JPH07151760A - 水溶液中のエンドトキシンの安定化方法 - Google Patents
水溶液中のエンドトキシンの安定化方法Info
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- JPH07151760A JPH07151760A JP5348481A JP34848193A JPH07151760A JP H07151760 A JPH07151760 A JP H07151760A JP 5348481 A JP5348481 A JP 5348481A JP 34848193 A JP34848193 A JP 34848193A JP H07151760 A JPH07151760 A JP H07151760A
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- aqueous solution
- endotoxin
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Abstract
(57)【要約】
【目的】今までは経時的なＥＴ測定値の低下が著しかっ
た水溶液中のＥＴ濃度を長期間に渡って安定に保存する
ための方法を提供。 【構成】エンドトキシンを含む水溶液に、エンドトキシ
ンに親和性を有し、且つエンドトキシンとカブトガニの
血球成分液との反応を阻害若しくは促進する性質を有さ
ない水溶性の蛋白質を共存させることを特徴とする、水
溶液中のエンドトキシンの安定化方法。
た水溶液中のＥＴ濃度を長期間に渡って安定に保存する
ための方法を提供。 【構成】エンドトキシンを含む水溶液に、エンドトキシ
ンに親和性を有し、且つエンドトキシンとカブトガニの
血球成分液との反応を阻害若しくは促進する性質を有さ
ない水溶性の蛋白質を共存させることを特徴とする、水
溶液中のエンドトキシンの安定化方法。
Description
【０００１】
【発明の利用分野】本発明は、例えば血液透析用透析液
等の水溶液中のエンドトキシン（以下、ＥＴと略記す
る。）濃度を正確に測定するために利用される、水溶液
中のＥＴの安定化方法に関する。
等の水溶液中のエンドトキシン（以下、ＥＴと略記す
る。）濃度を正確に測定するために利用される、水溶液
中のＥＴの安定化方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】主に慢性腎不全患者を対象として、人工
透析装置による血液透析が広く行われている。血液透析
では半透膜を有するダイアライザーを介して、血液中の
不要物質の除去、或は必要物質の補給を行っている。
透析装置による血液透析が広く行われている。血液透析
では半透膜を有するダイアライザーを介して、血液中の
不要物質の除去、或は必要物質の補給を行っている。
【０００３】近年、血液透析に於いて、従来の比較的低
分子量の物質のみならず、β2-ミクログロブリン等の比
較的分子量の大きな有害物質も除去しなければ、患者に
悪影響が生じることが判ると共に、半透膜の作製技術の
向上により、血液中不要物質のうち分子量が１万程度の
物質まで除去可能な高透過性ダイアライザーが使用され
るようになった。しかし、その一方で透析液中に存在し
得る毒性物質のうち、分子量数千から１万程度のＥＴ或
はそれに類似する物質が血液中へ半透膜を介して侵入す
る逆濾過、逆拡散なる現象が問題視されている。即ち、
ＥＴは、グラム陰性菌の細胞壁外膜に存在するリポ多糖
（Lipopolysaccharide、ＬＰＳ）で、強い発熱性物質と
して知られているものであり、血液透析用透析液へのＥ
Ｔのコンタミを防止することは極めて重要であると考え
られるからである。特に、逆拡散による侵入は透析方法
を工夫しても防ぐことができず［S.Takesawa, H.Saito,
H.Hidai, M.Suzuki and K.Sakai:Measurement of Back
Clearance. Trans Am SocIntern Organs. 36 M441-443
(1990)］、高透過性ダイアライザー使用施設では血液
透析用透析液をＥＴフリーとする努力が不可欠となっ
た。
分子量の物質のみならず、β2-ミクログロブリン等の比
較的分子量の大きな有害物質も除去しなければ、患者に
悪影響が生じることが判ると共に、半透膜の作製技術の
向上により、血液中不要物質のうち分子量が１万程度の
物質まで除去可能な高透過性ダイアライザーが使用され
るようになった。しかし、その一方で透析液中に存在し
得る毒性物質のうち、分子量数千から１万程度のＥＴ或
はそれに類似する物質が血液中へ半透膜を介して侵入す
る逆濾過、逆拡散なる現象が問題視されている。即ち、
ＥＴは、グラム陰性菌の細胞壁外膜に存在するリポ多糖
（Lipopolysaccharide、ＬＰＳ）で、強い発熱性物質と
して知られているものであり、血液透析用透析液へのＥ
Ｔのコンタミを防止することは極めて重要であると考え
られるからである。特に、逆拡散による侵入は透析方法
を工夫しても防ぐことができず［S.Takesawa, H.Saito,
H.Hidai, M.Suzuki and K.Sakai:Measurement of Back
Clearance. Trans Am SocIntern Organs. 36 M441-443
(1990)］、高透過性ダイアライザー使用施設では血液
透析用透析液をＥＴフリーとする努力が不可欠となっ
た。
【０００４】血液透析用透析液がＥＴフリーであるか否
かの判定方法としては、菌体数測定法や、カブトガニの
血球成分液（以下、ＡＬ溶液と略記する。）がＥＴと反
応して酵素（プロテアーゼ等）の活性化反応やゲル化反
応を生じる性質を有していることを利用したＥＴ測定
法、所謂リムルステスト等が主なものとして挙げられ
る。このうち、菌体数測定法はある程度確立された方法
ではあるものの、検出に時間を要すると言う問題点を有
している。そのため、迅速な測定が可能なＥＴ測定法に
より、血液透析用透析液がＥＴフリーであるか否かの判
定を行うことが望ましい。
かの判定方法としては、菌体数測定法や、カブトガニの
血球成分液（以下、ＡＬ溶液と略記する。）がＥＴと反
応して酵素（プロテアーゼ等）の活性化反応やゲル化反
応を生じる性質を有していることを利用したＥＴ測定
法、所謂リムルステスト等が主なものとして挙げられ
る。このうち、菌体数測定法はある程度確立された方法
ではあるものの、検出に時間を要すると言う問題点を有
している。そのため、迅速な測定が可能なＥＴ測定法に
より、血液透析用透析液がＥＴフリーであるか否かの判
定を行うことが望ましい。
【０００５】しかしながら、血液透析用透析液中のＥＴ
の測定は今だ重要な問題を解決できていないため、その
測定精度が問題となっている。即ち、リムルステストに
よるＥＴ測定に於いては、分析のために採取した血液透
析用透析液中のＥＴ測定値が経時的に減少するので、採
取後短時間の間に測定を行わない限り正しい値が求まら
ないという問題がある［竹沢真吾、菊池伸樹、日台英
雄、中村陽子、戸田規子、菅野正彦．透析液エンドトキ
シン測定の基礎検討．腎と透析別冊ハイパフォーマンス
メンブレン'９３ 64-66 (1993)］。
の測定は今だ重要な問題を解決できていないため、その
測定精度が問題となっている。即ち、リムルステストに
よるＥＴ測定に於いては、分析のために採取した血液透
析用透析液中のＥＴ測定値が経時的に減少するので、採
取後短時間の間に測定を行わない限り正しい値が求まら
ないという問題がある［竹沢真吾、菊池伸樹、日台英
雄、中村陽子、戸田規子、菅野正彦．透析液エンドトキ
シン測定の基礎検討．腎と透析別冊ハイパフォーマンス
メンブレン'９３ 64-66 (1993)］。
【０００６】そのため、血液透析用透析液等の水溶液中
のＥＴをリムルステスト等で測定するためには、これら
水溶液中でＥＴを安定化する必要があるが、この目的に
叶うＥＴの安定化方法は、未だ見出されておらず早急な
開発が望まれている現状にある。
のＥＴをリムルステスト等で測定するためには、これら
水溶液中でＥＴを安定化する必要があるが、この目的に
叶うＥＴの安定化方法は、未だ見出されておらず早急な
開発が望まれている現状にある。
【０００７】
【発明の目的】本発明は、上記した如き状況に鑑み成さ
れたもので、採取した水溶液中のＥＴ測定値が正確に求
められるよう、その経時変化を抑える安定化方法を提供
することをその目的とする。
れたもので、採取した水溶液中のＥＴ測定値が正確に求
められるよう、その経時変化を抑える安定化方法を提供
することをその目的とする。
【０００８】
【発明の構成】本発明は、ＥＴを含む水溶液に、ＥＴに
親和性を有し、且つＥＴとＡＬ溶液との反応を阻害若し
くは促進する性質を有さない水溶性の蛋白質を共存させ
ることを特徴とする、水溶液中のＥＴの安定化方法、の
発明である。
親和性を有し、且つＥＴとＡＬ溶液との反応を阻害若し
くは促進する性質を有さない水溶性の蛋白質を共存させ
ることを特徴とする、水溶液中のＥＴの安定化方法、の
発明である。
【０００９】即ち、本発明者らは、血液透析用透析液等
の水溶液に於いては、保存中にＥＴの測定値が経時的に
減少して、これら水溶液中のＥＴ濃度を精度良く測定で
きないという問題を解決するために、水溶液中のＥＴを
安定化し得る方法を求めて鋭意研究の結果、例えばアル
ブミンや免疫グロブリン等のようにＥＴに親和性を有
し、且つＥＴとＡＬ溶液との反応を阻害若しくは促進す
る性質を有さない水溶性の蛋白質をこれら水溶液中に共
存させた場合には、ＥＴを安定化し得ること、即ちＥＴ
測定値の経時変化を抑えることができることを見出し、
本発明を完成させるに至った。
の水溶液に於いては、保存中にＥＴの測定値が経時的に
減少して、これら水溶液中のＥＴ濃度を精度良く測定で
きないという問題を解決するために、水溶液中のＥＴを
安定化し得る方法を求めて鋭意研究の結果、例えばアル
ブミンや免疫グロブリン等のようにＥＴに親和性を有
し、且つＥＴとＡＬ溶液との反応を阻害若しくは促進す
る性質を有さない水溶性の蛋白質をこれら水溶液中に共
存させた場合には、ＥＴを安定化し得ること、即ちＥＴ
測定値の経時変化を抑えることができることを見出し、
本発明を完成させるに至った。
【００１０】本発明に於いて使用される、ＥＴに親和性
を有し、且つＥＴとＡＬ溶液との反応を阻害若しくは促
進する性質を有さない蛋白質（以下、ＥＴ親和性蛋白質
と略記する。）としては、このような性質を有する蛋白
質であれば特に限定されることなく挙げられるが、例え
ばアルブミン（オボアルブミン等も含む。）、免疫グロ
ブリン（ＩgＧ、ＩgＭ、ＩgＡ等）、リゾチーム等が好
ましく挙げられる。 尚、これらＥＴ親和性蛋白質の由
来は特に限定されず、例えばヒト、牛、馬、羊、兎、ラ
ット、マウス等の哺乳類や例えば鶏等の鳥類の血漿又は
例えば鶏等の鳥類の卵に由来するものなどでよい。尚、
これらＥＴ親和性蛋白質と同等の性質を有するものであ
れば、遺伝子工学的に得られたものや、合成されたもの
も同様に本発明に利用できることは言うまでもない。
を有し、且つＥＴとＡＬ溶液との反応を阻害若しくは促
進する性質を有さない蛋白質（以下、ＥＴ親和性蛋白質
と略記する。）としては、このような性質を有する蛋白
質であれば特に限定されることなく挙げられるが、例え
ばアルブミン（オボアルブミン等も含む。）、免疫グロ
ブリン（ＩgＧ、ＩgＭ、ＩgＡ等）、リゾチーム等が好
ましく挙げられる。 尚、これらＥＴ親和性蛋白質の由
来は特に限定されず、例えばヒト、牛、馬、羊、兎、ラ
ット、マウス等の哺乳類や例えば鶏等の鳥類の血漿又は
例えば鶏等の鳥類の卵に由来するものなどでよい。尚、
これらＥＴ親和性蛋白質と同等の性質を有するものであ
れば、遺伝子工学的に得られたものや、合成されたもの
も同様に本発明に利用できることは言うまでもない。
【００１１】尚、例えばＸa因子等のセリンプロテアー
ゼの如くリムルステストで偽陽性を呈するような蛋白質
や、例えばアンチトロンビンIII，α2ープラスミンイン
ヒビター，アンチトリプシン，高比重リポ蛋白（ＨＤ
Ｌ）等の如くリムルステストで偽陰性を呈するような蛋
白質は、たとえＥＴに親和性を有するものであっても、
本発明に使用することができないことはいうまでもな
い。
ゼの如くリムルステストで偽陽性を呈するような蛋白質
や、例えばアンチトロンビンIII，α2ープラスミンイン
ヒビター，アンチトリプシン，高比重リポ蛋白（ＨＤ
Ｌ）等の如くリムルステストで偽陰性を呈するような蛋
白質は、たとえＥＴに親和性を有するものであっても、
本発明に使用することができないことはいうまでもな
い。
【００１２】本発明に於けるＥＴ親和性蛋白質として
は、複数の成分が混在しているようなもの、或はアルブ
ミンや免疫グロブリン等を豊富に含むもの、例えばコー
ンフラクションにより得られるアルブミン分画や免疫グ
ロブリン分画、例えば電気泳動により得られるアルブミ
ン分画や免疫グロブリン分画、例えば不活化処理（例え
ば80℃、５分間処理）された血漿や血清、例えば卵白希
釈液等の形態であってもよい。
は、複数の成分が混在しているようなもの、或はアルブ
ミンや免疫グロブリン等を豊富に含むもの、例えばコー
ンフラクションにより得られるアルブミン分画や免疫グ
ロブリン分画、例えば電気泳動により得られるアルブミ
ン分画や免疫グロブリン分画、例えば不活化処理（例え
ば80℃、５分間処理）された血漿や血清、例えば卵白希
釈液等の形態であってもよい。
【００１３】また、本発明に於いて使用されるＥＴ親和
性蛋白質は、必ずしもその目的の為に特別に調製された
ものである必要はなく、例えば、日本赤十字社等より市
販されている新鮮液状血漿及び新鮮凍結人血漿、或は、
日本製薬(株)、ローラー社、アーマー社、カッター社、
バクスター社、(株)ミドリ十字社及び化血研等より市販
されている加熱人血漿蛋白製剤及び人血清アルブミン製
剤、また、武田薬品工業(株)、大塚製薬(株)、(株)ミド
リ十字社、ヘキスト社、日本赤十字社及び富士レビオ
(株)等より市販されている人免疫グロブリン製剤、更に
は、ウィタカー社、ハイクロン社、ギブコ社及びベーリ
ンガーマンハイム社等より市販されている牛胎児血清等
を用いて調製されたもの等も当然のことながら使用する
ことができる。
性蛋白質は、必ずしもその目的の為に特別に調製された
ものである必要はなく、例えば、日本赤十字社等より市
販されている新鮮液状血漿及び新鮮凍結人血漿、或は、
日本製薬(株)、ローラー社、アーマー社、カッター社、
バクスター社、(株)ミドリ十字社及び化血研等より市販
されている加熱人血漿蛋白製剤及び人血清アルブミン製
剤、また、武田薬品工業(株)、大塚製薬(株)、(株)ミド
リ十字社、ヘキスト社、日本赤十字社及び富士レビオ
(株)等より市販されている人免疫グロブリン製剤、更に
は、ウィタカー社、ハイクロン社、ギブコ社及びベーリ
ンガーマンハイム社等より市販されている牛胎児血清等
を用いて調製されたもの等も当然のことながら使用する
ことができる。
【００１４】本発明に係るＥＴ親和性蛋白質は、当然の
ことながら、ＥＴ測定に影響を与える量のＥＴを含んで
いてはならない。そのためには、ＥＴ含有量の少ないも
のを選択するか、或は、ＥＴを含んだものを使用する場
合は、予めオートクレーブやＥＴ吸着剤等を用いてＥＴ
を除去する必要がある。
ことながら、ＥＴ測定に影響を与える量のＥＴを含んで
いてはならない。そのためには、ＥＴ含有量の少ないも
のを選択するか、或は、ＥＴを含んだものを使用する場
合は、予めオートクレーブやＥＴ吸着剤等を用いてＥＴ
を除去する必要がある。
【００１５】ＥＴの除去をオートクレーブにより行うの
であれば、例えば上記した如きＥＴ親和性蛋白質を適当
な濃度の水溶液とした後、例えば通常用いられる温度
（121℃程度）で15〜120分程度オートクレーブ処理すれ
ばよい。
であれば、例えば上記した如きＥＴ親和性蛋白質を適当
な濃度の水溶液とした後、例えば通常用いられる温度
（121℃程度）で15〜120分程度オートクレーブ処理すれ
ばよい。
【００１６】また、ＥＴの除去をＥＴ吸着剤により行う
のであれば、例えばポリミキシンＢを固定化した担体や
ヒスチジンをスペーサーを介して固定化した担体等、具
体的な商品名としては、デトキシゲル（ピアス社製）、
アフィプレップポリミキシン（バイオラッド社製）、パ
イロセップ（田辺製薬(株)製）を用いれば足りるが勿論
これらに限定されるものではない。
のであれば、例えばポリミキシンＢを固定化した担体や
ヒスチジンをスペーサーを介して固定化した担体等、具
体的な商品名としては、デトキシゲル（ピアス社製）、
アフィプレップポリミキシン（バイオラッド社製）、パ
イロセップ（田辺製薬(株)製）を用いれば足りるが勿論
これらに限定されるものではない。
【００１７】例えば血液透析用透析液等の水溶液中で
の、本発明に係るＥＴ親和性蛋白質の濃度は、使用する
ＥＴ親和性蛋白質の種類やロットの違い等によって異な
り必ずしも一定ではないが、水溶液中の蛋白濃度として
通常0.1〜2,500μg/ml程度、好ましくは0.25〜1,000μg
/ml程度、より好ましくは2.5〜500μg/ml程度が挙げら
れる。また、例えばＥＴ親和性蛋白質が人血清アルブミ
ンの場合には、通常、0.1〜2,500μg/ml程度、好ましく
は0.25〜1,000μg/ml程度、より好ましくは2.5〜250μg
/ml程度であり、ＥＴ親和性蛋白質が例えば不活化処理
した人血漿溶液の場合には、通常、蛋白濃度として通常
0.1〜200μg/ml程度、好ましくは0.25〜100μg/ml程
度、より好ましくは2.5〜70μg/ml程度である。
の、本発明に係るＥＴ親和性蛋白質の濃度は、使用する
ＥＴ親和性蛋白質の種類やロットの違い等によって異な
り必ずしも一定ではないが、水溶液中の蛋白濃度として
通常0.1〜2,500μg/ml程度、好ましくは0.25〜1,000μg
/ml程度、より好ましくは2.5〜500μg/ml程度が挙げら
れる。また、例えばＥＴ親和性蛋白質が人血清アルブミ
ンの場合には、通常、0.1〜2,500μg/ml程度、好ましく
は0.25〜1,000μg/ml程度、より好ましくは2.5〜250μg
/ml程度であり、ＥＴ親和性蛋白質が例えば不活化処理
した人血漿溶液の場合には、通常、蛋白濃度として通常
0.1〜200μg/ml程度、好ましくは0.25〜100μg/ml程
度、より好ましくは2.5〜70μg/ml程度である。
【００１８】本発明で用いられるＥＴ親和性蛋白質が、
例えば人血清アルブミン（ＨＳＡ）、人血漿、人血清、
牛胎児血清、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、免疫グロブ
リン等の場合は、何れも水溶液中の蛋白濃度が高くなる
と、該水溶液のリムルステスト法によるＥＴ測定に於い
て、阻害作用が生じ、実際の値よりも低い値が出る。従
って、そのような高濃度のものは好ましくない。それ
故、上記本発明に係るＥＴ親和性蛋白質の好ましい濃度
範囲、特にその上限の値はこのような点を考慮に入れた
上でのものである。尚、リムルステスト法による測定時
に阻害を生じるＥＴ親和性蛋白質の濃度はＥＴ親和性蛋
白質の種類により著しく異なる。即ち、例えばＨＳＡの
場合には蛋白濃度が6.0mg/ml程度で阻害が起る。
例えば人血清アルブミン（ＨＳＡ）、人血漿、人血清、
牛胎児血清、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、免疫グロブ
リン等の場合は、何れも水溶液中の蛋白濃度が高くなる
と、該水溶液のリムルステスト法によるＥＴ測定に於い
て、阻害作用が生じ、実際の値よりも低い値が出る。従
って、そのような高濃度のものは好ましくない。それ
故、上記本発明に係るＥＴ親和性蛋白質の好ましい濃度
範囲、特にその上限の値はこのような点を考慮に入れた
上でのものである。尚、リムルステスト法による測定時
に阻害を生じるＥＴ親和性蛋白質の濃度はＥＴ親和性蛋
白質の種類により著しく異なる。即ち、例えばＨＳＡの
場合には蛋白濃度が6.0mg/ml程度で阻害が起る。
【００１９】本発明を実施するには、上記した如きＥＴ
親和性蛋白質を所定濃度となるように例えば血液透析用
透析液等の被検水溶液中に添加、溶解すれば足りる。Ｅ
Ｔ親和性蛋白質を被検水溶液に所定濃度となるように添
加する方法としては、最終的にＥＴ親和性蛋白質を被検
水溶液に所定濃度となるように添加できる方法であれば
特に限定されないが、例えばＥＴ親和性蛋白質を含む水
溶液を被検水溶液に適当量添加する方法、ＥＴ親和性蛋
白質を含む水溶液の適当量を予め分注した試料採取用試
験管に被検水溶液を採取する方法、ＥＴ親和性蛋白質を
含む水溶液の適当量を予め分注した後凍結乾燥処理した
試料採取用試験管に被検水溶液を採取する方法、凍結乾
燥等により粉末化したＥＴ親和性蛋白質を被検水溶液に
適当量添加する方法等が好ましく挙げられる。尚、上記
のＥＴ親和性蛋白質を含む水溶液或はこれを凍結乾燥処
理したものの中には、ＥＴのリムルステスト法による測
定を阻害又は促進しない範囲であれば例えば燐酸塩，グ
ッド（Ｇｏｏｄ）緩衝剤等の緩衝剤や例えばエチレンジ
アミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤等が含まれて
いても良いことは言うまでもない。
親和性蛋白質を所定濃度となるように例えば血液透析用
透析液等の被検水溶液中に添加、溶解すれば足りる。Ｅ
Ｔ親和性蛋白質を被検水溶液に所定濃度となるように添
加する方法としては、最終的にＥＴ親和性蛋白質を被検
水溶液に所定濃度となるように添加できる方法であれば
特に限定されないが、例えばＥＴ親和性蛋白質を含む水
溶液を被検水溶液に適当量添加する方法、ＥＴ親和性蛋
白質を含む水溶液の適当量を予め分注した試料採取用試
験管に被検水溶液を採取する方法、ＥＴ親和性蛋白質を
含む水溶液の適当量を予め分注した後凍結乾燥処理した
試料採取用試験管に被検水溶液を採取する方法、凍結乾
燥等により粉末化したＥＴ親和性蛋白質を被検水溶液に
適当量添加する方法等が好ましく挙げられる。尚、上記
のＥＴ親和性蛋白質を含む水溶液或はこれを凍結乾燥処
理したものの中には、ＥＴのリムルステスト法による測
定を阻害又は促進しない範囲であれば例えば燐酸塩，グ
ッド（Ｇｏｏｄ）緩衝剤等の緩衝剤や例えばエチレンジ
アミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤等が含まれて
いても良いことは言うまでもない。
【００２０】本発明の方法により処理した水溶液中のＥ
Ｔは、溶液の状態でも１週間程度は安定であるが、室温
若しくは冷蔵保存しておいた場合には、ＥＴをその細胞
壁外膜に含むグラム陰性菌が繁殖して見かけのＥＴ量が
増加する場合がある。従って、本発明の方法により処理
した水溶液をＥＴ測定用試料として用いる場合には、測
定に供するまで凍結保存しておくことが望ましい。凍結
保存した場合でも該水溶液中のＥＴの測定値は一週間程
度は変動しない。また、該水溶液について凍結、融解を
２〜３回程度繰り返しても該水溶液中のＥＴの測定値は
変動しない。
Ｔは、溶液の状態でも１週間程度は安定であるが、室温
若しくは冷蔵保存しておいた場合には、ＥＴをその細胞
壁外膜に含むグラム陰性菌が繁殖して見かけのＥＴ量が
増加する場合がある。従って、本発明の方法により処理
した水溶液をＥＴ測定用試料として用いる場合には、測
定に供するまで凍結保存しておくことが望ましい。凍結
保存した場合でも該水溶液中のＥＴの測定値は一週間程
度は変動しない。また、該水溶液について凍結、融解を
２〜３回程度繰り返しても該水溶液中のＥＴの測定値は
変動しない。
【００２１】本発明の安定化方法により安定化された水
溶液中のＥＴ量をリムルステストを用いて測定する場合
に用いられるＡＬ溶液としては、例えばリムルス属（Li
mulus）、タキプレウス属（Tachypleus）或いはカルシ
ノスコピウス属（Carcinoscorpius）に属するカブトガ
ニの血球成分を含むもので、ＥＴとの反応により凝固が
生じるものであれば特に限定されることなく挙げられ
る。また、例えばＡＣＣ（Associates of Cape Cod）
社、ウィタカー社（WhittakerBioproducts, Inc.）、エ
ンドセイフ社（Endosafe, Inc.）、生化学工業(株)及び
和光純薬工業(株)等から市販されているＡＬ溶液の凍結
乾燥品をもとに調製したものも当然のことながら使用可
能である。
溶液中のＥＴ量をリムルステストを用いて測定する場合
に用いられるＡＬ溶液としては、例えばリムルス属（Li
mulus）、タキプレウス属（Tachypleus）或いはカルシ
ノスコピウス属（Carcinoscorpius）に属するカブトガ
ニの血球成分を含むもので、ＥＴとの反応により凝固が
生じるものであれば特に限定されることなく挙げられ
る。また、例えばＡＣＣ（Associates of Cape Cod）
社、ウィタカー社（WhittakerBioproducts, Inc.）、エ
ンドセイフ社（Endosafe, Inc.）、生化学工業(株)及び
和光純薬工業(株)等から市販されているＡＬ溶液の凍結
乾燥品をもとに調製したものも当然のことながら使用可
能である。
【００２２】また、本発明の安定化方法により安定化さ
れた水溶液中のＥＴ量をリムルステストを用いて測定す
る場合のリムルステストの手法は、通常用いられる方法
であれば特に限定されることなく使用可能である。通常
良く用いられる手法としては、例えば、ＦＤＡガイドラ
イン（Guidelineon validation of the Limulus amoeb
ocyte lysate test as an end-productendotoxin tes
t for human and animal parenteral drugs, biol
ogicalproducts, and medical devices, Food and Drug
Adm. (1987)）に記載されているゲル化転倒法、合成基
質法、比濁時間分析法等が挙げられる。より具体的に
は、例えばトキシノメーターＥＴ−２０１（和光純薬工
業（株）製）、トキシノメーターＭＴ−２５１（和光純
薬工業（株）製）、ＬＡＬ−５０００［ＡＣＣ（ASSOCI
ATES OF CAPE COD）社製］等の専用装置を用いる比濁時
間分析法等のＡＬ溶液を用いた常法により実施すれば足
りる。以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明
するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるも
のではない。
れた水溶液中のＥＴ量をリムルステストを用いて測定す
る場合のリムルステストの手法は、通常用いられる方法
であれば特に限定されることなく使用可能である。通常
良く用いられる手法としては、例えば、ＦＤＡガイドラ
イン（Guidelineon validation of the Limulus amoeb
ocyte lysate test as an end-productendotoxin tes
t for human and animal parenteral drugs, biol
ogicalproducts, and medical devices, Food and Drug
Adm. (1987)）に記載されているゲル化転倒法、合成基
質法、比濁時間分析法等が挙げられる。より具体的に
は、例えばトキシノメーターＥＴ−２０１（和光純薬工
業（株）製）、トキシノメーターＭＴ−２５１（和光純
薬工業（株）製）、ＬＡＬ−５０００［ＡＣＣ（ASSOCI
ATES OF CAPE COD）社製］等の専用装置を用いる比濁時
間分析法等のＡＬ溶液を用いた常法により実施すれば足
りる。以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明
するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるも
のではない。
【００２３】
実施例１． （試薬） ・ＬＡＬ溶液 リムルス属カブトガニ由来のＡＬ溶液の凍結乾燥品（以
下，ＬＡＬと略記する。和光純薬工業(株)販売、ゲル化
感度：0.6 EU/リットル、５ml用。）を注射用蒸留水で溶解
して得たＬＡＬ溶液を使用した。 ・ＥＴ安定化剤溶液 所定のＥＴ親和性蛋白質を所定濃度となるように注射用
蒸留水（大塚製薬(株)製）に溶解した後、オートクレー
ブ処理（121℃、20分）したものであって、エンドトキ
シンフリーであること及びリムルステスト等を促進又は
阻害しないことを確認したものをＥＴ安定化剤溶液とし
た。尚、各ＥＴ親和性蛋白質は、以下のものを使用し
た。ヒト血清アルブミン：日本赤十字社製。ヒト免疫グ
ロブリン：(株)緑十字製。牛血清アルブミン：和光純薬
工業(株)製。リゾチーム：和光純薬工業(株)製（鶏卵由
来）。オボアルブミン：和光純薬工業(株)製（鶏卵由
来）。 （試料）2054ファルコン管（ベクトンデッキンソン社
製、容量：約４ml）に、ＥＴを約120 EU/リットル含む血液
透析用透析液２mlと、所定のＥＴ安定化剤溶液50μlと
を添加、混合したものを試料とした。 （操作法）0.1 mlのＬＡＬ溶液と0.1 mlの上記試料とを
攪拌混合後、37℃保温下に、該混合液の透過光量が５％
減少するまでの時間（以下、Ｔｇと略記する。）をトキ
シノメーターMT-251（和光純薬工業(株)製）を用いて測
定した。別に、所定濃度のＥＴを含む注射用蒸留水を検
体として、同様の測定を行い，ＥＴ濃度とＴｇとの関係
を表す検量線を作成した。この検量線に基づいて各試料
中のＥＴ濃度を算出した。尚、ＥＴの測定は、調製直後
の試料と、調製直後に−20℃の冷凍庫にて凍結保存し所
定日数経過後融解した試料について行った。 （結果）得られた結果を図１に示す。尚、図１は、横軸
の各凍結保存日数に対して得られた試料中のＥＴ相対濃
度（％）を縦軸に沿ってプロットした点を結んだもので
あり、図中、−●−はＥＴ安定化剤溶液の代りに注射用
蒸留水を用いた試料（ブランク）について得られた結果
を、−○−はＥＴ安定化剤溶液として0.25％のヒト血清
アルブミン水溶液を用いた試料について得られた結果
を、−□−はＥＴ安定化剤溶液として0.02％のヒト血清
アルブミン水溶液を用いた試料について得られた結果
を、−△−はＥＴ安定化剤溶液として0.002％のヒト血
清アルブミン水溶液を用いた試料について得られた結果
を、−◎−はＥＴ安定化剤溶液として0.1％のヒト免疫
グロブリン水溶液を用いた試料について得られた結果
を、−◇−はＥＴ安定化剤溶液として0.02％の 牛血清
アルブミン水溶液を用いた試料について得られた結果
を、−▽−はＥＴ安定化剤溶液として2.5％の不活化処
理済ヒト血漿水溶液（総蛋白濃度；約0.2g/dl）を用い
た試料について得られた結果を、−＋−はＥＴ安定化剤
溶液として0.1％のオボアルブミン水溶液を用いた試料
について得られた結果を、また、−☆−はＥＴ安定化剤
溶液として0.025％のリゾチーム水溶液を用いた試料に
ついて得られた結果を夫々示す。尚、ＥＴ相対濃度
（％）は、調製直後の各試料中のＥＴ濃度を100％とし
た場合の、所定日数凍結保存後の各試料中のＥＴ濃度の
割合を示すものである。図１の結果から明らかな如く、
血液透析用透析液中に各種ＥＴ親和性蛋白質を含む溶液
を添加することにより、該透析液中のＥＴ測定値の経時
変化を抑えることができることが判る。特に、ＥＴ安定
化剤溶液として0.02％のヒト血清アルブミン水溶液を用
いた試料中のＥＴ測定値は、凍結保存後６日目でも変動
は見られない。尚、ＥＴ安定化剤溶液として、0.02％の
ヒト血清アルブミンと10％のグルコースを含む水溶液、
0.02％のヒト血清アルブミンと0.04％のポリオキシエチ
レンオクチルフェニルエーテルを含む水溶液、又は0.02
％のヒト血清アルブミンを含む10〜500mM 燐酸緩衝液
（pＨ7.4）を用いて上記と同様の操作を行ったところ、
これらもＥＴ安定化剤溶液として有効であることが判っ
た。また、ＥＴ安定化剤溶液を添加した試料について、
凍結融解を繰り返してＥＴ濃度の測定を行ったところ、
２〜３回程度の凍結融解では測定値に変動が見られない
ことも判った。
下，ＬＡＬと略記する。和光純薬工業(株)販売、ゲル化
感度：0.6 EU/リットル、５ml用。）を注射用蒸留水で溶解
して得たＬＡＬ溶液を使用した。 ・ＥＴ安定化剤溶液 所定のＥＴ親和性蛋白質を所定濃度となるように注射用
蒸留水（大塚製薬(株)製）に溶解した後、オートクレー
ブ処理（121℃、20分）したものであって、エンドトキ
シンフリーであること及びリムルステスト等を促進又は
阻害しないことを確認したものをＥＴ安定化剤溶液とし
た。尚、各ＥＴ親和性蛋白質は、以下のものを使用し
た。ヒト血清アルブミン：日本赤十字社製。ヒト免疫グ
ロブリン：(株)緑十字製。牛血清アルブミン：和光純薬
工業(株)製。リゾチーム：和光純薬工業(株)製（鶏卵由
来）。オボアルブミン：和光純薬工業(株)製（鶏卵由
来）。 （試料）2054ファルコン管（ベクトンデッキンソン社
製、容量：約４ml）に、ＥＴを約120 EU/リットル含む血液
透析用透析液２mlと、所定のＥＴ安定化剤溶液50μlと
を添加、混合したものを試料とした。 （操作法）0.1 mlのＬＡＬ溶液と0.1 mlの上記試料とを
攪拌混合後、37℃保温下に、該混合液の透過光量が５％
減少するまでの時間（以下、Ｔｇと略記する。）をトキ
シノメーターMT-251（和光純薬工業(株)製）を用いて測
定した。別に、所定濃度のＥＴを含む注射用蒸留水を検
体として、同様の測定を行い，ＥＴ濃度とＴｇとの関係
を表す検量線を作成した。この検量線に基づいて各試料
中のＥＴ濃度を算出した。尚、ＥＴの測定は、調製直後
の試料と、調製直後に−20℃の冷凍庫にて凍結保存し所
定日数経過後融解した試料について行った。 （結果）得られた結果を図１に示す。尚、図１は、横軸
の各凍結保存日数に対して得られた試料中のＥＴ相対濃
度（％）を縦軸に沿ってプロットした点を結んだもので
あり、図中、−●−はＥＴ安定化剤溶液の代りに注射用
蒸留水を用いた試料（ブランク）について得られた結果
を、−○−はＥＴ安定化剤溶液として0.25％のヒト血清
アルブミン水溶液を用いた試料について得られた結果
を、−□−はＥＴ安定化剤溶液として0.02％のヒト血清
アルブミン水溶液を用いた試料について得られた結果
を、−△−はＥＴ安定化剤溶液として0.002％のヒト血
清アルブミン水溶液を用いた試料について得られた結果
を、−◎−はＥＴ安定化剤溶液として0.1％のヒト免疫
グロブリン水溶液を用いた試料について得られた結果
を、−◇−はＥＴ安定化剤溶液として0.02％の 牛血清
アルブミン水溶液を用いた試料について得られた結果
を、−▽−はＥＴ安定化剤溶液として2.5％の不活化処
理済ヒト血漿水溶液（総蛋白濃度；約0.2g/dl）を用い
た試料について得られた結果を、−＋−はＥＴ安定化剤
溶液として0.1％のオボアルブミン水溶液を用いた試料
について得られた結果を、また、−☆−はＥＴ安定化剤
溶液として0.025％のリゾチーム水溶液を用いた試料に
ついて得られた結果を夫々示す。尚、ＥＴ相対濃度
（％）は、調製直後の各試料中のＥＴ濃度を100％とし
た場合の、所定日数凍結保存後の各試料中のＥＴ濃度の
割合を示すものである。図１の結果から明らかな如く、
血液透析用透析液中に各種ＥＴ親和性蛋白質を含む溶液
を添加することにより、該透析液中のＥＴ測定値の経時
変化を抑えることができることが判る。特に、ＥＴ安定
化剤溶液として0.02％のヒト血清アルブミン水溶液を用
いた試料中のＥＴ測定値は、凍結保存後６日目でも変動
は見られない。尚、ＥＴ安定化剤溶液として、0.02％の
ヒト血清アルブミンと10％のグルコースを含む水溶液、
0.02％のヒト血清アルブミンと0.04％のポリオキシエチ
レンオクチルフェニルエーテルを含む水溶液、又は0.02
％のヒト血清アルブミンを含む10〜500mM 燐酸緩衝液
（pＨ7.4）を用いて上記と同様の操作を行ったところ、
これらもＥＴ安定化剤溶液として有効であることが判っ
た。また、ＥＴ安定化剤溶液を添加した試料について、
凍結融解を繰り返してＥＴ濃度の測定を行ったところ、
２〜３回程度の凍結融解では測定値に変動が見られない
ことも判った。
【００２４】
【発明の効果】以上述べたことから明らかな如く、本発
明は、例えば血液透析用透析液等の水溶液中のＥＴの安
定化方法に関するものであり、本発明を利用することに
より、今までは経時的なＥＴ測定値の低下が著しかった
水溶液中のＥＴ濃度を長期間に渡って精度良く測定する
ことが可能となる、という効果を奏するものであり、斯
業に貢献するところ大なる発明である。
明は、例えば血液透析用透析液等の水溶液中のＥＴの安
定化方法に関するものであり、本発明を利用することに
より、今までは経時的なＥＴ測定値の低下が著しかった
水溶液中のＥＴ濃度を長期間に渡って精度良く測定する
ことが可能となる、という効果を奏するものであり、斯
業に貢献するところ大なる発明である。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１で得られた、横軸の各凍結保存日数に
対して得られた試料中のエンドトキシン（以下、ＥＴと
略記する。）相対濃度（％）を縦軸に沿ってプロットし
た点を結んだものである。
対して得られた試料中のエンドトキシン（以下、ＥＴと
略記する。）相対濃度（％）を縦軸に沿ってプロットし
た点を結んだものである。
図１中、−●−はＥＴ安定化剤溶液の代りに注射用蒸留
水を用いた試料（ブランク）について得られた結果を、
−○−はＥＴ安定化剤溶液として0.25％のヒト血清アル
ブミン水溶液を用いた試料について得られた結果を、−
□−はＥＴ安定化剤溶液として0.02％のヒト血清アルブ
ミン水溶液を用いた試料について得られた結果を、−△
−はＥＴ安定化剤溶液として0.002％のヒト血清アルブ
ミン水溶液を用いた試料について得られた結果を、−◎
−はＥＴ安定化剤溶液として0.1％のヒト免疫グロブリ
ン水溶液を用いた試料について得られた結果を、−◇−
はＥＴ安定化剤溶液として0.02％の牛血清アルブミン水
溶液を用いた試料について得られた結果を、−▽−はＥ
Ｔ安定化剤溶液として2.5％の不活化処理済ヒト血漿水
溶液（総蛋白濃度；約0.2g/dl）を用いた試料について
得られた結果を、−＋−はＥＴ安定化剤溶液として0.1
％のオボアルブミン水溶液を用いた試料について得られ
た結果を、また、−☆−はＥＴ安定化剤溶液として0.02
5％のリゾチーム水溶液を用いた試料について得られた
結果を夫々示す。
水を用いた試料（ブランク）について得られた結果を、
−○−はＥＴ安定化剤溶液として0.25％のヒト血清アル
ブミン水溶液を用いた試料について得られた結果を、−
□−はＥＴ安定化剤溶液として0.02％のヒト血清アルブ
ミン水溶液を用いた試料について得られた結果を、−△
−はＥＴ安定化剤溶液として0.002％のヒト血清アルブ
ミン水溶液を用いた試料について得られた結果を、−◎
−はＥＴ安定化剤溶液として0.1％のヒト免疫グロブリ
ン水溶液を用いた試料について得られた結果を、−◇−
はＥＴ安定化剤溶液として0.02％の牛血清アルブミン水
溶液を用いた試料について得られた結果を、−▽−はＥ
Ｔ安定化剤溶液として2.5％の不活化処理済ヒト血漿水
溶液（総蛋白濃度；約0.2g/dl）を用いた試料について
得られた結果を、−＋−はＥＴ安定化剤溶液として0.1
％のオボアルブミン水溶液を用いた試料について得られ
た結果を、また、−☆−はＥＴ安定化剤溶液として0.02
5％のリゾチーム水溶液を用いた試料について得られた
結果を夫々示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 1/14 8318−4Ｈ
Claims (2)
- 【請求項１】エンドトキシンを含む水溶液に、エンドト
キシンに親和性を有し、且つエンドトキシンとカブトガ
ニの血球成分液との反応を阻害若しくは促進する性質を
有さない水溶性の蛋白質を共存させることを特徴とす
る、水溶液中のエンドトキシンの安定化方法。 - 【請求項２】蛋白質が、アルブミン、免疫グロブリン及
びリゾチームから選ばれた少なくとも１種である、請求
項１に記載の安定化方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5348481A JP2817606B2 (ja) | 1993-10-08 | 1993-12-27 | 水溶液中のエンドトキシンの安定化方法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5-277590 | 1993-10-08 | ||
| JP27759093 | 1993-10-08 | ||
| JP5348481A JP2817606B2 (ja) | 1993-10-08 | 1993-12-27 | 水溶液中のエンドトキシンの安定化方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07151760A true JPH07151760A (ja) | 1995-06-16 |
| JP2817606B2 JP2817606B2 (ja) | 1998-10-30 |
Family
ID=26552466
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5348481A Expired - Lifetime JP2817606B2 (ja) | 1993-10-08 | 1993-12-27 | 水溶液中のエンドトキシンの安定化方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2817606B2 (ja) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5876955A (en) * | 1994-06-30 | 1999-03-02 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Endotoxin stabilizing agent, endotoxin composition and method for assaying endotoxin |
| WO2006129662A1 (ja) * | 2005-05-30 | 2006-12-07 | Daiichi Sankyo Company, Limited | エンドトキシン試験法 |
| JP2010070493A (ja) * | 2008-09-18 | 2010-04-02 | Kagoshima Univ | 抗菌剤およびその製造方法、化粧料ならびに医薬品 |
| WO2012102353A1 (ja) * | 2011-01-26 | 2012-08-02 | 興和株式会社 | 生物由来の生理活性物質の測定方法及び測定装置 |
| JP2012154815A (ja) * | 2011-01-26 | 2012-08-16 | Iwate Medical Univ | 生物由来の生理活性物質の測定方法及び測定装置 |
| JP2012215461A (ja) * | 2011-03-31 | 2012-11-08 | Kowa Co | 生物由来の生理活性物質の測定方法及び測定装置 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103168243B (zh) * | 2010-10-18 | 2016-03-02 | 小幡彻 | 凝胶粒子测定试剂及使用其的测定方法 |
| US20150301052A1 (en) | 2012-05-09 | 2015-10-22 | Kowa Company, Ltd. | Method for measuring organism-originated physiologically active substance in hyaluronic acid preparation |
-
1993
- 1993-12-27 JP JP5348481A patent/JP2817606B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5876955A (en) * | 1994-06-30 | 1999-03-02 | Seikagaku Kogyo Kabushiki Kaisha | Endotoxin stabilizing agent, endotoxin composition and method for assaying endotoxin |
| WO2006129662A1 (ja) * | 2005-05-30 | 2006-12-07 | Daiichi Sankyo Company, Limited | エンドトキシン試験法 |
| US7833747B2 (en) | 2005-05-30 | 2010-11-16 | Daiichi Sankyo Company, Limited | Methods for detecting an endotoxin with a lysate reagent |
| JP2010070493A (ja) * | 2008-09-18 | 2010-04-02 | Kagoshima Univ | 抗菌剤およびその製造方法、化粧料ならびに医薬品 |
| WO2012102353A1 (ja) * | 2011-01-26 | 2012-08-02 | 興和株式会社 | 生物由来の生理活性物質の測定方法及び測定装置 |
| JP2012154815A (ja) * | 2011-01-26 | 2012-08-16 | Iwate Medical Univ | 生物由来の生理活性物質の測定方法及び測定装置 |
| JP2012215461A (ja) * | 2011-03-31 | 2012-11-08 | Kowa Co | 生物由来の生理活性物質の測定方法及び測定装置 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2817606B2 (ja) | 1998-10-30 |
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