取、分離されたリンパ球を
インターロイキン（ＩＬ）−２やＩＬ−４の存在下で培
養して、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞を誘
導し、このＬＡＫ細胞を再び患者の体内に戻すＬＡＫ療
法（養子免疫法）が開発されている。
【０００３】しかしながら、ＬＡＫ細胞は、腫瘍細胞な
どの抗原に対して非特異的な細胞障害活性を示すので、
あまり治療効果を期待できないのが現状である。そこ
で、抗原非特異的なキラー細胞ではなく、抗原特異的な
活性化Ｔ細胞を用いて、ＬＡＫ療法と同様の治療を行う
手法が注目されつつある。
どの抗原に対して非特異的な細胞障害活性を示すので、
あまり治療効果を期待できないのが現状である。そこ
で、抗原非特異的なキラー細胞ではなく、抗原特異的な
活性化Ｔ細胞を用いて、ＬＡＫ療法と同様の治療を行う
手法が注目されつつある。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】この活性化Ｔ細胞を用
いた療法では、大量にＴ細胞を活性化させることが重要
な要件であり、例えばＬＡＫ療法の場合と同様に、抗Ｃ
Ｄ（cluster differentiation ）３抗体または高濃度
（50〜2,000 ＪＲＵ／ml）のＩＬ−２を用いて、リンパ
球を活性化Ｔ細胞に分化させる方法が知られている。
いた療法では、大量にＴ細胞を活性化させることが重要
な要件であり、例えばＬＡＫ療法の場合と同様に、抗Ｃ
Ｄ（cluster differentiation ）３抗体または高濃度
（50〜2,000 ＪＲＵ／ml）のＩＬ−２を用いて、リンパ
球を活性化Ｔ細胞に分化させる方法が知られている。
【０００５】本発明者らは、上記の知見に基づいて、例
えばＣＤ４+ 、ＣＤ８+ （活性化）Ｔ細胞などの活性化
Ｔ細胞の製造条件について検討を行った結果、上記の手
法では、効率よく該細胞を製造することが困難であると
判断した。そこで、本発明者らは、さらに効率よく該細
胞を製造できる方法を開発するために、鋭意研究を行っ
た。
えばＣＤ４+ 、ＣＤ８+ （活性化）Ｔ細胞などの活性化
Ｔ細胞の製造条件について検討を行った結果、上記の手
法では、効率よく該細胞を製造することが困難であると
判断した。そこで、本発明者らは、さらに効率よく該細
胞を製造できる方法を開発するために、鋭意研究を行っ
た。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく研究を重ねた結果、リンパ球の培養時に、
抗ＣＤ３抗体、ＬＰＳ刺激Ｂ細胞およびリンホカインを
併用することにより、活性化Ｔ細胞が極めて効率よく増
殖することを見出し、さらに研究を重ねることによっ
て、本発明を完成するに至った。
を解決すべく研究を重ねた結果、リンパ球の培養時に、
抗ＣＤ３抗体、ＬＰＳ刺激Ｂ細胞およびリンホカインを
併用することにより、活性化Ｔ細胞が極めて効率よく増
殖することを見出し、さらに研究を重ねることによっ
て、本発明を完成するに至った。
【０００７】すなわち、本発明の活性化Ｔ細胞の製造法
は、抗ＣＤ３抗体、ＬＰＳ刺激Ｂ細胞およびリンホカイ
ンの存在下で、リンパ球を培養することを特徴とするも
のである。
は、抗ＣＤ３抗体、ＬＰＳ刺激Ｂ細胞およびリンホカイ
ンの存在下で、リンパ球を培養することを特徴とするも
のである。
【０００８】また、本発明の活性化Ｔ細胞製造用培地
は、抗ＣＤ３抗体、ＬＰＳ刺激Ｂ細胞およびリンホカイ
ンを含有することを特徴とするものである。
は、抗ＣＤ３抗体、ＬＰＳ刺激Ｂ細胞およびリンホカイ
ンを含有することを特徴とするものである。
【０００９】本発明において用いられる出発細胞である
リンパ球としては、末梢血リンパ球細胞（ＰＢＬ）、リ
ンパ節細胞、腫瘍湿潤リンパ球、担癌（または腫瘍）局
所リンパ節細胞などが挙げられる。なお、本発明の製造
法により得られた活性化Ｔ細胞を患者に投与する場合に
は、該患者から採取されたリンパ球を用いることが望ま
しい。また、癌転移抑制剤および癌療法補助剤として使
用する場合には、標的となる腫瘍の局所リンパ節細胞を
培養することによって、腫瘍特異的な抗腫瘍効果を期待
できる。
リンパ球としては、末梢血リンパ球細胞（ＰＢＬ）、リ
ンパ節細胞、腫瘍湿潤リンパ球、担癌（または腫瘍）局
所リンパ節細胞などが挙げられる。なお、本発明の製造
法により得られた活性化Ｔ細胞を患者に投与する場合に
は、該患者から採取されたリンパ球を用いることが望ま
しい。また、癌転移抑制剤および癌療法補助剤として使
用する場合には、標的となる腫瘍の局所リンパ節細胞を
培養することによって、腫瘍特異的な抗腫瘍効果を期待
できる。
【００１０】抗ＣＤ３抗体は、ＣＤ３に対する抗体であ
れば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいず
れであってもよく、ＴＣＲ（Ｔ cell receptor）αまた
はβchain に対する抗体でも代用できる。
れば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体のいず
れであってもよく、ＴＣＲ（Ｔ cell receptor）αまた
はβchain に対する抗体でも代用できる。
【００１１】ＬＰＳ刺激Ｂ細胞とは、ＬＰＳ（リポ多
糖）で刺激したＢ細胞であり、例えば腫瘍局所リンパ節
または脾臓細胞からＢ細胞画分を回収し、大腸菌由来の
ＬＰＳ（１〜100 μｇ／ml）で１〜３日間程度培養する
ことによって、調製することができる。なお、ポリＩ：
ＣまたはＩＬ−５などで活性化したＢ細胞（Ｂ細胞ブラ
スト）でも代用できる。さらに、Ｆｃ receptor および
costimulatory moleculeを発現しているヒトおよびその
他の種のＢ cell line、または遺伝子工学的にＦｃ rec
eptor およびcostimulatory moleculeを発現させた細胞
株でも代用できる。
糖）で刺激したＢ細胞であり、例えば腫瘍局所リンパ節
または脾臓細胞からＢ細胞画分を回収し、大腸菌由来の
ＬＰＳ（１〜100 μｇ／ml）で１〜３日間程度培養する
ことによって、調製することができる。なお、ポリＩ：
ＣまたはＩＬ−５などで活性化したＢ細胞（Ｂ細胞ブラ
スト）でも代用できる。さらに、Ｆｃ receptor および
costimulatory moleculeを発現しているヒトおよびその
他の種のＢ cell line、または遺伝子工学的にＦｃ rec
eptor およびcostimulatory moleculeを発現させた細胞
株でも代用できる。
【００１２】リンホカインとしては、マクロファージ遊
走阻止因子（ＭＩＦ）、マクロファージ走化性因子（Ｍ
ＣＦ）、皮膚反応因子（ＳＲＦ）、マクロファージ活性
化因子（ＭＡＦ）、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）、好
中球走化性因子（ＮＣＦ）、好酸球走化性因子（ＥＣ
Ｆ）、好塩基球走化性因子（ＢＣＦ）、好酸球刺激促進
因子（ＥＳＰ）、リンホトキシン（ＬＴ）、血管透過性
亢進因子（ＶＰＦ）、幼若化因子（ＢＦまたはＭＦ）、
破骨細胞活性化因子（ＯＡＦまたはＩＬ−１β）、γ−
インターフェロン（ＩＦＮ−γ）などのエフェクターリ
ンホカイン、およびコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、ＩＬ
−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ
−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２レセプター調節因子（ＡＴ
Ｆ）などの免疫調節性リンホカインが挙げられるが、特
にＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γが望ましい。
これらリンホカインは、単独または二種以上を併用する
ことができる。ＩＬ−２およびＩＬ−１２は、末梢血か
ら分離したものでも、また遺伝子組換により調製したも
のでもよい。ＩＦＮ−γは、細胞培養、遺伝子組換など
の手段により調製されたものを利用できる。
走阻止因子（ＭＩＦ）、マクロファージ走化性因子（Ｍ
ＣＦ）、皮膚反応因子（ＳＲＦ）、マクロファージ活性
化因子（ＭＡＦ）、白血球遊走阻止因子（ＬＩＦ）、好
中球走化性因子（ＮＣＦ）、好酸球走化性因子（ＥＣ
Ｆ）、好塩基球走化性因子（ＢＣＦ）、好酸球刺激促進
因子（ＥＳＰ）、リンホトキシン（ＬＴ）、血管透過性
亢進因子（ＶＰＦ）、幼若化因子（ＢＦまたはＭＦ）、
破骨細胞活性化因子（ＯＡＦまたはＩＬ−１β）、γ−
インターフェロン（ＩＦＮ−γ）などのエフェクターリ
ンホカイン、およびコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、ＩＬ
−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ
−６、ＩＬ−１２、ＩＬ−２レセプター調節因子（ＡＴ
Ｆ）などの免疫調節性リンホカインが挙げられるが、特
にＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γが望ましい。
これらリンホカインは、単独または二種以上を併用する
ことができる。ＩＬ−２およびＩＬ−１２は、末梢血か
ら分離したものでも、また遺伝子組換により調製したも
のでもよい。ＩＦＮ−γは、細胞培養、遺伝子組換など
の手段により調製されたものを利用できる。
【００１３】本発明の活性化Ｔ細胞の製造法は、抗ＣＤ
３抗体、ＬＰＳ刺激Ｂ細胞およびリンホカインの存在下
で、リンパ球を培養することを特徴とし、例えば以下の
操作により行われる。まず、抗ＣＤ３抗体（0.1 〜1,00
0 μｇ／ml）およびＬＰＳ刺激Ｂ細胞（104 〜108 個／
ml）を含む培地中にて、リンパ球（104 〜106 個／ml）
を１〜３日間程度培養する。培地中における抗ＣＤ３抗
体の添加量は、0.1 〜1,000 μｇ／ml、好ましくは0.1
〜100 μｇ／ml、より好ましくは0.5 〜５μｇ／mlであ
り、ＬＰＳ刺激Ｂ細胞の添加量は、104 〜108 個／ml、
好ましくは105〜108 個／ml、より好ましくは５×106
〜５×107 個／mlである。
３抗体、ＬＰＳ刺激Ｂ細胞およびリンホカインの存在下
で、リンパ球を培養することを特徴とし、例えば以下の
操作により行われる。まず、抗ＣＤ３抗体（0.1 〜1,00
0 μｇ／ml）およびＬＰＳ刺激Ｂ細胞（104 〜108 個／
ml）を含む培地中にて、リンパ球（104 〜106 個／ml）
を１〜３日間程度培養する。培地中における抗ＣＤ３抗
体の添加量は、0.1 〜1,000 μｇ／ml、好ましくは0.1
〜100 μｇ／ml、より好ましくは0.5 〜５μｇ／mlであ
り、ＬＰＳ刺激Ｂ細胞の添加量は、104 〜108 個／ml、
好ましくは105〜108 個／ml、より好ましくは５×106
〜５×107 個／mlである。
【００１４】次に、リンホカインを含む培地で１〜10日
間程度培養する。リンホカインは、末梢血から分離され
たもの、または遺伝子組換により調製されたものを使用
することができる。リンホカインの配合量は、例えばＩ
Ｌ−２の場合、10〜1,000 ＪＲＵ／ml、好ましくは10〜
100 ＪＲＵ／ml、より好ましくは20〜50ＪＲＵ／mlであ
り、ＩＬ−１２の場合、0.1 〜1,000 Ｕ／ml、好ましく
は0.1 〜100 Ｕ／ml、より好ましくは１〜50Ｕ／mlであ
り、ＩＦＮ−γの場合、0.1 〜1,000 ＩＵ／ml、好まし
くは10〜1,000 ＩＵ／ml、より好ましくは20〜500 ＩＵ
／mlである。
間程度培養する。リンホカインは、末梢血から分離され
たもの、または遺伝子組換により調製されたものを使用
することができる。リンホカインの配合量は、例えばＩ
Ｌ−２の場合、10〜1,000 ＪＲＵ／ml、好ましくは10〜
100 ＪＲＵ／ml、より好ましくは20〜50ＪＲＵ／mlであ
り、ＩＬ−１２の場合、0.1 〜1,000 Ｕ／ml、好ましく
は0.1 〜100 Ｕ／ml、より好ましくは１〜50Ｕ／mlであ
り、ＩＦＮ−γの場合、0.1 〜1,000 ＩＵ／ml、好まし
くは10〜1,000 ＩＵ／ml、より好ましくは20〜500 ＩＵ
／mlである。
【００１５】培養は、好ましくは炭酸ガスを３〜７容量
％含有する雰囲気中にて、36〜38℃で行う。
％含有する雰囲気中にて、36〜38℃で行う。
【００１６】本発明の活性化Ｔ細胞製造用培地は、基本
培地に上記の抗ＣＤ３抗体、ＬＰＳ刺激Ｂ細胞およびリ
ンホカインを含有する。抗ＣＤ３抗体、ＬＰＳ刺激Ｂ細
胞およびリンホカインは、同時に全て含有される必要は
なく、抗ＣＤ３抗体およびＬＰＳ刺激Ｂ細胞を含む培地
を用いて、リンパ球を培養した後、リンホカインを該培
地に添加するか、あるいはリンホカインを含む培地で培
養してもよい。基本培地としては、最小基本培地（ＭＥ
Ｍ）、ＲＰＭＩ1640、ハムＦ12、ダルベッコ改変イーグ
ル培地（ＤＭＥＭ）、イスコフ改変イーグル培地（ＩＭ
ＤＭ）などを単独または混合して使用することができ
る。好ましくはＲＰＭＩ1640が例示される。
培地に上記の抗ＣＤ３抗体、ＬＰＳ刺激Ｂ細胞およびリ
ンホカインを含有する。抗ＣＤ３抗体、ＬＰＳ刺激Ｂ細
胞およびリンホカインは、同時に全て含有される必要は
なく、抗ＣＤ３抗体およびＬＰＳ刺激Ｂ細胞を含む培地
を用いて、リンパ球を培養した後、リンホカインを該培
地に添加するか、あるいはリンホカインを含む培地で培
養してもよい。基本培地としては、最小基本培地（ＭＥ
Ｍ）、ＲＰＭＩ1640、ハムＦ12、ダルベッコ改変イーグ
ル培地（ＤＭＥＭ）、イスコフ改変イーグル培地（ＩＭ
ＤＭ）などを単独または混合して使用することができ
る。好ましくはＲＰＭＩ1640が例示される。
【００１７】基本培地に対して、その細胞増殖能をさら
に向上させるために、種々の公知成分を添加することも
できる。その具体例としては、インシュリン、トランス
フェリン、フェツイン、カタラーゼ、Ｏ−フォスホリル
エタノールアミン、エタノールアミン、亜セレン酸ナト
リウム、２−メルカプトエタノール、コルチコステロン
などが挙げられる。
に向上させるために、種々の公知成分を添加することも
できる。その具体例としては、インシュリン、トランス
フェリン、フェツイン、カタラーゼ、Ｏ−フォスホリル
エタノールアミン、エタノールアミン、亜セレン酸ナト
リウム、２−メルカプトエタノール、コルチコステロン
などが挙げられる。
【００１８】インシュリンとしては、ヒト、ブタ、ヒツ
ジ、ウシ、ウマなど由来のもの、または組換体のいずれ
でも使用でき、その添加量は、１〜100 μｇ／ml、特に
10μｇ／ml程度が好ましい。トランスフェリンとして
は、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、マウス、モルモット、ウ
サギなど由来のものが使用でき、その添加量は、１〜10
0 μｇ／ml、特に10μｇ／ml程度が好ましい。フェツイ
ンとしては、例えばウシ由来のものが使用でき、その添
加量は、１〜100 μｇ／ml、特に10μｇ／ml程度が好ま
しい。カタラーゼとしては、例えばウシ、イヌ、マウ
ス、糸状菌など由来のものが使用でき、その添加量は、
２〜50μｇ／ml、特に30μｇ／ml程度が好ましい。Ｏ−
フォスホリンエタノールアミンまたはエタノールアミン
の添加量は、２〜200 μｇ／ml、特に20μｇ／ml程度が
好ましい。亜セレン酸ナトリウムの添加量は、10-10 〜
10-7Ｍ、特に10-8Ｍ程度が好ましい。２−メルカプトエ
タノールの添加量は、10-9〜10-7Ｍ、特に10-8Ｍ程度が
好ましい。コルチコステロンの添加量は、10-9〜10
-6Ｍ、特に10-7Ｍ程度が好ましい。
ジ、ウシ、ウマなど由来のもの、または組換体のいずれ
でも使用でき、その添加量は、１〜100 μｇ／ml、特に
10μｇ／ml程度が好ましい。トランスフェリンとして
は、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、マウス、モルモット、ウ
サギなど由来のものが使用でき、その添加量は、１〜10
0 μｇ／ml、特に10μｇ／ml程度が好ましい。フェツイ
ンとしては、例えばウシ由来のものが使用でき、その添
加量は、１〜100 μｇ／ml、特に10μｇ／ml程度が好ま
しい。カタラーゼとしては、例えばウシ、イヌ、マウ
ス、糸状菌など由来のものが使用でき、その添加量は、
２〜50μｇ／ml、特に30μｇ／ml程度が好ましい。Ｏ−
フォスホリンエタノールアミンまたはエタノールアミン
の添加量は、２〜200 μｇ／ml、特に20μｇ／ml程度が
好ましい。亜セレン酸ナトリウムの添加量は、10-10 〜
10-7Ｍ、特に10-8Ｍ程度が好ましい。２−メルカプトエ
タノールの添加量は、10-9〜10-7Ｍ、特に10-8Ｍ程度が
好ましい。コルチコステロンの添加量は、10-9〜10
-6Ｍ、特に10-7Ｍ程度が好ましい。
【００１９】本発明の培地を用いることによって、リン
パ球がＣＤ４+ 、ＣＤ８+ （活性化）Ｔ細胞などの活性
化Ｔ細胞に分化、誘導される。活性化Ｔ細胞は、単独で
または公知の薬剤と併用して、ヒト、ウシ、ウマ、イ
ヌ、マウス、ラットなどの哺乳動物に対して、感染防
御、抗アレルギー、癌転移抑制などの作用を有する。併
用し得る公知の薬剤としては、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、
ＩＦＮ−γなどが例示される。
パ球がＣＤ４+ 、ＣＤ８+ （活性化）Ｔ細胞などの活性
化Ｔ細胞に分化、誘導される。活性化Ｔ細胞は、単独で
または公知の薬剤と併用して、ヒト、ウシ、ウマ、イ
ヌ、マウス、ラットなどの哺乳動物に対して、感染防
御、抗アレルギー、癌転移抑制などの作用を有する。併
用し得る公知の薬剤としては、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、
ＩＦＮ−γなどが例示される。
【００２０】活性化Ｔ細胞を含有する医薬組成物は、液
状製剤の形態で非経口的に投与され、疾病の進度または
病状に対して所望の治療的効果を生ぜしめるに十分な量
の活性化Ｔ細胞を含有しているべきである。本医薬組成
物は、感染防御剤、抗アレルギー剤、癌転移抑制剤また
は癌療法補助剤などとして有用である。本医薬組成物
は、必要に応じて、懸濁化剤、保存剤、ｐＨ緩衝剤、等
張剤、局所麻酔剤、抗生物質などが添加され、常法によ
り皮下、筋肉内、静脈注射剤を製造することができる。
状製剤の形態で非経口的に投与され、疾病の進度または
病状に対して所望の治療的効果を生ぜしめるに十分な量
の活性化Ｔ細胞を含有しているべきである。本医薬組成
物は、感染防御剤、抗アレルギー剤、癌転移抑制剤また
は癌療法補助剤などとして有用である。本医薬組成物
は、必要に応じて、懸濁化剤、保存剤、ｐＨ緩衝剤、等
張剤、局所麻酔剤、抗生物質などが添加され、常法によ
り皮下、筋肉内、静脈注射剤を製造することができる。
【００２１】以下に本発明の好ましい態様を列挙する。 １．本発明の活性化Ｔ細胞の製造法において、リンパ球
が、腫瘍局所リンパ節細胞である態様。 ２．本発明の活性化Ｔ細胞の製造法において、リンホカ
インが、ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γから選
ばれる少なくとも一種である態様。 ３．本発明の活性化Ｔ細胞の製造法が、抗ＣＤ３抗体お
よびＬＰＳ刺激Ｂ細胞の存在下でリンパ球を培養した
後、リンホカインの存在下で培養する態様。 ４．本発明の活性化Ｔ細胞の製造法が、104 〜106 個／
mlのリンパ球に対して、0.1 〜1,000 μｇ／mlの抗ＣＤ
３抗体と、104 〜108 個／mlのＬＰＳ刺激Ｂ細胞とを併
用し、10〜1,000 ＪＲＵ／mlのＩＬ−２、0.1 〜1,000
Ｕ／mlのＩＬ−１２および0.1 〜1,000 ＩＵ／mlのＩＦ
Ｎ−γから選ばれる少なくとも一種を用いる態様。 ５．本発明の活性化Ｔ細胞増殖用培地が、0.1 〜1,000
μｇ／mlの抗ＣＤ３抗体と、104 〜108 個／mlのＬＰＳ
刺激Ｂ細胞とを含み、10〜1,000 ＪＲＵ／mlのＩＬ−
２、0.1 〜1,000 Ｕ／mlのＩＬ−１２および0.1 〜1,00
0 ＩＵ／mlのＩＦＮ−γから選ばれる少なくとも一種の
リンホカインを含有する態様。 ６．本発明の活性化Ｔ細胞の製造法により得られた活性
化Ｔ細胞を含有する医薬組成物。 ７．上記医薬組成物が、感染防御剤、抗アレルギー剤、
癌転移抑制剤または癌療法補助剤用である態様。
が、腫瘍局所リンパ節細胞である態様。 ２．本発明の活性化Ｔ細胞の製造法において、リンホカ
インが、ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＦＮ−γから選
ばれる少なくとも一種である態様。 ３．本発明の活性化Ｔ細胞の製造法が、抗ＣＤ３抗体お
よびＬＰＳ刺激Ｂ細胞の存在下でリンパ球を培養した
後、リンホカインの存在下で培養する態様。 ４．本発明の活性化Ｔ細胞の製造法が、104 〜106 個／
mlのリンパ球に対して、0.1 〜1,000 μｇ／mlの抗ＣＤ
３抗体と、104 〜108 個／mlのＬＰＳ刺激Ｂ細胞とを併
用し、10〜1,000 ＪＲＵ／mlのＩＬ−２、0.1 〜1,000
Ｕ／mlのＩＬ−１２および0.1 〜1,000 ＩＵ／mlのＩＦ
Ｎ−γから選ばれる少なくとも一種を用いる態様。 ５．本発明の活性化Ｔ細胞増殖用培地が、0.1 〜1,000
μｇ／mlの抗ＣＤ３抗体と、104 〜108 個／mlのＬＰＳ
刺激Ｂ細胞とを含み、10〜1,000 ＪＲＵ／mlのＩＬ−
２、0.1 〜1,000 Ｕ／mlのＩＬ−１２および0.1 〜1,00
0 ＩＵ／mlのＩＦＮ−γから選ばれる少なくとも一種の
リンホカインを含有する態様。 ６．本発明の活性化Ｔ細胞の製造法により得られた活性
化Ｔ細胞を含有する医薬組成物。 ７．上記医薬組成物が、感染防御剤、抗アレルギー剤、
癌転移抑制剤または癌療法補助剤用である態様。
【００２２】
【実施例】以下、本発明をより詳細に説明するために実
施例および実験例を挙げるが、本発明はこれらによって
何ら限定されるものではない。
施例および実験例を挙げるが、本発明はこれらによって
何ら限定されるものではない。
【００２３】実施例１ 無処置Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のリンパ節細胞を抗Ｃ
Ｄ８モノクローナル抗体および抗ＨＳＡ抗体で処理し
て、ＣＤ４+ Ｔ細胞を調製した。このＣＤ４+ Ｔ細胞
（２×105 個／ml）を抗ＣＤ３モノクローナル抗体（１
μｇ／ml）と大腸菌由来のＬＰＳで２日間刺激したＢ細
胞（２×105 個／ml）とを用いて、37℃で１日間培養す
ることにより刺激した。さらに、ＩＬ−２（20ＪＲＵ／
ml）を添加して、37℃で７日間培養を続けた。なお、基
本培地は、10％ＦＣＳ（fetal calf serum）加ＲＰＭＩ
1640培地を用いた（以下の実施例も同様）。その結果、
Ｔ細胞は総数19×105 個／mlに増殖し、その内訳はＣＤ
４+ Ｔ細胞が98％であり、ＣＤ８+ Ｔ細胞が２％であっ
た。
Ｄ８モノクローナル抗体および抗ＨＳＡ抗体で処理し
て、ＣＤ４+ Ｔ細胞を調製した。このＣＤ４+ Ｔ細胞
（２×105 個／ml）を抗ＣＤ３モノクローナル抗体（１
μｇ／ml）と大腸菌由来のＬＰＳで２日間刺激したＢ細
胞（２×105 個／ml）とを用いて、37℃で１日間培養す
ることにより刺激した。さらに、ＩＬ−２（20ＪＲＵ／
ml）を添加して、37℃で７日間培養を続けた。なお、基
本培地は、10％ＦＣＳ（fetal calf serum）加ＲＰＭＩ
1640培地を用いた（以下の実施例も同様）。その結果、
Ｔ細胞は総数19×105 個／mlに増殖し、その内訳はＣＤ
４+ Ｔ細胞が98％であり、ＣＤ８+ Ｔ細胞が２％であっ
た。
【００２４】実施例２ 無処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６メラノーマを皮下
接種して、10〜15日後に腫瘍局所リンパ節細胞を回収し
た。このリンパ節Ｔ細胞（ＣＤ４が50％、ＣＤ８が45
％）２×105 個／mlを抗ＣＤ３モノクローナル抗体（１
μｇ／ml）と大腸菌由来のＬＰＳで２日間刺激したＢ細
胞（６×105 個／ml）とを用いて、37℃で１日間培養す
ることにより刺激した。さらに、ＩＬ−２（20ＪＲＵ／
ml）およびＩＬ−１２（100 Ｕ／ml）を添加して、37℃
で10日間培養を続けた。その結果、Ｔ細胞は総数160 ×
105 個／mlに増殖し、その内訳はＣＤ４+ Ｔ細胞が91％
であり、ＣＤ８+ Ｔ細胞が９％であった。
接種して、10〜15日後に腫瘍局所リンパ節細胞を回収し
た。このリンパ節Ｔ細胞（ＣＤ４が50％、ＣＤ８が45
％）２×105 個／mlを抗ＣＤ３モノクローナル抗体（１
μｇ／ml）と大腸菌由来のＬＰＳで２日間刺激したＢ細
胞（６×105 個／ml）とを用いて、37℃で１日間培養す
ることにより刺激した。さらに、ＩＬ−２（20ＪＲＵ／
ml）およびＩＬ−１２（100 Ｕ／ml）を添加して、37℃
で10日間培養を続けた。その結果、Ｔ細胞は総数160 ×
105 個／mlに増殖し、その内訳はＣＤ４+ Ｔ細胞が91％
であり、ＣＤ８+ Ｔ細胞が９％であった。
【００２５】実施例３ 実施例２と同様にして得たリンパ節Ｔ細胞（ＣＤ４が50
％、ＣＤ８が45％）２×105 個／mlを抗ＣＤ３モノクロ
ーナル抗体（１μｇ／ml）と大腸菌由来のＬＰＳで２日
間刺激したＢ細胞（６×105 個／ml）とを用いて、37℃
で１日間培養することにより刺激した。さらに、ＩＬ−
２（20ＪＲＵ／ml）を添加して、37℃で10日間培養を続
けた。その結果、Ｔ細胞は総数560 ×105 個／mlに増殖
し、その内訳はＣＤ４+ Ｔ細胞が50％であり、ＣＤ８+
Ｔ細胞が50％であった。
％、ＣＤ８が45％）２×105 個／mlを抗ＣＤ３モノクロ
ーナル抗体（１μｇ／ml）と大腸菌由来のＬＰＳで２日
間刺激したＢ細胞（６×105 個／ml）とを用いて、37℃
で１日間培養することにより刺激した。さらに、ＩＬ−
２（20ＪＲＵ／ml）を添加して、37℃で10日間培養を続
けた。その結果、Ｔ細胞は総数560 ×105 個／mlに増殖
し、その内訳はＣＤ４+ Ｔ細胞が50％であり、ＣＤ８+
Ｔ細胞が50％であった。
【００２６】実施例４ 実施例２と同様にして得たリンパ節Ｔ細胞（ＣＤ４が50
％、ＣＤ８が45％）２×105 個／mlを抗ＣＤ３モノクロ
ーナル抗体（１μｇ／ml）と大腸菌由来のＬＰＳで２日
間刺激したＢ細胞（６×105 個／ml）とを用いて、37℃
で２日間培養することにより刺激した。さらに、ＩＬ−
２（100 ＪＲＵ／ml）を添加して、37℃で４〜５日間培
養を続けた。その結果、Ｔ細胞は総数900 ×105 個／ml
に増殖し、その内訳はＣＤ４+ Ｔ細胞が９％であり、Ｃ
Ｄ８+ Ｔ細胞が91％であった。
％、ＣＤ８が45％）２×105 個／mlを抗ＣＤ３モノクロ
ーナル抗体（１μｇ／ml）と大腸菌由来のＬＰＳで２日
間刺激したＢ細胞（６×105 個／ml）とを用いて、37℃
で２日間培養することにより刺激した。さらに、ＩＬ−
２（100 ＪＲＵ／ml）を添加して、37℃で４〜５日間培
養を続けた。その結果、Ｔ細胞は総数900 ×105 個／ml
に増殖し、その内訳はＣＤ４+ Ｔ細胞が９％であり、Ｃ
Ｄ８+ Ｔ細胞が91％であった。
【００２７】実験例１ 実施例４により調製された活性化Ｔ細胞、実施例４と同
様にして調製された無処置マウス由来の活性化Ｔ細胞お
よびＭＣＡ（3-methylcholanthrene-induced sarcoma）
担癌マウス由来の活性化Ｔ細胞１×107 個を肺転移腫瘍
モデル（Ｂ１６メラノーマを３日前に静脈内投与したマ
ウス）にそれぞれ静脈内投与し、さらにＩＬ−２（３万
ＪＲＵ）を１日２回、計４日間腹腔内投与した。これら
の抗腫瘍効果を無処置群およびＩＬ−２のみを単独投与
した場合と比較して、その肺転移数により評価し、表１
にまとめた。
様にして調製された無処置マウス由来の活性化Ｔ細胞お
よびＭＣＡ（3-methylcholanthrene-induced sarcoma）
担癌マウス由来の活性化Ｔ細胞１×107 個を肺転移腫瘍
モデル（Ｂ１６メラノーマを３日前に静脈内投与したマ
ウス）にそれぞれ静脈内投与し、さらにＩＬ−２（３万
ＪＲＵ）を１日２回、計４日間腹腔内投与した。これら
の抗腫瘍効果を無処置群およびＩＬ−２のみを単独投与
した場合と比較して、その肺転移数により評価し、表１
にまとめた。
【００２８】
【表１】
【００２９】さらに、生存率による評価実験によれば、
Ｂ１６メラノーマ担癌マウス由来の活性化Ｔ細胞を投与
した群では、１例の死亡例もなく、抗腫瘍効果を示し
た。この効果は腫瘍特異的であった。一方、無処置のマ
ウスは、約35日で全例が死亡した。
Ｂ１６メラノーマ担癌マウス由来の活性化Ｔ細胞を投与
した群では、１例の死亡例もなく、抗腫瘍効果を示し
た。この効果は腫瘍特異的であった。一方、無処置のマ
ウスは、約35日で全例が死亡した。
【００３０】実験例２ Ｂ１６メラノーマ担癌マウスの癌部周辺にピシバニール
を投与した場合、および投与しない場合について、腫瘍
局所リンパ節細胞をそれぞれ回収し、実施例４の手法に
準じて、それぞれ活性化Ｔ細胞を培養、増殖させた。こ
のようにして調製された活性化Ｔ細胞を用いて、実験例
１と同様にして、ＩＬ−２を併用しない場合、およびＩ
Ｌ−２（１万ＪＲＵ）を１日２回、計４日間併用した場
合の効果をその肺転移数により評価し、表２にまとめ
た。
を投与した場合、および投与しない場合について、腫瘍
局所リンパ節細胞をそれぞれ回収し、実施例４の手法に
準じて、それぞれ活性化Ｔ細胞を培養、増殖させた。こ
のようにして調製された活性化Ｔ細胞を用いて、実験例
１と同様にして、ＩＬ−２を併用しない場合、およびＩ
Ｌ−２（１万ＪＲＵ）を１日２回、計４日間併用した場
合の効果をその肺転移数により評価し、表２にまとめ
た。
【００３１】
【表２】
【００３２】その結果、ＩＬ−２を併用せずにＢ１６メ
ラノーマ担癌マウス由来の活性化Ｔ細胞を投与した群で
は、７匹中５匹が完全治癒し、２匹に極小の肺転移が数
個認められた。一方、ＩＬ−２を併用してＢ１６メラノ
ーマ担癌マウス由来の活性化Ｔ細胞を投与した群では、
７匹全例が完全治癒し、ＩＬ−２を併用しない場合に比
して、さらに顕著な抗腫瘍効果を示した。
ラノーマ担癌マウス由来の活性化Ｔ細胞を投与した群で
は、７匹中５匹が完全治癒し、２匹に極小の肺転移が数
個認められた。一方、ＩＬ−２を併用してＢ１６メラノ
ーマ担癌マウス由来の活性化Ｔ細胞を投与した群では、
７匹全例が完全治癒し、ＩＬ−２を併用しない場合に比
して、さらに顕著な抗腫瘍効果を示した。
【００３３】実験例３ Ｂａｌｂ／ｃマウスに抗原としてＤＮＰ−ＫＬＨ（dini
tro phenol-keyhole limpet hemocyanin）４μｇおよび
水酸化アルミニウム４mgを腹腔内投与し、アレルギー状
態（ＩｇＥ産生を示す。）にした。そのマウスの脾臓細
胞２×105 個／mlを抗ＣＤ３モノクローナル抗体（１μ
ｇ／ml）と大腸菌由来のＬＰＳで２日間刺激したＢ細胞
（６×105 個／ml）とを用いて、37℃で２日間培養する
ことにより刺激した。さらに、ＩＬ−２（50ＪＲＵ／m
l）およびＩＬ−１２（100 Ｕ／ml）を添加して、37℃
で４〜５日間培養を続けた。その結果、Ｔ細胞は総数15
0 ×105 個／mlに増殖し、その内訳はＣＤ４+ Ｔ細胞が
90％であり、ＣＤ８+ Ｔ細胞が10％であった。
tro phenol-keyhole limpet hemocyanin）４μｇおよび
水酸化アルミニウム４mgを腹腔内投与し、アレルギー状
態（ＩｇＥ産生を示す。）にした。そのマウスの脾臓細
胞２×105 個／mlを抗ＣＤ３モノクローナル抗体（１μ
ｇ／ml）と大腸菌由来のＬＰＳで２日間刺激したＢ細胞
（６×105 個／ml）とを用いて、37℃で２日間培養する
ことにより刺激した。さらに、ＩＬ−２（50ＪＲＵ／m
l）およびＩＬ−１２（100 Ｕ／ml）を添加して、37℃
で４〜５日間培養を続けた。その結果、Ｔ細胞は総数15
0 ×105 個／mlに増殖し、その内訳はＣＤ４+ Ｔ細胞が
90％であり、ＣＤ８+ Ｔ細胞が10％であった。
【００３４】こうして調製された活性化Ｔ細胞を上記の
アレルギー状態にある他のマウスにＩＬ−１２（1,000
〜１万Ｕ）とともに静脈内投与したところ、アレルギー
状態が緩和された。
アレルギー状態にある他のマウスにＩＬ−１２（1,000
〜１万Ｕ）とともに静脈内投与したところ、アレルギー
状態が緩和された。
【００３５】実施例５ 900 mlの水に下記のものを溶解させ、１Ｎ水酸化ナトリ
ウムでｐＨ7.0 に調整した後、0.22μｍのフィルターで
濾過することによって、活性化Ｔ細胞製造用培地を調製
した。
ウムでｐＨ7.0 に調整した後、0.22μｍのフィルターで
濾過することによって、活性化Ｔ細胞製造用培地を調製
した。
【００３６】 粉末ＲＰＭＩ 1640 10.4ｇ 炭酸水素ナトリウム 2.0ｇ ペニシリンＧ 1.25×105 Ｕ ストレプトマイシン 125mg ＨＥＰＥＳ 5.0ｇ インシュリン（ブタ） 10mg トランスフェリン（ヒト） 10mg フェツイン（ウシ） 10mg Ｏ−フォスホリルエタノールアミン 10mg 亜セレン酸ナトリウム 1.73×10-3mg ２−メルカプトエタノール 78.1×10-5mg カタラーゼ（ウシ） 30mg コルチコステロン 3.46×10-2mg 抗ＣＤ３モノクローナル抗体 １mg ＬＰＳ刺激Ｂ細胞 ２×108 個 ＩＬ−２ 20,000ＪＲＵ
【００３７】
【発明の効果】以上説明したように、本発明の活性化Ｔ
細胞の製造法によれば、例えばＣＤ４ + 、ＣＤ８+ （活
性化）Ｔ細胞などの活性化Ｔ細胞を効率よく、しかも大
量に製造することができる。
細胞の製造法によれば、例えばＣＤ４ + 、ＣＤ８+ （活
性化）Ｔ細胞などの活性化Ｔ細胞を効率よく、しかも大
量に製造することができる。
【００３８】また、本発明の活性化Ｔ細胞製造用培地
は、本発明の製造法を行うに好適な培地である。
は、本発明の製造法を行うに好適な培地である。
【００３９】したがって、本発明の完成により、活性化
Ｔ細胞を利用した療法の臨床への応用の途が開けたこと
になる。すなわち、該療法による感染防御、抗アレルギ
ー、癌転移抑制、癌療法補助としての利用が大いに期待
できる。
Ｔ細胞を利用した療法の臨床への応用の途が開けたこと
になる。すなわち、該療法による感染防御、抗アレルギ
ー、癌転移抑制、癌療法補助としての利用が大いに期待
できる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 35/26 ＡＤＵ 35/28 7431−4Ｃ
Claims (7)
- 【請求項１】 抗ＣＤ３抗体、ＬＰＳ刺激Ｂ細胞および
リンホカインの存在下で、リンパ球を培養することを特
徴とする活性化Ｔ細胞の製造法。 - 【請求項２】 リンパ球が、腫瘍局所リンパ節細胞であ
る請求項１記載の製造法。 - 【請求項３】 リンホカインが、ＩＬ−２、ＩＬ−１２
およびＩＦＮ−γから選ばれる少なくとも一種である請
求項１または２記載の製造法。 - 【請求項４】 抗ＣＤ３抗体およびＬＰＳ刺激Ｂ細胞の
存在下でリンパ球を培養した後、リンホカインの存在下
で培養する請求項１〜３記載の製造法。 - 【請求項５】 104 〜106 個／mlのリンパ球に対して、
0.1 〜1,000 μｇ／mlの抗ＣＤ３抗体と、104 〜108 個
／mlのＬＰＳ刺激Ｂ細胞とを併用し、10〜1,000 ＪＲＵ
／mlのＩＬ−２、0.1 〜1,000 Ｕ／mlのＩＬ−１２およ
び0.1 〜1,000 ＩＵ／mlのＩＦＮ−γから選ばれる少な
くとも一種を用いる請求項１〜４記載の製造法。 - 【請求項６】 抗ＣＤ３抗体、ＬＰＳ刺激Ｂ細胞および
リンホカインを含有することを特徴とする活性化Ｔ細胞
製造用培地。 - 【請求項７】 0.1 〜1,000 μｇ／mlの抗ＣＤ３抗体
と、104 〜108 個／mlのＬＰＳ刺激Ｂ細胞とを含み、10
〜1,000 ＪＲＵ／mlのＩＬ−２、0.1 〜1,000Ｕ／mlの
ＩＬ−１２および0.1 〜1,000 ＩＵ／mlのＩＦＮ−γか
ら選ばれる少なくとも一種のリンホカインを含有する請
求項６記載の培地。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6033884A JPH07236474A (ja) | 1994-03-03 | 1994-03-03 | 活性化ｔ細胞の製造法およびそのための培地 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6033884A JPH07236474A (ja) | 1994-03-03 | 1994-03-03 | 活性化ｔ細胞の製造法およびそのための培地 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07236474A true JPH07236474A (ja) | 1995-09-12 |
Family
ID=12398957
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6033884A Pending JPH07236474A (ja) | 1994-03-03 | 1994-03-03 | 活性化ｔ細胞の製造法およびそのための培地 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07236474A (ja) |
-
1994
- 1994-03-03 JP JP6033884A patent/JPH07236474A/ja active Pending
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050329 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20050726 |