JPH07181181A - Immunological detection method of pyrethroid compound - Google Patents
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Landscapes
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- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、ピレスロイド系化合物
と結合する抗体、並びに抗体を製造する上で必要とする
ハプテン化合物、該ハプテン化合物の中間体、並びにこ
れらの製造方法、並びに抗体を用いて水、土壌などの自
然環境試料、および、穀物などの食料試料からピレスロ
イド系化合物を検出する免疫学的検出方法に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to an antibody that binds to a pyrethroid compound, a hapten compound required for producing the antibody, an intermediate of the hapten compound, a method for producing these, and an antibody. The present invention relates to an immunological detection method for detecting pyrethroid compounds from natural environment samples such as water and soil, and food samples such as grains.
【０００２】[0002]
【従来の技術】ピレスロイド系化合物の免疫化学的分析
方法としては、Ｂ．Ｄ．ＨａｍｍｏｃｋらによるＳ−Ｂ
ｉｏａｌｌｅｔｈｒｉｎに対する特異的抗体の研究
（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．２６：１３２
８−１３３３，１９７８）およびラジオイムノアッセイ
（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｉａ ３５：１６１９−１６２
０，１９７９）がある。これらは免疫化学的分析方法を
特定のピレスロイドに適用した基礎的な研究である。
Ｌ．Ｈ．Ｓｔａｎｋｅｒらは食肉中のパーメスリンの免
疫化学的分析方法について基礎的研究を報告している
（Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ Ｃｈｅｍ．３７：８３４
−８３９，１９８９）。これはフェノスリンのジメチル
ビニル基をオゾン酸化してカルボン酸誘導体とし、これ
をタンパク質と結合させたハプテン−タンパク結合体を
使用して動物に免疫することで３種類のモノクローナル
抗体を単離した。しかしながら、この抗体はフェノスリ
ン、パーメスリン、サイパーメスリン、デルタメスリン
のみが検出可能であり、その他の合成ピレスロイドに対
しては検出感度が非常に低い。また、抗体と検出対象化
合物とを反応させる場合、試料中化合物の溶解性を高め
反応し易くするために、水溶性有機溶媒（アセトニトリ
ルなど）が添加される。しかし、抗体の有機溶媒に対す
る安定性から添加量は６％以下と低濃度でなければなら
ず、水溶解度の極端に低い化合物の検出が難しいこと
や、微量分析に伴い溶媒の除去または濃縮操作が必要に
なるなどの課題が残されている。2. Description of the Related Art As an immunochemical analysis method for pyrethroid compounds, B. D. SB by Hammock et al.
Studies on specific antibodies against ioallethrin (J. Agric. Food Chem. 26: 132).
8-1333,1978) and radioimmunoassay (Experimentia 35: 1619-162).
0,1979). These are basic studies in which immunochemical analysis methods were applied to specific pyrethroids.
L. H. Stanker et al. Reported basic research on an immunochemical analysis method for permethrin in meat (J. Agric. Food Chem. 37: 834.
-839, 1989). This was carried out by ozone-oxidizing the dimethylvinyl group of phenothrin to form a carboxylic acid derivative, and using a hapten-protein conjugate in which this was bound to a protein, animals were immunized to isolate three types of monoclonal antibodies. However, this antibody can detect only phenothrin, permethrin, cypermethrin, and deltamethrin, and has extremely low detection sensitivity to other synthetic pyrethroids. When the antibody is reacted with the compound to be detected, a water-soluble organic solvent (acetonitrile or the like) is added to enhance the solubility of the compound in the sample and facilitate the reaction. However, due to the stability of the antibody against organic solvents, the addition amount must be as low as 6% or less, which makes it difficult to detect compounds with extremely low water solubility, and the solvent removal or concentration operation is required for trace analysis. Issues such as the need for it remain.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】自然環境下での残留農
薬、および、最近とくに増加してきた輸入食料のポスト
ハーベスト農薬などの残留問題には大きな社会的関心が
よせられている。これらの安全性確保のためには、自然
環境および食料の多くの試料について含有される農薬残
留量を、正確かつ迅速に測定する必要がある。従来、残
留農薬は、主に、ガスクロマトグラフィーや高速液体ク
ロマトグラフィーを用いて測定しているが、これらの方
法は、分析試料の調製に多大の手間と時間を必要とし、
また、測定機器や試薬類が高価であるという欠点がある
ため、簡便、経済的かつ迅速に行うことのできる新しい
測定方法が望まれている。There is great social interest in the residual pesticide residues in the natural environment and the problem of residual post-harvest pesticide residues in imported foods, which has recently been particularly increasing. In order to ensure these safety, it is necessary to accurately and promptly measure the pesticide residues contained in many samples of natural environment and food. Conventionally, residual pesticides are mainly measured by using gas chromatography or high performance liquid chromatography, but these methods require a great deal of labor and time to prepare an analytical sample,
In addition, a new measuring method that can be performed easily, economically, and quickly is desired because of the drawback that measuring instruments and reagents are expensive.
【０００４】本発明の分析対象であるピレスロイド系化
合物は穀物、果物、野菜、綿、コーヒー、および茶、動
物、森林の樹木、家庭の衛生害虫駆除などに広く使用さ
れている広範なスペクトルを有する汎用殺虫剤である。
ピレスロイド系化合物は、他の多くの殺虫剤に比べて哺
乳動物に対する毒性が低く、また、抵抗性害虫の防除に
効果があるためその用途が拡大している。しかし、これ
ら化合物にはそれぞれ、大部分の食品中における残留量
の上限が法的に定められており、また、ピレスロイド系
化合物の多くは水棲生物に対し強い毒性を有するため自
然環境への影響が憂慮されている。従って、本発明の目
的は、今後も増加が予想される自然環境および食料の残
留分析が必要となる試料中のピレスロイド系化合物を、
簡便、経済的かつ迅速に分析する方法を提供することで
ある。特に輸入農産物の残留農薬を従来法で分析するに
は、今後、規制対象農薬の増加に伴い試料が膨大になる
ため経費、労力の点から対応しきれないのが現状であ
る。本発明は、残留農薬の成分分析を実施する前に、あ
らかじめ分析対象試料がどのようなタイプの農薬がどの
程度残留しているか検査することも可能である。さら
に、今まで製造されている抗体の持つ弱点である有機溶
媒に対する不安定性を克服できれば、ＥＬＩＳＡ法を応
用できるピレスロイド系化合物の数が増える可能性も高
くなり、輸入農産物分析に係わる諸問題を始め、前述し
た多くの課題が解決される。The pyrethroid compounds to be analyzed according to the present invention have a broad spectrum widely used in cereals, fruits, vegetables, cotton, coffee, and tea, animals, forest trees, household hygiene pest control and the like. It is a general-purpose insecticide.
Pyrethroid compounds are less toxic to mammals than many other insecticides and are effective in controlling resistant pests, and therefore their applications are expanding. However, the upper limit of the residual amount in most of foods is legally set for each of these compounds, and most of the pyrethroid compounds are highly toxic to aquatic organisms, so that they have no influence on the natural environment. I am worried. Therefore, an object of the present invention is to provide pyrethroid compounds in samples that require residual analysis of natural environment and food, which are expected to increase in the future.
It is to provide a simple, economical and rapid method for analysis. In particular, in order to analyze residual pesticides in imported agricultural products by the conventional method, the amount of samples will become enormous with the increase in the number of regulated pesticides in the future, and it is the current situation that it cannot be handled in terms of cost and labor. According to the present invention, it is also possible to test in advance what type of pesticide and how much pesticide remains in the sample to be analyzed before carrying out the component analysis of the pesticide residue. Furthermore, if the instability of the antibodies that have been produced up to now to the instability with respect to organic solvents can be overcome, the number of pyrethroid compounds to which the ELISA method can be applied will increase, and various problems related to the analysis of imported agricultural products will start. , Many problems mentioned above are solved.
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】発明者らは前述の課題を
解決するためにピレスロイド系化合物の免疫化学的分析
法を検討し、自然環境および食料試料でのピレスロイド
系化合物の簡便かつ迅速な検出方法として、間接競合Ｅ
ＬＩＳＡ法が有効であることを見いだし本発明を完成し
た。[Means for Solving the Problems] In order to solve the above-mentioned problems, the inventors have investigated an immunochemical analysis method for pyrethroid compounds, and have been able to detect pyrethroid compounds in a natural environment and food samples simply and quickly. Indirect competition E
The present invention has been completed by finding that the LISA method is effective.
【０００６】すなわち、本発明は（ａ）下記一般式
（１）（化５）または（２）（化６）の化合物（以下、
ハプテン化合物という。）That is, the present invention provides (a) a compound represented by the following general formula (1) (formula 5) or (2) (formula 6) (hereinafter,
It is called a hapten compound. )
【０００７】[0007]
【化５】 [Chemical 5]
【０００８】[0008]
【化６】 [Chemical 6]
【０００９】（式中、Ｒ1 は水素原子、ハロゲン原子、
Ｃ1〜Ｃ5のアルキル基、Ｃ1〜Ｃ5のハロアルキル基、Ｃ
1〜Ｃ5のアルコキシ基、Ｃ1〜Ｃ5 のハロアルコキシ
基、Ｃ1〜Ｃ5のアルキルチオ基、Ｃ1〜Ｃ5のハロアルキ
ルチオ基、Ｃ2〜Ｃ5のアルケニル基、Ｃ2〜Ｃ5のハロア
ルケニルチオ基、Ｃ2〜Ｃ5のアルキニル基、Ｃ2〜Ｃ5の
ハロアルキニル基、低級アルコキシ低級アルキル基、低
級アルコキシ低級アルコキシ基、Ｃ2〜Ｃ5のハロアルケ
ニルオキシ基、Ｃ2〜Ｃ5のアルキニルオキシ基、Ｃ 1〜
Ｃ5のアルコキシカボニル基、Ｃ1〜Ｃ5 のハロアルコキ
シカルボニル基、Ｃ3〜Ｃ6のシクロアルキル基、Ｃ3〜
Ｃ6 のシクロアルコキシ基、フェニル基、フェノキシ
基、シアノ基を表わし、Ｒ2 はＣ1〜Ｃ5のアルキル基、
Ｃ1〜Ｃ5のハロアルキル基を表わし、Ｒ3 は水素原子、
Ｃ1〜Ｃ5のアルキル基、Ｃ1〜Ｃ5のハロアルキル基を表
わし、Ｒ2とＲ3はそれらが結合してＣ3〜Ｃ6のシクロア
ルキル基、Ｃ3〜Ｃ6のシクロハロアルキル基を形成して
も良い。Ｒ4、Ｒ5は水素原子、ハロゲン原子、アルキル
基、アルコキシ基を表わし、Ａは炭素原子、ケイ素原子
を表わし、Ｂは−ＣＨ2−、−ＮＲ6−、−Ｏ−、−Ｓ−
を表わし、Ｒ6 は水素原子または低級アルキル基を表わ
し、Ｚは−Ｙ−（ＣＨ2）ｍ−ＣＯＯＨまたは −Ｙ−
（ＣＨ2）ｎ−ＮＨ2を表わし、Ｙは−Ｈ2Ｃ−、−ＮＲ7
−、−Ｏ−、−Ｓ−を表わし、Ｒ7 は水素原子または低
級アルキル基を表わし、ｍおよびｎは１〜５を表わ
す。）と高分子化合物の結合体を免疫原として動物に免
疫することにより得られるピレスロイド系化合物に対す
る抗体を第一抗体とし、該第一抗体を試料溶液に混合し
た後、未反応の第一抗体を担体の表面にコートした高分
子化合物とハプテンの結合体（以下、コーティング抗原
と表す。）に結合させて抗原抗体結合体を得、該抗原抗
体結合体に、標識酵素を結合した第一抗体に対する抗体
（以下、第二抗体と表す。）を反応させることからなる
ピレスロイド系化合物の検出方法、（ｂ）一般式（１）
および（２）のハプテン化合物、（ｃ）一般式（１）お
よび（２）を製造するための下記一般式（３）（化７）
および（４）（化８）(Where R is1 Is a hydrogen atom, a halogen atom,
C1~ CFiveAlkyl group of C1~ CFiveHaloalkyl group, C
1~ CFiveAlkoxy group of C1~ CFive The haloalkoxy
Base, C1~ CFiveAlkylthio group of C1~ CFiveThe halo archi
Ruthio group, C2~ CFiveAlkenyl group of C2~ CFiveHalo a
Lucenylthio group, C2~ CFiveAn alkynyl group of C2~ CFiveof
Haloalkynyl group, lower alkoxy lower alkyl group, low
Lower alkoxy lower alkoxy group, C2~ CFiveThe halo arche
Nyloxy group, C2~ CFiveAlkynyloxy group, C 1~
CFiveAn alkoxycarbonyl group of C1~ CFive The halo arcoki
Sicarbonyl group, C3~ C6Cycloalkyl group, C3~
C6 Cycloalkoxy group, phenyl group, phenoxy
Group, a cyano group, R2 Is C1~ CFiveAn alkyl group of
C1~ CFiveRepresents a haloalkyl group of3 Is a hydrogen atom,
C1~ CFiveAlkyl group of C1~ CFiveThe haloalkyl group of
I, R2And R3Is C when they combine3~ C6Cycloa
Rukiru group, C3~ C6Forming a cyclohaloalkyl group of
Is also good. RFour, RFiveIs hydrogen atom, halogen atom, alkyl
Group, an alkoxy group, A is a carbon atom, a silicon atom
And B is -CH2-, -NR6-, -O-, -S-
And R6 Represents a hydrogen atom or a lower alkyl group
Z is -Y- (CH2) M-COOH or -Y-
(CH2) N-NH2Represents, and Y is -H2C-, -NR7
Represents-, -O-, -S-, R7 Is a hydrogen atom or low
Represents a primary alkyl group, m and n represent 1 to 5
You ) And a polymer compound conjugate as an immunogen to animals.
Against pyrethroid compounds obtained by epidemics
As the first antibody, and mixing the first antibody with the sample solution
Then, the unreacted primary antibody was coated on the surface of the carrier
Conjugate of child compound and hapten (hereinafter, coating antigen
Express. ) To obtain an antigen-antibody conjugate,
Antibody to the first antibody in which the labeling enzyme is bound to the conjugate
(Hereinafter referred to as the second antibody)
Method for detecting pyrethroid compound, (b) General formula (1)
And (2) the hapten compound, (c) the general formula (1),
And the following general formula (3) (chemical formula 7) for producing (2)
And (4) (Chem. 8)
【００１０】[0010]
【化７】 [Chemical 7]
【００１１】[0011]
【化８】 [Chemical 8]
【００１２】（式中、Ｒ1 は水素原子、ハロゲン原子、
Ｃ1〜Ｃ5のアルキル基、Ｃ1〜Ｃ5のハロアルキル基、Ｃ
1〜Ｃ5のアルコキシ基、Ｃ1〜Ｃ5のハロアルコキシ基、
Ｃ1〜Ｃ5のアルキルチオ基、Ｃ1〜Ｃ5のハロアルキルチ
オ基、Ｃ2〜Ｃ5 のアルケニル基、Ｃ2〜Ｃ5のハロアル
ケニルチオ基、Ｃ2〜Ｃ5のアルキニル基、Ｃ2〜Ｃ5のハ
ロアルキニル基、低級アルコキシ低級アルキル基、低級
アルコキシ低級アルコキシ基、Ｃ2〜Ｃ5のハロアルケニ
ルオキシ基、Ｃ2〜Ｃ5のアルキニルオキシ基、Ｃ 1〜Ｃ5
のアルコキシカボニル基、Ｃ1〜Ｃ5のハロアルコキシカ
ルボニル基、Ｃ3〜Ｃ6のシクロアルキル基、Ｃ3〜Ｃ6
のシクロアルコキシ基、フェニル基、フェノキシ基、シ
アノ基を表わし、Ｒ2 はＣ1〜Ｃ5のアルキル基、Ｃ1〜
Ｃ5のハロアルキル基を表わし、Ｒ3 は水素原子、Ｃ1〜
Ｃ5のアルキル基、Ｃ1〜Ｃ5のハロアルキル基を表わ
し、Ｒ2とＲ3はそれらが結合してＣ3〜Ｃ6のシクロアル
キル基、Ｃ3〜Ｃ6のシクロハロアルキル基を形成しても
良い。Ｒ4、Ｒ5は水素原子、ハロゲン原子、アルキル
基、アルコキシ基を表わし、Ａは炭素原子、ケイ素原子
を表し、Ｂは−ＣＨ2−、−ＮＲ6−、−Ｏ−、−Ｓ−を
表わし、Ｒ6 は水素原子またたは低級アルキル基を表わ
し、Ｚ'は−Ｙ'−（ＣＨ2）ｍ−ＣＯＯＲ7' または−
Ｙ'−（ＣＨ2）ｎ−ＮＨＲ8を表わし、Ｙ'は−ＣＨ2Ｏ
−、−ＮＲ9−、−Ｏ−、−Ｓ−を表わし、Ｒ7'はＣ1〜
Ｃ5のアルキル基、低級アルコキシ低級アルキル基、低
級アルコキシ低級アルコキシ低級アルキル基、低級アル
キルチオ低級アルキル基、テトラヒドロピラニル基、テ
トラヒドロフラニル基、フェニル基、フェニルオキシ低
級アルキル基、フェナシル基、ジアシルメチル基、Ｎ−
フタルイミドメチル基、ベンジル基、シリル基を表わ
し、ｍは１〜５を表わし、Ｒ8 はホルミル基、アセチル
基、ハロアセチル基、プロピオニル基、フェニルアセチ
ル基、アルコキシカルボニル基、ハロアルコキシカルボ
ニル基、フルオレンメチルカルボニル基、フェニルオキ
シカルボニル基、フェニルチオカルボニル基、ピペリジ
ニルオキシカルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基
を表わす。Ｒ9 は水素原子または低級アルキル基を表わ
し、ｎは１〜５を表わす。）で表わされるハプテン化合
物中間体、（ｄ）一般式（１）または（２）のハプテン
化合物と高分子化合物との結合体、（ｅ）アルコール
類、ジメチルスルフォキシドまたはアセトニトリルの存
在下に安定なピレスロイド系化合物を認識し得る抗体を
提供するものである。(Where R1 Is a hydrogen atom, a halogen atom,
C1~ CFiveAlkyl group of C1~ CFiveHaloalkyl group, C
1~ CFiveAlkoxy group of C1~ CFiveA haloalkoxy group of
C1~ CFiveAlkylthio group of C1~ CFiveThe haloalkyl
O group, C2~ CFive Alkenyl group of C2~ CFiveThe halo al
Kenylthio group, C2~ CFiveAn alkynyl group of C2~ CFiveHa
Lower alkynyl group, lower alkoxy lower alkyl group, lower
Alkoxy lower alkoxy group, C2~ CFiveThe halo archeni
Luoxy group, C2~ CFiveAlkynyloxy group, C 1~ CFive
An alkoxycarbonyl group of C1~ CFiveThe haloalkoxy
Rubonyl group, C3~ C6Cycloalkyl group, C3~ C6
Cycloalkoxy group, phenyl group, phenoxy group,
R represents an ano group2 Is C1~ CFiveAlkyl group of C1~
CFiveRepresents a haloalkyl group of3 Is a hydrogen atom, C1~
CFiveAlkyl group of C1~ CFiveRepresents a haloalkyl group of
And R2And R3Is C when they combine3~ C6The cycloal
Kill group, C3~ C6Forming a cyclohaloalkyl group of
good. RFour, RFiveIs hydrogen atom, halogen atom, alkyl
Group, an alkoxy group, A is a carbon atom, a silicon atom
And B is -CH2-, -NR6-, -O-, -S-
Represent, R6 Represents a hydrogen atom or a lower alkyl group
Z'is -Y '-(CH2) M-COOR7'Or-
Y '-(CH2) N-NHR8And Y'is -CH2O
-, -NR9Represents-, -O-, -S-, R7'Is C1~
CFiveAlkyl group, lower alkoxy lower alkyl group, low
Lower alkoxy lower alkoxy lower alkyl group, lower alkyl
Lower alkyl group, tetrahydropyranyl group,
Trahydrofuranyl group, phenyl group, phenyloxy low
Grade alkyl group, phenacyl group, diacylmethyl group, N-
Represents phthalimidomethyl group, benzyl group, silyl group
, M represents 1 to 5, R8 Is a formyl group, acetyl
Group, haloacetyl group, propionyl group, phenylacetyl
Group, alkoxycarbonyl group, haloalkoxycarbo
Nyl group, fluorenemethylcarbonyl group, phenyloxy
Cycarbonyl group, phenylthiocarbonyl group, piperidi
Nyloxycarbonyl group, benzyloxycarbonyl group
Represents R9 Represents a hydrogen atom or a lower alkyl group
However, n represents 1-5. ) Hapten compound
Intermediate, (d) hapten of general formula (1) or (2)
Conjugate of compound and polymer compound, (e) alcohol
The presence of compounds, dimethyl sulfoxide or acetonitrile
An antibody capable of recognizing a stable pyrethroid compound
It is provided.
【００１３】すなわち、ハプテン化合物と高分子化合物
（例えばタンパク質）の結合体を免疫原として動物に免
疫することによって得たピレスロイド系化合物に対する
抗体を第一抗体とし、所定量の第一抗体とピレスロイド
系化合物を含む試料溶液を混合し、反応液に含まれる未
反応の第一抗体を、担体の表面にコートしたコーティン
グ抗原に結合させ、標識酵素を結合した第二抗体を担体
に結合した第一抗体に反応させた後、酵素の基質および
酵素反応によって発色する発色試薬を含有する緩衝液を
添加し、発色させた後に吸光度を測定し、その測定値か
ら検量線をもとに試料中のピレスロイド系化合物の濃度
を算出するものである。ここで使用する第一抗体は、免
疫原として高分子化合物、例えばタンパク質と本発明の
ハプテン化合物との結合体を免疫原とし得たものであ
る。一般式（１）において各種置換基の様々な組み合わ
せで多くの化合物を例示することができるが、好ましく
はＡは炭素原子、Ｂは酸素原子である。さらに好ましく
は、Ａは炭素原子、Ｂは酸素原子、Ｒ2およびＲ3はメチ
ル基、ＺにおいてＹは酸素原子である。最も好ましくは
Ｚはヒドロキシカルボニルメチルオキシ基であり、Ｒ2
およびＲ3 はメチル基、Ａは炭素原子、Ｂは酸素原子、
Ｒ4およびＲ5は水素原子である。That is, an antibody against a pyrethroid compound obtained by immunizing an animal with a conjugate of a hapten compound and a high molecular compound (for example, a protein) as an immunogen is used as a first antibody, and a predetermined amount of the first antibody and the pyrethroid system are used. A sample solution containing a compound is mixed, the unreacted first antibody contained in the reaction solution is bound to the coating antigen coated on the surface of the carrier, and the second antibody bound to the labeling enzyme is bound to the carrier. After the reaction, the buffer solution containing the enzyme substrate and the coloring reagent that develops color by the enzymatic reaction is added, the absorbance is measured after the color is developed, and the pyrethroid system in the sample is measured from the measured value based on the calibration curve. The concentration of the compound is calculated. The first antibody used here is a high molecular compound as an immunogen, for example, a conjugate of a protein and the hapten compound of the present invention can be used as an immunogen. Although many compounds can be exemplified by various combinations of various substituents in the general formula (1), preferably A is a carbon atom and B is an oxygen atom. More preferably, A is a carbon atom, B is an oxygen atom, R 2 and R 3 are methyl groups, and in Z, Y is an oxygen atom. Most preferably Z is a hydroxycarbonylmethyloxy group and R 2
And R 3 is a methyl group, A is a carbon atom, B is an oxygen atom,
R 4 and R 5 are hydrogen atoms.
【００１４】また一般式（２）においても同様に多くの
化合物を例示することができるが、好ましくはＡは炭素
原子、Ｂは酸素原子、ＺにおいてＹは酸素原子である。
最も好ましくはＲ1 はアルコキシ基またはハロアルコキ
シ基、Ｒ2およびＲ3はメチル基、Ｒ4およびＲ5は水素原
子、Ａは炭素原子、Ｂは酸素原子、Ｚは４−ヒドロキシ
カルボニルメチルオキシ基である。In the general formula (2), many compounds can be similarly exemplified, but preferably A is a carbon atom, B is an oxygen atom, and Z in Z is an oxygen atom.
Most preferably, R 1 is an alkoxy group or a haloalkoxy group, R 2 and R 3 are methyl groups, R 4 and R 5 are hydrogen atoms, A is a carbon atom, B is an oxygen atom, and Z is a 4-hydroxycarbonylmethyloxy group. Is.
【００１５】これらハプテン化合物は一般式（３）また
は（４）から製造することができる。一般式（３）また
は（４）の化合物を塩基または酸存在下で加水分解する
か、あるいは還元することでそれぞれ相当する一般式
（１）または（２）のハプテン化合物を得ることができ
る。ここで一般式（３）において各種置換基の組み合わ
せにより多くの化合物を例示することができるが、最も
好ましくはＺ' がメトキシカルボニルメチロキシ基であ
り、Ｒ2およびＲ3はメチル基、Ａは炭素原子、Ｂは酸素
原子、Ｒ4よびＲ5は水素原子である。These hapten compounds can be produced from the general formula (3) or (4). The corresponding hapten compound of the general formula (1) or (2) can be obtained by hydrolyzing or reducing the compound of the general formula (3) or (4) in the presence of a base or an acid. Although many compounds can be exemplified by the combination of various substituents in the general formula (3), most preferably Z ′ is a methoxycarbonylmethyloxy group, R 2 and R 3 are methyl groups, and A is A carbon atom, B is an oxygen atom, and R 4 and R 5 are hydrogen atoms.
【００１６】これら中間体（３）および（４）は既知の
化合物より製造することができる。すなわち、一般式
（５）（化９）These intermediates (3) and (4) can be produced from known compounds. That is, the general formula (5) (chemical formula 9)
【００１７】[0017]
【化９】 [Chemical 9]
【００１８】（式中、Ａ、Ｂ、Ｙ、Ｒ2〜Ｒ5は前記の意
味を表わす。）の化合物と、一般式（６）（化１０）(Wherein A, B, Y, R 2 to R 5 have the above-mentioned meanings), and a compound of the general formula (6)
【００１９】[0019]
【化１０】 [Chemical 10]
【００２０】（式中、Ｘはハロゲン原子、ｍおよびＲ7'
は前記の意味を表わす。）の化合物とを塩基存在下縮合
させることにより一般式（３）の化合物を製造すること
ができる。(Wherein X is a halogen atom, m and R 7 '
Represents the above meaning. The compound of the general formula (3) can be produced by condensing the compound of 1) in the presence of a base.
【００２１】また一般式（５）の化合物と一般式（７）
（化１１）Further, the compound of the general formula (5) and the general formula (7)
(Chemical formula 11)
【００２２】[0022]
【化１１】 [Chemical 11]
【００２３】（式中、Ｘはハロゲン原子、ｎおよびＲ8
は前記の意味を表わす。）の化合物とを塩基存在下縮合
させることで（ａ）と同様にして一般式（３）の化合物
を製造することができる。(Wherein X is a halogen atom, n and R 8
Represents the above meaning. The compound of the general formula (3) can be produced in the same manner as in (a) by condensing the compound of (1) in the presence of a base.
【００２４】また一般式（８）（化１２）The general formula (8) (formula 12)
【００２５】[0025]
【化１２】 [Chemical 12]
【００２６】（式中、Ｒ1〜Ｒ5、Ａ、ＢおよびＹ' は前
記の意味を表わす。）と一般式（６）または一般式
（７）の化合物と塩基存在下縮合させることにより一般
式（４）の化合物を製造することができる。(Wherein R 1 to R 5 , A, B and Y ′ have the above-mentioned meanings) and the compound of the general formula (6) or the general formula (7) are condensed in the presence of a base to give a compound. Compounds of formula (4) can be prepared.
【００２７】これらハプテン化合物中間体を製造する際
の原料となる一般式（５）の化合物において、Ａが炭素
原子でかつＢが酸素原子である化合物は、特開昭５８−
３２８４０号公報、特開昭５８−７７８３６号公報に記
載の公知化合物、またはそれら化合物の製造方法で容易
に得ることができる。またＡおよびＢが共に炭素原子で
ある化合物は特開昭６２−２０１８３５号公報に記載の
公知化合物により公知の反応で製造することができる。
例えば化合物（９）（化１３）Compounds of the general formula (5), which are raw materials for producing these hapten compound intermediates, wherein A is a carbon atom and B is an oxygen atom are described in JP-A-58-58.
It can be easily obtained by known compounds described in JP-A-32840 and JP-A-58-77836, or by methods for producing these compounds. A compound in which both A and B are carbon atoms can be produced by a known reaction using a known compound described in JP-A-62-201835.
For example, compound (9)
【００２８】[0028]
【化１３】 [Chemical 13]
【００２９】を極性有機溶媒中で塩基（例えばカリウム
ターシャリーブトキサイドのような強塩基）と反応させ
ることで相当するフェノール誘導体を製造することがで
きる。また一般式（５）の化合物においてＡがケイ素原
子である場合、特開昭６１−２６３９８８号公報、特開
昭６２−１０６０３２号公報に記載された公知の有機ケ
イ素化合物より公知の反応で製造することができる。例
えば化合物（１０）（化１４）Corresponding phenol derivatives can be prepared by reacting with a base (for example, a strong base such as potassium tert-butoxide) in a polar organic solvent. When A is a silicon atom in the compound of the general formula (5), it is produced by a known reaction from a known organosilicon compound described in JP-A-61-263988 and JP-A-62-106032. be able to. For example, compound (10)
【００３０】[0030]
【化１４】 [Chemical 14]
【００３１】を極性溶媒中で塩基（えばカリウムターシ
ャリーブトキサイドのような強塩基）と反応させること
で相当するフェノール誘導体を製造することができる。The corresponding phenol derivative can be prepared by reacting a base with a base (for example, a strong base such as potassium tert-butoxide) in a polar solvent.
【００３２】もう一方のハプテン化合物中間体を製造す
る際の原料となる一般式（８）の化合物においてＡが炭
素原子、Ｂが酸素原子である化合物は、特開昭５８−３
２８４０号公報、特開昭５８−７７８３６号公報に記載
の公知化合物またはそれら化合物の製造方法で容易に得
ることができる。またＡおよびＢが炭素原子である化合
物は特開昭６２−２０１８３５号公報に記載の公知化合
物より公知の反応で製造できる。例えば化合物（１１）
（化１５）The compound of the general formula (8), which is a raw material for producing the other hapten compound intermediate, wherein A is a carbon atom and B is an oxygen atom is described in JP-A-58-3.
It can be easily obtained by the known compounds described in JP-A-2840 and JP-A-58-77836 or the method for producing these compounds. A compound in which A and B are carbon atoms can be produced by a known reaction from a known compound described in JP-A-62-201835. For example, compound (11)
(Chemical formula 15)
【００３３】[0033]
【化１５】 [Chemical 15]
【００３４】のメトキシメトキシ基を酸で処理して相当
するフェノール誘導体を製造することができる。化合物
（１１）は化合物（１２）（化１６）と化合物（１３）
（化１７）を縮合し接触還元することで製造することが
できる。The corresponding phenol derivative can be prepared by treating the methoxymethoxy group of (1) with an acid. Compound (11) is compound (12) (Chemical Formula 16) and compound (13)
It can be produced by condensation of (Chemical Formula 17) and catalytic reduction.
【００３５】[0035]
【化１６】 [Chemical 16]
【００３６】[0036]
【化１７】 [Chemical 17]
【００３７】またＡがケイ素原子である化合物は、特開
昭６１−２６３９８８号公報、特開昭６２−１０６０３
２号公報に記載された公知の有機ケイ素化合物より公知
の反応で製造することができる。例えば化合物（１４）
（化１８）Compounds in which A is a silicon atom are disclosed in JP-A-61-263988 and JP-A-62-16033.
It can be produced by a known reaction from a known organosilicon compound described in JP-A-2. For example, compound (14)
(Chemical formula 18)
【００３８】[0038]
【化１８】 [Chemical 18]
【００３９】のメトキシメトキシ基を酸で処理して相当
するフェノール誘導体を製造することができる。化合物
（１４）は化合物（１５）（化１９）と化合物（１６）
（化２０）とを塩基存在下縮合させることにより容易に
製造することができる。The corresponding phenol derivative can be prepared by treating the methoxymethoxy group of (1) with an acid. Compound (14) is compound (15) (Chemical Formula 19) and compound (16)
It can be easily produced by condensation with (Chemical Formula 20) in the presence of a base.
【００４０】[0040]
【化１９】 [Chemical 19]
【００４１】[0041]
【化２０】 [Chemical 20]
【００４２】第一抗体を産生するための免疫原は、一般
式（１）または（２）のハプテン化合物と高分子化合物
（例えば血清タンパク質であるアルブミン、グロブリ
ン、ヘモシアニンなどや、アゾフェニル酢酸、グルタミ
ン−アデニン−チロシン共重合体など）とを結合試薬存
在下で縮合させることにより製造できる。特にハプテン
化合物がカルボン酸誘導体の場合、Ｂ．Ｆ．Ｅｒｌａｎ
ｇｅｒらによる混合酸無水物法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ
ｍ．Ｖｏｌ．２３４，１０９０−１０９４（１９５
９））によってタンパク質と結合させることが一般的で
ある。The immunogen for producing the first antibody is a hapten compound of the general formula (1) or (2) and a high molecular compound (for example, serum proteins such as albumin, globulin, hemocyanin, azophenylacetic acid, glutamine-). Adenine-tyrosine copolymer, etc.) in the presence of a binding reagent. Particularly when the hapten compound is a carboxylic acid derivative, B.I. F. Erlan
ger et al. mixed acid anhydride method (J. Biol. Che.
m. Vol. 234, 1090-1094 (195
It is common to bind to a protein by 9)).
【００４３】本発明の検出法で使用する担体としては、
ＥＬＩＳＡ法において通常用いられる担体を使用するこ
とができ、種々の形が可能である。例えば管、ウェルプ
レート、マイクロプレート、細長いスティック、薄いス
トリップまたはビーズなどがあげられる。このような固
相の表面を形成する材料としてはポリスチレンもしくは
他の適当なプラスチック、ニトロセルロース、ナイロ
ン、ポリビニリデンジフルオライド、ガラス、シリカな
どがあげられる。特に限定されないが、ポリスチレンの
９６穴マイクロプレートの使用が適している。The carrier used in the detection method of the present invention is
The carrier usually used in the ELISA method can be used, and various forms are possible. Examples include tubes, well plates, microplates, elongated sticks, thin strips or beads. Materials that form the surface of such solid phases include polystyrene or other suitable plastics, nitrocellulose, nylon, polyvinylidene difluoride, glass, silica and the like. Although not particularly limited, the use of polystyrene 96-well microplates is suitable.
【００４４】本発明の測定法において、コーティング抗
原の担体表面へのコートは、ハプテン化合物と第一抗体
を産生する動物種の血清アルブミンの結合体を、コーテ
ィング緩衝液で希釈し、担体に添加した後、インキュベ
ーションすることによって行われる。ここで使用するコ
ーティング緩衝液としては、１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５、１００ｍＭＮａＣｌ）の組成のものを使用す
るのが適してるが、コーティングを妨げる界面活性剤な
どを含まなければ、これのみに限定されるものではな
い。また、コーティング用結合体に用いるタンパク質
は、免疫原に用いたもの以外のタンパク質を用いること
が可能であり、免疫原の作製の場合と同様にして結合体
を製造することができる。担体の抗原によるコーティン
グの条件について検討した結果、コーティング抗原の濃
度は０．０１から０．１μｇ／ｍｌが適している。使用
する量としては、９６穴マイクプレートを使用する場合
には０．１ｍｇ／ｗｅｌｌ程度が望ましい。また、イン
キュベーションの条件としては、４℃で一晩のインキュ
ベーションが適している。担体にコーティング抗原を吸
着させた後、抗体の非特異的結合を防止するために抗原
以外の蛋白質で抗原が吸着していない部分をブロックす
る必要がある。ブロッキングには３％のスキムミルク溶
液と担体と２５℃で１時間インキュベーションする。担
体はインキュベーション後、洗浄緩衝液（１０ｍＭン酸
緩衝液（ｐＨ７．２）、０．８％ＮａＣｌ、０．０２％
ＫＣｌ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０の組成のものが適し
ている。）で洗浄する。In the assay method of the present invention, the coating of the coating antigen on the surface of the carrier was performed by diluting a conjugate of the hapten compound and the serum albumin of the animal species producing the first antibody with the coating buffer and adding it to the carrier. Later, it is carried out by incubation. The coating buffer used here is 10 mM phosphate buffer (p
It is suitable to use a composition of H7.5, 100 mM NaCl), but it is not limited to this as long as it does not contain a surfactant or the like which hinders coating. Further, as the protein used for the coating conjugate, a protein other than that used for the immunogen can be used, and the conjugate can be produced in the same manner as in the case of producing the immunogen. As a result of examining the conditions for coating the carrier with the antigen, the concentration of the coating antigen is preferably 0.01 to 0.1 μg / ml. The amount used is preferably about 0.1 mg / well when using a 96-well microphone plate. Further, as the incubation condition, overnight incubation at 4 ° C is suitable. After the coating antigen is adsorbed on the carrier, it is necessary to block the portion where the antigen is not adsorbed with a protein other than the antigen in order to prevent nonspecific binding of the antibody. For blocking, a 3% skim milk solution and carrier are incubated for 1 hour at 25 ° C. After incubation, the carrier was washed with a washing buffer (10 mM acid buffer (pH 7.2), 0.8% NaCl, 0.02%).
A composition of KCl and 0.02% Tween 20 is suitable. ) Wash with.
【００４５】本発明の方法は、ピレスロイド系化合物と
第一抗体との反応溶液に高濃度の有機溶媒を加えること
により、ピレスロイド系化合物と第一抗体との反応をし
易くくすることを特徴とする。一般にピレスロイド系化
合物の水に対する溶解度は極めて低く、通常の条件下で
は第一抗体と十分に効率よく反応させることができな
い。そこで種々条件を検討した結果、反応系に有機溶媒
を添加することで抗体とピレスロイド系化合物の反応を
可能にすることができる。添加する有機溶媒としてはメ
タノール、エタノール等のアルコール類、ジメチルスル
ホキシド、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ、Ｎ−ジ
メチルアセトアミド、ＨＭＰＡ、ＤＭＩ、アセトニトリ
ル、アセトンなどの水溶性有機溶媒があげられる。第一
抗体の有機溶媒に対する安定性からアルコール類、ジメ
チルスルフォキシド、アセトニトリルが適し、特にメタ
ノールが適し、その溶媒濃度は２０％から５０％が適し
ている。本発明の第一抗体が有機溶媒のこれらの濃度に
おいて安定であることは驚くべきことである。また第一
抗体は希釈用緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．
２）、０．８％ＮａＣｌ、０．０２％ＫＣｌ）で反応溶
液中の抗体濃度が２０，０００から８０，０００倍希釈
となるように調製する。水田水や水道水などの自然環境
中の水類を試料とする場合には、試料に直接、第一抗体
溶液や有機溶媒を所定の濃度になるように添加すること
により、反応溶液を調製する。また、食料、植物および
土壌などの試料では、有機溶媒で試料からピレスロイド
系化合物を抽出した後、溶媒抽出溶液に抗体溶液を添加
して反応溶液を調製することができる。この反応溶液を
２５℃で１時間インキュベーションし反応させる。上記
のように調製したピレスロイド系化合物と第一抗体の反
応溶液中の未反応の第一抗体を、担体に結合したコーテ
ィング抗原と反応させる。反応溶液を担体に添加し２５
℃で１時間インュベーションする。反応後、洗浄緩衝液
で担体を洗浄して、第二抗体との反応に供する。The method of the present invention is characterized by facilitating the reaction between the pyrethroid compound and the first antibody by adding a high-concentration organic solvent to the reaction solution of the pyrethroid compound and the first antibody. To do. Generally, the solubility of pyrethroid compounds in water is extremely low, and they cannot react with the primary antibody sufficiently efficiently under normal conditions. Therefore, as a result of examining various conditions, it is possible to allow the reaction between the antibody and the pyrethroid compound by adding an organic solvent to the reaction system. Examples of the organic solvent to be added include alcohols such as methanol and ethanol, and water-soluble organic solvents such as dimethyl sulfoxide, N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, HMPA, DMI, acetonitrile, and acetone. Alcohols, dimethylsulfoxide, and acetonitrile are suitable because of the stability of the first antibody against an organic solvent, particularly methanol is suitable, and the solvent concentration thereof is preferably 20% to 50%. It is surprising that the first antibody of the present invention is stable at these concentrations of organic solvent. In addition, the first antibody is a buffer for dilution (10 mM phosphate buffer (pH 7.
2), 0.8% NaCl, 0.02% KCl) so that the antibody concentration in the reaction solution is diluted 20,000 to 80,000 times. When using water in the natural environment such as paddy water or tap water as a sample, prepare the reaction solution by directly adding the first antibody solution or organic solvent to the sample to a specified concentration. . For samples such as food, plants and soil, the reaction solution can be prepared by extracting the pyrethroid compound from the sample with an organic solvent and then adding the antibody solution to the solvent extraction solution. This reaction solution is incubated at 25 ° C. for 1 hour to react. The unreacted first antibody in the reaction solution of the pyrethroid compound and the first antibody prepared as described above is reacted with the coating antigen bound to the carrier. Add the reaction solution to the carrier and
Incubate at ℃ for 1 hour. After the reaction, the carrier is washed with a washing buffer and used for the reaction with the second antibody.
【００４６】本発明の測定法において使用する第二抗体
としては、酵素を結合した第一抗体に対する抗体を用い
ることができる。第一抗体としてウサギ抗血清を用いる
場合、ペルオキシダーゼを結合した抗ウサギＩｇＧヤギ
ＩｇＧ画分を用いるのが適当である。担体に結合した第
一抗体に約５，０００から１０，０００倍、好ましくは
最終吸光度が１．０から１．５となるよう希釈した第二
抗体を反応させるのが望ましい。希釈には洗浄用緩衝液
を用いる。反応は２５℃で１時間行い、反応後、洗浄緩
衝液で洗浄する。また、アビジン−ビオチン反応を利用
して、第二抗体としてビオチンを結合した第一抗体に対
する抗体と酵素を結合したアビジンを組み合わせて用い
ることもできる。担体に結合した第一抗体に約２，００
０倍に希釈したビオチンを結合した抗ウサギＩｇＧロバ
ＩｇＧ画分を反応させた後、洗浄し、約１，０００倍に
希釈したアルカリフォスファターゼを結合したアビジン
を加えるのが望ましいが、第二抗体を産生する動物、お
よび、用いる酵素については他の動物および酵素であっ
てもさしつかえない。希釈には洗浄用緩衝液を用い、反
応はどちらも２５℃で１時間行い、反応後、洗浄緩衝液
で洗浄して、酵素反応に供する。担体に結合した第二抗
体の酵素と基質との反応によって発色する試薬を加え、
吸光度を測定することによって検量線からピレスロイド
系化合物の量を算出することができる。As the second antibody used in the assay method of the present invention, an antibody to an enzyme-bound first antibody can be used. When a rabbit antiserum is used as the first antibody, it is suitable to use a peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG goat IgG fraction. It is desirable to react the first antibody bound to the carrier with a second antibody diluted to about 5,000 to 10,000 times, preferably to a final absorbance of 1.0 to 1.5. A washing buffer is used for dilution. The reaction is performed at 25 ° C. for 1 hour, and after the reaction, it is washed with a washing buffer. Further, by utilizing the avidin-biotin reaction, it is also possible to use a combination of an antibody against the first antibody bound with biotin and an avidin bound with an enzyme as the second antibody. About 2,000 for the first antibody bound to the carrier
It is preferable to react the biotin-conjugated anti-rabbit IgG donkey IgG fraction diluted 0-fold, wash, and add alkaline phosphatase-conjugated avidin diluted approximately 1,000-fold, but the second antibody The animal to be produced and the enzyme used may be other animals and enzymes. A washing buffer is used for dilution, and both reactions are carried out at 25 ° C. for 1 hour. After the reaction, the reaction is washed with a washing buffer and used for the enzymatic reaction. Add a reagent that develops color by the reaction of the substrate with the enzyme of the second antibody bound to the carrier,
The amount of the pyrethroid compound can be calculated from the calibration curve by measuring the absorbance.
【００４７】第二抗体にペルオキシダーゼを使用する場
合には、基質として過酸化水素、発色試薬としてｏ‐フ
ェニレンジアミンを使用することが望ましい。発色溶液
を加え２５℃で１０分間反応させた後、直ちに４Ｎの硫
酸を加えることにより、酵素反応を止める。ｏ−フェニ
レンジアミンを使用する場合、４９２および６３０ｎｍ
の吸光度を測定する。一方、アルカリフォスファターゼ
を使用する場合には、ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質
として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加えて酵素反応を止
め、４１５および６３０ｎｍでの吸光度を測定する方法
が適している。When peroxidase is used as the second antibody, it is desirable to use hydrogen peroxide as a substrate and o-phenylenediamine as a color developing reagent. After adding the coloring solution and reacting at 25 ° C for 10 minutes, 4N sulfuric acid is immediately added to stop the enzymatic reaction. 492 and 630 nm when using o-phenylenediamine
The absorbance of is measured. On the other hand, when alkaline phosphatase is used, a method in which p-nitrophenyl phosphate is used as a substrate for color development, 2N NaOH is added to stop the enzymatic reaction, and the absorbance at 415 and 630 nm is measured is suitable.
【００４８】ピレスロイド系化合物を添加していない反
応溶液の吸光度に対する、一定量のピレスロイド系化合
物を添加して抗体と反応させた溶液の吸光度の減少率を
阻害率として算出する。既知の濃度のピレスロイド系化
合物を添加した反応液の阻害率により作成した検量線を
用いて、試料中のピレスロイド系化合物濃度を算出する
ことができる。The rate of decrease in the absorbance of the solution prepared by adding a fixed amount of the pyrethroid compound to the antibody and the absorbance of the reaction solution containing no pyrethroid compound was calculated as the inhibition rate. The concentration of the pyrethroid compound in the sample can be calculated using a calibration curve prepared from the inhibition rate of the reaction solution containing a known concentration of the pyrethroid compound.
【００４９】本願発明の第一抗体は、ハプテン化合物の
構造にかかわらず、その反応性に差はあるが種々の他の
ピレスロイド系化合物と交叉反応性を示し、ピレスロイ
ド系化合物を一般的に検出するのに有効に用いられる。The first antibody of the present invention shows cross-reactivity with various other pyrethroid compounds regardless of the structure of the hapten compound, but shows cross reactivity with various other pyrethroid compounds, and generally detects pyrethroid compounds. It is effectively used for.
【００５０】本発明で検出できるピレスロイド系化合物
としてはレスメトリン、カデスリン、シハロトリン、ビ
フェントリン、フェンプロパトリン、アレスリン、トラ
ロメスリンなどのシクロプロパンカルボン酸のエステル
類、フェンバレレート、フルシトリネート、フルバリネ
ート、シクロプロトリンなどの芳香族基置換アルカンカ
ルボン酸のエステル類およびエトフェンプロックス、フ
ブフェンプロックス（ＭＴＩ−７３２）、１−（３−フ
ェノキシフェニル）−４−（４−エトキシフェニル）−
４−メチルペンタン（ＭＴＩ−７９０）、１−（３−フ
ェノキシ−４−フルオロフェニル）−４−（４−エトキ
シフェニル）−４−メチルペンタン（ＭＴＩ−８０
０）、ジメチル−（４−エトキシフェニル）−（３−フ
ェノキシベンジルオキシ）メチルシラン（ＳＳＩ−１１
６）、シラフルオフェン、ＰＰ−６８２などの非エステ
ル系化合物類などがあげらる。Pyrethroid compounds that can be detected in the present invention include esters of cyclopropanecarboxylic acid such as resmethrin, cadesulin, cyhalothrin, bifenthrin, phenpropatrine, allethrin and tralomethrin, fenvalerate, flucitrinate, fluvalinate, cycloprothrin. Esters of aromatic group-substituted alkanecarboxylic acids such as trin and etofenprox, fubufenprox (MTI-732), 1- (3-phenoxyphenyl) -4- (4-ethoxyphenyl)-
4-Methylpentane (MTI-790), 1- (3-phenoxy-4-fluorophenyl) -4- (4-ethoxyphenyl) -4-methylpentane (MTI-80)
0), dimethyl- (4-ethoxyphenyl)-(3-phenoxybenzyloxy) methylsilane (SSI-11
6), silafluofene, non-ester compounds such as PP-682, and the like.
【００５１】両抗体を用いたＥＬＩＳＡ法を実施するこ
とにより分析試料中の種々のピレスロイド系化合物の総
残留量の検出が可能である。無論、これらの化合物の中
で、その散布または使用が一つに限定されている分析試
料であれば、その定量結果は該化合物の残留量となる。
さらに、数種類のピレスロイド系化合物が混在する試料
についても、個々の化合物の残留値を定量したい場合に
は、液体クロマトグラフィ−などの既存の技術を利用し
各成分への分画操作を加えればよい。By carrying out an ELISA method using both antibodies, it is possible to detect the total residual amount of various pyrethroid compounds in an analytical sample. Of course, among these compounds, in the case of an analytical sample whose application or use is limited to one, the quantitative result is the residual amount of the compound.
Further, even for a sample in which several kinds of pyrethroid compounds are mixed, when it is desired to quantify the residual value of each compound, it is sufficient to add an fractionation operation to each component using an existing technique such as liquid chromatography.
【００５２】[0052]
【実施例】以下にエトフェンプロックスに対する抗体の
製造方法、本抗体を用いたピレスロイド系化合物の検出
法を実施例によって詳細に説明するが、本発明は本化合
物や実施例のみに限定されるものではない。[Examples] Hereinafter, a method for producing an antibody against etofenprox and a method for detecting a pyrethroid compound using the present antibody will be described in detail with reference to Examples, but the present invention is not limited to the present compound and Examples. is not.
【００５３】実施例１ ハプテン化合物（Ｉ）中間体の
合成 ３−フェノキシベンジル ２−４−ヒドロキシフェニ
ル）−２−メチルプロピルエーテル３．０ｇ、水素化ナ
トリウム０．３６ｇ、アセトニトリル２０ｍｌを約２０
分間加熱還流した後、室温でブロモ酢酸メチル ２ｍｌ
を滴下し、６０℃で２０分間攪拌した。反応液を濃縮
し、酢酸エチル約５０ｍｌを加え、水洗、乾燥、濃縮
後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより分離精
製して３−フェノキシベンジル ２−｛４−（メトキシ
カルボニルメチルオキシ）フェニル｝−２−メチルプロ
ピルエーテル３．０ｇを得た。 ＮＭＲ ：δTMS(CDCl3)(ppm):1.30(6H,s),3.40(2H,s),
3.79(3H,s),4.43(2H,s),4.59(2H,s),6.81-7.35(13H,m) ＩＲ ：νMAX(neat)(cm-1):1763,1585,1488,1252,12
13,1080 屈折率 ：１．５６４１（２１．６℃）Example 1 Synthesis of Hapten Compound (I) Intermediate 3.0 g of 3-phenoxybenzyl 2-4-hydroxyphenyl) -2-methylpropyl ether, 0.36 g of sodium hydride and 20 ml of acetonitrile were added to about 20 g.
After heating under reflux for 1 minute, 2 ml of methyl bromoacetate at room temperature
Was added dropwise, and the mixture was stirred at 60 ° C for 20 minutes. The reaction solution was concentrated, about 50 ml of ethyl acetate was added, washed with water, dried and concentrated, and then separated and purified by silica gel column chromatography to give 3-phenoxybenzyl 2- {4- (methoxycarbonylmethyloxy) phenyl} -2-methyl. 3.0 g of propyl ether was obtained. NMR: δTMS (CDCl 3 ) (ppm): 1.30 (6H, s), 3.40 (2H, s),
3.79 (3H, s), 4.43 (2H, s), 4.59 (2H, s), 6.81-7.35 (13H, m) IR: ν MAX (neat) (cm -1 ): 1763,1585,1488,1252, 12
13,1080 Refractive index: 1.5641 (21.6 ℃)
【００５４】実施例２ ハプテン化合物（Ｉ）の合成 ３−フェキシベンジル ２−｛４−（メトキシカルボニ
ルメチルオキシ）フェニル｝−２−メチルプロピルエー
テル２．２ｇ、水酸化ナトリウム２．５ｇ、水７．５
ｇ、エチレングリコール１０ｍｌを２．５時間加熱還流
した。反応液に希塩酸を加え、酸性にして酢酸エチルで
抽出、水洗、乾燥、濃縮後、シリカゲルカラムクロマト
グラフィーにより分離精製して０．９ｇの３−フェノキ
シベンジル２−｛４−（ヒドロキシカルボニルメチルオ
キシ）フェニル｝−２−メチルプロピルエーテルを得
た。 ＮＭＲ ：δTMS(CDCl3)(ppm):1.30(6H,s),3.41(2H,s),
4.43(2H,s),4.62(2H,s),6.81-7.35(13H,m),9.10-9.90(1
H,br) ＩＲ ：νMAX(neat)(cm-1):3041,1733,1585,1488,12
50,1188,1076 屈折率 ：１．５６８０（２１．６℃）Example 2 Synthesis of hapten compound (I) 3-foxybenzyl 2- {4- (methoxycarbonylmethyloxy) phenyl} -2-methylpropyl ether 2.2 g, sodium hydroxide 2.5 g, water 7 .5
g and 10 ml of ethylene glycol were heated under reflux for 2.5 hours. Dilute hydrochloric acid was added to the reaction solution to make it acidic, extracted with ethyl acetate, washed with water, dried and concentrated, and then separated and purified by silica gel column chromatography to obtain 0.9 g of 3-phenoxybenzyl 2- {4- (hydroxycarbonylmethyloxy). Phenyl} -2-methylpropyl ether was obtained. NMR: δTMS (CDCl 3 ) (ppm): 1.30 (6H, s), 3.41 (2H, s),
4.43 (2H, s), 4.62 (2H, s), 6.81-7.35 (13H, m), 9.10-9.90 (1
H, br) IR: ν MAX (neat) (cm -1 ): 3041,1733,1585,1488,12
50,1188,1076 Refractive index: 1.5680 (21.6 ℃)
【００５５】実施例３ ハプテン化合物（ＩＩ）中間体
の合成 ３−（４−ヒドロキシフェノキシ）ベンジル ２−（４
−エトキシフェニル）−２−メチルプロピルエーテル
１．１ｇ、水素化ナトリウム０．１７ｇ、アセトニトリ
ル１０ｍｌを約２０分間、６０℃で攪拌した後、室温で
ブロモ酢酸エチル１ｍｌを滴下して加え、５０℃で３０
分間攪拌した。反応液を濾過し、濾液を濃縮後、シリカ
ゲルカラムクロマトグラフィーにより分離精製して３−
｛４−（エトキシカルボニルメチルオキシ）フェノキ
シ｝ベンジル ２−（４−エトキシフェニル）−２−メ
チルプロピルエーテル１．２ｇを得た。 ＮＭＲ ：δTMS(CDCl3)(ppm):1.30(6H,s),1.30(3H,t,J
=6.6Hz),1.39(3H,t,J=6.6Hz),3.40(2H,s),4.21-4.31(4
H,m),4.42(2H,s),4.60(2H,s),6.81-7.27(12H,m) ＩＲ ：νMAX(neat)(cm-1):1759,1505,1248,1192,10
85 屈折率 ：１．５４６１（２０．４℃）Example 3 Synthesis of Hapten Compound (II) Intermediate 3- (4-Hydroxyphenoxy) benzyl 2- (4
-Ethoxyphenyl) -2-methylpropyl ether (1.1 g), sodium hydride (0.17 g) and acetonitrile (10 ml) were stirred at 60 ° C for about 20 minutes, and then 1 ml of ethyl bromoacetate was added dropwise at room temperature, and the mixture was added at 50 ° C. Thirty
Stir for minutes. The reaction solution is filtered, and the filtrate is concentrated and then separated and purified by silica gel column chromatography.
1.2 g of {4- (ethoxycarbonylmethyloxy) phenoxy} benzyl 2- (4-ethoxyphenyl) -2-methylpropyl ether was obtained. NMR: δ TMS (CDCl 3 ) (ppm): 1.30 (6H, s), 1.30 (3H, t, J
= 6.6Hz), 1.39 (3H, t, J = 6.6Hz), 3.40 (2H, s), 4.21-4.31 (4
H, m), 4.42 (2H, s), 4.60 (2H, s), 6.81-7.27 (12H, m) IR: ν MAX (neat) (cm -1 ): 1759,1505,1248,1192,10
85 Refractive index: 1.5461 (20.4 ° C)
【００５６】実施例４ ハプテン化合物（ＩＩ）の合成 ３−｛４−（エトキシカルボニルメチルオキシ）フェノ
キシ｝ベンジル ２−（４−エトキシフェニル）−２−
メチルプロピルエーテル１．２ｇ、水酸化ナトリウム
０．９ｇ、水３．０ｇ、エチルアルコール１２ｍｌを
１．５時間加熱還流した。反応液に希塩酸を加え、酸性
にして酢酸エチルで抽出、水洗、乾燥、濃縮後、シリカ
ゲルカラムクロマトグラフィーにより分離精製して０．
７５ｇの３−｛４−（ヒドロキシカルボニルメチルオキ
シ）フェノキシ｝ベンジル ２−（４−エトキシフェニ
ル）−２−メチルプロピルエーテルを得た。 ＮＭＲ ：δTMS(CDCl3)(ppm):1.30(6H,s),1.39(3H,t,J
=6.6Hz),3.40(2H,s),4.00(2H,q,J=6.6Hz),4.43(2H,s),
4.66(2H,s),6.80-7.27(12H,m) ＩＲ ：νMAX(neat)(cm-1):3044,1737,1505,1247,12
05,1081 屈折率 ：１．５４４９（０．４℃）Example 4 Synthesis of hapten compound (II) 3- {4- (ethoxycarbonylmethyloxy) phenoxy} benzyl 2- (4-ethoxyphenyl) -2-
1.2 g of methyl propyl ether, 0.9 g of sodium hydroxide, 3.0 g of water, and 12 ml of ethyl alcohol were heated under reflux for 1.5 hours. Dilute hydrochloric acid was added to the reaction solution to make it acidic, extracted with ethyl acetate, washed with water, dried and concentrated, and then separated and purified by silica gel column chromatography to give a pH of 0.1.
There was obtained 75 g of 3- {4- (hydroxycarbonylmethyloxy) phenoxy} benzyl 2- (4-ethoxyphenyl) -2-methylpropyl ether. NMR: δ TMS (CDCl 3 ) (ppm): 1.30 (6H, s), 1.39 (3H, t, J
= 6.6Hz), 3.40 (2H, s), 4.00 (2H, q, J = 6.6Hz), 4.43 (2H, s),
4.66 (2H, s), 6.80-7.27 (12H, m) IR: ν MAX (neat) (cm -1 ): 3044,1737,1505,1247,12
05,1081 Refractive index: 1.5449 (0.4 ℃)
【００５７】実施例５ ハプテン化合物（ＩＩＩ）中間
体の合成 ３−｛４−（メトキシメチルオキシ）フェニルオキシ｝
ベンジルクロライド０．９ｇ、２−｛４−（ブロモジフ
ルオロメトキシ）フェニル｝ ２−メチルプロピルアル
コール０．９ｇ、トリエチルベンジルアンモニウムクロ
ライド０．１ｇ、水酸化ナトリウム３．５ｇ、水４．０
ｇを４０〜５０℃で４時間攪拌した。反応液に水を加
え、酢酸エチルで抽出、水洗、乾燥、濃縮後、シリカゲ
ルカラムクロマトグラフィーにより分離精製して１．２
ｇの３−｛４−（メトキシメチルオキシ）フェニロキ
シ｝ベンジル ２−｛４−（ブロモジフルオロメトキ
シ）フェニル｝−２−メチルプロピルエーテル１．２ｇ
を得た。Example 5 Synthesis of Hapten Compound (III) Intermediate 3- {4- (methoxymethyloxy) phenyloxy}
Benzyl chloride 0.9 g, 2- {4- (bromodifluoromethoxy) phenyl} 2-methylpropyl alcohol 0.9 g, triethylbenzylammonium chloride 0.1 g, sodium hydroxide 3.5 g, water 4.0.
g was stirred at 40-50 ° C. for 4 hours. Water was added to the reaction solution, which was extracted with ethyl acetate, washed with water, dried and concentrated, and then purified by silica gel column chromatography to obtain 1.2.
1.2 g of 3- {4- (methoxymethyloxy) phenyloxy} benzyl 2- {4- (bromodifluoromethoxy) phenyl} -2-methylpropyl ether
Got
【００５８】３−｛４−（メトキシメチルオキシ）フェ
ニロキシ｝ベンジル ２−｛４−（ブロモジフルオロメ
トキシ）フェニル｝−２−メチルプロピルエーテル１．
２ｇ、ｐ−トルエンスルホン酸０．０５ｇ、アセトン３
０ｍｌを２時間加熱還流した。反応液を濃縮し３−（４
−ヒドロキシフェニルオキシ）ベンジル ２−｛４−
（ブロモジフルオロメトキシ）フェニル｝−２−メチル
プロピルエーテル１．２ｇを油状物として得た。3- {4- (methoxymethyloxy) phenyloxy} benzyl 2- {4- (bromodifluoromethoxy) phenyl} -2-methylpropyl ether 1.
2 g, p-toluenesulfonic acid 0.05 g, acetone 3
0 ml was heated to reflux for 2 hours. The reaction solution is concentrated to 3- (4
-Hydroxyphenyloxy) benzyl 2- {4-
1.2 g of (bromodifluoromethoxy) phenyl} -2-methylpropyl ether was obtained as an oil.
【００５９】３−（４−ヒドロキシフェニルオキシ）ベ
ンジル ２−｛４−（ブロモジフルオロメトキシ）フェ
ニル｝−２−メチルプロピルエーテル１．２ｇ、水素化
ナトリウム０．１３ｇ、アセトニトリル１０ｍｌを約２
０分間、６０℃で攪拌した後、室温でブロモ酢酸エチル
１ｍｌを滴下して加え、５０℃で３０分間攪拌した。反
応液をろ過し、濾液を濃縮後、シリカゲルカラムクロマ
トグラフィーにより分離精製して３−｛４−（エトキシ
カルボニルメチルオキシ）フェノキシ｝ベンジル ２−
｛４−（ブロモジフルオロメトキシ）フェニル｝−２−
メチルプロピルエーテル １．０ｇを得た。 ＮＭＲ ：δTMS(CDCl3)(ppm):1.31(3H,t,J=7.3Hz),1.3
3(6H,s),3.43(2H,s),4.28(2H,q,J=7.3Hz),4.43(2H,s),
4.61(2H,s),6.83-7.39(12H,m) ＩＲ ：νMAX(neat)(cm-1):1760,1505,1198,1008 屈折率 ：．４９８２（２３．８℃）About 2 g of 3- (4-hydroxyphenyloxy) benzyl 2- {4- (bromodifluoromethoxy) phenyl} -2-methylpropyl ether, 0.13 g of sodium hydride and 10 ml of acetonitrile were added.
After stirring for 0 minutes at 60 ° C., 1 ml of ethyl bromoacetate was added dropwise at room temperature, and the mixture was stirred at 50 ° C. for 30 minutes. The reaction solution is filtered, and the filtrate is concentrated and then separated and purified by silica gel column chromatography to give 3- {4- (ethoxycarbonylmethyloxy) phenoxy} benzyl 2-.
{4- (bromodifluoromethoxy) phenyl} -2-
1.0 g of methyl propyl ether was obtained. NMR: δ TMS (CDCl 3 ) (ppm): 1.31 (3H, t, J = 7.3Hz), 1.3
3 (6H, s), 3.43 (2H, s), 4.28 (2H, q, J = 7.3Hz), 4.43 (2H, s),
4.61 (2H, s), 6.83-7.39 (12H, m) IR: ν MAX (neat) (cm -1 ): 1760,1505,1198,1008 Refractive index :. 4982 (23.8 ° C)
【００６０】実施例６ ハプテン化合物（ＩＩＩ）の合
成 ３−｛４−（エトシカルボニルメチルオキシ）フェノキ
シ｝ベンジル ２−｛４−（ブロモジフルオロメトキ
シ）フェニル｝−２−メチルプロピルエーテル１．０
ｇ、水酸化ナトリウム０．９ｇ、水４．０ｇ、エチルア
ルコール２０ｍｌを６０℃で１．５時間攪拌した。反応
液に水を加え、ヘキサンで洗浄後、希塩酸を加え、酸性
にして酢酸エチルで抽出、水洗、乾燥、濃縮後、シリカ
ゲルカラムクロマトグラフィーにより分離精製して０．
７２ｇの３−｛４−（ヒドロキシカルボニルメチルオキ
シ）フェノキシ｝ベンジル ２−｛４−（ブロモジフル
オロメトキシ）フェニル｝−２−メチルプロピルエーテ
ルを得た。 ＮＭＲ ：δTMS(CDCl3)(ppm):1.33(6H,s),3.44(2H,s),
4.43(2H,s),4.66(2H,s),6.84-7.39(12H,m) ＩＲ ：νMAX(neat)(cm-1):3049,1733,1506,1202,10
82,1008 屈折率 ：１．５５０１（２３．５℃）Example 6 Synthesis of Hapten Compound (III) 3- {4- (Ethoxycarbonylmethyloxy) phenoxy} benzyl 2- {4- (bromodifluoromethoxy) phenyl} -2-methylpropyl ether 1.0
g, sodium hydroxide 0.9 g, water 4.0 g, and ethyl alcohol 20 ml were stirred at 60 ° C. for 1.5 hours. After adding water to the reaction solution and washing with hexane, dilute hydrochloric acid was added to acidify the mixture, which was extracted with ethyl acetate, washed with water, dried and concentrated, and then separated and purified by silica gel column chromatography to give 0.1.
72 g of 3- {4- (hydroxycarbonylmethyloxy) phenoxy} benzyl 2- {4- (bromodifluoromethoxy) phenyl} -2-methylpropyl ether was obtained. NMR: δ TMS (CDCl 3 ) (ppm): 1.33 (6H, s), 3.44 (2H, s),
4.43 (2H, s), 4.66 (2H, s), 6.84-7.39 (12H, m) IR: ν MAX (neat) (cm -1 ): 3049,1733,1506,1202,10
82,1008 Refractive index: 1.5501 (23.5 ° C)
【００６１】実施例７ 免疫原として牛血清アルブミン（ＢＳＡ）と実施例２お
よび４で得たカルボン酸誘導体の２種の結合体を混合酸
無水法を用いて作製した。３−フェノキシベンジル ２
−｛４−（ヒドロキシカルボニルメチロキシ）フェニ
ル｝−２−メチルプロピルエーテル（ハプテン化合物
（Ｉ））、もしくは、３−４−（ヒドロキシカルボニル
メチロキシ）フェノキシ｝ベンジル ２−（４−エトキ
シフェニル）−２−メチルプロピルエーテル（ハプテン
化合物（ＩＩ））の２５ｍｇを２ｍｌの無水ジオキサン
に溶解し、０．０５ｍｌのＮ−メチルモルホリンを加え
て１０℃で２０分間撹拌し、０．０２ｍｌのイソブチル
クロロカーボネートを添加し１５分間撹拌して、ハプテ
ンの酸無水物溶液を調製した。一方、８０ｍｇのＢＳＡ
を４．３ｍｌの蒸留水に溶解して、１Ｎの水酸化ナトリ
ウム溶液でｐＨ９．０に調整した後、２．６ｍｌの無水
ジオキサンを少しずつ添加した。このＢＳＡ溶液に１Ｎ
の水酸化ナトリウム溶液でｐＨ９に保ちながら、先に調
製したハプテンの酸無水物溶液を各々少しずつ加え、４
℃で４時間撹拌して反応させた。得られた反応物を、Ｓ
ｅｐｈａｄｅｘＧ−２５を用いたカラムで精製し、蒸留
水で２４時間透析した後、凍結乾操して免疫原として使
用した。また、抗原として用いるウサギ血清アルブミン
とハプテン化合物（Ｉ）および化合物（ＩＩ）との結合
体も各々同様に調製した。Example 7 Bovine serum albumin (BSA) as an immunogen and two kinds of conjugates of the carboxylic acid derivatives obtained in Examples 2 and 4 were prepared by the mixed acid anhydride method. 3-phenoxybenzyl 2
-{4- (hydroxycarbonylmethyloxy) phenyl} -2-methylpropyl ether (hapten compound (I)) or 3-4- (hydroxycarbonylmethyloxy) phenoxy} benzyl 2- (4-ethoxyphenyl)- 25 mg of 2-methylpropyl ether (hapten compound (II)) was dissolved in 2 ml of anhydrous dioxane, 0.05 ml of N-methylmorpholine was added and stirred at 10 ° C. for 20 minutes, and 0.02 ml of isobutyl chlorocarbonate was added. The mixture was added and stirred for 15 minutes to prepare an acid anhydride solution of hapten. Meanwhile, 80 mg of BSA
Was dissolved in 4.3 ml of distilled water, adjusted to pH 9.0 with 1N sodium hydroxide solution, and 2.6 ml of anhydrous dioxane was added little by little. 1N to this BSA solution
While maintaining the pH at 9 with the above sodium hydroxide solution, add each of the hapten acid anhydride solutions prepared above little by little.
The reaction was allowed to stir at 4 ° C. for 4 hours. The obtained reaction product is S
It was purified by a column using ephadex G-25, dialyzed against distilled water for 24 hours, freeze-dried and used as an immunogen. Further, conjugates of rabbit serum albumin used as an antigen with hapten compound (I) and compound (II) were similarly prepared.
【００６２】２種の各々の免疫原を２００μｇ／ｍｌに
なるように生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ；１０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．２）、０．９％ＮａＣｌ）に溶解
し、フロイントの完全アジュバントと等量混合して油中
水型エマルジョン状態にしたもの１ｍｌをウサギ（ＮＺ
Ｗ、雌、１３令）に皮下投与した。その後２週間毎に免
疫原とフロイントの不完全アジュバントの混合エマルジ
ョンを同様に追加免疫した。免疫後、採血して得られた
血液を遠心分離して血清を取得し、更に血清を３３％の
硫安で塩析したものを第一抗体として使用した。ハプテ
ン化合物（Ｉ）とＢＳＡの結合体を免疫して得られた抗
体を抗エトフェンプロックス抗体Ｉ（以下、Ｅ抗体Ｉと
略す。）、ハプテン化合物（ＩＩ）とＢＳＡの結合体を
免疫して得られた抗体を抗エトフェンプロックス抗体Ｉ
Ｉ（以下、Ｅ抗体ＩＩと略す。）とする。Each of the two immunogens was dissolved in physiological phosphate buffer (PBS; 10 mM phosphate buffer (pH 7.2), 0.9% NaCl) so as to have a concentration of 200 μg / ml, and Freund's solution was added. Rabbit (NZ
W, female, 13 years old). Then, every two weeks, a mixed emulsion of the immunogen and Freund's incomplete adjuvant was similarly boosted. After immunization, the blood obtained by collecting the blood was centrifuged to obtain serum, and the serum was salted out with 33% ammonium sulfate and used as the first antibody. The antibody obtained by immunizing the conjugate of hapten compound (I) and BSA was immunized with the anti-ethofenprox antibody I (hereinafter, abbreviated as E antibody I) and the conjugate of hapten compound (II) and BSA. The obtained antibody was used as anti-ethofenprox antibody I.
I (hereinafter, abbreviated as E antibody II).
【００６３】実施例８ Ｅ抗体Ｉを用いた以下のようなＥＬＩＳＡ法により、エ
トフェンプロックスを測定できた。 １．ポリスチレンの９６穴マイクロプレートに、コーテ
ィング抗原としてウサギ血清アルブミン（ＲＳＡ）とハ
プテン（Ｉ）の結合体を０．０３μｌ／ｗｅｌｌになる
ようにコーティング緩衝液（ｌ０ｍＭリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７．５）、１００ｍＭＮａＣｌ）に溶解したものを
０．１ｍｌ／ｗｅｌｌの割合で添加し、４℃で一晩イン
キュベーションしてプレートに吸着させた。残った溶液
を除去し、３％のスキムミルク溶液を０．３ｍｌ／ｗｅ
ｌｌの割合で添加し、２５℃で１時間インキュベーショ
ン後、プレートを洗浄緩衝液（１０ｍＭリン酸緩衝液
（ｐＨ７．２）、０．８％ＮａＣ１、０．０２％ＫＣ
ｌ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄して抗原吸
着プレートを得た。Example 8 Etofenprox could be measured by the following ELISA method using the E antibody I. 1. A 96-well polystyrene microplate was coated with a coating buffer solution (10 mM phosphate buffer solution (10 mM phosphate buffer solution (p)) so that the conjugate of rabbit serum albumin (RSA) and hapten (I) as a coating antigen was 0.03 μl / well.
What was dissolved in H7.5), 100 mM NaCl) was added at a rate of 0.1 ml / well, and incubated at 4 ° C. overnight to be adsorbed on the plate. The remaining solution was removed and 3% skim milk solution was added to 0.3 ml / we.
After addition at a rate of 11 and incubation at 25 ° C. for 1 hour, the plate was washed with a washing buffer (10 mM phosphate buffer (pH 7.2), 0.8% NaCl, 0.02% KC).
l, 0.02% Tween20) and washed 3 times to obtain an antigen adsorption plate.
【００６４】２．Ｅ抗体Ｉを希釈緩衝液（ｌ０ｍＭリン
酸緩衝液（ｐＨ７．５）、０．８％ＮａＣｌ、０．０２
％ＫＣｌ）で２０，０００倍に希釈し、メタノールに溶
解したエトフェンプロックス溶液と１：１の割合で混合
し、反応溶液中の抗体濃度が４０，０００倍希釈、メタ
ノール濃度が５０％になるようにして、２５℃で１時間
インキュベーションして反応させた。この反応液を０．
１ｍｌ／ｗｅｌｌづつ抗原吸着プレートに添加し、２５
℃で１時間反応させた後、洗浄緩衝液でこのプレートを
３回洗浄した。2. E-antibody I was diluted with dilution buffer (10 mM phosphate buffer (pH 7.5), 0.8% NaCl, 0.02).
% KCl) and mixed with an etofenprox solution dissolved in methanol at a ratio of 1: 1 to dilute the antibody concentration in the reaction solution by 40,000 and the methanol concentration to 50%. Thus, the reaction was carried out by incubating at 25 ° C. for 1 hour. The reaction mixture was charged with 0.
Add 1 ml / well to the antigen adsorption plate, 25
After reacting at 0 ° C. for 1 hour, the plate was washed 3 times with the washing buffer.
【００６５】３．西洋ワサビペルオキシダーゼを結合し
た抗ウサギＩｇＧヤギＩｇＧ（第二抗体）を洗浄緩衝液
で１０，０００倍に希釈し、０．１ｍｌ／ｗｅｌｌづつ
抗原吸着プレートに添加し２５℃で１時間インキュベー
ションした後、このプレートを洗浄緩衝液で３回洗浄し
た。3. Anti-rabbit IgG goat IgG (second antibody) conjugated with horseradish peroxidase was diluted 10,000-fold with a wash buffer, added to the antigen adsorption plate at 0.1 ml / well, and incubated at 25 ° C. for 1 hour. The plate was washed 3 times with wash buffer.
【００６６】４．ｏ−フェニレンジアミン発色溶液
（０．２％（ｖ／ｖ）ｏ−フェニレンジアミン、１００
ｍＭリン酸クエン酸緩衝液（ｐＨ５．０、０．００３％
（ｖ／ｖ）過酸化水素）を０．２ｍｌ／ｗｅｌｌづつ抗
原吸着プレートに添加し、２５℃で１０分間インキュベ
ーションしたのち、４Ｎ硫酸を０．０５ｍｌ／ｗｅｌｌ
づつプレートに添加して酵素反応を止め、その後、４９
２および６３０ｎｍの吸光度を測定した。この方法によ
り、１０ｎｇ／ｍｌから１０，０００ｎｇ／ｍｌのエト
フェンプロックスの測定が可能であった。4. o-phenylenediamine color developing solution (0.2% (v / v) o-phenylenediamine, 100
mM phosphate citrate buffer (pH 5.0, 0.003%
(V / v) hydrogen peroxide) was added to the antigen adsorption plate in an amount of 0.2 ml / well and incubated at 25 ° C. for 10 minutes, and then 4 N sulfuric acid was added in an amount of 0.05 ml / well.
Add to the plate to stop the enzyme reaction, then
Absorbance at 2 and 630 nm was measured. By this method, it was possible to measure etofenprox from 10 ng / ml to 10,000 ng / ml.
【００６７】一方、Ｅ抗体ＩＩを用いたＥＬＩＳＡで
は、コーティング抗原としてハプテン化合物（ＩＩ）と
ＲＳＡの結合体の０．０１μｇ／ｍｌ溶液を用い、Ｅ抗
体ＩＩの６４，０００倍希釈溶液とエトフェンプロック
スのメタノール溶液を４：１の割合で混合し、反応溶液
中の抗体濃度が８０，０００倍希釈、メタノール濃度が
２０％となるように混合して反応させた後、抗ウサギＩ
ｇＧヤギＩｇＧ（第二抗体）を５，０００倍希釈したも
のを用いることにより、先のＥＬＩＳＡと同様の方法で
３ｎｇ／ｍｌから１，０００ｎｇ／ｍｌのエトフェンプ
ロックスの測定ができた。On the other hand, in the ELISA using the E antibody II, a 0.01 μg / ml solution of the hapten compound (II) / RSA conjugate was used as a coating antigen, and a 64,000-fold diluted solution of the E antibody II and etophene were used. A solution of prox in methanol was mixed at a ratio of 4: 1 and diluted so that the antibody concentration in the reaction solution was 80,000 times and the concentration of methanol was 20%, and the mixture was reacted.
By using 5,000-fold diluted gG goat IgG (second antibody), it was possible to measure etofenprox from 3 ng / ml to 1,000 ng / ml by the same method as in the above ELISA.
【００６８】実施例９ 試験例１の方法を用いて、水田土壌、作物（穀物、野
菜、果実など）および水道水に含まれるエトフェンプロ
ックスの測定が可能であった。すなわち、４０から４，
０００ｎｇ／ｍｌのエトフェンプロックスを含む土壌５
ｇに水５ｍｌとメタノール１５ｍｌを添加して３０分間
振とう抽出した。抽出溶液と１０，０００倍に希釈した
Ｅ抗体Ｉを３：１の割合で混合し、実施例８と同様にし
てＥＬＩＳＡ法で測定できた。同様に、４０から４，０
００ｎｇ／ｍｌのエトフェンプロックスを含む作物１０
ｇに水１０ｍｌとメタノール３０ｍｌを添加して３０分
間振とう抽出した。抽出溶液と１０，０００倍に希釈し
た抗体を３：１の割合で混合し、実施例８と同様にして
ＥＬＩＳＡ法で測定できた。一方、３０から３，０００
ｎｇ／ｍｌのエトフェンプロックスを含む水道水８０ｍ
ｌ、４０，０００倍希釈のＥ抗体ＩＩ溶液２００ｍｌ、
および、メタノール８０ｍｌを混合し、反応溶液中抗体
濃度が８０，０００倍希釈、メタノール濃度が２０％と
なるようにして２５℃で１時間反応させてＥＬＩＳＡ法
で測定した。この方法で土壌及び作物中のエトフェンプ
ロックスは４０から４，０００ｎｇ／ｍｌを測定でき、
また、水道中のエトフェンプロックスは３０から３，０
００ｎｇ／ｍｌを測定できた。Example 9 Using the method of Test Example 1, it was possible to measure etofenprox contained in paddy soil, crops (grains, vegetables, fruits, etc.) and tap water. That is, 40 to 4,
Soil containing 000 ng / ml etofenprox 5
5 g of water and 15 ml of methanol were added to g and the mixture was shake-extracted for 30 minutes. The extraction solution and E antibody I diluted 10,000 times were mixed at a ratio of 3: 1, and the measurement could be performed by the ELISA method in the same manner as in Example 8. Similarly, 40 to 4,0
Crop 10 containing 00 ng / ml etofenprox
10 g of water and 30 ml of methanol were added to g and shake extraction was performed for 30 minutes. The extraction solution and the 10,000-fold diluted antibody were mixed at a ratio of 3: 1 and measured by the ELISA method in the same manner as in Example 8. On the other hand, 30 to 3,000
80m tap water containing ng / ml etofenprox
l, 40,000-fold diluted E antibody II solution 200 ml,
Then, 80 ml of methanol was mixed, the reaction solution was diluted with the antibody concentration by 80,000 times, and the reaction was carried out at 25 ° C. for 1 hour so that the methanol concentration became 20%, and the measurement was carried out by the ELISA method. With this method, etofenprox in soil and crops can measure 40 to 4,000 ng / ml,
In addition, the amount of etofenprox in the water is 30 to 3,0.
It was possible to measure 00 ng / ml.
【００６９】実施例１０ 実施例８の方法と同様にして、コーティング抗原として
ハプテン化合物ＩまたはＩＩとＲＳＡの結合体を９６穴
マイクロプレートにコーティングし、試料中のエトフェ
ンロックスと反応させたＥ抗体ＩまたはＥ抗体ＩＩをコ
ーティング抗原と反応させた後、下記の方法でもエトフ
ェンプロックスを検出できた。すなわち、ビオチンを結
合した抗ウサギＩｇＧロバＩｇＧを洗浄用緩衝液で２，
０００倍に希釈し、０．１ｍｌ／ｗｅｌｌずつ添加し２
５℃で１時間インキュベーションした後、プレートを洗
浄用緩衝液で３回洗浄した。アルカリフォスファターゼ
を結合したアビジンを洗浄用緩衝液で１，０００倍に希
釈して０．１ｍｌ／ｗｅｌｌず添加し、２５℃で１時間
反応させた。その後、洗浄用緩衝液で３回洗浄した。ア
ルカリフォスファターゼ発色溶液（０．１％ｐ−ニトロ
フェニルリン酸、９．７％ジエタノールアミン−塩酸緩
衝液（ｐＨ９．８）、０．００５％塩化マグネシウム）
を０．２ｍｌ／ｗｅｌｌずつ添加し、２５℃で３０分間
インキュベーションして発色させ、２Ｎの水酸化ナトリ
ウムを５０μｌ／ｗｅｌｌずつ添加して反応を止め、４
１５および６３０ｎｍでの吸光度を測定した。このアビ
ジン−ビオチン法を用いた方法では、約１０ｎｇ／ｍｌ
以上のエトフェンプロックスの測定ができた。Example 10 In the same manner as in Example 8, a 96-well microplate was coated with a hapten compound I or II-RSA conjugate as a coating antigen, and the E antibody was reacted with etofenrox in the sample. After reacting I or E antibody II with the coating antigen, etofenprox could also be detected by the following method. That is, anti-rabbit IgG donkey IgG bound with biotin was washed with a washing buffer to
Dilute 000-fold and add 0.1 ml / well each 2
After incubation for 1 hour at 5 ° C, the plates were washed 3 times with wash buffer. Avidin to which alkaline phosphatase was bound was diluted 1,000 times with a washing buffer, 0.1 ml / well was added, and the mixture was reacted at 25 ° C. for 1 hour. Then, it wash | cleaned 3 times with the wash buffer. Alkaline phosphatase coloring solution (0.1% p-nitrophenyl phosphate, 9.7% diethanolamine-hydrochloric acid buffer (pH 9.8), 0.005% magnesium chloride)
0.2 ml / well, and the mixture was incubated at 25 ° C. for 30 minutes to develop color, and 2N sodium hydroxide was added at 50 μl / well to stop the reaction.
Absorbance was measured at 15 and 630 nm. In the method using the avidin-biotin method, about 10 ng / ml
The above measurement of etofenprox was completed.
【００７０】実施例１１ Ｅ抗体ＩとＥ抗体ＩＩを用いて実施例８の方法により各
種ピレスロイド系化合物に対する交又反応性を測定し
た。ピレスロイド系化合物の各々のメタノール溶液（濃
度２〜２０，０００ｎｇ／ｍｌ）と、希釈用緩衝液で２
０，０００倍に希釈したＥ抗体Ｉの溶液を１：１の割合
で混合し、２５℃で１時間インキュベーションして反応
させた。この反応液を用いて、実施例８と同様にしてＥ
ＬＩＳＡ法による測定を行った。そして、ピレスロイド
系化合物を加えずに反応させた場合の吸光度を１００％
としてその５０％を阻害するエトフェンプロックスの濃
度をＩＣ50濃度とし、さらにエトフェンプロックスのＩ
Ｃ50濃度時の阻害率を１００％とした時の他のピレスロ
イド系化合物の阻害率の比を交叉反応性として第１表
（表１）に示した。Example 11 E antibodies I and E antibodies II were used to measure cross-reactivity with various pyrethroid compounds by the method of Example 8. Each solution of pyrethroid compound in methanol (concentration 2-20,000 ng / ml) and diluting buffer
A solution of E antibody I diluted 10,000 times was mixed at a ratio of 1: 1 and incubated at 25 ° C. for 1 hour to react. Using this reaction solution, E was prepared in the same manner as in Example 8.
The measurement was performed by the LISA method. And, the absorbance when reacted without adding the pyrethroid compound is 100%.
And the concentration of etofenprox that inhibits 50% thereof is defined as the IC 50 concentration.
The ratio of the inhibition rates of other pyrethroid compounds when the inhibition rate at the C 50 concentration was 100% was shown as cross-reactivity in Table 1 (Table 1).
【００７１】また、ピレスロイド系化合物の各々のメタ
ノール溶液（濃度５〜５０，０００ｎｇ／ｍｌ）とＥ抗
体ＩＩの６４，０００倍希釈溶液を１：４の割合で混合
し、２５℃で１時間インキュベーションした反応液を用
いて実施例８と同様に行ない、交又反応性を求めた。結
果を上記と同様にしてエトフェンプロックスのＩＣ50濃
度時の阻害率を１００％とした時の他のピレスロイド系
化合物の阻害率の比を交叉反応性として第１表（表１）
に示した。Further, each methanol solution of pyrethroid compound (concentration: 5 to 50,000 ng / ml) and a 64,000-fold diluted solution of E antibody II were mixed at a ratio of 1: 4 and incubated at 25 ° C. for 1 hour. The reaction solution thus obtained was used to carry out the same procedure as in Example 8 to determine the cross reactivity. The results are the same as above, and the cross-reactivity is defined as the cross-reactivity ratio of the inhibition rate of other pyrethroid compounds when the inhibition rate of etofenprox at the IC 50 concentration is 100%.
It was shown to.
【００７２】[0072]
【表１】 [Table 1]
【００７３】[0073]
【発明の効果】以上の各実施例から明らかなように、本
発明によって、環境中の水、土壌、植物および食料に残
留するピレスロイド系化合物の量を簡便かつ迅速に測定
することが可能であった。As is apparent from the above examples, the present invention enables simple and rapid measurement of the amount of pyrethroid compounds remaining in water, soil, plants and food in the environment. It was
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ０７Ｃ 69/78 9279−4Ｈ 69/94 255/54 323/16 323/29 323/50 Ｃ０７Ｆ 7/08 Ｇ Ｃ０７Ｋ 16/44 8318−4Ｈ (72)発明者 麓 康紀 千葉県茂原市東郷1144番地 三井東圧化学 株式会社内 (72)発明者 粂田 貴子 千葉県茂原市東郷1144番地 三井東圧化学 株式会社内─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification code Internal reference number FI Technical indication C07C 69/78 9279-4H 69/94 255/54 323/16 323/29 323/50 C07F 7 / 08 G C07K 16/44 8318-4H (72) Inventor Yasuki Koji 1144 Togo, Mobara-shi, Chiba Prefecture Mitsui Toatsu Chemical Co., Ltd. (72) Takako Kata, 1144 Togo, Mobara-shi, Chiba Mitsui Toatsu Chemical Co., Ltd. Within
Claims (7)
（化２）のハプテン化合物 【化１】 【化２】 （式中、Ｒ1 は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ1〜Ｃ5のア
ルキル基、Ｃ1〜Ｃ5のハロアルキル基、Ｃ1〜Ｃ5のアル
コキシ基、Ｃ1〜Ｃ5 のハロアルコキシ基、Ｃ1〜Ｃ5 の
アルキルチオ基、Ｃ1〜Ｃ5のハロアルキルチオ基、Ｃ2
〜Ｃ5のアルケニル基、Ｃ2〜Ｃ5のハロアルケニルチオ
基、Ｃ2〜Ｃ5のアルキニル基、Ｃ2〜Ｃ5のハロアルキニ
ル基、低級アルコキシ低級アルキル基、低級アルコキシ
低級アルコキシ基、Ｃ2〜Ｃ5のハロアルケニルオキシ
基、Ｃ2〜Ｃ5のアルキニルオキシ基、Ｃ 1〜Ｃ5のアルコ
キシカボニル基、Ｃ1〜Ｃ5 のハロアルコキシカルボニ
ル基、Ｃ3〜Ｃ6のシクロアルキル基、Ｃ3〜Ｃ6 のシク
ロアルコキシ基、フェニル基、フェノキシ基、シアノ基
を表わし、Ｒ2 はＣ1〜Ｃ5のアルキル基、Ｃ1〜Ｃ5のハ
ロアルキル基を表わし、Ｒ3 は水素原子、Ｃ1〜Ｃ5のア
ルキル基、Ｃ1〜Ｃ5のハロアルキル基を表わし、Ｒ2と
Ｒ3はそれらが結合してＣ3〜Ｃ6のシクロアルキル基、
Ｃ3〜Ｃ6のシクロハロアルキル基を形成しても良い。Ｒ
4、Ｒ5は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコ
キシ基を表わし、Ａは炭素原子、ケイ素原子を表わし、
Ｂは−ＣＨ2−、−ＮＲ6−、−Ｏ−、−Ｓ−を表わし、
Ｒ6 は水素原子または低級アルキル基を表わし、Ｚは−
Ｙ−（ＣＨ2）ｍ−ＣＯＯＨまたは −Ｙ−（ＣＨ2）ｎ
−ＮＨ2を表わし、Ｙは−Ｈ2Ｃ−、−ＮＲ7−、−Ｏ
−、−Ｓ−を表わし、Ｒ7 は水素原子または低級アルキ
ル基を表わし、ｍおよびｎは１〜５を表わす。）と高分
子化合物の結合体を免疫原として動物に免疫することに
より得られるピレスロイド系化合物に対する抗体を第一
抗体とし、該第一抗体を試料溶液に混合した後、未反応
の第一抗体を担体の表面にコートした高分子化合物とハ
プテンの結合体（コーティング抗原）に結合させて抗原
抗体結合体を得、該抗原抗体結合体に、標識酵素を結合
した第一抗体に対する抗体（第二抗体）を反応させるこ
とからなるピレスロイド系化合物の検出方法。1. The following general formula (1) (formula 1) or (2)
Hapten compound of (Chemical formula 2)[Chemical 2](In the formula, R1 Is hydrogen atom, halogen atom, C1~ CFiveA
Rukiru group, C1~ CFiveHaloalkyl group, C1~ CFiveThe al
Coxy group, C1~ CFive Haloalkoxy group, C1~ CFive of
Alkylthio group, C1~ CFiveHaloalkylthio group, C2
~ CFiveAlkenyl group of C2~ CFiveHalo alkenyl thio
Base, C2~ CFiveAn alkynyl group of C2~ CFiveThe halo alkini
Group, lower alkoxy, lower alkyl group, lower alkoxy
Lower alkoxy group, C2~ CFiveOf haloalkenyloxy
Base, C2~ CFiveAlkynyloxy group, C 1~ CFiveArco
Xycavonyl group, C1~ CFive The haloalkoxy carbonyl
Lu group, C3~ C6Cycloalkyl group, C3~ C6 Shiku
Ralkoxy group, phenyl group, phenoxy group, cyano group
And R2 Is C1~ CFiveAlkyl group of C1~ CFiveHa
Represents a lower alkyl group, R3 Is a hydrogen atom, C1~ CFiveA
Rukiru group, C1~ CFiveRepresents a haloalkyl group of2When
R3Is C when they combine3~ C6A cycloalkyl group of
C3~ C6The cyclohaloalkyl group may be formed. R
Four, RFiveIs a hydrogen atom, a halogen atom, an alkyl group, an alcohol
Represents a xy group, A represents a carbon atom, a silicon atom,
B is -CH2-, -NR6Represents-, -O-, -S-,
R6 Represents a hydrogen atom or a lower alkyl group, and Z is-.
Y- (CH2) M-COOH or -Y- (CH2) N
-NH2Represents, and Y is -H2C-, -NR7-, -O
Represents-, -S-, R7 Is a hydrogen atom or lower alk
Group and m and n represent 1 to 5. ) And Komin
To immunize animals with a conjugate of a child compound as an immunogen
The antibody against the obtained pyrethroid compound
As an antibody, and after mixing the first antibody with the sample solution, unreacted
Of the polymer compound coated with the primary antibody of
Antigen by binding to the conjugate of puten (coating antigen)
Obtain an antibody conjugate, and bind a labeling enzyme to the antigen-antibody conjugate
The antibody against the primary antibody (second antibody)
A method for detecting a pyrethroid compound, comprising:
（２）のハプテン化合物。2. The hapten compound represented by the general formula (1) or (2) according to claim 1.
（化４） 【化３】 【化４】 （式中、Ｒ1 は水素原子、ハロゲン原子、Ｃ1〜Ｃ5のア
ルキル基、Ｃ1〜Ｃ5のハロアルキル基、Ｃ1〜Ｃ5のアル
コキシ基、Ｃ1〜Ｃ5のハロアルコキシ基、Ｃ1〜Ｃ5のア
ルキルチオ基、Ｃ1〜Ｃ5のハロアルキルチオ基、Ｃ2〜
Ｃ5 のアルケニル基、Ｃ2〜Ｃ5のハロアルケニルチオ
基、Ｃ2〜Ｃ5のアルキニル基、Ｃ2〜Ｃ5のハロアルキニ
ル基、低級アルコキシ低級アルキル基、低級アルコキシ
低級アルコキシ基、Ｃ2〜Ｃ5のハロアルケニルオキシ
基、Ｃ2〜Ｃ5のアルキニルオキシ基、Ｃ 1〜Ｃ5のアルコ
キシカボニル基、Ｃ1〜Ｃ5のハロアルコキシカルボニル
基、Ｃ3〜Ｃ6のシクロアルキル基、Ｃ3〜Ｃ6 のシクロ
アルコキシ基、フェニル基、フェノキシ基、シアノ基を
表わし、Ｒ2 はＣ1〜Ｃ5のアルキル基、Ｃ1〜Ｃ5のハロ
アルキル基を表わし、Ｒ3 は水素原子、Ｃ1〜Ｃ5のアル
キル基、Ｃ1〜Ｃ5のハロアルキル基を表わし、Ｒ2とＲ3
はそれらが結合してＣ3〜Ｃ6のシクロアルキル基、Ｃ3
〜Ｃ6のシクロハロアルキル基を形成しても良い。Ｒ4、
Ｒ5は水素原子、ハロゲン原子、アルキル基、アルコキ
シ基を表わし、Ａは炭素原子、ケイ素原子を表わし、Ｂ
は−ＣＨ2−、−ＮＲ6−、−Ｏ−、−Ｓ−を表わし、Ｒ
6 は水素原子または低級アルキル基を表わし、Ｚ'は−
Ｙ'−（ＣＨ2）ｍ−ＣＯＯＲ7' または−Ｙ'−（Ｃ
Ｈ2）ｎ−ＮＨＲ8を表わし、Ｙ'は−ＣＨ2Ｏ−、−ＮＲ
9−、−Ｏ−、−Ｓ−を表わし、Ｒ7'はＣ1〜Ｃ5のアル
キル基、低級アルコキシ低級アルキル基、低級アルコキ
シ低級アルコキシ低級アルキル基、低級アルキルチオ低
級アルキル基、テトラヒドロピラニル基、テトラヒドロ
フラニル基、フェニル基、フェニルオキシ低級アルキル
基、フェナシル基、ジアシルメチル基、Ｎ−フタルイミ
ドメチル基、ベンジル基、シリル基を表わし、ｍは１〜
５を表わし、Ｒ8 はホルミル基、アセチル基、ハロアセ
チル基、プロピオニル基、フェニルアセチル基、アルコ
キシカルボニル基、ハロアルコキシカルボニル基、フル
オレンメチルカルボニル基、フェニルオキシカルボニル
基、フェニルチオカルボニル基、ピペリジニルオキシカ
ルボニル基、ベンジルオキシカルボニル基を表わす。Ｒ
9 は水素原子または低級アルキル基を表わし、ｎは１〜
５を表わす。）の請求項２のハプテン化合物を製造する
ための中間体。3. The following general formula (3) (formula 3) and (4)
(Chemical formula 4) [Chemical formula 3][Chemical 4](In the formula, R1 Is hydrogen atom, halogen atom, C1~ CFiveA
Rukiru group, C1~ CFiveHaloalkyl group, C1~ CFiveThe al
Coxy group, C1~ CFiveHaloalkoxy group, C1~ CFiveA
Rukiruthio group, C1~ CFiveHaloalkylthio group, C2~
CFive Alkenyl group of C2~ CFiveHalo alkenyl thio
Base, C2~ CFiveAn alkynyl group of C2~ CFiveThe halo alkini
Group, lower alkoxy, lower alkyl group, lower alkoxy
Lower alkoxy group, C2~ CFiveOf haloalkenyloxy
Base, C2~ CFiveAlkynyloxy group, C 1~ CFiveArco
Xycavonyl group, C1~ CFiveHaloalkoxycarbonyl
Base, C3~ C6Cycloalkyl group, C3~ C6 The cyclo
Alkoxy group, phenyl group, phenoxy group, cyano group
Represent, R2 Is C1~ CFiveAlkyl group of C1~ CFiveThe halo
Represents an alkyl group, R3 Is a hydrogen atom, C1~ CFiveThe al
Kill group, C1~ CFiveRepresents a haloalkyl group of2And R3
Is C when they combine3~ C6Cycloalkyl group, C3
~ C6The cyclohaloalkyl group may be formed. RFour,
RFiveIs a hydrogen atom, a halogen atom, an alkyl group, an alkoxy group
Represents a Si group, A represents a carbon atom, a silicon atom, B
Is -CH2-, -NR6Represents-, -O-, -S-, R
6 Represents a hydrogen atom or a lower alkyl group, and Z'is-
Y '-(CH2) M-COOR7'Or -Y'-(C
H2) N-NHR8And Y'is -CH2O-, -NR
9Represents-, -O-, -S-, R7'Is C1~ CFiveThe al
Kill group, lower alkoxy lower alkyl group, lower alkoxy group
Si lower alkoxy lower alkyl group, lower alkylthio lower
Class alkyl group, tetrahydropyranyl group, tetrahydro
Furanyl group, phenyl group, phenyloxy lower alkyl
Group, phenacyl group, diacylmethyl group, N-phthalimi
Represents a methyl group, a benzyl group or a silyl group, and m is 1 to
Represents 5, R8 Is formyl group, acetyl group, haloacetate
Cyl group, propionyl group, phenylacetyl group, alco
Xycarbonyl group, haloalkoxycarbonyl group, full
Orenemethylcarbonyl group, phenyloxycarbonyl
Group, phenylthiocarbonyl group, piperidinyloxyca
It represents a rubonyl group or a benzyloxycarbonyl group. R
9 Represents a hydrogen atom or a lower alkyl group, and n is 1 to
Represents 5. ) The hapten compound according to claim 2 is produced.
Intermediate for.
たは（２）と高分子化合物との結合体。4. A conjugate of the hapten compound (1) or (2) according to claim 2 and a polymer compound.
またはアセトニトリルの存在下に、ピレスロイド系化合
物を認識し得る抗体。5. An antibody capable of recognizing a pyrethroid compound in the presence of alcohols, dimethyl sulfoxide or acetonitrile.
カデスリン、シハロトリン、ビフェントリン、フェンプ
ロパトリン、アレスリン、トラロメスリン、フェンバレ
レート、フルシトリネート、フルバリネート、シクロプ
ロトリン、エトフェンプロックス、フブフェンプロック
ス、１−（３−フェノキシフェニル）−４−（４−エト
キシフェニル）−４−メチルペンタン、１−（３−フェ
ノキシ−４−フルオロフェニル）−４−（４−エトキシ
フェニル）−４−メチルペンタン、ジメチル−（４−エ
トキシフェニル）−（３−フェノキシベンジルオキシ）
メチルシラン、シラフルオフェンから選ばれた少なくと
も１種である請求項５の抗体。6. A pyrethroid compound is resmethrin,
Cadethrin, cyhalothrin, bifenthrin, fenpropatorin, allethrin, tralomethrin, fenvalerate, flucitrinate, fluvalinate, cycloprotoline, etofenprox, fubufenprox, 1- (3-phenoxyphenyl) -4- (4- Ethoxyphenyl) -4-methylpentane, 1- (3-phenoxy-4-fluorophenyl) -4- (4-ethoxyphenyl) -4-methylpentane, dimethyl- (4-ethoxyphenyl)-(3-phenoxybenzyl Oxy)
The antibody according to claim 5, which is at least one selected from methylsilane and silafluofen.
（ヒドロキシカルボニルメチルオキシ）フェニル｝−２
−メチルプロピル エーテルまたは３−｛４−（ヒドロ
キシカルボニルメチルオキシ）フェノキシ｝ベンジル
２−（４−エトキシフェニル）−２−メチルプロピル
エーテルを抗原決定基として認識し得る請求項５または
６記載の抗体。7. 3-Phenoxybenzyl 2- {4-
(Hydroxycarbonylmethyloxy) phenyl} -2
-Methylpropyl ether or 3- {4- (hydroxycarbonylmethyloxy) phenoxy} benzyl
2- (4-ethoxyphenyl) -2-methylpropyl
The antibody according to claim 5 or 6, which can recognize ether as an antigenic determinant.
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| CN111781348A (en) * | 2020-07-08 | 2020-10-16 | 中国中医科学院医学实验中心 | Fluorescent quantitative immunochromatography detection test paper for pesticide ethofenprox and application thereof |
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1994
- 1994-09-26 JP JP22925194A patent/JP3543846B2/en not_active Expired - Fee Related
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| CN111781348B (en) * | 2020-07-08 | 2023-03-24 | 中国中医科学院医学实验中心 | Fluorescent quantitative immunochromatography detection test paper for pesticide ethofenprox and application thereof |
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