JPH07233198A - ガラニン - Google Patents
ガラニンInfo
- Publication number
- JPH07233198A JPH07233198A JP6023846A JP2384694A JPH07233198A JP H07233198 A JPH07233198 A JP H07233198A JP 6023846 A JP6023846 A JP 6023846A JP 2384694 A JP2384694 A JP 2384694A JP H07233198 A JPH07233198 A JP H07233198A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- galanin
- inhibitory effect
- hormone secretion
- supernatant
- ala
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
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- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 下記式に記載の一次構造を有するガラニン；
【化１】
ただし、上記式において、−Ala29 は、
【化２】
を示す。
【効果】本発明のガラニンは、研究用基質として重要で
あるとともに、ホルモン分泌抑制作用、下垂体ホルモン
分泌亢進作用、平滑筋収縮抑制作用等の生理活性が期待
され、医薬品等への応用展開が考えられる。
あるとともに、ホルモン分泌抑制作用、下垂体ホルモン
分泌亢進作用、平滑筋収縮抑制作用等の生理活性が期待
され、医薬品等への応用展開が考えられる。
Description
【０００１】
【発明の技術分野】本発明は、新規ガラニンに関する。
【０００２】
【従来の技術】ガラニンは、１９８３年にTatemotoら
（FEBS Lett., 1983; 164; 124-128）によりブタ上部小
腸より単離された２９アミノ酸残基よりなるポリペプチ
ドであり、更に、その組織内分布が検討され、中枢およ
び抹消神経に広く分布する神経ペプチドであることが明
らかにされている。その後、ラット、牛、人のガラニン
の一次構造も明らかにされた。
（FEBS Lett., 1983; 164; 124-128）によりブタ上部小
腸より単離された２９アミノ酸残基よりなるポリペプチ
ドであり、更に、その組織内分布が検討され、中枢およ
び抹消神経に広く分布する神経ペプチドであることが明
らかにされている。その後、ラット、牛、人のガラニン
の一次構造も明らかにされた。
【０００３】ガラニンの作用については、中枢神経系、
視床下部−下垂体、腸管、膵、胃などに対する種々の作
用が報告されている〔矢内原ら、「日本内分泌学会雑
誌」、第６８巻、第７号、第６３７〜６５７頁（１９９
２）〕。その作用として中枢では成長ホルモン分泌亢進
作用、プラクチン分泌亢進作用、単シナップス反射抑制
作用、侵害反射抑制作用等が知られ、また末梢では膵イ
ンスリン分泌抑制作用および腸管運動、筋トーヌスの調
節に関与しているものと報告されている。
視床下部−下垂体、腸管、膵、胃などに対する種々の作
用が報告されている〔矢内原ら、「日本内分泌学会雑
誌」、第６８巻、第７号、第６３７〜６５７頁（１９９
２）〕。その作用として中枢では成長ホルモン分泌亢進
作用、プラクチン分泌亢進作用、単シナップス反射抑制
作用、侵害反射抑制作用等が知られ、また末梢では膵イ
ンスリン分泌抑制作用および腸管運動、筋トーヌスの調
節に関与しているものと報告されている。
【０００４】また、最近の学説によれば、ガラニンはア
ルツハイマー型痴呆症の発症とも密接な関係があると示
唆されている。近年、ガラニン、そのアナログおよびフ
ラグメントが、種々の生理活性を有することから、医学
的、薬学的研究の対象となっている。また、これらの研
究結果に基づき、ガラニンの医薬品分野への応用展開が
期待されている。
ルツハイマー型痴呆症の発症とも密接な関係があると示
唆されている。近年、ガラニン、そのアナログおよびフ
ラグメントが、種々の生理活性を有することから、医学
的、薬学的研究の対象となっている。また、これらの研
究結果に基づき、ガラニンの医薬品分野への応用展開が
期待されている。
【０００５】したがって、今後さらに、新規ガラニンの
提供、ならびにその生理作用を解明する研究が重要とな
る。
提供、ならびにその生理作用を解明する研究が重要とな
る。
【０００６】
【発明の目的】本発明は、上記のような従来技術に鑑み
てなされたものであって、新規構造のガラニンを提供す
ることを目的としている。
てなされたものであって、新規構造のガラニンを提供す
ることを目的としている。
【０００７】
【発明の概要】本発明に係る新規ガラニンは、下記式に
記載の一次構造（アミノ酸配列）を有するガラニンであ
る。
記載の一次構造（アミノ酸配列）を有するガラニンであ
る。
【０００８】
【化３】
【０００９】ただし、上記式において、−Ala29 は、
【００１０】
【化４】
【００１１】を示す。
【００１２】
【発明の具体的説明】以下、本発明をさらに具体的に説
明する。本発明に係る新規ガラニンは、前記したような
アミノ酸配列を有するペプチドである。本発明のガラニ
ンは、キハダマグロの脳下垂体から抽出して得ることも
できるし、また化学的手法により合成することもでき
る。さらに本発明のガラニンは、当業界における汎用の
手法あるいはこれらの類法により得られるガラニンをも
包含する。
明する。本発明に係る新規ガラニンは、前記したような
アミノ酸配列を有するペプチドである。本発明のガラニ
ンは、キハダマグロの脳下垂体から抽出して得ることも
できるし、また化学的手法により合成することもでき
る。さらに本発明のガラニンは、当業界における汎用の
手法あるいはこれらの類法により得られるガラニンをも
包含する。
【００１３】
【実施例】以下、本発明のガラニンを実施例に基づい
て、さらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例
に限定されるものではない。
て、さらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例
に限定されるものではない。
【００１４】
【実施例１】
【００１５】
［組織材料］キハダマグロ（Albacore : Yellowfin tun
a, すずき目さば科）頭部凍結品を東洋冷蔵（株）より
購入後、脳下垂体を摘出し材料とした。 ［組織の抽出］脳下垂体１８０ｇ（2000匹相当）に蒸留
水５００mlを加え、沸騰水浴上１０分間煮沸した。氷冷
後、phenylmethanesulfonylfluoride（Sigma 社、St. L
ouis,Mo, USA）およびペプスタチンＡ（Sigma 社、St.
Louis, Mo, USA）をそれぞれ１０μｌ／ml含有３Ｍ酢酸
を５００ml加え、ミキサーにて１０分間ホモジナイズし
た。ホモジネートを遠心分離（5000rpm, 30 分、４℃）
し、上清を得た。沈殿物に２００mlの１．５Ｍ酢酸を加
え攪拌後、再度遠心分離し、得られた上清を先の上清と
合わせ凍結乾燥した。凍結乾燥品に、石油エーテル：エ
ーテル（２：１）の混合溶液を添加し、脂溶成分を抽出
除去後、減圧乾燥して粗抽出物６．５ｇを得た。この操
作を繰り返し、マグロ脳下垂体６７０ｇ（8000匹）から
粗抽出物２５ｇを得た。なお、抽出操作は煮沸処理以外
すべて４℃または氷冷下で行った。 ［粗抽出物からのガラニンの単離］ガラニンの単離を図
１に示す方法で行った。
a, すずき目さば科）頭部凍結品を東洋冷蔵（株）より
購入後、脳下垂体を摘出し材料とした。 ［組織の抽出］脳下垂体１８０ｇ（2000匹相当）に蒸留
水５００mlを加え、沸騰水浴上１０分間煮沸した。氷冷
後、phenylmethanesulfonylfluoride（Sigma 社、St. L
ouis,Mo, USA）およびペプスタチンＡ（Sigma 社、St.
Louis, Mo, USA）をそれぞれ１０μｌ／ml含有３Ｍ酢酸
を５００ml加え、ミキサーにて１０分間ホモジナイズし
た。ホモジネートを遠心分離（5000rpm, 30 分、４℃）
し、上清を得た。沈殿物に２００mlの１．５Ｍ酢酸を加
え攪拌後、再度遠心分離し、得られた上清を先の上清と
合わせ凍結乾燥した。凍結乾燥品に、石油エーテル：エ
ーテル（２：１）の混合溶液を添加し、脂溶成分を抽出
除去後、減圧乾燥して粗抽出物６．５ｇを得た。この操
作を繰り返し、マグロ脳下垂体６７０ｇ（8000匹）から
粗抽出物２５ｇを得た。なお、抽出操作は煮沸処理以外
すべて４℃または氷冷下で行った。 ［粗抽出物からのガラニンの単離］ガラニンの単離を図
１に示す方法で行った。
【００１６】各精製段階において、ガラニンの検索は、
哺乳類のガラニンにおいて共通の構造であるガラニン
（１−１５）配列に特異的な抗血清（R-0672）を用いる
ラジオイムノアッセイ系により行った。
哺乳類のガラニンにおいて共通の構造であるガラニン
（１−１５）配列に特異的な抗血清（R-0672）を用いる
ラジオイムノアッセイ系により行った。
【００１７】すなわち、まず、第１工程では、マグロ脳
下垂体粗抽出物を０．０２％エタンチオール含有３Ｍ酢
酸を溶出液とするSephadex G-50 fineカラムを用いてゲ
ルろ過した。１０ml毎に分取した各画分中のガラニン様
免疫活性をガラニン（１−１５）特異ＲＩＡで検索した
結果、画分７１から１１５に免疫活性が検出され、この
画分を集めて凍結乾燥し、つぎの精製段階（第２工程）
の試料とした。第２工程では、第１工程で得られた画分
を０．０１Ｎ ＨＣｌに溶解後waters RCMカラムに添加
した。アセトニトリルの濃度を０．０１Ｎ塩酸中０，２
０，４０，６０，８０，１００％とした溶出液をそれぞ
れ１００ml用いて溶出し、溶出液中の免疫活性ガラニン
を測定した結果、２０％アセトニトリル溶液中に高濃度
の免疫活性ガラニンが認められたため、この画分を凍結
乾燥し、第３工程に供した。第３工程ではＣＭ−５２カ
ラムを用いる陽イオン交換クロマトグラフィーによる精
製を行った。すなわち、０．０１Ｍ重炭酸アンモニウム
緩衝液２００mlに第２工程で得られた試料を溶解後カラ
ムに添加し、重炭酸アンモニウム緩衝液の濃度を０．０
１Ｍから０．１Ｍに変化させる直線濃度勾配法で溶出
し、免疫活性ガラニンを含む画分８４から９１を集め凍
結乾燥した。第４工程では、先の試料を０．０２％エタ
ンチオール含有３Ｍ酢酸を溶出液とするSephadex G-50
superfine カラムによるゲルろ過で脱塩し、ガラニン免
疫活性を含む画分４５から５２を集め凍結乾燥した。
下垂体粗抽出物を０．０２％エタンチオール含有３Ｍ酢
酸を溶出液とするSephadex G-50 fineカラムを用いてゲ
ルろ過した。１０ml毎に分取した各画分中のガラニン様
免疫活性をガラニン（１−１５）特異ＲＩＡで検索した
結果、画分７１から１１５に免疫活性が検出され、この
画分を集めて凍結乾燥し、つぎの精製段階（第２工程）
の試料とした。第２工程では、第１工程で得られた画分
を０．０１Ｎ ＨＣｌに溶解後waters RCMカラムに添加
した。アセトニトリルの濃度を０．０１Ｎ塩酸中０，２
０，４０，６０，８０，１００％とした溶出液をそれぞ
れ１００ml用いて溶出し、溶出液中の免疫活性ガラニン
を測定した結果、２０％アセトニトリル溶液中に高濃度
の免疫活性ガラニンが認められたため、この画分を凍結
乾燥し、第３工程に供した。第３工程ではＣＭ−５２カ
ラムを用いる陽イオン交換クロマトグラフィーによる精
製を行った。すなわち、０．０１Ｍ重炭酸アンモニウム
緩衝液２００mlに第２工程で得られた試料を溶解後カラ
ムに添加し、重炭酸アンモニウム緩衝液の濃度を０．０
１Ｍから０．１Ｍに変化させる直線濃度勾配法で溶出
し、免疫活性ガラニンを含む画分８４から９１を集め凍
結乾燥した。第４工程では、先の試料を０．０２％エタ
ンチオール含有３Ｍ酢酸を溶出液とするSephadex G-50
superfine カラムによるゲルろ過で脱塩し、ガラニン免
疫活性を含む画分４５から５２を集め凍結乾燥した。
【００１８】この試料を４段階の逆相ＨＰＬＣにて精製
した。まず、Ｄ−ＯＤＳ−５（２×２５cm）カラムを用
い、５０分で０．０１Ｎ ＨＣｌとＣＨ3ＣＮの混合比
を１００：０から５０：５０に変化させる直線濃度勾配
法で溶出するＨＰＬＣにより精製し、免疫活性を含む画
分７２を得た。ついでこの画分をＲ−ＯＤＳ−５（０．
４６×２５cm）カラムを用い、溶出法として６０分で
０．０１Ｎ ＨＣｌとＣＨ3ＣＮの混合比を９０：１０
から６０：４０に変化させる直線濃度勾配法によるＨＰ
ＬＣを行った。画分８６，８７を集め凍結乾燥した後、
TSK-Gel 80TM（０．４６×１５cm）カラムに添加し、
０．１％ＴＦＡ−ＣＨ3ＣＮ系の混合溶媒により溶出す
るＨＰＬＣを行い、単一の免疫活性成分を得た。なお溶
出条件は、０．１％ＴＦＡとＣＨ3ＣＮ−１％ＴＦＡ
（９：１）の比を５分間で９０：１０から８０：２０に
変化させた後、さらに３０分間で６０：４０に変化させ
たものである。最終精製はTSK-Gel 80TM（０．４６×１
５cm）カラムを用い、５分間で０．１％ＴＦＡとＣＨ3
ＣＮ−１％ＴＦＡ（９：１）の比を７２：２８から６
７：３３に変化させた後、さらに３０分間で６０：４０
に変化させる直線濃度勾配法で溶出するＨＰＬＣで行っ
た。その結果２５分に溶出する単一ピーク成分を得た。
した。まず、Ｄ−ＯＤＳ−５（２×２５cm）カラムを用
い、５０分で０．０１Ｎ ＨＣｌとＣＨ3ＣＮの混合比
を１００：０から５０：５０に変化させる直線濃度勾配
法で溶出するＨＰＬＣにより精製し、免疫活性を含む画
分７２を得た。ついでこの画分をＲ−ＯＤＳ−５（０．
４６×２５cm）カラムを用い、溶出法として６０分で
０．０１Ｎ ＨＣｌとＣＨ3ＣＮの混合比を９０：１０
から６０：４０に変化させる直線濃度勾配法によるＨＰ
ＬＣを行った。画分８６，８７を集め凍結乾燥した後、
TSK-Gel 80TM（０．４６×１５cm）カラムに添加し、
０．１％ＴＦＡ−ＣＨ3ＣＮ系の混合溶媒により溶出す
るＨＰＬＣを行い、単一の免疫活性成分を得た。なお溶
出条件は、０．１％ＴＦＡとＣＨ3ＣＮ−１％ＴＦＡ
（９：１）の比を５分間で９０：１０から８０：２０に
変化させた後、さらに３０分間で６０：４０に変化させ
たものである。最終精製はTSK-Gel 80TM（０．４６×１
５cm）カラムを用い、５分間で０．１％ＴＦＡとＣＨ3
ＣＮ−１％ＴＦＡ（９：１）の比を７２：２８から６
７：３３に変化させた後、さらに３０分間で６０：４０
に変化させる直線濃度勾配法で溶出するＨＰＬＣで行っ
た。その結果２５分に溶出する単一ピーク成分を得た。
【００１９】この成分の一次構造を気相プロテインシー
クエンサー（Simazu）により解析した。その結果、H-Gl
y-Trp-Thr-Leu-Asn-Ala-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-
His-Gly-Ile-Asp-Gly-His-Arg-Thr-Leu-Gly-Asp-Lys-Pr
o-Gly-Leu-Ala であることが判明したが、Ｃ末端構造は
他のガラニン同様アミド構造であるか否かは不明であっ
た。そこで、トリプシン分解により得られることが予想
されるH-Pro-Gly-Leu-Ala 配列ペプチドのＣ末端がアミ
ド型のH-Pro-Gly-Leu-Ala-NH2 およびＣ末端がカルボキ
シ型のH-Pro-Gly-Leu-Ala-OHを化学合成し、両ペプチド
と本願ガラニンのトリプシン分解物をＨＰＬＣで比較検
討した結果、本願ガラニンはＣ末端アミド型であること
を同定した。ここにガラニンの一次構造が後記する配列
表に記載の構造であることを明らかにした。
クエンサー（Simazu）により解析した。その結果、H-Gl
y-Trp-Thr-Leu-Asn-Ala-Ala-Gly-Tyr-Leu-Leu-Gly-Pro-
His-Gly-Ile-Asp-Gly-His-Arg-Thr-Leu-Gly-Asp-Lys-Pr
o-Gly-Leu-Ala であることが判明したが、Ｃ末端構造は
他のガラニン同様アミド構造であるか否かは不明であっ
た。そこで、トリプシン分解により得られることが予想
されるH-Pro-Gly-Leu-Ala 配列ペプチドのＣ末端がアミ
ド型のH-Pro-Gly-Leu-Ala-NH2 およびＣ末端がカルボキ
シ型のH-Pro-Gly-Leu-Ala-OHを化学合成し、両ペプチド
と本願ガラニンのトリプシン分解物をＨＰＬＣで比較検
討した結果、本願ガラニンはＣ末端アミド型であること
を同定した。ここにガラニンの一次構造が後記する配列
表に記載の構造であることを明らかにした。
【００２０】
【実施例２】
【００２１】
【本願ガラニンの化学合成】以下の装置、試薬を用い
た。 装置：Beckman 990 樹脂：Methyl Benzhydryl amine (MBHA)樹脂 (-NH2含
量: 0.64 mmol/g. 0.78g) カップリング剤：ＢＯＰ試薬 脱保護剤： 50 ％ TFA/CH2Cl2 中和剤： 10 ％ Diisopropylethyl amine/CH2Cl2 カップリング溶媒：CH2Cl2-DMF Boc アミノ酸誘導体：Boc-Ala-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gl
y-OH, Boc-Pro-OH, Boc-Lys(CI-Z)-OH, Boc-Asp(OcHex)
-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH,
Boc-His(Bom)-OH, Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH, Boc-Trp(CH
O)-OH この結果、保護ガラニン樹脂 920 mg を得た。
た。 装置：Beckman 990 樹脂：Methyl Benzhydryl amine (MBHA)樹脂 (-NH2含
量: 0.64 mmol/g. 0.78g) カップリング剤：ＢＯＰ試薬 脱保護剤： 50 ％ TFA/CH2Cl2 中和剤： 10 ％ Diisopropylethyl amine/CH2Cl2 カップリング溶媒：CH2Cl2-DMF Boc アミノ酸誘導体：Boc-Ala-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gl
y-OH, Boc-Pro-OH, Boc-Lys(CI-Z)-OH, Boc-Asp(OcHex)
-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Arg(Tos)-OH,
Boc-His(Bom)-OH, Boc-Tyr(Cl2-Bzl)-OH, Boc-Trp(CH
O)-OH この結果、保護ガラニン樹脂 920 mg を得た。
【００２２】次いで得られた保護ガラニン樹脂を、図２
に記載のフローチャートにしたがって処理し、粗精製物
349.1 mg を得た。粗生成物 150 mg を図３に記載のフ
ローチャートにしたがって処理し、精製物 36.4 mgを得
た。
に記載のフローチャートにしたがって処理し、粗精製物
349.1 mg を得た。粗生成物 150 mg を図３に記載のフ
ローチャートにしたがって処理し、精製物 36.4 mgを得
た。
【００２３】
（1%フェノールおよびメルカプトエタノール含有６Ｎ塩
酸、110 ℃、24時間） Asp(3)2.81, Thr(2)1.89, Gly(6)6.40, Ala(3)3.10, Il
e(1)1.01, Leu(5)4.89,Tyr(1)1.04, Trp(1)0.77, Lys
(2)1.85, His(2)2.14, Arg(1)0.95, Pro(2)1.93 〔AP-M digest 中のアミノ酸比〕Asp(2)1.85, Thr(2)1.
88, Asn(1)1.03, Gly(5)5.25, Ala(3)3.19, Ile(1)0.8
6,Leu(5)4.70, Tyr(1)0.95, Trp(1)1.07, His(2)2.20,
Arg(1)0.93 〔HPLC保持時間〕下記の条件でHPLC保持時間を測定し
た。 カラム：YMC Pack R-ODS-5, 0.46 x 25 cm. 溶出液：0.01 N HCl/CH3CN, 80/20 → 60/40, v/v, 30
分 検出：210 nm 流速：1.0 ml/分 HPLC保持時間は１４．２分であった。 〔TLC のRf値〕Kieselgel ６０（DC-Plastikfolien, ME
RCK 社）を用いた薄膜クロマトグラフィーでＲｆ値を測
定した。結果は下記のとおり。
酸、110 ℃、24時間） Asp(3)2.81, Thr(2)1.89, Gly(6)6.40, Ala(3)3.10, Il
e(1)1.01, Leu(5)4.89,Tyr(1)1.04, Trp(1)0.77, Lys
(2)1.85, His(2)2.14, Arg(1)0.95, Pro(2)1.93 〔AP-M digest 中のアミノ酸比〕Asp(2)1.85, Thr(2)1.
88, Asn(1)1.03, Gly(5)5.25, Ala(3)3.19, Ile(1)0.8
6,Leu(5)4.70, Tyr(1)0.95, Trp(1)1.07, His(2)2.20,
Arg(1)0.93 〔HPLC保持時間〕下記の条件でHPLC保持時間を測定し
た。 カラム：YMC Pack R-ODS-5, 0.46 x 25 cm. 溶出液：0.01 N HCl/CH3CN, 80/20 → 60/40, v/v, 30
分 検出：210 nm 流速：1.0 ml/分 HPLC保持時間は１４．２分であった。 〔TLC のRf値〕Kieselgel ６０（DC-Plastikfolien, ME
RCK 社）を用いた薄膜クロマトグラフィーでＲｆ値を測
定した。結果は下記のとおり。
【００２４】 ＲｆI ：0.14（n-BuOH:AcOH:H2O = 4:1:5,上相） ＲｆII ：0.38（n-BuOH:ピリジン:AcOH:H2O = 15:10:
3:12） ＲｆIII ：0.19（n-BuOH:ピリジン:蟻酸:H2O = 20:12:
3:10） 〔比旋光度〕比旋光度は以下のとおりであった。 〔α〕20 D ：５３．８°（C＝0.1, 1M AcOH)
3:12） ＲｆIII ：0.19（n-BuOH:ピリジン:蟻酸:H2O = 20:12:
3:10） 〔比旋光度〕比旋光度は以下のとおりであった。 〔α〕20 D ：５３．８°（C＝0.1, 1M AcOH)
【００２５】
１．ラット海馬細胞膜を用いるレセプターアッセイ 1-1 ラット海馬細胞膜の調製 ウイスター系雄性ラット(200g)の海馬組織を摘出し、10
倍量のTris-HCl (pH 7.4) を加え、氷冷下ホモジナイザ
ーでホモジナイズした。ホモジネート50,000gを 28000
rpm、４℃で２０分遠心分離後、沈渣を再度ホモジナイ
ズし、先と同一条件で遠心分離を行い得られる沈渣をラ
ット海馬細胞膜標本とした。 1-2 ラジオレセプターアッセイ 1-1 で調製したラット海馬細胞膜標本(200μg protein/
200μl)にincubationbuffer (50mM Tris buffer contai
ning 5mM MgCl2, 5mM KCl, 10mM NaCl, 1mM EDTA 0.4%
BSA および 0.05% バシトラシン)100μl を加え25℃で
15分pre-incubationの後、 125Ｉ−ラットガラニン(10,
000 cpm)および各用量の合成ガラニンまたはラットガラ
ニンを加え、25℃で１時間incubationした。吸引濾過
後、濾紙上の放射活性をガンマーカウンターにて測定し
た。その結果、本願ガラニンは、ラットガラニンに比
し、用量反応的に 125Ｉ−ラットガラニンの海馬細胞膜
に存在する受容体への結合を阻害した。図４に結果を示
す。 ２．ヒト肺小細胞癌培養細胞膜を用いるラジオレセプタ
ーアッセイ 2-1 ヒト肺小細胞癌培養細胞膜画分の調製 ヒト肺小細胞癌培養細胞（SBC-3A）に 0.05%トリプシン
/1mM EDTA を加え細胞を分散させた後、１tube当たり10
6 cellとなるように調製した。5 mM HEPES (pH7.4) 低
張緩衝液を加え、20,000g で４℃、20分、遠心分離後、
沈渣にincubation buffer (1-2で使用したものと同一の
もの) を加え、ホモジナイズ後106 cell/200μl となる
ように分注した。 2-2 ラジオレセプターアッセイ 2-1 で調製したヒト肺小細胞癌培養細胞膜画分、 125Ｉ
−ヒトガラニン、ヒトガラニンおよび本願ガラニンを用
い、2-2 と同様の方法で行った。
倍量のTris-HCl (pH 7.4) を加え、氷冷下ホモジナイザ
ーでホモジナイズした。ホモジネート50,000gを 28000
rpm、４℃で２０分遠心分離後、沈渣を再度ホモジナイ
ズし、先と同一条件で遠心分離を行い得られる沈渣をラ
ット海馬細胞膜標本とした。 1-2 ラジオレセプターアッセイ 1-1 で調製したラット海馬細胞膜標本(200μg protein/
200μl)にincubationbuffer (50mM Tris buffer contai
ning 5mM MgCl2, 5mM KCl, 10mM NaCl, 1mM EDTA 0.4%
BSA および 0.05% バシトラシン)100μl を加え25℃で
15分pre-incubationの後、 125Ｉ−ラットガラニン(10,
000 cpm)および各用量の合成ガラニンまたはラットガラ
ニンを加え、25℃で１時間incubationした。吸引濾過
後、濾紙上の放射活性をガンマーカウンターにて測定し
た。その結果、本願ガラニンは、ラットガラニンに比
し、用量反応的に 125Ｉ−ラットガラニンの海馬細胞膜
に存在する受容体への結合を阻害した。図４に結果を示
す。 ２．ヒト肺小細胞癌培養細胞膜を用いるラジオレセプタ
ーアッセイ 2-1 ヒト肺小細胞癌培養細胞膜画分の調製 ヒト肺小細胞癌培養細胞（SBC-3A）に 0.05%トリプシン
/1mM EDTA を加え細胞を分散させた後、１tube当たり10
6 cellとなるように調製した。5 mM HEPES (pH7.4) 低
張緩衝液を加え、20,000g で４℃、20分、遠心分離後、
沈渣にincubation buffer (1-2で使用したものと同一の
もの) を加え、ホモジナイズ後106 cell/200μl となる
ように分注した。 2-2 ラジオレセプターアッセイ 2-1 で調製したヒト肺小細胞癌培養細胞膜画分、 125Ｉ
−ヒトガラニン、ヒトガラニンおよび本願ガラニンを用
い、2-2 と同様の方法で行った。
【００２６】その結果、10-9M から10-6M において本願
ガラニンは、用量依存的に 125Ｉ−ヒトガラニンの膜画
分中のガラニン受容体への結合を阻害した。図５に結果
を示す。
ガラニンは、用量依存的に 125Ｉ−ヒトガラニンの膜画
分中のガラニン受容体への結合を阻害した。図５に結果
を示す。
【００２７】
【発明の効果】本発明のガラニンは、既知ガラニンと同
様に研究用基質として重要であるとともに、ホルモン分
泌抑制作用、下垂体ホルモン分泌亢進作用、平滑筋収縮
抑制作用等の生理活性が期待され、さらに、ガラニンア
ナログ、ガラニンフラグメントへの生理活性物質および
医薬品としての応用展開が期待される。
様に研究用基質として重要であるとともに、ホルモン分
泌抑制作用、下垂体ホルモン分泌亢進作用、平滑筋収縮
抑制作用等の生理活性が期待され、さらに、ガラニンア
ナログ、ガラニンフラグメントへの生理活性物質および
医薬品としての応用展開が期待される。
【００２８】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：２９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源： 生物名：キハダマグロ（Albacore: Yellowfin tuna、す
ずき目さば科） 組織の種類：脳下垂体 配列の特徴： −Ala29 は、
ずき目さば科） 組織の種類：脳下垂体 配列の特徴： −Ala29 は、
【００２９】
【化５】
【００３０】を示す。 配列 Gly Trp Thr Leu Asn Ala Ala Gly Tyr Leu Leu Gly Pro His Gly Ile 1 5 10 15 Asp Gly His Arg Thr Leu Gly Asp Lys Pro Gly Leu Ala 20 25 29
【図１】 図１は、マグロ脳下垂体からのガラニンの単
離精製工程を示す。
離精製工程を示す。
【図２】 図２は、保護ガラニン樹脂の粗精製工程を示
す。
す。
【図３】 図３は、合成ガラニンの精製工程を示す。
【図４】 図４は、ラット海馬細胞膜を用いるレセプタ
ーアッセイの結果を示す。
ーアッセイの結果を示す。
【図５】 図５は、ヒト肺小細胞癌培養細胞膜を用いた
ラジオレセプターアッセイの結果を示す。
ラジオレセプターアッセイの結果を示す。
Claims (1)
- 【請求項１】 下記式に記載の一次構造を有するガラニ
ン； 【化１】 ただし、上記式において、 −Ala29 は、 【化２】 を示す。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6023846A JPH07233198A (ja) | 1994-02-22 | 1994-02-22 | ガラニン |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6023846A JPH07233198A (ja) | 1994-02-22 | 1994-02-22 | ガラニン |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07233198A true JPH07233198A (ja) | 1995-09-05 |
Family
ID=12121777
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6023846A Pending JPH07233198A (ja) | 1994-02-22 | 1994-02-22 | ガラニン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07233198A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100390529B1 (ko) * | 2000-04-25 | 2003-07-04 | 동원산업 주식회사 | 참치정소로부터 핵산복합물질을 추출하는 방법 및 이방법에 의해 얻어진 핵산복합물질 |
-
1994
- 1994-02-22 JP JP6023846A patent/JPH07233198A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100390529B1 (ko) * | 2000-04-25 | 2003-07-04 | 동원산업 주식회사 | 참치정소로부터 핵산복합물질을 추출하는 방법 및 이방법에 의해 얻어진 핵산복합물질 |
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