JPH07209294A - 新規な ’ｍｅｃＡタンパク質、それをコードするＤＮＡ、およびそれを用いたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出方法 - Google Patents
新規な ’ｍｅｃＡタンパク質、それをコードするＤＮＡ、およびそれを用いたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出方法Info
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- JPH07209294A JPH07209294A JP1222694A JP1222694A JPH07209294A JP H07209294 A JPH07209294 A JP H07209294A JP 1222694 A JP1222694 A JP 1222694A JP 1222694 A JP1222694 A JP 1222694A JP H07209294 A JPH07209294 A JP H07209294A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）
のメチシリン耐性機構を支配する 'ｍｅｃＡタンパク質
を抗原として免疫学的にＭＲＳＡを検出する方法を提供
する。 【構成】 上記 'ｍｅｃＡタンパク質をコ−ドするＤＮ
Ａを合成して、その塩基配列およびそれより推定される
アミノ酸配列を決定した。当該ＤＮＡを用い、組換えＤ
ＮＡ技術により、'ｍｅｃＡタンパク質を産生させ、当
該タンパク質を抗原とする免疫学的反応によりＭＲＳＡ
を検出する。
のメチシリン耐性機構を支配する 'ｍｅｃＡタンパク質
を抗原として免疫学的にＭＲＳＡを検出する方法を提供
する。 【構成】 上記 'ｍｅｃＡタンパク質をコ−ドするＤＮ
Ａを合成して、その塩基配列およびそれより推定される
アミノ酸配列を決定した。当該ＤＮＡを用い、組換えＤ
ＮＡ技術により、'ｍｅｃＡタンパク質を産生させ、当
該タンパク質を抗原とする免疫学的反応によりＭＲＳＡ
を検出する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規な 'ｍｅｃＡタンパ
ク質、それをコードするＤＮＡ、およびそれ用いたメチ
シリン耐性黄色ブドウ球菌の検出方法に関する。詳しく
は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌ
ｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ：以下、「ＭＲＳＡ」と略す）に
おけるメチシリン耐性機構を支配する新規な 'ｍｅｃＡ
タンパク質、およびそれをコードするＤＮＡと、少なく
ともそのＤＮＡを有する組換えベクターにより形質転換
された形質転換体、さらにその形質転換体を培養するこ
とにより当該タンパク質を産生させる方法、そして産生
された当該タンパク質を用いたＭＲＳＡの検出方法に関
する。
ク質、それをコードするＤＮＡ、およびそれ用いたメチ
シリン耐性黄色ブドウ球菌の検出方法に関する。詳しく
は、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌ
ｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ：以下、「ＭＲＳＡ」と略す）に
おけるメチシリン耐性機構を支配する新規な 'ｍｅｃＡ
タンパク質、およびそれをコードするＤＮＡと、少なく
ともそのＤＮＡを有する組換えベクターにより形質転換
された形質転換体、さらにその形質転換体を培養するこ
とにより当該タンパク質を産生させる方法、そして産生
された当該タンパク質を用いたＭＲＳＡの検出方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】近
年、ＭＲＳＡによる院内感染症が社会問題にまで発展し
ている。ＭＲＳＡはペニシリン系、セフェム系等の約２
０種類ものβ−ラクタム系抗生物質に対して耐性を示す
黄色ブドウ球菌で、抗生物質の多用により黄色ブドウ球
菌が行き着いた姿であると考えられている。
年、ＭＲＳＡによる院内感染症が社会問題にまで発展し
ている。ＭＲＳＡはペニシリン系、セフェム系等の約２
０種類ものβ−ラクタム系抗生物質に対して耐性を示す
黄色ブドウ球菌で、抗生物質の多用により黄色ブドウ球
菌が行き着いた姿であると考えられている。
【０００３】１９８０年代の中ごろ、ＭＲＳＡのメチシ
リン耐性機構として、新たなペニシリン結合タンパク質
（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ−ｐｒｏｔｅ
ｉｎ：ＰＢＰｓ）、すなわちＰＢＰ−２’（または２
ａ）と呼ばれる細胞質膜上に存在する酵素タンパク質の
出現にあることが明らかにされた（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ．，１５８，５１３（１９８４）；Ａｎｔｉｍｉｃ
ｒｏｂ．ＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．，２７，８
５１（１９８５））。ＰＢＰｓは、一般に黄色ブドウ球
菌の細胞壁ペプチドグリカン層（ムレイン）の架橋酵素
で、β−ラクタム系抗生物質の標的部位であるといわれ
ている。β−ラクタム系抗生物質はＰＢＰｓに共有結合
することによりＰＢＰｓの酵素活性が失われ、細胞壁合
成が停止して溶菌するため、抗菌作用を示す（Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．，３８，２９１（１９７４））。
ＭＲＳＡにおいては、この標的酵素の代わりに薬剤親和
性の低いＰＢＰ−２’が合成されている。メチシリンの
ようなβ−ラクタム系抗生物質の存在下、ほかのＰＢＰ
ｓは失活するのに対して、ＰＢＰ−２’は薬剤親和性が
低いため失活しない。また、このＰＢＰ−２’はある種
のβ−ラクタム系抗生物質に触れさせると増量する。よ
ってメチシリン耐性の本態はＰＢＰ−２’の誘導的産生
にあるとされている。
リン耐性機構として、新たなペニシリン結合タンパク質
（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ−ｐｒｏｔｅ
ｉｎ：ＰＢＰｓ）、すなわちＰＢＰ−２’（または２
ａ）と呼ばれる細胞質膜上に存在する酵素タンパク質の
出現にあることが明らかにされた（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌ．，１５８，５１３（１９８４）；Ａｎｔｉｍｉｃ
ｒｏｂ．ＡｇｅｎｔｓＣｈｅｍｏｔｈｅｒ．，２７，８
５１（１９８５））。ＰＢＰｓは、一般に黄色ブドウ球
菌の細胞壁ペプチドグリカン層（ムレイン）の架橋酵素
で、β−ラクタム系抗生物質の標的部位であるといわれ
ている。β−ラクタム系抗生物質はＰＢＰｓに共有結合
することによりＰＢＰｓの酵素活性が失われ、細胞壁合
成が停止して溶菌するため、抗菌作用を示す（Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．，３８，２９１（１９７４））。
ＭＲＳＡにおいては、この標的酵素の代わりに薬剤親和
性の低いＰＢＰ−２’が合成されている。メチシリンの
ようなβ−ラクタム系抗生物質の存在下、ほかのＰＢＰ
ｓは失活するのに対して、ＰＢＰ−２’は薬剤親和性が
低いため失活しない。また、このＰＢＰ−２’はある種
のβ−ラクタム系抗生物質に触れさせると増量する。よ
ってメチシリン耐性の本態はＰＢＰ−２’の誘導的産生
にあるとされている。
【０００４】１９８６年、ＰＢＰ−２’の産生を支配す
る構造遺伝子、すなわちメチシリン−セフェム耐性遺伝
子の塩基配列が明らかにされた（ＦＥＢＳ，２２１，１
６７（１９８７））。この耐性遺伝子はｍｅｃＡと名付
けられ、ＭＲＳＡの染色体上に存在している。ＭＲＳＡ
の染色体を制限酵素ＢａｍＨＩによって切断し、大腸菌
に形質転換すると、ＰＢＰ−２’が大腸菌においても産
生された（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６７，９７５
（１９８６））。さらに制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによっ
て切断された比較的短い４．３ｋｂのＤＮＡ断片を、メ
チシリン感受性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉ
ｎ−ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ：以下、「ＭＳＳＡ」と略す）に
形質転換するとＰＢＰ−２’が産生され、この形質転換
株は各種β−ラクタム系抗生物質に対し、耐性化した
（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１，２８８２（１９
８９））。
る構造遺伝子、すなわちメチシリン−セフェム耐性遺伝
子の塩基配列が明らかにされた（ＦＥＢＳ，２２１，１
６７（１９８７））。この耐性遺伝子はｍｅｃＡと名付
けられ、ＭＲＳＡの染色体上に存在している。ＭＲＳＡ
の染色体を制限酵素ＢａｍＨＩによって切断し、大腸菌
に形質転換すると、ＰＢＰ−２’が大腸菌においても産
生された（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６７，９７５
（１９８６））。さらに制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩによっ
て切断された比較的短い４．３ｋｂのＤＮＡ断片を、メ
チシリン感受性黄色ブドウ球菌（Ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉ
ｎ−ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ
ｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ：以下、「ＭＳＳＡ」と略す）に
形質転換するとＰＢＰ−２’が産生され、この形質転換
株は各種β−ラクタム系抗生物質に対し、耐性化した
（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１，２８８２（１９
８９））。
【０００５】従来ＭＲＳＡの判定には、メチシリンまた
はオキサシリンを用い、ペーパーディスク法による薬剤
感受性試験（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃ
ｈｅｍｏｔｈｅｒ．，３３，９９５（１９８９））か、
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の測定により行われていた
が、薬剤耐性の機構が分子レベルで明らかになるにつれ
て、上記ｍｅｃＡ ＤＮＡのプローブを用いたサザンハ
イブリダイゼーション法やドットブロットハイブリダイ
ゼーション法が開発された（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａ
ｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，３４，１７２０
（１９９０））。しかしこれらの方法では、多大な時間
と、操作に熟練を要し、かつ放射性物質を使用するため
に臨床検査の現場では利用しがたい問題があった。
はオキサシリンを用い、ペーパーディスク法による薬剤
感受性試験（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃ
ｈｅｍｏｔｈｅｒ．，３３，９９５（１９８９））か、
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の測定により行われていた
が、薬剤耐性の機構が分子レベルで明らかになるにつれ
て、上記ｍｅｃＡ ＤＮＡのプローブを用いたサザンハ
イブリダイゼーション法やドットブロットハイブリダイ
ゼーション法が開発された（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａ
ｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，３４，１７２０
（１９９０））。しかしこれらの方法では、多大な時間
と、操作に熟練を要し、かつ放射性物質を使用するため
に臨床検査の現場では利用しがたい問題があった。
【０００６】またＤＮＡの増幅法であるポリメラーゼ
チェイン リアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈ
ａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）法を用いて、ｍｅ
ｃＡＤＮＡを検出する方法が開発されているが（Ａｎｔ
ｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅ
ｒ．，３５，２５６８（１９９１）；Ａｎｔｉｍｉｃｒ
ｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，３６，６
（１９９２）、費用が高く、１０3ｃｅｌｌｓ以上の細
胞がないと、疑陽性や疑陰性が出現しやすく、判定が困
難である等の問題があった。
チェイン リアクション（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈ
ａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）法を用いて、ｍｅ
ｃＡＤＮＡを検出する方法が開発されているが（Ａｎｔ
ｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅ
ｒ．，３５，２５６８（１９９１）；Ａｎｔｉｍｉｃｒ
ｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，３６，６
（１９９２）、費用が高く、１０3ｃｅｌｌｓ以上の細
胞がないと、疑陽性や疑陰性が出現しやすく、判定が困
難である等の問題があった。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ｍｅｃＡ
ＤＮＡがコードするポリペプチド（以下、「ｍｅｃＡ
タンパク質」と略す）による抗原−抗体反応を利用して
黄色ブドウ球菌の新鮮分離菌株がＭＲＳＡかＭＳＳＡか
の判定を簡便に行うべく検討を重ねてきた結果、天然型
のｍｅｃＡタンパク質を改変して低分子量化した 'ｍｅ
ｃＡタンパク質を免疫して得られた抗血清がＭＲＳＡと
のみ反応し、かつ当該タンパク質は遺伝子工学的手法を
用いることにより大量に産生できることを初めて見い出
し、本発明を完成するに至った。
ＤＮＡがコードするポリペプチド（以下、「ｍｅｃＡ
タンパク質」と略す）による抗原−抗体反応を利用して
黄色ブドウ球菌の新鮮分離菌株がＭＲＳＡかＭＳＳＡか
の判定を簡便に行うべく検討を重ねてきた結果、天然型
のｍｅｃＡタンパク質を改変して低分子量化した 'ｍｅ
ｃＡタンパク質を免疫して得られた抗血清がＭＲＳＡと
のみ反応し、かつ当該タンパク質は遺伝子工学的手法を
用いることにより大量に産生できることを初めて見い出
し、本発明を完成するに至った。
【０００８】すなわち本発明の要旨は、下記の理化学的
性質を有することを特徴とする新規な 'ｍｅｃＡタンパ
ク質、それをコードするＤＮＡ、当該タンパク質の産生
方法および当該タンパク質を用いたＭＲＳＡの検出方法
に存する。 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分
子量が、約４０，０００である。 メチシリン耐性黄色ブドウ球菌におけるメチシリン
耐性機構を支配する。
性質を有することを特徴とする新規な 'ｍｅｃＡタンパ
ク質、それをコードするＤＮＡ、当該タンパク質の産生
方法および当該タンパク質を用いたＭＲＳＡの検出方法
に存する。 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分
子量が、約４０，０００である。 メチシリン耐性黄色ブドウ球菌におけるメチシリン
耐性機構を支配する。
【０００９】以下本発明をさらに詳細に説明するに、本
発明の新規な 'ｍｅｃＡタンパク質は、例えば天然型の
ｍｅｃＡタンパク質に適当なプロテアーゼを作用させて
加水分解するか、後述の実施例で詳述するように、ｍｅ
ｃＡ ＤＮＡをまず改変し、次にこれを遺伝子工学的手
法を用いて組換えタンパク質として産生させることによ
って得ることができる。かくして得られる 'ｍｅｃＡタ
ンパク質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
による分子量が約４０，０００であり、ＭＲＳＡにおけ
るメチシリン耐性機構を天然型のｍｅｃＡタンパク質と
同様に支配するタンパク質である。 'ｍｅｃＡタンパク
質のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２にて示される
が、上記の機能を損なわない範囲において一部のアミノ
酸を除去、置換、修飾または追加するなどの改変を行っ
たものも、本発明の 'ｍｅｃＡタンパク質に含まれる。
発明の新規な 'ｍｅｃＡタンパク質は、例えば天然型の
ｍｅｃＡタンパク質に適当なプロテアーゼを作用させて
加水分解するか、後述の実施例で詳述するように、ｍｅ
ｃＡ ＤＮＡをまず改変し、次にこれを遺伝子工学的手
法を用いて組換えタンパク質として産生させることによ
って得ることができる。かくして得られる 'ｍｅｃＡタ
ンパク質は、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
による分子量が約４０，０００であり、ＭＲＳＡにおけ
るメチシリン耐性機構を天然型のｍｅｃＡタンパク質と
同様に支配するタンパク質である。 'ｍｅｃＡタンパク
質のアミノ酸配列は、配列表の配列番号２にて示される
が、上記の機能を損なわない範囲において一部のアミノ
酸を除去、置換、修飾または追加するなどの改変を行っ
たものも、本発明の 'ｍｅｃＡタンパク質に含まれる。
【００１０】（Ａ） 'ｍｅｃＡ ＤＮＡの取得 ＭＲＳＡの染色体から遺伝子を常法に従って抽出し、こ
れをＨｉｎｄＩＩＩ等の適当な制限酵素を用いて切断す
ることによって、ｍｅｃＡ ＤＮＡを得る。またこのと
き、すでにクローニングされているｍｅｃＡ ＤＮＡを
含有しているプラスミド、例えばｐＭＲ１１１（Ａｎｔ
ｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅ
ｒ．，３４，６００（１９９０））等から常法に従って
得てもよい。かくして得られるｍｅｃＡ ＤＮＡの塩基
配列およびそれより推定されるアミノ酸配列を、配列表
の配列番号１に示す。
れをＨｉｎｄＩＩＩ等の適当な制限酵素を用いて切断す
ることによって、ｍｅｃＡ ＤＮＡを得る。またこのと
き、すでにクローニングされているｍｅｃＡ ＤＮＡを
含有しているプラスミド、例えばｐＭＲ１１１（Ａｎｔ
ｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅ
ｒ．，３４，６００（１９９０））等から常法に従って
得てもよい。かくして得られるｍｅｃＡ ＤＮＡの塩基
配列およびそれより推定されるアミノ酸配列を、配列表
の配列番号１に示す。
【００１１】次に、ｍｅｃＡ ＤＮＡを改変する。ｍｅ
ｃＡタンパク質のアミノ酸配列において、ブドウ球菌の
β−ラクタマーゼのＮ末端とｍｅｃＡタンパク質のＮ末
端に相同性のあることが報告されている（Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．，１６７，９７５（１９８６））。そこで
β−ラクタマーゼに対する抗体の作製を防止するため
に、この相同性のある領域を欠失させることが好まし
い。従って、ｍｅｃＡタンパク質のアミノ酸配列のう
ち、β−ラクマターゼと相同性のあるアミノ酸数が１〜
１３５番目までの領域を欠損させたポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを取得する。これは、該当する領域におけ
る順方向用プライマーおよび逆方向用プライマーを用い
て増幅させる、いわゆるＰＣＲ法を用いて行うことがで
きる。ＰＣＲ法によって増幅されたＤＮＡは、適当な制
限酵素、例えばＢａｍＨＩ等で切断後，ｐＵＣ１８、ｐ
ＵＣ１１９等のプラスミドにクローニングし、Ｓａｎｇ
ｅｒらのジデオキシ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７））等
により塩基配列を決定できる。
ｃＡタンパク質のアミノ酸配列において、ブドウ球菌の
β−ラクタマーゼのＮ末端とｍｅｃＡタンパク質のＮ末
端に相同性のあることが報告されている（Ｊ．Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．，１６７，９７５（１９８６））。そこで
β−ラクタマーゼに対する抗体の作製を防止するため
に、この相同性のある領域を欠失させることが好まし
い。従って、ｍｅｃＡタンパク質のアミノ酸配列のう
ち、β−ラクマターゼと相同性のあるアミノ酸数が１〜
１３５番目までの領域を欠損させたポリペプチドをコー
ドするＤＮＡを取得する。これは、該当する領域におけ
る順方向用プライマーおよび逆方向用プライマーを用い
て増幅させる、いわゆるＰＣＲ法を用いて行うことがで
きる。ＰＣＲ法によって増幅されたＤＮＡは、適当な制
限酵素、例えばＢａｍＨＩ等で切断後，ｐＵＣ１８、ｐ
ＵＣ１１９等のプラスミドにクローニングし、Ｓａｎｇ
ｅｒらのジデオキシ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７７））等
により塩基配列を決定できる。
【００１２】かくして得られるｍｅｃＡ ＤＮＡの改変
体が 'ｍｅｃＡ ＤＮＡである。'ｍｅｃＡ ＤＮＡの
塩基配列としては、例えば配列表の配列番号２に示すも
のが挙げられる。かかる 'ｍｅｃＡ ＤＮＡにおいて
も、一部の塩基を除去、置換、修飾または追加する等の
改変を行っても差し支えない。 （Ｂ） 'ｍｅｃＡ ＤＮＡ含有組換えベクターの作成 前記（Ａ）項で得られたＤＮＡは、その５’末端を修飾
して公知の発現ベクターにそれ自体公知の方法でプロモ
ーターの下流に挿入され、次いで上記のＤＮＡが挿入さ
れた組換えベクターは、大腸菌、酵母、動物細胞宿主
等、公知の細胞中にそれ自体公知の方法により導入され
る。
体が 'ｍｅｃＡ ＤＮＡである。'ｍｅｃＡ ＤＮＡの
塩基配列としては、例えば配列表の配列番号２に示すも
のが挙げられる。かかる 'ｍｅｃＡ ＤＮＡにおいて
も、一部の塩基を除去、置換、修飾または追加する等の
改変を行っても差し支えない。 （Ｂ） 'ｍｅｃＡ ＤＮＡ含有組換えベクターの作成 前記（Ａ）項で得られたＤＮＡは、その５’末端を修飾
して公知の発現ベクターにそれ自体公知の方法でプロモ
ーターの下流に挿入され、次いで上記のＤＮＡが挿入さ
れた組換えベクターは、大腸菌、酵母、動物細胞宿主
等、公知の細胞中にそれ自体公知の方法により導入され
る。
【００１３】たとえば大腸菌、枯草菌等の微生物を宿主
とするときには、組換えベクターはプロモーター、リボ
ソーム結合（ＳＤ）配列、 'ｍｅｃＡタンパク質ＤＮ
Ａ、転写終結配列、及びプロモーターを制御するＤＮＡ
順に配列することが好ましい。発現ベクターとして使用
できるものとしては、ｐＵＡＩ２（特開平１−９５７９
８号公報）、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，６９２９（１９８
４）；Ｇｅｎｅ，２５，１６７（１９８３）；Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，２３，４４７０（１９８４）；Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，２７，１８６９（１９８８））や市販のｐＫＫ２
３３−２（ファルマシア社製）等がある。また、融合蛋
白として発現させる発現ベクターｐＧＥＸシリーズ（フ
ァルマシア社製）等も同様にして使用できる。
とするときには、組換えベクターはプロモーター、リボ
ソーム結合（ＳＤ）配列、 'ｍｅｃＡタンパク質ＤＮ
Ａ、転写終結配列、及びプロモーターを制御するＤＮＡ
順に配列することが好ましい。発現ベクターとして使用
できるものとしては、ｐＵＡＩ２（特開平１−９５７９
８号公報）、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，６９２９（１９８
４）；Ｇｅｎｅ，２５，１６７（１９８３）；Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．，２３，４４７０（１９８４）；Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．，２７，１８６９（１９８８））や市販のｐＫＫ２
３３−２（ファルマシア社製）等がある。また、融合蛋
白として発現させる発現ベクターｐＧＥＸシリーズ（フ
ァルマシア社製）等も同様にして使用できる。
【００１４】プロモーターとしては、大腸菌、ファージ
等由来のもの、例えばトリプトファン合成酵素（ｔｒ
ｐ）、ラクトースオペロン（ｌａｃ）、これらのハイブ
リッドプロモーター（ｔａｃ）、ラムダファージＰL 、
ＰR 、Ｔ5 ファージの初期ＤＮＡのプロモーターである
Ｐ25、Ｐ26プロモーター等が挙げられる。また、これら
は例えばｐａｃプロモーター（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，５２，９８３（１９８８））のように独自
に改変、設計された配列でも良い。
等由来のもの、例えばトリプトファン合成酵素（ｔｒ
ｐ）、ラクトースオペロン（ｌａｃ）、これらのハイブ
リッドプロモーター（ｔａｃ）、ラムダファージＰL 、
ＰR 、Ｔ5 ファージの初期ＤＮＡのプロモーターである
Ｐ25、Ｐ26プロモーター等が挙げられる。また、これら
は例えばｐａｃプロモーター（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．
Ｃｈｅｍ．，５２，９８３（１９８８））のように独自
に改変、設計された配列でも良い。
【００１５】リボソーム結合配列としては、大腸菌、フ
ァージ等由来のものでも良いが、ＤＮＡ合成により作成
した１６ＳリボソームＲＮＡの３’末端領域に相補的な
配列を４塩基以上連続してもつコンセンサス配列を持っ
たものでも良い。転写終結配列は必ずしも必要ではない
が、ρ非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネ
ーター、ｔｒｐオペロンターミネーター等を有している
方が好ましい。
ァージ等由来のものでも良いが、ＤＮＡ合成により作成
した１６ＳリボソームＲＮＡの３’末端領域に相補的な
配列を４塩基以上連続してもつコンセンサス配列を持っ
たものでも良い。転写終結配列は必ずしも必要ではない
が、ρ非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネ
ーター、ｔｒｐオペロンターミネーター等を有している
方が好ましい。
【００１６】また組換えベクター上のＳＤ配列と 'ｍｅ
ｃＡタンパク質ＤＮＡとのユニットを複数個同方向に挿
入することにより、ベクター上の転写単位のコピー数を
増加させる方法（特開平１−９５７９８号公報）を用い
ることもできる。
ｃＡタンパク質ＤＮＡとのユニットを複数個同方向に挿
入することにより、ベクター上の転写単位のコピー数を
増加させる方法（特開平１−９５７９８号公報）を用い
ることもできる。
【００１７】（Ｃ） 'ｍｅｃＡタンパク質の産生方法 組換えベクターによる宿主の形質転換法は、常法に従い
行うことができる。形質転換に用いる宿主としては、例
えば後述の実施例のように大腸菌が挙げられるが、とく
に大腸菌に限定されるものではなく、他の微生物、動物
細胞、昆虫細胞などの宿主生物を用いることができる。
形質転換体の培養は、モレキュラー クローニング（コ
ールド スプリングハーバー ラボラトリー，１９８２
年）に記載の方法を参考にして行うことができる。培養
温度としては、２８〜４２℃が適当である。上記形質転
換体を培養して得られる 'ｍｅｃＡタンパク質は、公知
の方法で宿主から単離・精製される。
行うことができる。形質転換に用いる宿主としては、例
えば後述の実施例のように大腸菌が挙げられるが、とく
に大腸菌に限定されるものではなく、他の微生物、動物
細胞、昆虫細胞などの宿主生物を用いることができる。
形質転換体の培養は、モレキュラー クローニング（コ
ールド スプリングハーバー ラボラトリー，１９８２
年）に記載の方法を参考にして行うことができる。培養
温度としては、２８〜４２℃が適当である。上記形質転
換体を培養して得られる 'ｍｅｃＡタンパク質は、公知
の方法で宿主から単離・精製される。
【００１８】（Ｄ）ＭＲＳＡの検出方法 本発明の 'ｍｅｃＡタンパク質は、ＭＲＳＡを検出する
場合の試薬として有用である。例えば、本発明の 'ｍｅ
ｃＡタンパク質を抗原タンパク質として用いて、ウエス
タンブロット法、エンザイムイムノアッセイ法、ラテッ
クス凝集法、ラジオイムノアッセイ法等により、被検患
者より分離された黄色ブドウ球菌がＭＲＳＡであるか否
かを検出することができ、これによりＭＲＳＡの感染を
診断することができる。また 'ｍｅｃＡ ＤＮＡのＤＮ
Ａ断片は、ＭＲＳＡの検出・診断のために、またはｍｅ
ｃＡ ＤＮＡを新たにクローニングするためのプローブ
としても使用することができる。
場合の試薬として有用である。例えば、本発明の 'ｍｅ
ｃＡタンパク質を抗原タンパク質として用いて、ウエス
タンブロット法、エンザイムイムノアッセイ法、ラテッ
クス凝集法、ラジオイムノアッセイ法等により、被検患
者より分離された黄色ブドウ球菌がＭＲＳＡであるか否
かを検出することができ、これによりＭＲＳＡの感染を
診断することができる。また 'ｍｅｃＡ ＤＮＡのＤＮ
Ａ断片は、ＭＲＳＡの検出・診断のために、またはｍｅ
ｃＡ ＤＮＡを新たにクローニングするためのプローブ
としても使用することができる。
【００１９】
【実施例】以下の実施例により、本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実施
例によって限定されるものではない。 実施例１ ｍｅｃＡ ＤＮＡの調製 ｍｅｃＡ ＤＮＡがベクターｐＵＣ１１８に組み込まれ
たプラスミドｐＭＲ１１１から、プラスミドＤＮＡをＣ
ｓＣｌ−ＥｔＢｒ（塩化セシウム−エチジウムブロマイ
ド）密度勾配遠心法を用いて大量に調製した（モレキュ
ラー クローニング，コールド スプリング ハーバー
ラボラトリー，１９８２年）。
明するが、本発明はその要旨を越えない限り以下の実施
例によって限定されるものではない。 実施例１ ｍｅｃＡ ＤＮＡの調製 ｍｅｃＡ ＤＮＡがベクターｐＵＣ１１８に組み込まれ
たプラスミドｐＭＲ１１１から、プラスミドＤＮＡをＣ
ｓＣｌ−ＥｔＢｒ（塩化セシウム−エチジウムブロマイ
ド）密度勾配遠心法を用いて大量に調製した（モレキュ
ラー クローニング，コールド スプリング ハーバー
ラボラトリー，１９８２年）。
【００２０】詳しくは、プラスミドｐＭＲ１１１保有大
腸菌を２０μｇ／ｍｌ アンピシリン含有ＬＢ液体培地
（ポリペプトン １０ｇ、酵母エキス ５ｇおよびＮａ
Ｃｌ５ｇを精製水１ｌに溶解し、ｐＨ７．２に調製した
もの）５００ｍｌに接種し、３７℃で一夜振とう培養し
た。遠心によって集菌後、ＴＥＳバッファー（５０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌおよ
び５０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ）を用いて菌体を洗浄し
た。Ｉ溶液（５０ｍＭ ブドウ糖、２５ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ８．０）および１０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（ｐ
Ｈ８．０））１８ｍｌに懸濁後、１０ｍｇ／ｍｌのリゾ
チームを含有したＩ溶液を２ｍｌ加え、直ちに混合し、
室温で５分間放置した。０．２Ｎ ＮａＯＨ−１％ Ｓ
ＤＳ溶液４０ｍｌを加え、穏やかに混合して、室温で１
０分間放置した。氷冷した５Ｍ 酢酸カリウム溶液を２
０ｍｌ加え、穏やかに混合し、氷中に１５分間以上放置
し、４℃、８０００ｒｐｍで２０分間遠心を行った。上
清を新しいチューブに移し、０．６倍量のイソプロパノ
ールを加えて懸濁後、室温で１０分間以上放置し、４
℃、８０００ｒｐｍ、２０分間の遠心により、ＤＮＡを
沈殿させた。沈殿を７０％ 冷エタノールで洗浄した
後、真空乾燥し、ＴＥＳバッファー ７ｍｌに溶解さ
せ，ＤＮＡ溶液とした。このＤＮＡ溶液から、ＣｓＣｌ
−ＥｔＢｒ密度勾配遠心法を用いてプラスミドＤＮＡを
精製した。
腸菌を２０μｇ／ｍｌ アンピシリン含有ＬＢ液体培地
（ポリペプトン １０ｇ、酵母エキス ５ｇおよびＮａ
Ｃｌ５ｇを精製水１ｌに溶解し、ｐＨ７．２に調製した
もの）５００ｍｌに接種し、３７℃で一夜振とう培養し
た。遠心によって集菌後、ＴＥＳバッファー（５０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ ＮａＣｌおよ
び５０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ）を用いて菌体を洗浄し
た。Ｉ溶液（５０ｍＭ ブドウ糖、２５ｍＭトリス塩酸
（ｐＨ８．０）および１０ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（ｐ
Ｈ８．０））１８ｍｌに懸濁後、１０ｍｇ／ｍｌのリゾ
チームを含有したＩ溶液を２ｍｌ加え、直ちに混合し、
室温で５分間放置した。０．２Ｎ ＮａＯＨ−１％ Ｓ
ＤＳ溶液４０ｍｌを加え、穏やかに混合して、室温で１
０分間放置した。氷冷した５Ｍ 酢酸カリウム溶液を２
０ｍｌ加え、穏やかに混合し、氷中に１５分間以上放置
し、４℃、８０００ｒｐｍで２０分間遠心を行った。上
清を新しいチューブに移し、０．６倍量のイソプロパノ
ールを加えて懸濁後、室温で１０分間以上放置し、４
℃、８０００ｒｐｍ、２０分間の遠心により、ＤＮＡを
沈殿させた。沈殿を７０％ 冷エタノールで洗浄した
後、真空乾燥し、ＴＥＳバッファー ７ｍｌに溶解さ
せ，ＤＮＡ溶液とした。このＤＮＡ溶液から、ＣｓＣｌ
−ＥｔＢｒ密度勾配遠心法を用いてプラスミドＤＮＡを
精製した。
【００２１】すなわち、ＤＮＡ溶液 ６．５ｍｌを、Ｃ
ｓＣｌ ７．０ｇ、５ｍｇ／ｍｌＥｔＢｒ溶液０．５ｍ
ｌと穏やかに混合した。超遠心用チューブ（１２ＰＡ、
日立工機）に入れ、流動パラフィンの積層によりバラン
スを調整し、ＲＰ６５Ｔアングルローター（日立工機）
を用いて、４４０００ｒｐｍ、２０℃、４０時間の超遠
心を行った（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃ
ｈｅｍｏｔｈｅｒ．，９，７０６（１９７６））。超遠
心後、長波長紫外線（３６５ｎｍ）照射下、下層のプラ
スミドＤＮＡバンドを回収した。水で飽和したｎ−ブタ
ノールを加えてＥｔＢｒを除去後、１％ 炭酸水素ナト
リウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液で煮沸した透析チューブ
（８／３２）を用いて、滅菌したＴＥバッファー（１０
ｍＭトリス塩酸および１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（ｐＨ
８．０））に対して一夜透析し、ＣｓＣｌを除去した。
このＤＮＡ溶液に１／１０量の３Ｍ 酢酸ナトリウム溶
液（ｐＨ５．２）および２．５倍量のエタノールを加え
て、−７０℃で１５〜３０分間冷却後、１５０００×
ｇ、５分間の遠心によりＤＮＡを沈殿させた。沈殿した
ＤＮＡを７０％ 冷エタノールで洗浄し、真空乾燥後、
適量のＴＥバッファーに溶解させてプラスミドＤＮＡ溶
液とした。このプラスミドＤＮＡにはｍｅｃＡ ＤＮＡ
が含まれている。
ｓＣｌ ７．０ｇ、５ｍｇ／ｍｌＥｔＢｒ溶液０．５ｍ
ｌと穏やかに混合した。超遠心用チューブ（１２ＰＡ、
日立工機）に入れ、流動パラフィンの積層によりバラン
スを調整し、ＲＰ６５Ｔアングルローター（日立工機）
を用いて、４４０００ｒｐｍ、２０℃、４０時間の超遠
心を行った（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃ
ｈｅｍｏｔｈｅｒ．，９，７０６（１９７６））。超遠
心後、長波長紫外線（３６５ｎｍ）照射下、下層のプラ
スミドＤＮＡバンドを回収した。水で飽和したｎ−ブタ
ノールを加えてＥｔＢｒを除去後、１％ 炭酸水素ナト
リウム、５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液で煮沸した透析チューブ
（８／３２）を用いて、滅菌したＴＥバッファー（１０
ｍＭトリス塩酸および１ｍＭ ＥＤＴＡ・２Ｎａ（ｐＨ
８．０））に対して一夜透析し、ＣｓＣｌを除去した。
このＤＮＡ溶液に１／１０量の３Ｍ 酢酸ナトリウム溶
液（ｐＨ５．２）および２．５倍量のエタノールを加え
て、−７０℃で１５〜３０分間冷却後、１５０００×
ｇ、５分間の遠心によりＤＮＡを沈殿させた。沈殿した
ＤＮＡを７０％ 冷エタノールで洗浄し、真空乾燥後、
適量のＴＥバッファーに溶解させてプラスミドＤＮＡ溶
液とした。このプラスミドＤＮＡにはｍｅｃＡ ＤＮＡ
が含まれている。
【００２２】実施例２ 'ｍｅｃＡ ＤＮＡの合成 実施例１で得られたプラスミドＤＮＡ溶液から、目的と
する 'ｍｅｃＡ ＤＮＡをＰＣＲ法により増幅させた。
詳しくは、ＰＣＲ法に必要なプライマーを、ａ）ＤＮＡ
鎖の結合を強めるために５０〜６０％のＧＣ（グアニン
−シトシン）を含むようにし、かつＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼの酵素活性を高めるために、Ｔｍ値が５５〜８０
℃となるようにし、ＰＣＲ効率のよい２０〜３０塩基対
の長さにする、ｂ）プラスミドベクターに効率よく組み
込むために、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ認識領域
を取り入れる、ｃ）ｍＲＮＡからのリボゾームによる翻
訳効率をよくするため、リボゾーム結合配列と開始コド
ン間の距離を７〜１２塩基とするようにデザインした。
する 'ｍｅｃＡ ＤＮＡをＰＣＲ法により増幅させた。
詳しくは、ＰＣＲ法に必要なプライマーを、ａ）ＤＮＡ
鎖の結合を強めるために５０〜６０％のＧＣ（グアニン
−シトシン）を含むようにし、かつＴａｑＤＮＡポリメ
ラーゼの酵素活性を高めるために、Ｔｍ値が５５〜８０
℃となるようにし、ＰＣＲ効率のよい２０〜３０塩基対
の長さにする、ｂ）プラスミドベクターに効率よく組み
込むために、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ認識領域
を取り入れる、ｃ）ｍＲＮＡからのリボゾームによる翻
訳効率をよくするため、リボゾーム結合配列と開始コド
ン間の距離を７〜１２塩基とするようにデザインした。
【００２３】順方向のプライマーとしては、β−ラクタ
マーゼと相同性のある領域を欠失させるため、配列表の
配列番号１に記載の塩基配列で５３９番目から始まり、
その上流にサブクローニングサイトとしてＥｃｏＲＩ部
位（ＧＡＡＴＴＣ）を挿入した２６塩基を（５’−ＧＧ
ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＡＡＧＣ−
３’、Ｔｍ＝７６；配列表の配列番号３）、逆方向用の
プライマーとしては、ｍｅｃＡ ＤＮＡ末端のターミネ
ーターより下流の前記条件に適した領域を選択し、その
領域の中にサブクローニングサイトＨｉｎｄＩＩＩ部位
（ＴＴＣＧＡＡ）を挿入した２６塩基（３’−ＧＴＣＧ
ＣＴＡＴＴＧＣＡＴＧＴＴＣＧＡＡＡＡＴＧＧＡ−
５’、Ｔｍ＝７４；配列表の配列番号４）を、ＤＮＡシ
ンセサイザー（ＭＯＤＥＬ ３８１Ａ；Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて合成した。
マーゼと相同性のある領域を欠失させるため、配列表の
配列番号１に記載の塩基配列で５３９番目から始まり、
その上流にサブクローニングサイトとしてＥｃｏＲＩ部
位（ＧＡＡＴＴＣ）を挿入した２６塩基を（５’−ＧＧ
ＧＡＡＴＴＣＡＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＡＡＧＣ−
３’、Ｔｍ＝７６；配列表の配列番号３）、逆方向用の
プライマーとしては、ｍｅｃＡ ＤＮＡ末端のターミネ
ーターより下流の前記条件に適した領域を選択し、その
領域の中にサブクローニングサイトＨｉｎｄＩＩＩ部位
（ＴＴＣＧＡＡ）を挿入した２６塩基（３’−ＧＴＣＧ
ＣＴＡＴＴＧＣＡＴＧＴＴＣＧＡＡＡＡＴＧＧＡ−
５’、Ｔｍ＝７４；配列表の配列番号４）を、ＤＮＡシ
ンセサイザー（ＭＯＤＥＬ ３８１Ａ；Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて合成した。
【００２４】ミクロ遠心チューブを用い、プラスミドＤ
ＮＡ １ｎｇ、上記２種類の合成プライマーをそれぞれ
２０ｐＭ、１０×反応バッファー（ＡｍｐｌｉＴａｑ；
ＴＡＫＡＲＡ）１０μｌ、ｄＮＴＰｓ混合液（Ａｍｐｌ
ｉＴａｑ；ＴＡＫＡＲＡ）各１００μＭ、ＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ；ＴＡＫＡＲＡ）２単
位、精製水 ６５．５μｌを混合し、ミネラルオイル
７５μｌを重層した。ＤＮＡサーマルサイクラー（ＰＪ
２０００；ＴＡＫＡＲＡ）を用いて 'ｍｅｃＡＤＮＡを
合成した。反応は、９５℃で２分間、５０℃で３０秒
間、７２℃で２分間を２サイクル行った後、９４℃で１
分間、５０℃で３０秒間、７２℃で１分３０秒間を２０
サイクル行い、さらに７２℃で５分間反応させ、４℃で
放置した。
ＮＡ １ｎｇ、上記２種類の合成プライマーをそれぞれ
２０ｐＭ、１０×反応バッファー（ＡｍｐｌｉＴａｑ；
ＴＡＫＡＲＡ）１０μｌ、ｄＮＴＰｓ混合液（Ａｍｐｌ
ｉＴａｑ；ＴＡＫＡＲＡ）各１００μＭ、ＴａｑＤＮＡ
ポリメラーゼ（ＡｍｐｌｉＴａｑ；ＴＡＫＡＲＡ）２単
位、精製水 ６５．５μｌを混合し、ミネラルオイル
７５μｌを重層した。ＤＮＡサーマルサイクラー（ＰＪ
２０００；ＴＡＫＡＲＡ）を用いて 'ｍｅｃＡＤＮＡを
合成した。反応は、９５℃で２分間、５０℃で３０秒
間、７２℃で２分間を２サイクル行った後、９４℃で１
分間、５０℃で３０秒間、７２℃で１分３０秒間を２０
サイクル行い、さらに７２℃で５分間反応させ、４℃で
放置した。
【００２５】合成の確認は、５μｌをとりアガロースゲ
ル電気泳動法によって行った。すなわち、ＤＮＡ溶液に
色素溶液（３０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ブロモフ
ェノールブルー、０．０５％ キシレンシアノール、２
０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．０）および６０％ グリ
セロール）を１／５〜１／１０量加えて、電気泳動用サ
ンプルとした。トリス酢酸バッファー（４０ｍＭ トリ
ス酢酸、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５μｌ／ｍｌ Ｅ
ｔＢｒ（ｐＨ８．０））を用い、０．７％ アガロース
ゲルにて、１００Ｖで３０分間電気泳動した。紫外線発
光器を用いて３６５ｎｍ紫外線照射下、赤色フィルター
を通じて写真の撮影を行った。ＤＮＡ断片の分子量は、
分子量既知のＤＮＡと泳動距離を比較することにより求
めた（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８，５５１（１９７
５））。
ル電気泳動法によって行った。すなわち、ＤＮＡ溶液に
色素溶液（３０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ ブロモフ
ェノールブルー、０．０５％ キシレンシアノール、２
０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ８．０）および６０％ グリ
セロール）を１／５〜１／１０量加えて、電気泳動用サ
ンプルとした。トリス酢酸バッファー（４０ｍＭ トリ
ス酢酸、２ｍＭ ＥＤＴＡおよび０．５μｌ／ｍｌ Ｅ
ｔＢｒ（ｐＨ８．０））を用い、０．７％ アガロース
ゲルにて、１００Ｖで３０分間電気泳動した。紫外線発
光器を用いて３６５ｎｍ紫外線照射下、赤色フィルター
を通じて写真の撮影を行った。ＤＮＡ断片の分子量は、
分子量既知のＤＮＡと泳動距離を比較することにより求
めた（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９８，５５１（１９７
５））。
【００２６】またｍｅｃＡ ＤＮＡの全配列を増幅させ
るために、順方向プライマーとしてｍｅｃＡ ＤＮＡの
開始点から始まり、その上流にサブクローニングサイト
としてＥｃｏＲＩ部位（ＧＡＡＴＴＣ）を挿入した３１
塩基を（５’−ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡ
ＴＡＡＡＡＡＴＴＧＴＴＣＣ−３’、Ｔｍ＝８０；配列
表の配列番号５）、逆方向用のプライマーとして前記と
同じものを用いて、同様の条件にてＰＣＲ反応を行っ
た。
るために、順方向プライマーとしてｍｅｃＡ ＤＮＡの
開始点から始まり、その上流にサブクローニングサイト
としてＥｃｏＲＩ部位（ＧＡＡＴＴＣ）を挿入した３１
塩基を（５’−ＧＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＡＡＡＡＡＧＡ
ＴＡＡＡＡＡＴＴＧＴＴＣＣ−３’、Ｔｍ＝８０；配列
表の配列番号５）、逆方向用のプライマーとして前記と
同じものを用いて、同様の条件にてＰＣＲ反応を行っ
た。
【００２７】実施例３ 大腸菌ＭＶ１１８４の形質転換 実施例２でＰＣＲ法によって合成・増幅させた 'ｍｅｃ
Ａ ＤＮＡ及びｍｅｃＡ ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ
およびＨｉｎｄＩＩＩにて切断した。すなわち、 'ｍｅ
ｃＡ ＤＮＡ１〜３μｇを反応溶液２０〜３０μｌに溶
解し、１０〜２０ｕｎｉｔｓの制限酵素を加えて１〜２
時間反応させた。反応溶液および反応温度は、それぞれ
の制限酵素の至適反応条件に従った（モレキュラー ク
ローニング 第２版，コールド スプリング ハーバー
ラボラトリー，１９８９年）。
Ａ ＤＮＡ及びｍｅｃＡ ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩ
およびＨｉｎｄＩＩＩにて切断した。すなわち、 'ｍｅ
ｃＡ ＤＮＡ１〜３μｇを反応溶液２０〜３０μｌに溶
解し、１０〜２０ｕｎｉｔｓの制限酵素を加えて１〜２
時間反応させた。反応溶液および反応温度は、それぞれ
の制限酵素の至適反応条件に従った（モレキュラー ク
ローニング 第２版，コールド スプリング ハーバー
ラボラトリー，１９８９年）。
【００２８】一方、プラスミドベクターｐＵＣ１１９
（アンピシリン耐性）をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩ
Ｉにて同様に切断し、 'ｍｅｃＡ ＤＮＡを連結し、プ
ラスミドＤＮＡとした。すなわち、 'ｍｅｃＡ ＤＮＡ
１〜３μｇを反応溶液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ
７．９）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２０ｍＭ ジチオス
レイトールおよび１ｍＭ ＡＴＰ）２０μｌに溶解し、
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを５００〜１０００ｕｎｉｔｓ加
えて、１６℃で２〜１６時間反応させた。
（アンピシリン耐性）をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩ
Ｉにて同様に切断し、 'ｍｅｃＡ ＤＮＡを連結し、プ
ラスミドＤＮＡとした。すなわち、 'ｍｅｃＡ ＤＮＡ
１〜３μｇを反応溶液（５０ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ
７．９）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 、２０ｍＭ ジチオス
レイトールおよび１ｍＭ ＡＴＰ）２０μｌに溶解し、
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを５００〜１０００ｕｎｉｔｓ加
えて、１６℃で２〜１６時間反応させた。
【００２９】次にＨａｎａｈａｎの方法により、プラス
ミドＤＮＡを大腸菌ＭＶ１１８４株に形質転換した。大
腸菌ＭＶ１１８４株を１０ｍｌのＳＯＢ培地（２．０％
トリプトン、０．５％ 酵母エキス、１０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 およ
び１０ｍＭ ＭｇＳＯ4 （ｐＨ７．０））に接種し、３
７℃で穏やかに一夜振とう培養した。１００ｍｌのＳＯ
Ｂ培地に１ｍｌの一夜培養液を接種し、３７℃で穏やか
に振とう培養した。菌密度が４〜９×１０7 に達した
後、直ちに滅菌遠心管に移し、１０〜１５分間、氷中で
冷やした。４℃、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、沈
澱を３０ｍｌの氷冷したＦＳＢ溶液（１００ｍＭ ＫＣ
ｌ、４５ｍＭ ＭｎＣｌ2 、１０ｍＭ ＣａＣｌ2 、３
ｍＭ ［Ｃｏ（ＮＨ3）6］Ｃｌ3、１０ｍＭ 酢酸カリ
ウムおよびグリセロール（ｐＨ６．２））に穏やかに懸
濁し、氷中に３０分間放置した。４℃、３０００ｒｐ
ｍ、１０分間遠心し、沈澱を８ｍｌの氷冷したＦＳＢ溶
液に穏やかに懸濁した。２８０μｌのＤＭＳＯを懸濁液
中央に滴下し、直ちに混合し、氷中に１５分間放置し
た。ドライアイスアセトンで急速に凍結し、それをコン
ピテントセルとした。室温で融解したコンピテントセル
懸濁液 １００μｌに１μｇのプラスミドＤＮＡ溶液を
加え、直ちに５秒間ほど穏やかに混和した。氷中に３０
分間放置後、４２℃で４５秒間置き、直ちに氷中に戻
し、５分間放置した。９００μｌのＳＯＣ培地（ＳＯＢ
培地＋２０ｍＭ ブドウ糖）を加え、３７℃で６０分間
振とう培養した。この菌液１００μｌを、アンピシリン
（ＳＩＧＭＡ）、メチシリン（ＳＩＧＭＡ）、ノボビオ
シン（ＳＩＧＭＡ）、カナマイシン（ＳＩＧＭＡ）の選
択薬剤を含有するＬＢ寒天培地（ＬＢ液体培地＋１．５
％ 寒天）に塗布した。以下、本発明の 'ｍｅｃＡ Ｄ
ＮＡを有する菌をＭＶ１１８４（ 'ｍｅｃＡ）株、ｍｅ
ｃＡ ＤＮＡ全体を有する菌をＭＶ１１８４（ｍｅｃ
Ａ）株と呼ぶ。
ミドＤＮＡを大腸菌ＭＶ１１８４株に形質転換した。大
腸菌ＭＶ１１８４株を１０ｍｌのＳＯＢ培地（２．０％
トリプトン、０．５％ 酵母エキス、１０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ2 およ
び１０ｍＭ ＭｇＳＯ4 （ｐＨ７．０））に接種し、３
７℃で穏やかに一夜振とう培養した。１００ｍｌのＳＯ
Ｂ培地に１ｍｌの一夜培養液を接種し、３７℃で穏やか
に振とう培養した。菌密度が４〜９×１０7 に達した
後、直ちに滅菌遠心管に移し、１０〜１５分間、氷中で
冷やした。４℃、３０００ｒｐｍ、１０分間遠心し、沈
澱を３０ｍｌの氷冷したＦＳＢ溶液（１００ｍＭ ＫＣ
ｌ、４５ｍＭ ＭｎＣｌ2 、１０ｍＭ ＣａＣｌ2 、３
ｍＭ ［Ｃｏ（ＮＨ3）6］Ｃｌ3、１０ｍＭ 酢酸カリ
ウムおよびグリセロール（ｐＨ６．２））に穏やかに懸
濁し、氷中に３０分間放置した。４℃、３０００ｒｐ
ｍ、１０分間遠心し、沈澱を８ｍｌの氷冷したＦＳＢ溶
液に穏やかに懸濁した。２８０μｌのＤＭＳＯを懸濁液
中央に滴下し、直ちに混合し、氷中に１５分間放置し
た。ドライアイスアセトンで急速に凍結し、それをコン
ピテントセルとした。室温で融解したコンピテントセル
懸濁液 １００μｌに１μｇのプラスミドＤＮＡ溶液を
加え、直ちに５秒間ほど穏やかに混和した。氷中に３０
分間放置後、４２℃で４５秒間置き、直ちに氷中に戻
し、５分間放置した。９００μｌのＳＯＣ培地（ＳＯＢ
培地＋２０ｍＭ ブドウ糖）を加え、３７℃で６０分間
振とう培養した。この菌液１００μｌを、アンピシリン
（ＳＩＧＭＡ）、メチシリン（ＳＩＧＭＡ）、ノボビオ
シン（ＳＩＧＭＡ）、カナマイシン（ＳＩＧＭＡ）の選
択薬剤を含有するＬＢ寒天培地（ＬＢ液体培地＋１．５
％ 寒天）に塗布した。以下、本発明の 'ｍｅｃＡ Ｄ
ＮＡを有する菌をＭＶ１１８４（ 'ｍｅｃＡ）株、ｍｅ
ｃＡ ＤＮＡ全体を有する菌をＭＶ１１８４（ｍｅｃ
Ａ）株と呼ぶ。
【００３０】実施例４ 大腸菌ＭＶ１１８４のＤＮＡ塩
基配列の決定 ＤＮＡ塩基配列の決定は、ＤＮＡポリメラーゼとしてＳ
ｅｑｕｅｎａｓｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０を使用した
ＤＮＡシークエンシングキット（東洋紡）を用いて、Ｓ
ａｎｇｅｒらのジデオキシ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７
７））により行った。プライマーＤＮＡとしては、ｐＵ
Ｃ系ベクターの順方向用プライマーＰ４（５’−ＧＴＴ
ＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡ−３’，東洋紡；配列表の配
列番号６）を用いた。
基配列の決定 ＤＮＡ塩基配列の決定は、ＤＮＡポリメラーゼとしてＳ
ｅｑｕｅｎａｓｅ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０を使用した
ＤＮＡシークエンシングキット（東洋紡）を用いて、Ｓ
ａｎｇｅｒらのジデオキシ法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３（１９７
７））により行った。プライマーＤＮＡとしては、ｐＵ
Ｃ系ベクターの順方向用プライマーＰ４（５’−ＧＴＴ
ＴＣＣＣＡＧＴＣＡＣＧＡ−３’，東洋紡；配列表の配
列番号６）を用いた。
【００３１】ヘルパーファージＭ１３Ｋ０７液をＹＴ液
体培地（ポリペプトン ８ｇ、酵母エキス ５ｇおよび
ＮａＣｌ ５ｇを精製水１Ｌに溶解し、ｐＨ７．６に調
製）で１０-6〜１０-8に希釈した。希釈したファージ液
１００μｌに、大腸菌ＭＶ１１８４培養液（ＯＤ＞０．
８）０．５ｍｌとＹＴ軟寒天培地（予め溶かし、５０℃
にしておいたもの）３．５ｍｌを混合し、ＹＴ寒天培地
に重層した。３７℃で静置し、プラークを形成させた
（６時間以上）。シングルプラークを３〜１００ｍｌの
２×ＹＴ液体培地（７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含
む）に植え、３７℃で振とう培養した（１２〜２０時
間）。培養液を冷却遠心して上清をとり、その上清をタ
イターチェック後、ファージ液として使用した。
体培地（ポリペプトン ８ｇ、酵母エキス ５ｇおよび
ＮａＣｌ ５ｇを精製水１Ｌに溶解し、ｐＨ７．６に調
製）で１０-6〜１０-8に希釈した。希釈したファージ液
１００μｌに、大腸菌ＭＶ１１８４培養液（ＯＤ＞０．
８）０．５ｍｌとＹＴ軟寒天培地（予め溶かし、５０℃
にしておいたもの）３．５ｍｌを混合し、ＹＴ寒天培地
に重層した。３７℃で静置し、プラークを形成させた
（６時間以上）。シングルプラークを３〜１００ｍｌの
２×ＹＴ液体培地（７０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含
む）に植え、３７℃で振とう培養した（１２〜２０時
間）。培養液を冷却遠心して上清をとり、その上清をタ
イターチェック後、ファージ液として使用した。
【００３２】プラスミド保有株を２×ＹＴ液体培地（１
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）で前培養し、前
培養液５０μｌにヘルパーファージ液５０μｌを加え、
３７℃で１０〜３０分間静置した。３７℃に温めておい
た２×ＹＴ液体培地（１５０μｇ／ｍｌ アンピシリ
ン、７０μｇ／ｍｌ カナマイシンおよび０．０１％チ
アミンを含む）を５ｍｌ加え、３７℃で１４〜１８時間
培養した。培養液を１５０００ｒｐｍで５分間遠心して
菌体を除き、培養上清１ｍｌに対して２００μｌの２０
％ ＰＥＧ−２．５Ｍ ＮａＣｌ溶液を加え、よく混合
して、室温で１５分間放置した。１５０００ｒｐｍ、５
分間遠心分離して上清を除き、ＴＥバッファー５００μ
ｌに溶解した。フェノール／クロロホルム溶液を等量加
えて懸濁後、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行っ
た。この操作を３回繰り返した後、上清に２．５倍量の
エタノールと０．１倍量の３Ｍ 酢酸ナトリウム溶液を
添加し、−７０℃で５分間放置した。１５０００ｒｐｍ
で５分間遠心分離をしてＤＮＡを沈澱させ、沈澱を７０
％エタノールで洗浄後真空乾燥し、ＴＥバッファー３０
μｌに溶解し、−２０℃で保存した。こうして一本鎖Ｄ
ＮＡを調整した。
５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）で前培養し、前
培養液５０μｌにヘルパーファージ液５０μｌを加え、
３７℃で１０〜３０分間静置した。３７℃に温めておい
た２×ＹＴ液体培地（１５０μｇ／ｍｌ アンピシリ
ン、７０μｇ／ｍｌ カナマイシンおよび０．０１％チ
アミンを含む）を５ｍｌ加え、３７℃で１４〜１８時間
培養した。培養液を１５０００ｒｐｍで５分間遠心して
菌体を除き、培養上清１ｍｌに対して２００μｌの２０
％ ＰＥＧ−２．５Ｍ ＮａＣｌ溶液を加え、よく混合
して、室温で１５分間放置した。１５０００ｒｐｍ、５
分間遠心分離して上清を除き、ＴＥバッファー５００μ
ｌに溶解した。フェノール／クロロホルム溶液を等量加
えて懸濁後、１５０００ｒｐｍで５分間遠心分離を行っ
た。この操作を３回繰り返した後、上清に２．５倍量の
エタノールと０．１倍量の３Ｍ 酢酸ナトリウム溶液を
添加し、−７０℃で５分間放置した。１５０００ｒｐｍ
で５分間遠心分離をしてＤＮＡを沈澱させ、沈澱を７０
％エタノールで洗浄後真空乾燥し、ＴＥバッファー３０
μｌに溶解し、−２０℃で保存した。こうして一本鎖Ｄ
ＮＡを調整した。
【００３３】一本鎖ＤＮＡ ２μｇ、５×Ｓｅｑｕｅｎ
ａｓｅ緩衝液（２００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．
５）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2 および２５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ）２μｌおよびプライマー（０．５ｐｍｏｌ／μ
ｌ）１μｌを加え、６５℃で２分間加温した。３０分間
以上かけてゆっくり３５℃まで冷却していき、鋳型ＤＮ
Ａとプライマーとをアニーリングさせた。この溶液に
０．１Ｍ ジチオスレイトール１μｌ、ラベリングミッ
クス溶液（１．５μＭ ｄＧＴＰ、１．５μＭ ｄＡＴ
Ｐおよび１．５μＭ ｄＴＴＰ）２μｌ、９倍希釈Ｓｅ
ｑｕｅｎａｓｅ酵素液（１．４ｕｎｉｔｓ／μｌ）２μ
ｌ、および［α−35Ｓ］−ｄＣＴＰ（３７ ＴＢｑ／ｍ
ｍｏｌ、３７０ ＭＢｑ／ｍｌ）０．５μｌを穏やかに
混和し、室温で２〜５分間ラベリング反応を行った。予
め、マイクロ遠心チューブに、ｄｄＧＴＰ用、ｄｄＡＴ
Ｐ用、ｄｄＴＴＰ用、ｄｄＧＴＰ用ターミネーションミ
ックス溶液（８μＭ ｄｄＮＴＰ、８０μＭ ｄＧＴ
Ｐ、８０μＭ ｄＡＴＰ、８０μＭｄＣＴＰ、８０μＭ
ｄＴＴＰ、５０ｍＭ ＮａＣｌ）２．５μｌずつ分注
し、少なくとも１分間は３７℃に保温しておいた。各チ
ューブにラベリング反応液を３．５μｌずつ加えて混和
し、３７℃で５分間インキュベートすることにより、タ
ーミネーション反応をさせた。各反応液にストップ溶液
（９５％ ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０
５％ ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンシ
アノールＦＦ）を４μｌ加えてよく混和した後、氷冷
し、−２０℃にて保存した。
ａｓｅ緩衝液（２００ｍＭ トリス塩酸（ｐＨ７．
５）、１００ｍＭ ＭｇＣｌ2 および２５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ）２μｌおよびプライマー（０．５ｐｍｏｌ／μ
ｌ）１μｌを加え、６５℃で２分間加温した。３０分間
以上かけてゆっくり３５℃まで冷却していき、鋳型ＤＮ
Ａとプライマーとをアニーリングさせた。この溶液に
０．１Ｍ ジチオスレイトール１μｌ、ラベリングミッ
クス溶液（１．５μＭ ｄＧＴＰ、１．５μＭ ｄＡＴ
Ｐおよび１．５μＭ ｄＴＴＰ）２μｌ、９倍希釈Ｓｅ
ｑｕｅｎａｓｅ酵素液（１．４ｕｎｉｔｓ／μｌ）２μ
ｌ、および［α−35Ｓ］−ｄＣＴＰ（３７ ＴＢｑ／ｍ
ｍｏｌ、３７０ ＭＢｑ／ｍｌ）０．５μｌを穏やかに
混和し、室温で２〜５分間ラベリング反応を行った。予
め、マイクロ遠心チューブに、ｄｄＧＴＰ用、ｄｄＡＴ
Ｐ用、ｄｄＴＴＰ用、ｄｄＧＴＰ用ターミネーションミ
ックス溶液（８μＭ ｄｄＮＴＰ、８０μＭ ｄＧＴ
Ｐ、８０μＭ ｄＡＴＰ、８０μＭｄＣＴＰ、８０μＭ
ｄＴＴＰ、５０ｍＭ ＮａＣｌ）２．５μｌずつ分注
し、少なくとも１分間は３７℃に保温しておいた。各チ
ューブにラベリング反応液を３．５μｌずつ加えて混和
し、３７℃で５分間インキュベートすることにより、タ
ーミネーション反応をさせた。各反応液にストップ溶液
（９５％ ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０
５％ ブロモフェノールブルー、０．０５％キシレンシ
アノールＦＦ）を４μｌ加えてよく混和した後、氷冷
し、−２０℃にて保存した。
【００３４】反応液は、ポリアクリルアミドゲル電気泳
動直前に７５〜８０℃で２分間加温後氷冷し、ＴＡＫＡ
ＲＡ ＶＥ型電気泳動装置（宝酒造）にて泳動（４５Ｗ
の一定電力、最大電圧２５００Ｖ、最大電流２５ｍＡ）
させた。泳動終了後、片側のガラス板をゲルから外し、
１０％ 酢酸−１２％ メタノール溶液に１５分間浸し
て、ゲル中のＤＮＡ断片を固定した。次にゲルを濾紙上
に移し、８０℃、４０分間減圧乾燥後、Ｘ線フィルム
ＡＩＦ−ＲＸ（フジ）に密着させて、室温にて約１６時
間感光させた。感光済みのフィルムを現像することによ
り、ＤＮＡ塩基配列を読みとった。かくして確認された
塩基配列は、ＭＶ１１８４（ 'ｍｅｃＡ）株では配列表
の配列番号１においてブドウ球菌のβ−ラクタマーゼと
相同性のある領域を欠失させた５３９番目から２３３７
番目までの約１８００塩基が、ＭＶ１１８４（ｍｅｃ
Ａ）株では配列表の配列番号１において１３４番目から
２３３７番目までの約２２００塩基が全て存在している
ことが確認された。
動直前に７５〜８０℃で２分間加温後氷冷し、ＴＡＫＡ
ＲＡ ＶＥ型電気泳動装置（宝酒造）にて泳動（４５Ｗ
の一定電力、最大電圧２５００Ｖ、最大電流２５ｍＡ）
させた。泳動終了後、片側のガラス板をゲルから外し、
１０％ 酢酸−１２％ メタノール溶液に１５分間浸し
て、ゲル中のＤＮＡ断片を固定した。次にゲルを濾紙上
に移し、８０℃、４０分間減圧乾燥後、Ｘ線フィルム
ＡＩＦ−ＲＸ（フジ）に密着させて、室温にて約１６時
間感光させた。感光済みのフィルムを現像することによ
り、ＤＮＡ塩基配列を読みとった。かくして確認された
塩基配列は、ＭＶ１１８４（ 'ｍｅｃＡ）株では配列表
の配列番号１においてブドウ球菌のβ−ラクタマーゼと
相同性のある領域を欠失させた５３９番目から２３３７
番目までの約１８００塩基が、ＭＶ１１８４（ｍｅｃ
Ａ）株では配列表の配列番号１において１３４番目から
２３３７番目までの約２２００塩基が全て存在している
ことが確認された。
【００３５】実施例５ 'ｍｅｃＡタンパク質の産生 'ｍｅｃＡタンパク質を大量に産生させるために、ＰＣ
Ｒ法により増幅させた'ｍｅｃＡ ＤＮＡおよびｍｅｃ
Ａ ＤＮＡをそれぞれプラスミドベクターｐＫＫ２２３
−３にサブクローニングした。実施例３と同様に、各Ｄ
ＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩに
て切断し、これをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにて
同様に切断したプラスミドベクターｐＫＫ２２３−３
（アンピシリン耐性）のｔａｃプロモーターの下流に連
結した。次にＨａｎａｈａｎの方法により、プラスミド
ＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。 'ｍｅｃ
Ａ ＤＮＡを有する組換え大腸菌をＪＭ１０９（ 'ｍｅ
ｃＡ）株、ｍｅｃＡ ＤＮＡ全体を有する組換え大腸菌
をＪＭ１０９（ｍｅｃＡ）株と呼ぶ。
Ｒ法により増幅させた'ｍｅｃＡ ＤＮＡおよびｍｅｃ
Ａ ＤＮＡをそれぞれプラスミドベクターｐＫＫ２２３
−３にサブクローニングした。実施例３と同様に、各Ｄ
ＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩに
て切断し、これをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩにて
同様に切断したプラスミドベクターｐＫＫ２２３−３
（アンピシリン耐性）のｔａｃプロモーターの下流に連
結した。次にＨａｎａｈａｎの方法により、プラスミド
ＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０９株に形質転換した。 'ｍｅｃ
Ａ ＤＮＡを有する組換え大腸菌をＪＭ１０９（ 'ｍｅ
ｃＡ）株、ｍｅｃＡ ＤＮＡ全体を有する組換え大腸菌
をＪＭ１０９（ｍｅｃＡ）株と呼ぶ。
【００３６】組換え大腸菌ＪＭ１０９株をＬＢ液体培地
５ｍｌに接種し、３７℃で一夜振とう培養した。一夜振
とう培養液を新鮮な同培地で１０倍希釈し、ＯＤ＝０．
８（６００ｎｍ）の対数増殖期培養液を作製した。同培
養液０．３ｍｌを新鮮培地９．７ｍｌに加えて、さらに
振とう培養を行った。ＤＮＡの発現を誘導させるため
に、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラ
クトピラノシド）１ｍＭをＯＤ＝０．３およびＯＤ＝
０．５のときに添加し、その後の増殖を観察した。組換
え大腸菌の増殖曲線を、図１及び２に示す。
５ｍｌに接種し、３７℃で一夜振とう培養した。一夜振
とう培養液を新鮮な同培地で１０倍希釈し、ＯＤ＝０．
８（６００ｎｍ）の対数増殖期培養液を作製した。同培
養液０．３ｍｌを新鮮培地９．７ｍｌに加えて、さらに
振とう培養を行った。ＤＮＡの発現を誘導させるため
に、ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ（−）−チオガラ
クトピラノシド）１ｍＭをＯＤ＝０．３およびＯＤ＝
０．５のときに添加し、その後の増殖を観察した。組換
え大腸菌の増殖曲線を、図１及び２に示す。
【００３７】ＩＰＴＧで誘導をかけたＪＭ１０９（ 'ｍ
ｅｃＡ）株の培養液を１ｍｌ採取して菌体を集菌し、希
釈緩衝液（０．２Ｍ トリス塩酸（ｐＨ６．８）、３％
ドデシル硫酸ナトリウム、３０％ グリセロール、１
６％ ２−メルカプトエタノールおよび０．０２％ ブ
ロモフェノールブルー）２０μｌに懸濁し、１００℃で
３分間加熱し、全量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた（１５
ｍＡで約５分、その後３０ｍＡで約３時間）。その結
果、分子量４０，０００のところに太いバンドが確認さ
れた（図３）。同様にＩＰＴＧで誘導をかけて培養した
'ｍｅｃＡ ＤＮＡを持たない大腸菌（ＪＭ１０９（ｐ
ＫＫ２２３−３））では、同じ位置にかかるバンドが確
認されなかったため、このタンパク質が 'ｍｅｃＡタン
パク質であると推測された。
ｅｃＡ）株の培養液を１ｍｌ採取して菌体を集菌し、希
釈緩衝液（０．２Ｍ トリス塩酸（ｐＨ６．８）、３％
ドデシル硫酸ナトリウム、３０％ グリセロール、１
６％ ２−メルカプトエタノールおよび０．０２％ ブ
ロモフェノールブルー）２０μｌに懸濁し、１００℃で
３分間加熱し、全量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけた（１５
ｍＡで約５分、その後３０ｍＡで約３時間）。その結
果、分子量４０，０００のところに太いバンドが確認さ
れた（図３）。同様にＩＰＴＧで誘導をかけて培養した
'ｍｅｃＡ ＤＮＡを持たない大腸菌（ＪＭ１０９（ｐ
ＫＫ２２３−３））では、同じ位置にかかるバンドが確
認されなかったため、このタンパク質が 'ｍｅｃＡタン
パク質であると推測された。
【００３８】ＪＭ１０９（ 'ｍｅｃＡ）株の培養液から
集菌した菌体を、滅菌生理食塩水に懸濁し、０℃におい
て１５秒間、１０回超音波破砕（２０ｋＨｚ；Ｏｈｔａ
ｋｅ，Ｔｏｋｙｏ）をした。これを１５０００ｒｐｍで
１０分間遠心分離した後、上清を除いて沈澱を適当量の
滅菌精製水に懸濁して、 'ｍｅｃＡタンパク質調製液と
した。この調製液について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った
（図４）。その結果本発明の 'ｍｅｃＡタンパク質は、
超音波破砕後の沈澱に多く存在していた。
集菌した菌体を、滅菌生理食塩水に懸濁し、０℃におい
て１５秒間、１０回超音波破砕（２０ｋＨｚ；Ｏｈｔａ
ｋｅ，Ｔｏｋｙｏ）をした。これを１５０００ｒｐｍで
１０分間遠心分離した後、上清を除いて沈澱を適当量の
滅菌精製水に懸濁して、 'ｍｅｃＡタンパク質調製液と
した。この調製液について、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った
（図４）。その結果本発明の 'ｍｅｃＡタンパク質は、
超音波破砕後の沈澱に多く存在していた。
【００３９】電気泳動後、ゲルの端の一部を切りとり、
染色および脱色を行った。それを染色していないゲルと
あわせて 'ｍｅｃＡタンパク質のバンド部分よりタンパ
クを溶出させた。その結果、１００ｍｌの培養で約２ｍ
ｇの 'ｍｅｃＡタンパク質を得た。
染色および脱色を行った。それを染色していないゲルと
あわせて 'ｍｅｃＡタンパク質のバンド部分よりタンパ
クを溶出させた。その結果、１００ｍｌの培養で約２ｍ
ｇの 'ｍｅｃＡタンパク質を得た。
【００４０】実施例６ 黄色ブドウ球菌の判定 実施例５で溶出させた 'ｍｅｃＡタンパク質を凍結乾燥
し、適当量の滅菌生理食塩水に溶解させたものとＦｒｅ
ｕｎｄの完全アジュバントを、金属フランジル付ルアー
ロックの注射器を用いて１：１で混合し、均一な乳濁液
とした（ 'ｍｅｃＡタンパク質抗原液）。この抗原液を
ウサギ二匹に注射し、対照として一匹に滅菌生理食塩水
を注射した（使用したウサギは、いずれも体重２．５ｋ
ｇの雄）。抗原液は、１ｍｌを下肢指掌部数カ所に分け
て注射した。１週間ごとに４回注射を行い、５週目に血
清を採取して抗血清を得た。抗血清は、５６℃で３０分
間の処理により非動化して用いた。
し、適当量の滅菌生理食塩水に溶解させたものとＦｒｅ
ｕｎｄの完全アジュバントを、金属フランジル付ルアー
ロックの注射器を用いて１：１で混合し、均一な乳濁液
とした（ 'ｍｅｃＡタンパク質抗原液）。この抗原液を
ウサギ二匹に注射し、対照として一匹に滅菌生理食塩水
を注射した（使用したウサギは、いずれも体重２．５ｋ
ｇの雄）。抗原液は、１ｍｌを下肢指掌部数カ所に分け
て注射した。１週間ごとに４回注射を行い、５週目に血
清を採取して抗血清を得た。抗血清は、５６℃で３０分
間の処理により非動化して用いた。
【００４１】黄色ブドウ球菌として１９９１年に臨床分
離されたＭＲＳＡ２株（ＴＳ２，ＴＳ４）およびＭＳＳ
Ａ２株（ＲＮ２６７７，２０９Ｐ）を用いて、ガラス上
で上記抗血清とのためし凝集反応を行った。その結果、
ＪＭ１０９（ 'ｍｅｃＡ）株から得られた抗血清はＭＲ
ＳＡ２株と直ちに凝集反応が起こったが、ＭＳＳＡ２株
とは凝集反応が起こらなかった。また’ｍｅｃＡを持た
ないＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３）株から得られた抗
血清は、ＭＲＳＡ２株、ＭＳＳＡ２株ともに凝集反応が
起こらなかった。さらに免疫を行わなかったウサギの対
照血清とは、どの株も反応しなかった。
離されたＭＲＳＡ２株（ＴＳ２，ＴＳ４）およびＭＳＳ
Ａ２株（ＲＮ２６７７，２０９Ｐ）を用いて、ガラス上
で上記抗血清とのためし凝集反応を行った。その結果、
ＪＭ１０９（ 'ｍｅｃＡ）株から得られた抗血清はＭＲ
ＳＡ２株と直ちに凝集反応が起こったが、ＭＳＳＡ２株
とは凝集反応が起こらなかった。また’ｍｅｃＡを持た
ないＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３−３）株から得られた抗
血清は、ＭＲＳＡ２株、ＭＳＳＡ２株ともに凝集反応が
起こらなかった。さらに免疫を行わなかったウサギの対
照血清とは、どの株も反応しなかった。
【００４２】
【発明の効果】本発明の 'ｍｅｃＡタンパク質は、遺伝
子組換えの手法を用いて容易に製造することができ、黄
色ブドウ球菌の新鮮分離菌株がＭＲＳＡかＭＳＳＡかの
判定を行うための抗血清（ポリクローナル抗体、モノク
ローナル抗体）を作製する上での抗原タンパク質として
有用である。また 'ｍｅｃＡ ＤＮＡは、遺伝子組換え
法でかかる 'ｍｅｃＡタンパク質を製造する際に必要な
要素であると同時に、ＭＲＳＡを検出・診断するための
手段としても有用である。
子組換えの手法を用いて容易に製造することができ、黄
色ブドウ球菌の新鮮分離菌株がＭＲＳＡかＭＳＳＡかの
判定を行うための抗血清（ポリクローナル抗体、モノク
ローナル抗体）を作製する上での抗原タンパク質として
有用である。また 'ｍｅｃＡ ＤＮＡは、遺伝子組換え
法でかかる 'ｍｅｃＡタンパク質を製造する際に必要な
要素であると同時に、ＭＲＳＡを検出・診断するための
手段としても有用である。
【００４３】
【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：２４５５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 生物名：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ 配列 GATTATACTT AACATTAAAA AAGATGATAA CACCTTCTAC ACCTCCATAT CACAAAAAAT 60 TATAACATTA TTTTGACATA AATACTACAT TTGTAATATA CTACAAATGT AGTCTTATAT 120 AAGGAGGATA TTG ATG AAA AAG ATA AAA ATT GTT CCA CTT ATT TTA ATA 169 Met Lys Lys Ile Lys Ile Val Pro Leu Ile Leu Ile 1 5 10 GTT GTA GTT GTC GGG TTT GGT ATA TAT TTT TAT GCT TCA AAA GAT AAA 217 Val Val Val Val Gly Phe Gly Ile Tyr Phe Tyr Ala Ser Lys Asp Lys 15 20 25 GAA ATT AAT AAT ACT ATT GAT GCA ATT GAA GAT AAA AAT TTC AAA CAA 265 Glu Ile Asn Asn Thr Ile Asp Ala Ile Glu Asp Lys Asn Phe Lys Gln 30 35 40 GTT TAT AAA GAT AGC AGT TAT ATT TCT AAA AGC GAT AAT GGT GAA GTA 313 Val Tyr Lys Asp Ser Ser Tyr Ile Ser Lys Ser Asp Asn Gly Glu Val 45 50 55 60 GAA ATG ACT GAA CGT CCG ATA AAA ATA TAT AAT AGT TTA GGC GTT AAA 361 Glu Met Thr Glu Arg Pro Ile Lys Ile Tyr Asn Ser Leu Gly Val Lys 65 70 75 GAT ATA AAC ATT CAG GAT CGT AAA ATA AAA AAA GTA TCT AAA AAT AAA 409 Asp Ile Asn Ile Gln Asp Arg Lys Ile Lys Lys Val Ser Lys Asn Lys 80 85 90 AAA CGA GTA GAT GCT CAA TAT AAA ATT AAA ACA AAC TAC GGT AAC ATT 457 Lys Arg Val Asp Ala Gln Tyr Lys Ile Lys Thr Asn Tyr Gly Asn Ile 95 100 105 GAT CGC AAC GTT CAA TTT AAT TTT GTT AAA GAA GAT GGT ATG TGG AAG 505 Asp Arg Asn Val Gln Phe Asn Phe Val Lys Glu Asp Gly Met Trp Lys 110 115 120 TTA GAT TGG GAT CAT AGC GTC ATT ATT CCA GGA ATG CAG AAA GAC CAA 553 Leu Asp Trp Asp His Ser Val Ile Ile Pro Gly Met Gln Lys Asp Gln 125 130 135 140 AGC ATA CAT ATT GAA AAT TTA AAA TCA GAA CGT GGT AAA ATT TTA GAC 601 Ser Ile His Ile Glu Asn Leu Lys Ser Glu Arg Gly Lys Ile Leu Asp 145 150 155 CGA AAC AAT GTG GAA TTG GCC AAT ACA GGA ACA CAT ATG AGA TTA GGC 649 Arg Asn Asn Val Glu Leu Ala Asn Thr Gly Thr His Met Arg Leu Gly 160 165 170 ATC GTT CCA AAG AAT GTA TCT AAA AAA GAT TAT AAA GCA ATC GCT AAA 697 Ile Val Pro Lys Asn Val Ser Lys Lys Asp Tyr Lys Ala Ile Ala Lys 175 180 185 GAA CTA AGT ATT TCT GAA GAC TAT ATC AAC AAC AAA TGG ATC AAA ATT 745 Glu Leu Ser Ile Ser Glu Asp Tyr Ile Asn Asn Lys Trp Ile Lys Ile 190 195 200 GGG TAC AAG ATG ATA CCT TCG TTC CAC TTT AAA ACC GTT AAA AAA ATG 793 Gly Tyr Lys Met Ile Pro Ser Phe His Phe Lys Thr Val Lys Lys Met 205 210 215 220 GAT GAA TAT TTA AGT GAT TTC GCA AAA AAA TTT CAT CTT ACA ACT AAT 841 Asp Glu Tyr Leu Ser Asp Phe Ala Lys Lys Phe His Leu Thr Thr Asn 225 230 235 GAA ACA GAA AGT CGT AAC TAT CCT CTA GGA AAA GCG ACT TCA CAT CTA 889 Glu Thr Glu Ser Arg Asn Tyr Pro Leu Gly Lys Ala Thr Ser His Leu 240 245 250 TTA GGT TAT GTT GGT CCC ATT AAC TCT GAA GAA TTA AAA CAA AAA GAA 937 Leu Gly Tyr Val Gly Pro Ile Asn Ser Glu Glu Leu Lys Gln Lys Glu 255 260 265 TAT AAA GGC TAT AAA GAT GAT GCA GTT ATT GGT AAA AAG GGA CTC GAA 985 Tyr Lys Gly Tyr Lys Asp Asp Ala Val Ile Gly Lys Lys Gly Leu Glu 270 275 280 AAA CTT TAC GAT AAA AAG CTC CAA CAT GAA GAT GGC TAT CGT GTC ACA 1033 Lys Leu Tyr Asp Lys Lys Leu Gln His Glu Asp Gly Tyr Arg Val Thr 285 290 295 300 ATC GTT AGA GTC GAC GAT AAT AGC AAT ACA ATC GCA CAT ACA TTA ATA 1081 Ile Val Arg Val Asp Asp Asn Ser Asn Thr Ile Ala His Thr Leu Ile 305 310 315 GAG AAA AAG AAA AAA GAT GGC AAA GAT ATT CAA CTA ACT ATT GAT GCT 1129 Glu Lys Lys Lys Lys Asp Gly Lys Asp Ile Gln Leu Thr Ile Asp Ala 320 325 330 AAA GTT CAA AAG AGT ATT TAT AAC AAC ATG AAA AAT GAT TAT GGC TCA 1177 Lys Val Gln Lys Ser Ile Tyr Asn Asn Met Lys Asn Asp Tyr Gly Ser 335 340 345 GGT ACT GCT ATC CAC CCT CAA ACA GGT GAA TTA TTA GCA CTT GTA AGC 1225 Gly Thr Ala Ile His Pro Gln Thr Gly Glu Leu Leu Ala Leu Val Ser 350 355 360 ACA CCT TCA TAT GAC GTC TAT CCA TTT ATG TAT GGC ATG AGT AAC GAA 1273 Thr Pro Ser Tyr Asp Val Tyr Pro Phe Met Tyr Gly Met Ser Asn Glu 365 370 375 380 GAA TAT AAT AAA TTA ACC GAA GAT AAA AAA GAA CCT CTG CTC AAC AAG 1321 Glu Tyr Asn Lys Leu Thr Glu Asp Lys Lys Glu Pro Leu Leu Asn Lys 385 390 395 TTC CAG ATT ACA ACT TCA CCA GGT TCA ACT CAA AAA ATA TTA ACA GCA 1369 Phe Gln Ile Thr Thr Ser Pro Gly Ser Thr Gln Lys Ile Leu Thr Ala 400 405 410 ATG ATT GGG TTA AAT AAC AAA ACA TTA GAC GAT AAA ACA AGT TAT AAA 1417 Met Ile Gly Leu Asn Asn Lys Thr Leu Asp Asp Lys Thr Ser Tyr Lys 415 420 425 ATC GAT GGT AAA GGT TGG CAA AAA GAT AAA TCT TGG GGT GGT TAC AAC 1465 Ile Asp Gly Lys Gly Trp Gln Lys Asp Lys Ser Trp Gly Gly Tyr Asn 430 435 440 GTT ACA AGA TAT GAA GTG GTA AAT GGT AAT ATC GAC TTA AAA CAA GCA 1513 Val Thr Arg Tyr Glu Val Val Asn Gly Asn Ile Asp Leu Lys Gln Ala 445 450 455 460 ATA GAA TCA TCA GAT AAC ATT TTC TTT GCT AGA GTA GCA CTC GAA TTA 1561 Ile Glu Ser Ser Asp Asn Ile Phe Phe Ala Arg Val Ala Leu Glu Leu 465 470 475 GGC AGT AAG AAA TTT GAA AAA GGC ATG AAA AAA CTA GGT GTT GGT GAA 1609 Gly Ser Lys Lys Phe Glu Lys Gly Met Lys Lys Leu Gly Val Gly Glu 480 485 490 GAT ATA CCA AGT GAT TAT CCA TTT TAT AAT GCT CAA ATT TCA AAC AAA 1657 Asp Ile Pro Ser Asp Tyr Pro Phe Tyr Asn Ala Gln Ile Ser Asn Lys 495 500 505 AAT TTA GAT AAT GAA ATA TTA TTA GCT GAT TCA GGT TAC GGA CAA GGT 1705 Asn Leu Asp Asn Glu Ile Leu Leu Ala Asp Ser Gly Tyr Gly Gln Gly 510 515 520 GAA ATA CTG ATT AAC CCA GTA CAG ATC CTT TCA ATC TAT AGC GCA TTA 1753 Glu Ile Leu Ile Asn Pro Val Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Ala Leu 525 530 535 540 GAA AAT AAT GGC AAT ATT AAC GCA CCT CAC TTA TTA AAA GAC ACG AAA 1801 Glu Asn Asn Gly Asn Ile Asn Ala Pro His Leu Leu Lys Asp Thr Lys 545 550 555 AAC AAA GTT TGG AAG AAA AAT ATT ATT TCC AAA GAA AAT ATC AAT CTA 1849 Asn Lys Val Trp Lys Lys Asn Ile Ile Ser Lys Glu Asn Ile Asn Leu 560 565 570 TTA AAT GAT GGT ATG CAA CAA GTC GTA AAT AAA ACA CAT AAA GAA GAT 1897 Leu Asn Asp Gly Met Gln Gln Val Val Asn Lys Thr His Lys Glu Asp 575 580 585 ATT TAT AGA TCT TAT GCA AAC TTA ATT GGC AAA TCC GGT ACT GCA GAA 1945 Ile Tyr Arg Ser Tyr Ala Asn Leu Ile Gly Lys Ser Gly Thr Ala Glu 590 595 600 CTC AAA ATG AAA CAA GGA GAA ACT GGC AGA CAA ATT GGG TGG TTT ATA 1993 Leu Lys Met Lys Gln Gly Glu Thr Gly Arg Gln Ile Gly Trp Phe Ile 605 610 615 620 TCA TAT GAT AAA GAT AAT CCA AAC ATG ATG ATG GCT ATT AAT GTT AAA 2041 Ser Tyr Asp Lys Asp Asn Pro Asn Met Met Met Ala Ile Asn Val Lys 625 630 635 GAT GTA CAA GAT AAA GGA ATG GCT AGC TAC AAT GCC AAA ATC TCA GGT 2089 Asp Val Gln Asp Lys Gly Met Ala Ser Tyr Asn Ala Lys Ile Ser Gly 640 645 650 AAA GTG TAT GAT GAG CTA TAT GAG AAC GGT AAT AAA AAA TAC GAT ATA 2137 Lys Val Tyr Asp Glu Leu Tyr Glu Asn Gly Asn Lys Lys Tyr Asp Ile 655 660 665 GAT GAA TAA CAAAAGCAGT GAAGCATCCG TAACGATGGT TGCTTCACTG 2186 Asp Glu Stop 670 TTTTATTATG AATTATTAAT AAGTGCTGTT ACTTCTCCTT AAATACATTT CTCATTTCAT 2246 GTATGTTGAA AGTGACACTG TAACGAGTCC ATTTTCTTTT TTTATGGATT TCTTATTTGT 2306 AATTTCAGCG ATAACGTACA ATGTATTACC TGGGTATACA GGTTTAATAA ATTTTAACGT 2366 TATTCATGTT GTGTTCCTGC TACAACTTCT TCTCCGTATT TACCTTCTTC TACCCATAAT 2426 TTAAATGATA TTGAAAGTGT ATTGCATGC 2455
【００４４】配列番号：２ 配列の長さ：１７８５ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ ｔｏ ｍＲＮＡ 起源 生物名：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ 配列 ATG CAG AAA GAC CAA AGC ATA CAT ATT GAA AAT TTA AAA TCA GAA CGT 48 Met Gln Lys Asp Gln Ser Ile His Ile Glu Asn Leu Lys Ser Glu Arg 1 5 10 15 GGT AAA ATT TTA GAC CGA AAC AAT GTG GAA TTG GCC AAT ACA GGA ACA 96 Gly Lys Ile Leu Asp Arg Asn Asn Val Glu Leu Ala Asn Thr Gly Thr 20 25 30 CAT ATG AGA TTA GGC ATC GTT CCA AAG AAT GTA TCT AAA AAA GAT TAT 144 His Met Arg Leu Gly Ile Val Pro Lys Asn Val Ser Lys Lys Asp Tyr 35 40 45 AAA GCA ATC GCT AAA GAA CTA AGT ATT TCT GAA GAC TAT ATC AAC AAC 192 Lys Ala Ile Ala Lys Glu Leu Ser Ile Ser Glu Asp Tyr Ile Asn Asn 50 55 60 AAA TGG ATC AAA ATT GGG TAC AAG ATG ATA CCT TCG TTC CAC TTT AAA 240 Lys Trp Ile Lys Ile Gly Tyr Lys Met Ile Pro Ser Phe His Phe Lys 65 70 75 80 ACC GTT AAA AAA ATG GAT GAA TAT TTA AGT GAT TTC GCA AAA AAA TTT 288 Thr Val Lys Lys Met Asp Glu Tyr Leu Ser Asp Phe Ala Lys Lys Phe 85 90 95 CAT CTT ACA ACT AAT GAA ACA GAA AGT CGT AAC TAT CCT CTA GGA AAA 336 His Leu Thr Thr Asn Glu Thr Glu Ser Arg Asn Tyr Pro Leu Gly Lys 100 105 110 GCG ACT TCA CAT CTA TTA GGT TAT GTT GGT CCC ATT AAC TCT GAA GAA 384 Ala Thr Ser His Leu Leu Gly Tyr Val Gly Pro Ile Asn Ser Glu Glu 115 120 125 TTA AAA CAA AAA GAA TAT AAA GGC TAT AAA GAT GAT GCA GTT ATT GGT 432 Leu Lys Gln Lys Glu Tyr Lys Gly Tyr Lys Asp Asp Ala Val Ile Gly 130 135 140 AAA AAG GGA CTC GAA AAA CTT TAC GAT AAA AAG CTC CAA CAT GAA GAT 480 Lys Lys Gly Leu Glu Lys Leu Tyr Asp Lys Lys Leu Gln His Glu Asp 145 150 155 160 GGC TAT CGT GTC ACA ATC GTT AGA GTC GAC GAT AAT AGC AAT ACA ATC 528 Gly Tyr Arg Val Thr Ile Val Arg Val Asp Asp Asn Ser Asn Thr Ile 165 170 175 GCA CAT ACA TTA ATA GAG AAA AAG AAA AAA GAT GGC AAA GAT ATT CAA 576 Ala His Thr Leu Ile Glu Lys Lys Lys Lys Asp Gly Lys Asp Ile Gln 180 185 190 CTA ACT ATT GAT GCT AAA GTT CAA AAG AGT ATT TAT AAC AAC ATG AAA 624 Leu Thr Ile Asp Ala Lys Val Gln Lys Ser Ile Tyr Asn Asn Met Lys 195 200 205 AAT GAT TAT GGC TCA GGT ACT GCT ATC CAC CCT CAA ACA GGT GAA TTA 672 Asn Asp Tyr Gly Ser Gly Thr Ala Ile His Pro Gln Thr Gly Glu Leu 210 215 220 TTA GCA CTT GTA AGC ACA CCT TCA TAT GAC GTC TAT CCA TTT ATG TAT 720 Leu Ala Leu Val Ser Thr Pro Ser Tyr Asp Val Tyr Pro Phe Met Tyr 225 230 235 240 GGC ATG AGT AAC GAA GAA TAT AAT AAA TTA ACC GAA GAT AAA AAA GAA 768 Gly Met Ser Asn Glu Glu Tyr Asn Lys Leu Thr Glu Asp Lys Lys Glu 245 250 255 CCT CTG CTC AAC AAG TTC CAG ATT ACA ACT TCA CCA GGT TCA ACT CAA 816 Pro Leu Leu Asn Lys Phe Gln Ile Thr Thr Ser Pro Gly Ser Thr Gln 260 265 270 AAA ATA TTA ACA GCA ATG ATT GGG TTA AAT AAC AAA ACA TTA GAC GAT 864 Lys Ile Leu Thr Ala Met Ile Gly Leu Asn Asn Lys Thr Leu Asp Asp 275 280 285 AAA ACA AGT TAT AAA ATC GAT GGT AAA GGT TGG CAA AAA GAT AAA TCT 912 Lys Thr Ser Tyr Lys Ile Asp Gly Lys Gly Trp Gln Lys Asp Lys Ser 290 295 300 TGG GGT GGT TAC AAC GTT ACA AGA TAT GAA GTG GTA AAT GGT AAT ATC 960 Trp Gly Gly Tyr Asn Val Thr Arg Tyr Glu Val Val Asn Gly Asn Ile 305 310 315 320 GAC TTA AAA CAA GCA ATA GAA TCA TCA GAT AAC ATT TTC TTT GCT AGA 1008 Asp Leu Lys Gln Ala Ile Glu Ser Ser Asp Asn Ile Phe Phe Ala Arg 325 330 335 GTA GCA CTC GAA TTA GGC AGT AAG AAA TTT GAA AAA GGC ATG AAA AAA 1056 Val Ala Leu Glu Leu Gly Ser Lys Lys Phe Glu Lys Gly Met Lys Lys 340 345 350 CTA GGT GTT GGT GAA GAT ATA CCA AGT GAT TAT CCA TTT TAT AAT GCT 1104 Leu Gly Val Gly Glu Asp Ile Pro Ser Asp Tyr Pro Phe Tyr Asn Ala 355 360 365 CAA ATT TCA AAC AAA AAT TTA GAT AAT GAA ATA TTA TTA GCT GAT TCA 1152 Gln Ile Ser Asn Lys Asn Leu Asp Asn Glu Ile Leu Leu Ala Asp Ser 370 375 380 GGT TAC GGA CAA GGT GAA ATA CTG ATT AAC CCA GTA CAG ATC CTT TCA 1200 Gly Tyr Gly Gln Gly Glu Ile Leu Ile Asn Pro Val Gln Ile Leu Ser 385 390 395 400 ATC TAT AGC GCA TTA GAA AAT AAT GGC AAT ATT AAC GCA CCT CAC TTA 1248 Ile Tyr Ser Ala Leu Glu Asn Asn Gly Asn Ile Asn Ala Pro His Leu 405 410 415 TTA AAA GAC ACG AAA AAC AAA GTT TGG AAG AAA AAT ATT ATT TCC AAA 1296 Leu Lys Asp Thr Lys Asn Lys Val Trp Lys Lys Asn Ile Ile Ser Lys 420 425 430 GAA AAT ATC AAT CTA TTA AAT GAT GGT ATG CAA CAA GTC GTA AAT AAA 1344 Glu Asn Ile Asn Leu Leu Asn Asp Gly Met Gln Gln Val Val Asn Lys 435 440 445 ACA CAT AAA GAA GAT ATT TAT AGA TCT TAT GCA AAC TTA ATT GGC AAA 1392 Thr His Lys Glu Asp Ile Tyr Arg Ser Tyr Ala Asn Leu Ile Gly Lys 450 455 460 TCC GGT ACT GCA GAA CTC AAA ATG AAA CAA GGA GAA ACT GGC AGA CAA 1440 Ser Gly Thr Ala Glu Leu Lys Met Lys Gln Gly Glu Thr Gly Arg Gln 465 470 475 480 ATT GGG TGG TTT ATA TCA TAT GAT AAA GAT AAT CCA AAC ATG ATG ATG 1488 Ile Gly Trp Phe Ile Ser Tyr Asp Lys Asp Asn Pro Asn Met Met Met 485 490 495 GCT ATT AAT GTT AAA GAT GTA CAA GAT AAA GGA ATG GCT AGC TAC AAT 1536 Ala Ile Asn Val Lys Asp Val Gln Asp Lys Gly Met Ala Ser Tyr Asn 500 505 510 GCC AAA ATC TCA GGT AAA GTG TAT GAT GAG CTA TAT GAG AAC GGT AAT 1584 Ala Lys Ile Ser Gly Lys Val Tyr Asp Glu Leu Tyr Glu Asn Gly Asn 515 520 525 AAA AAA TAC GAT ATA GAT GAA TAA CAAAAGCAGT GAAGCATCCG TAACGATGGT 1634 Lys Lys Tyr Asp Ile Asp Glu Stop 530 535 TGCTTCACTG TTTTATTATG AATTATTAAT AAGTGCTGTT ACTTCTCCTT AAATACATTT 1694 CTCATTTCAT GTATGTTGAA AGTGACACTG TAACGAGTCC ATTTTCTTTT TTTATGGATT 1754 TCTTATTTGT AATTTCAGCG ATAACGTACA A 1785
【００４５】配列番号：３ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGGAATTCAT GCAGAAAGAC CAAAGC 26
【００４６】配列番号：４ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGGTAAAAGC TTGTACGTTA TCGCTG 26
【００４７】配列番号：５ 配列の長さ：３１ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGGAATTCAT GAAAAAGATA AAAATTGTTC C 31
【００４８】配列番号：６ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTTTCCCAGT CACGA 15
【図１】組換え大腸菌ＪＭ１０９（ｍｅｃＡ）株の増殖
曲線を吸光度（６００ｎｍ）で表した図面である。図
中、□はＩＰＴＧによる誘導をかけなかった場合、○は
ＯＤ＝０．３のときにＩＰＴＧで誘導をかけた場合、△
はＯＤ＝０．５のときにＩＰＴＧで誘導をかけた場合を
それぞれ表す。
曲線を吸光度（６００ｎｍ）で表した図面である。図
中、□はＩＰＴＧによる誘導をかけなかった場合、○は
ＯＤ＝０．３のときにＩＰＴＧで誘導をかけた場合、△
はＯＤ＝０．５のときにＩＰＴＧで誘導をかけた場合を
それぞれ表す。
【図２】組換え大腸菌ＪＭ１０９（ 'ｍｅｃＡ）株の増
殖曲線を吸光度（６００ｎｍ）で表した図面である。図
中、□はＩＰＴＧによる誘導をかけなかった場合、○は
ＯＤ＝０．３のときにＩＰＴＧで誘導をかけた場合、△
はＯＤ＝０．５のときにＩＰＴＧで誘導をかけた場合を
それぞれ表す。
殖曲線を吸光度（６００ｎｍ）で表した図面である。図
中、□はＩＰＴＧによる誘導をかけなかった場合、○は
ＯＤ＝０．３のときにＩＰＴＧで誘導をかけた場合、△
はＯＤ＝０．５のときにＩＰＴＧで誘導をかけた場合を
それぞれ表す。
【図３】誘導をかけた組換え大腸菌ＪＭ１０９（ 'ｍｅ
ｃＡ）株の培養液を集菌して、その全量についてＳＤＳ
−ＰＡＧＥを行った電気泳動パターンを表す図面であ
る。図中、レーン１は組換え大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ
２２３−３）株をＩＰＴＧで誘導をかけずに培養を行っ
た場合、レーン２は組換え大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２
２３−３）株をＩＰＴＧで誘導をかけて培養を行った場
合、レーン３は組換え大腸菌ＪＭ１０９（ 'ｍｅｃＡ）
株をＩＰＴＧで誘導をかけずに培養を行った場合、レー
ン２は組換え大腸菌ＪＭ１０９（ 'ｍｅｃＡ）株をＩＰ
ＴＧで誘導をかけて培養を行った場合の結果をそれぞれ
表す。
ｃＡ）株の培養液を集菌して、その全量についてＳＤＳ
−ＰＡＧＥを行った電気泳動パターンを表す図面であ
る。図中、レーン１は組換え大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ
２２３−３）株をＩＰＴＧで誘導をかけずに培養を行っ
た場合、レーン２は組換え大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２
２３−３）株をＩＰＴＧで誘導をかけて培養を行った場
合、レーン３は組換え大腸菌ＪＭ１０９（ 'ｍｅｃＡ）
株をＩＰＴＧで誘導をかけずに培養を行った場合、レー
ン２は組換え大腸菌ＪＭ１０９（ 'ｍｅｃＡ）株をＩＰ
ＴＧで誘導をかけて培養を行った場合の結果をそれぞれ
表す。
【図４】誘導をかけた組換え大腸菌ＪＭ１０９（ 'ｍｅ
ｃＡ）株の培養液を集菌して菌体を洗浄、超音波破砕し
た後の上清と沈殿についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った電
気泳動パターンを表す図面である。図中、レーン１は菌
体全体を、レーン２は沈殿物を、レーン３は上清の結果
をそれぞれ表す。
ｃＡ）株の培養液を集菌して菌体を洗浄、超音波破砕し
た後の上清と沈殿についてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った電
気泳動パターンを表す図面である。図中、レーン１は菌
体全体を、レーン２は沈殿物を、レーン３は上清の結果
をそれぞれ表す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 河野 恵 東京都調布市多摩川５丁目３番地１ネオコ −ポ202 (72)発明者 平松 啓一 東京都八王子市北野町23番地12 (72)発明者 笹津 備規 東京都日野市大字下田397番地の５ (72)発明者 野口 雅久 東京都八王子市南大沢５丁目７番地２− 501 (72)発明者 勝呂 一也 神奈川県足柄下郡箱根町大平台406番地
Claims (11)
- 【請求項１】 下記の理化学的性質を有することを特徴
とする 'ｍｅｃＡタンパク質。 ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分
子量が、約４０，０００である。 メチシリン耐性黄色ブドウ球菌におけるメチシリン
耐性機構を支配する。 - 【請求項２】 メチシリン耐性黄色ブドウ球菌のメチシ
リン耐性タンパクｍｅｃＡのアミノ酸配列のうちＮ末端
側からアミノ酸数が１〜１３５番目まで欠損しているこ
とを特徴とする請求項１記載の 'ｍｅｃＡタンパク質 - 【請求項３】 配列表の配列番号２に記載のアミノ酸配
列で表されることを特徴とする請求項１記載の 'ｍｅｃ
Ａタンパク質。 - 【請求項４】 請求項１〜３のいずれかに記載の 'ｍｅ
ｃＡタンパク質をコードするＤＮＡ。 - 【請求項５】 配列表の配列番号２に記載の塩基配列で
表されることを特徴とする請求項４記載のＤＮＡ。 - 【請求項６】 配列表の配列番号３及び４に記載の合成
ＤＮＡで増幅されることを特徴とするＤＮＡ。 - 【請求項７】 請求項４〜６のいずれかに記載のＤＮＡ
を有する組換えベクター。 - 【請求項８】 請求項７記載の組換えベクターで、宿主
細胞を形質転換させて得られた形質転換体。 - 【請求項９】 請求項８記載の形質転換体を培養して '
ｍｅｃＡタンパク質を産生させる方法。 - 【請求項１０】 請求項９記載の 'ｍｅｃＡタンパク質
を産生する方法により得られた 'ｍｅｃＡタンパク質。 - 【請求項１１】 請求項１、２または１０のいずれかに
記載の 'ｍｅｃＡタンパク質を用いることを特徴とする
メチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1222694A JP3525475B2 (ja) | 1994-01-10 | 1994-01-10 | 新規な ’ｍｅｃＡタンパク質、それをコードするＤＮＡ、およびそれを用いたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1222694A JP3525475B2 (ja) | 1994-01-10 | 1994-01-10 | 新規な ’ｍｅｃＡタンパク質、それをコードするＤＮＡ、およびそれを用いたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07209294A true JPH07209294A (ja) | 1995-08-11 |
| JP3525475B2 JP3525475B2 (ja) | 2004-05-10 |
Family
ID=11799467
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1222694A Expired - Lifetime JP3525475B2 (ja) | 1994-01-10 | 1994-01-10 | 新規な ’ｍｅｃＡタンパク質、それをコードするＤＮＡ、およびそれを用いたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3525475B2 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5994066A (en) * | 1995-09-11 | 1999-11-30 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US6001564A (en) * | 1994-09-12 | 1999-12-14 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US7943346B2 (en) | 1994-09-12 | 2011-05-17 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Probes and primers for detection of bacterial pathogens and antibiotic resistance genes |
| US8034588B2 (en) | 1997-11-04 | 2011-10-11 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Species-specific, genus-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial and fungal pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for diagnosis in microbiology laboratories |
| US8114601B2 (en) | 1999-09-28 | 2012-02-14 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Highly conserved genes and their use to generate probes and primers for detection of microorganisms |
| US8426137B2 (en) | 1996-11-04 | 2013-04-23 | Genohm Sciences Canada, Inc. | Methods and probes for detecting a vancomycin resistance gene |
-
1994
- 1994-01-10 JP JP1222694A patent/JP3525475B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6001564A (en) * | 1994-09-12 | 1999-12-14 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US7943346B2 (en) | 1994-09-12 | 2011-05-17 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Probes and primers for detection of bacterial pathogens and antibiotic resistance genes |
| US5994066A (en) * | 1995-09-11 | 1999-11-30 | Infectio Diagnostic, Inc. | Species-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for routine diagnosis in microbiology laboratories |
| US8426137B2 (en) | 1996-11-04 | 2013-04-23 | Genohm Sciences Canada, Inc. | Methods and probes for detecting a vancomycin resistance gene |
| US8034588B2 (en) | 1997-11-04 | 2011-10-11 | Geneohm Sciences Canada Inc. | Species-specific, genus-specific and universal DNA probes and amplification primers to rapidly detect and identify common bacterial and fungal pathogens and associated antibiotic resistance genes from clinical specimens for diagnosis in microbiology laboratories |
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