JPH0718855B2 - 自動臨床分析システム - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒト血中リポタンパクサブフラクション中のコ
レステロール分布の自動分析を行う自動臨床分析システ
ムに関する。

〔従来の技術〕

ヒト血中リポタンパクサブフラクション中に含まれるコ
レステロール分布を求めるためには、リポタンパクサブ
フラクションを分画しなければならない。これには、従
来より超遠心法及び電気泳動法が用いられてきた。超遠
心法は各フラクションの密度の異なりを識別する方法で
あり、一方電気泳動法はリポタンパクの表面電荷及び大
きさの異なりを識別する方法であるが、これらの方法を
用いた場合長時間を要するし、更にはこの後分離された
各フラクションについて含有されるコレステロールの測
定を行わなくてはならず、この二つの方法は現在の臨床
分析に於ても最も重要な点である迅速性，正確さ，経済
性を満たしていない。しかしながら、血中リポタンパク
サブフラクション中のコレステロール分布を決定するこ
とによって現代社会の最も高い死亡原因の一つである心
筋梗塞に対する予防を行うことが出来るばかりでなく、
これらの患者に対して薬物治療及び食事療法後の治癒経
過をモニターすることも可能であり、これがその重大な
疾患に対する現在する唯一の確立された方法であること
から専ら用いられている。これに代わる方法としては、
排除クロマトグラフィーによってリポタンパクサブフラ
クションを分離した後に、流路中にコレステロールエス
テルヒドラーゼ，コレステロールオキシダーゼ及び発色
剤を含んだ水溶液を通液することによって、分離した各
リポタンパンクサブフラクションを発色せしめて検出す
る方法が提案されているが、この方法では高価でしかも
寿命の短い酵素を大量に用いるという短所があるために
未だ実用化されていない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は、ヒト血中リポタンパクを排除クロマトグラフ
ィーによって自動的に分画した後、固定化したコレステ
ロールエステルヒドラーゼ及びコレステロールオキシダ
ーゼを充填したカラム内での反応を利用し、引続き各フ
ラクション中に含まれるコレステロールを自動的に検出
することにより心筋梗塞の原因である高脂血症患者を発
見し、更には高脂血症患者に対する医療の効果をモニタ
ーすることの出来る簡便で経済性に優れた自動臨床分析
システムを提供することを目的としている。

〔問題点を解決するための手段〕

上記目的を達成するための本発明は、粒径が20ミクロン
以下の親水性多孔質高分子粒状体に、その重量％が５％
以上になるようにコレステロールエステルヒドラーゼ及
び／またはコレステロールオキシターゼを固定化し、そ
れを充填した耐圧ガラスカラムを、親水性多孔質高分子
粒状体を充填した分離用耐圧ガラスカラム後に接続し、
これを金属表面を有しない高速液体クロマトグラフ中に
組み込むことを特徴とするものである。

本発明を更に詳細に説明するに、この発明に用いるコレ
ステロールエステルヒドラーゼ及び／またはコレステロ
ールオキシダーゼを固定化する担体には、親水性高分子
であるポリアクリル酸共重合体及びポリビニルアルコー
ル共重合体より成る多孔質粒状体を用いることが重要で
ある。従来、酵素固定化用担体としては、多孔性シリカ
ガラス，多孔性ガラスのアミン誘導体，ポリチオール，
ポリチオラクトン，カルボキシメチルセルロースのヒド
ラジド誘導体、臭化シアンで活性化したアガロース等が
あり、これ等も本発明に係る両酵素を固定化して用いる
ことは可能であるが、上記した親水性多孔質高分子と比
較して、基質であるリポタンパクとの親和力が強く、こ
のため酵素活性発現の低下を招き、また、試料として用
いる生体液に含まれる成分の吸着も生じ易く、固定化酵
素の寿命が短くなる。更には、本発明で用いる親水性多
孔質高分子粒状体は高速液体クロマトグラフィー分離用
充填剤として開発されたものをもちいるのが望ましく、
これ等は機械的強度が優れており、本発明の重要な特徴
である流路系での自動分析に適したものであるが、一方
従来より用いられて来た担体は機械的強度が劣る。また
高速液体クロマトグラフィー用充填剤として用いる親水
性多孔質高分子粒状体は粒径も整っており、20ミクロン
以下の粒径を有する。ここで20ミクロンを超えた粒径を
有した担体を用いると分離されたリポタンパクサブフラ
クションが固定化酵素上で再混合するために得られる結
果は悪い。本発明で用いる親水性多孔質高分子粒状体の
更に大きな特徴は、これらが大きさの整えられた細孔を
有していることであり、500Å以上の細孔径を有したも
のを用いた場合には固定化が細孔内まで行われ、更には
測定中に固定化酵素カラムに到達したリポタンパクサブ
フラクションは総て細孔内に侵入することが可能であ
り、結果固定化された酵素の活性が有効に発現する点は
他に類をみない特徴である。

本発明に於いては担体として親水性多孔質高分子粒状体
を用いるため、固定化に際しては架橋剤を使用する。本
発明で用いる担体は水酸基を有しているため、この基を
直接用いて、例えば臭化シアン法によって共有結合を導
入するか、あるいはこの基にスペーサーを介してこれと
酵素を反応させて固定化を行うことができるが、本発明
には後者が適している。導入するスペーサーとしては、
導入後の担体の形が末端にカルボキシル基を有するよう
担体を誘導体化できるものより、末端にアミノ基を有す
るよう誘導体化できるもののほうが後の処理に有利であ
る。スペーサー導入によってアミノ基を担体に付与した
後は、グルタールアルデヒドを用いる方法，ジアゾ化
法，カルボジイミド試薬を用いる方法等を用いることが
出来るが、本発明に於いてはグルタールアルデヒドを介
して固定化を行うのが最も簡便で且つ得られる固定化酵
素の活性維持に有効であるため好ましい。

コレステロールエステルヒドラーゼとコレステロールオ
キシダーゼは両者を個々に担体に固定化し、二本の別々
のカラムに充填し、接続して用いてもよいし、二種類の
固定化酵素を混合し、一本のカラムに充填して用いても
よいが、両者を同時に固定化して用いるのが最もよい結
果を与えるため好ましい。固定化の場合、固定された酵
素量が担体重量の５％以上になるよう調製することが必
須である。この値より低い酵素量を用いた場合には、所
期の目的であるリポタンパクサブフラクション中のコレ
ステロールを検出できない。

調製された固定化酵素は耐圧ガラスカラムに充填して用
いることが必須である。充填に際しては、充填用リザバ
ーもガラス製のものを用いて、リザバーとカラムの接続
にはテフロンチューブをもちいることも必須である。リ
ザバーからカラムへ固定化酵素を充填する際は、ポンプ
及びそれに付随する流路系から総ての金属表面を除去し
なければならない。もし金属が存在すれば固定化酵素は
失活する。

次に自動臨床分析システムを第１図に基ずいて説明す
る。

第１図は、分離カラム（５）の入口側が溶難液（１）、
第一ポンプ（３）および試料導入装置（４）と直列に、
また、分離カラム（５）の出口側が固定化酵素ガラスカ
ラム（６）、発色反応コイル（７）および検出器（８）
と直列に接続され、かつ、分離カラム（５）の出口側と
固定化酵素ガラスカラム（６）の入口側との間の分岐路
に発色剤を含む緩衝液（２）と第二ポンプ（３′）とが
直列に接続されているフローダイアグラムである。

なお、総タンパク検出のために、分離カラム（５）の出
口と分岐路の間にモニター用の検出器、また固定化酵素
ガラスカラム（６）と発色反応コイル（７）とが恒温槽
内に設置されていてもよい。

上述のように調製された固定化酵素ガラスカラム（６）
は、同じく耐圧ガラスカラム充填して調製した分離用カ
ラム（５）にテフロンチューブで接続する。分離用カラ
ム（５）入り口は表面を有しない高速液体クロマトグラ
フィー用の第一ポンプ（３）にテフロンチューブで接続
する。接続用部品も耐圧用プラスチック製のものをもち
いる。第一ポンプ（３）は少なくとも毎分マイクロリッ
トルの流量を制御できるものを用いるのが必須であり、
これを下回る精度のものを用いた場合所期の目的である
リポタンパクサブフラクション中のコレステロール分布
の測定精度は悪くなる。第一ポンプ（３）によって送液
される溶離液（１）は高精度の分析結果を得るには緩衝
液を用いることが必須であるが、トリス緩衝液並びにリ
ン酸緩衝液が望ましく、この中にエチレンジアミン四酢
酸が0.5−５ミリモル添加して溶離液中に存在する酵素
阻害作用を持った金属の固定化酵素カラムへの沈着を防
がなければならない。

本発明に係るシステムで用いられる検出法はコレステロ
ールとコレステロールオキシダーゼの反応によって生成
する過酸化水素量をモニターするためのキノンジイミン
染料を生成する発色反応系を用いる。このため、固定化
酵素ガラスカラム（６）入り口部へテフロンチューブを
介して第二ポンプ（３′）より発色剤を含む緩衝液
（２）を導入することが要求される。第二のポンプ系も
金属表面を完全に除去したもので流量制御が少なくとも
毎分10マイクロリットルで行えるものでなくてはならな
い。発色剤としては過酸化水素を分解するベルオキシダ
ーゼと４−アミノアンチピリンならびにＮ−エチル−Ｎ
−（２−ヒドロキシスルフォプロピル）−メタトルイジ
ンを用いた場合に良好な結果が得られたが、これを含む
水溶液としてはトリス緩衝液及びリン酸緩衝液が好まし
い。以上の発色剤混合系は第二のポンプによって排除ク
ロマトグラフィーで分離の終了したリポタンパクサブフ
ラクションを含む流路系へ添加され、その誤固定化酵素
ガラスカラム（６）へ導入され、ここで酵素反応を受け
ることになるが、基質であるリポタンパクは親油性の強
い物質であるため固定化酵素との親和力は十分でなく、
このため第三ポンプ（３′）によって送液される水溶液
中には界面活性剤を添加して用いなければならない。第
一ポンプ（３）で送液される水溶液中に界面活性剤を添
加した場合、試料中のリポタンパクサブフラクションの
構造破壊を招くため、これは避けるべきである。ここで
使用することのできる界面活性剤はノニオン系のもので
あって、好ましくはトリトンX,カーボンワックス等であ
る。中でもトリトンＸを用いた場合に優れた結果が得ら
れるが、第二ポンプ（３′）で送液されるトリトンＸの
添加量は0.3−3.0重量％が適当である。

本発明のヒト血中リポタンパクサブフラクション中のコ
レステロール分布の自動分析を行う自動臨床分析システ
ムは、上述したように固定化酵素失活の要因を総て除去
したものであり、また酵素活性発現を有効に引き出すた
めの反応液の条件も考慮して考案されたものであり、長
期間にわたり安定な分析結果を提供しうるものである。

〔発明の効果〕

次に、この発明の主として効果を実施例に基づいて詳細
に説明する。

〔実施例〕

固定化酵素用担体としてアクリル酸共重合体を用いて製
造された東洋曹達工業製排除クロマトグラフィー用ゲル
G6000PMを用いた。

G6000PWのアミノ化は以下の方法で行った。8gのG6000P
をピリジン500ml中で膨潤した後、トシルクロライド24g
を加え、５℃で約24時間反応した。その後、精製水,2規
定硫酸，精製水,5％炭酸ナトリウム水溶液，精製水，ア
セトニトリルの順で洗浄した後、この2gをアセトニトリ
ル50ml中で膨潤し、トリメチレンジアミン5gを加え、５
時間環留した。この後、精製水,10％炭酸ナトリウム，
精製水で洗浄した。この膨潤ゲル0.5mlに2.5％グルター
ルアルデヒド水溶液10mlを加え、水流ポンプで30分間室
温で脱気し細孔内の気泡を除去した後に大気圧で１時間
反応した。この後、精製水で洗浄して未反応のグルター
ルアルデヒドを除去した後、コレステロールエステルヒ
ドラーゼ（E.C.3.1.1.13）0.6mg及びコレステロールオ
キシアーゼ（E.C.1.1.3.6）9.4mgを2mmolのエチレンジ
アミン四酢酸塩を含む150mmolリン酸緩衝液（pH7）3ml
に溶解したものを加え、室温で30分間脱気した後に５℃
で１時間反応した。この後、反応液をロ過し、ロ液の紫
外線吸収スペクトルを測定し、この吸光度を牛血清アル
ブミンを用いて作成した検量線から求めたところ、ゲル
は約10重量％の酵素含有量を示した。これらの操作は総
てガラス容器中で行った。このようにして得られたコレ
ステロールエステルヒドラーゼ及びコレステロールオキ
シダーゼ同時固定化酵素カラムを内径2mm、長さ10cmの
ガラスカラムに充填した。充填には樹脂加工した金属表
面のない東洋曹達工業製高速液体クロマトグラフィー用
ポンプCCPMを用いた。このポンプの吐出口を内径2mmの
テフロンチチューブでガラス製リザバー（内径8.5mm,長
さ7.5cm）入り口へプラスチック製接続部品を用いて連
結し、リザバーとガラスカラムを接続した後、リザバー
中の固定化酵素を2mmolエチレンジアミン四酢酸を含む1
50mmolリン酸緩衝液（pH7）を送液して充填した。この
ようにして調製した固定化酵素ガラスカラムを、前述の
ポンプに接続した排除クロマトグラフィー用ガラスカラ
ム（東洋曹達工業製、G5000PW＋G3000SW、各一本）の後
に連結し、40℃湯浴中に浸した。この時、分離カラムと
固定化酵素カラムの間にはテフロン製Ｔ字接続部品を接
続し、一つは分離用カラム吐出口に、一つは固定化酵素
カラム入り口部に、残りの一つは第二の樹脂加工CCPMポ
ンプへ接続した。固定化酵素ガラスカラムの吐出口には
10mの内径0.4mmのテフロンチューブを接続し、これを40
℃の反応浴中に浸し発色反応を行った。この反応コイル
吐出部は550nmに設定した東洋曹達工業製UV8000紫外可
視フロー検出器に接続した。第一ポンプからは、2mmol
のエチレンジアミン四酢酸を含む150mmolリン酸緩衝液
から成る溶離液を毎分0.3mlで流し、第二ポンプからは
0.5mmolの４−アミノアンチピリン、0.3mmolのＮ−エチ
ル−Ｎ−（２−ヒドロキシスルホプロピル）−メタトル
イジン、ペルオキシダーゼ（1ml中6.7ユニット）（E.C.
1.11.1.7）及び１重量％のトリトンＸを含む水溶液を毎
分0.1mlで通液した。以上のように準備した分析システ
ムに樹脂加工した表面に金属表面のないインジェクター
から高脂血症患者血清三種類及び健常人血清を溶離液で
５倍に希釈したものを各々100マイクロリットル注入し
たところ、第１表に示すリポタンパクサブフラクション
の分離パターンがえられた。このとき得られたクロマト
グラムの代表例として健常人のものを第２図に示す。ま
た、これらのパターンからは以下の情報が得られた。高
脂血症と判定を受けた治療中の患者（サンプルNo.1−
７）と健常人（No.8）に対して本発明に係るシステムを
用いて検査を行ったところ、第一及び第二ピークがえら
れ、これらはそれぞれ低比重リポタンパク（LDL）及び
高比重リポタンパク（HDL）によるピークであることを
確かめた。第１表に示したのは得られたリポタンパクサ
ブフラクションが分離パターンから計算して求めた第一
ピーク及び第二ピークの溶出容量、第一ピークの論理段
数ならびに第一ピーク及び第二ピークの相対高さであ
る。ここで相対高さは、サンプルNo.8のピークの高さを
１として計算した。溶出容量はサンプルNo.1のピーク１
以外は総て一致した。サンプルNo.1のピーク１ではピー
ク頂点が前へ移動した。よってこの患者血清では、LDL
の溶出位置に超低比重リポタンパク（VLDL）が重なって
いると判定出来た。またサンプルNo.1のピークNo.の理
論段数が極めて低いことからも、このピークがLDL単一
のピークでないことが明かであり、これはこの血清がVL
DLも含んでいることを示すことから、この患者を、心筋
梗塞に最も関係の深いフレデリクソンの分類による典型
的型高脂血症疾患であると判断出来た。またサンプルN
o.2はピーク１の相対高さが極めて大きいことから、同
様に、LDLの多い心筋梗塞に最も関係の深い典型的型高
脂血症患者に相当すると判定出来た。またサンプルNo.1
−７の高脂血症患者の血清から得られたピーク１の高さ
は健常人のそれよりも高値を示し、このシステムでの高
脂血症患者検出の可能性の高さを確認出来た。この測定
は、引き続き連続して、健常人の血清を用いて200回,2
ケ月間にわたり行ったが、この間にピーク高さの減少な
らびにピーク形状の変化は観測されず、本システムの実
用性の高さを確認出来た。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の自動臨床分析システムを示すフローダ
イアグラム，第２図は得られたリポタンパクサブフラク
ションのクロマトグラムである。 1:溶離液、6:固定化酵素ガラスカラム 2:発色剤を含む緩衝液、7:発色反応コイル 3:第一ポンプ、8:検出器 ３′：第二ポンプ、11:低比重リポタンパク 4:試料導入装置、12:高比重リポタンパク 5:分離カラム

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−61777（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−8658（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−63462（ＪＰ，Ａ) Ｂｕｌｌ．Ｔｏｋｙｏ Ｍｅｄ．Ｄｅｎ ｄ．Ｕｍｉｖ．，29（４），Ｐ．130− 138，（1982) Ｊ．Ｂｌｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）, 87（６），Ｐ．1863−1866，（1980) Ｊ．Ｂｌｏｃｈｅｍ．（Ｔｏｋｙｏ）, 88（４），Ｐ．1215−1218，（1980)

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】粒径が20ミクロン以下の親水性多孔質高分
   子粒状体に、その重量％が５％以下になるようにコレス
   テロールエステルヒドラーゼ及び／またはコレステロー
   ルオキシダーゼを固定化し、それを充填した耐圧ガラス
   カラムを、親水性多孔質高分子粒状体を充填した分離用
   耐圧ガラスカラムの下流側に接続し、これを金属表面を
   有しない高速流体クロマトグラフ中に組み込むことを特
   徴とするリポタンパクサブフラクション中のコレステロ
   ール分布分析用自動臨床分析システム。