JPH07128238A - 化学発光等を用いた定量分析方法 - Google Patents
化学発光等を用いた定量分析方法Info
- Publication number
- JPH07128238A JPH07128238A JP29388993A JP29388993A JPH07128238A JP H07128238 A JPH07128238 A JP H07128238A JP 29388993 A JP29388993 A JP 29388993A JP 29388993 A JP29388993 A JP 29388993A JP H07128238 A JPH07128238 A JP H07128238A
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- JP
- Japan
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- reaction
- chemiluminescence
- bioluminescence
- reaction solution
- glucose
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- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
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- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 化学発光又は生物発光を起こす反応溶液で反
応を均一に開始させる。 【構成】 反応溶液に均一に分散したケイジドグルコー
スに光照射することによりグルコースを放出させる。グ
ルコースは抗原に標識化されたグルコースオキシダーゼ
（Ｅ）によりグルコン酸に変換され、このときＨ2Ｏ2が
生成する。生成したＨ2Ｏ2はＴＣＰＯと反応し、１，２
−ジオキセタジオンが生成する。１，２−ジオキシタジ
オンとＡＮＳは電荷移動鎖体を形成し、励起状態のＡＮ
ＳとＣＯ2となる。励起状態のＡＮＳから発光が起こ
る。
応を均一に開始させる。 【構成】 反応溶液に均一に分散したケイジドグルコー
スに光照射することによりグルコースを放出させる。グ
ルコースは抗原に標識化されたグルコースオキシダーゼ
（Ｅ）によりグルコン酸に変換され、このときＨ2Ｏ2が
生成する。生成したＨ2Ｏ2はＴＣＰＯと反応し、１，２
−ジオキセタジオンが生成する。１，２−ジオキシタジ
オンとＡＮＳは電荷移動鎖体を形成し、励起状態のＡＮ
ＳとＣＯ2となる。励起状態のＡＮＳから発光が起こ
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は生化学、臨床化学、分析
化学などの分野において、化学発光又は生物発光を利用
して目的成分を定量分析する方法に関するものである。
化学などの分野において、化学発光又は生物発光を利用
して目的成分を定量分析する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】化学発光や生物発光を利用した分析方法
では、化学発光や生物発光を開始させるために反応開始
試薬を添加する。反応開始試薬の添加はシリンジなどを
用いて手動又は自動的に注入した後、反応溶液を撹拌す
るか、又はフローインジェクション・システムを利用し
て反応開始試薬を注入して混合させることを行なってい
る。
では、化学発光や生物発光を開始させるために反応開始
試薬を添加する。反応開始試薬の添加はシリンジなどを
用いて手動又は自動的に注入した後、反応溶液を撹拌す
るか、又はフローインジェクション・システムを利用し
て反応開始試薬を注入して混合させることを行なってい
る。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】化学発光や生物発光を
起こさせるために反応溶液に反応開始試薬を注入して撹
拌させる方法では、反応開始試薬の注入や混合に時間が
かかるだけではなく、反応開始時点が一義的に定まらな
いという問題がある。
起こさせるために反応溶液に反応開始試薬を注入して撹
拌させる方法では、反応開始試薬の注入や混合に時間が
かかるだけではなく、反応開始時点が一義的に定まらな
いという問題がある。
【０００４】また、反応溶液に反応開始試薬を注入し、
撹拌すると、反応開始試薬が注入されてから反応溶液中
に均一に分散するまでの期間は反応開始試薬が場所的に
不均一に分散した状態になり、反応開始が反応溶液の場
所によって異なる。そのため、化学発光や生物発光を検
出する検出系では検出出力のピークが幅の広いものとな
ってピーク高さが低く、検出感度が低い問題がある。本
発明は化学発光又は生物発光を起こす反応溶液で反応を
均一に開始させ、反応開始時点を一義的に定めるのを容
易にし、かつ検出感度も高めることを目的とするもので
ある。
撹拌すると、反応開始試薬が注入されてから反応溶液中
に均一に分散するまでの期間は反応開始試薬が場所的に
不均一に分散した状態になり、反応開始が反応溶液の場
所によって異なる。そのため、化学発光や生物発光を検
出する検出系では検出出力のピークが幅の広いものとな
ってピーク高さが低く、検出感度が低い問題がある。本
発明は化学発光又は生物発光を起こす反応溶液で反応を
均一に開始させ、反応開始時点を一義的に定めるのを容
易にし、かつ検出感度も高めることを目的とするもので
ある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明では、反応開始剤
を添加すれば化学発光又は生物発光により目的物質を定
量できるように調製された反応溶液に、光照射により反
応開始剤を放出可能なケイジド化合物（Caged化合物）
の状態にして反応開始剤を添加し、その反応溶液に均一
に光照射を行なって前記ケイジド化合物を解離させて反
応開始剤を放出させ、化学発光又は生物発光を均一に開
始させる。
を添加すれば化学発光又は生物発光により目的物質を定
量できるように調製された反応溶液に、光照射により反
応開始剤を放出可能なケイジド化合物（Caged化合物）
の状態にして反応開始剤を添加し、その反応溶液に均一
に光照射を行なって前記ケイジド化合物を解離させて反
応開始剤を放出させ、化学発光又は生物発光を均一に開
始させる。
【０００６】化学発光又は生物発光の骨格となる反応系
として次のような反応系を利用することができる。 （１）ルミノール＋Ｈ2Ｏ2 （２）ルシゲニン＋還元物質 （３）ＴＣＰＯ（ビス−２，４，６−トリクロロフェニ
ルオキザレート）＋Ｈ2Ｏ2＋螢光物質 （４）ホタルルシフェリン＋ＡＴＰ＋ホタルルシフェラ
ーゼ （５）バクテリアルシフェリン（ＦＭＮＨ2、長鎖脂肪
酸アルデヒド）＋バクテリアルミフェラーゼ （６）イソルミノール＋マクロフェルオキシダーゼ＋Ｈ
2Ｏ2 （７）Ｎ−メチルアクリジウム誘導体＋Ｈ2Ｏ2 （８）ＡＭＰＰＤ（アダマンチルメトキシフェニルフォ
スホリルジオキセタン）＋ＡＬＰ（アルカリフォスファ
ダーゼ）
として次のような反応系を利用することができる。 （１）ルミノール＋Ｈ2Ｏ2 （２）ルシゲニン＋還元物質 （３）ＴＣＰＯ（ビス−２，４，６−トリクロロフェニ
ルオキザレート）＋Ｈ2Ｏ2＋螢光物質 （４）ホタルルシフェリン＋ＡＴＰ＋ホタルルシフェラ
ーゼ （５）バクテリアルシフェリン（ＦＭＮＨ2、長鎖脂肪
酸アルデヒド）＋バクテリアルミフェラーゼ （６）イソルミノール＋マクロフェルオキシダーゼ＋Ｈ
2Ｏ2 （７）Ｎ−メチルアクリジウム誘導体＋Ｈ2Ｏ2 （８）ＡＭＰＰＤ（アダマンチルメトキシフェニルフォ
スホリルジオキセタン）＋ＡＬＰ（アルカリフォスファ
ダーゼ）
【０００７】これらの反応にはＨ2Ｏ2やＦＭＮＨ2など
が必要であるが、このような物質を与えるために次のよ
うな反応系を利用する。 （Ａ）Ｈ2Ｏ2生成系： （ａ）Ｈ2Ｏ2を直接産出する系；グルコース，グルコー
スオキシダーゼ （ｂ）ＮＡＤＨ産出系＋（１−メトキシフェナジンサル
フェート） この反応系ではＮＡＤＨ産出系から生成するＮＡＤＨを
用いてＨ2Ｏ2を得る。 （ｃ）上記以外の複合系；ラクトース，β−Ｄ−ガラク
トシダーゼ，グルコースオキシダーゼ
が必要であるが、このような物質を与えるために次のよ
うな反応系を利用する。 （Ａ）Ｈ2Ｏ2生成系： （ａ）Ｈ2Ｏ2を直接産出する系；グルコース，グルコー
スオキシダーゼ （ｂ）ＮＡＤＨ産出系＋（１−メトキシフェナジンサル
フェート） この反応系ではＮＡＤＨ産出系から生成するＮＡＤＨを
用いてＨ2Ｏ2を得る。 （ｃ）上記以外の複合系；ラクトース，β−Ｄ−ガラク
トシダーゼ，グルコースオキシダーゼ
【０００８】（Ｂ）ＦＭＮＨ2生成系： （ａ）ＦＭＮＨ2を直接産出する系 （ｂ）ＮＡＤＨ産出系＋ＦＭＮ＋ＦＭＮ；ＮＡＤＨ酸化
還元酵素 この反応系ではＮＡＤＨ産出系から生成するＮＡＤＨを
用いてＦＭＮＨ2を得る。 （ｃ）上記以外の複合系；アルカリフォスファダーゼ＋
ＮＡＤＰ＋エタノール＋アルコールデヒドロゲナーゼ＋
ＦＭＮ＋ＮＡＤＨ酸化還元酵素
還元酵素 この反応系ではＮＡＤＨ産出系から生成するＮＡＤＨを
用いてＦＭＮＨ2を得る。 （ｃ）上記以外の複合系；アルカリフォスファダーゼ＋
ＮＡＤＰ＋エタノール＋アルコールデヒドロゲナーゼ＋
ＦＭＮ＋ＮＡＤＨ酸化還元酵素
【０００９】（Ｃ）酸化還元物質系：ショ糖，インベル
ターゼ （Ｄ）ＡＴＰ系
ターゼ （Ｄ）ＡＴＰ系
【００１０】反応系としては（１）から（８）に示した
ものをそれぞれ単独で用いるか、又はそれらに（ａ）か
ら（ｇ）に示された生成系を組み合わせて用いる。本発
明はこれらの系の反応に関与する物質を定量するための
分析方法である。
ものをそれぞれ単独で用いるか、又はそれらに（ａ）か
ら（ｇ）に示された生成系を組み合わせて用いる。本発
明はこれらの系の反応に関与する物質を定量するための
分析方法である。
【００１１】これらの系に関与する物質又は酵素（グル
コースオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、アルカリフォ
スファダーゼ、ペルオキシダーゼなど）を標識に用い
て、化学発光や生物発光のイムノアッセイ、化学発光酵
素や生物発光酵素のイムノアッセイを行なうことも可能
である。イムノアッセイでは測定方法としてはサンドイ
ッチ法（１ステップ法や２ステップ法）や競争法（第１
抗体固相法や第２抗体固相法）などを用いることができ
る。
コースオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、アルカリフォ
スファダーゼ、ペルオキシダーゼなど）を標識に用い
て、化学発光や生物発光のイムノアッセイ、化学発光酵
素や生物発光酵素のイムノアッセイを行なうことも可能
である。イムノアッセイでは測定方法としてはサンドイ
ッチ法（１ステップ法や２ステップ法）や競争法（第１
抗体固相法や第２抗体固相法）などを用いることができ
る。
【００１２】このような化学発光や生物発光を起こさせ
るための反応開始剤は、ケイジド化合物として添加す
る。ここでのケイジド化合物は、定量する物質以外のも
ので、発光系に含まれる物質に対応するものを光照射に
よる解離によって放出させるように、ケイジド化合物の
状態にしたものである。そのようなケイジド化合物は
るための反応開始剤は、ケイジド化合物として添加す
る。ここでのケイジド化合物は、定量する物質以外のも
ので、発光系に含まれる物質に対応するものを光照射に
よる解離によって放出させるように、ケイジド化合物の
状態にしたものである。そのようなケイジド化合物は
【００１３】
【化１】
【００１４】のような構造をもつ化合物である。ここ
で、Ｒ１〜Ｒ５は任意の官能基で、その中には反応開始
剤が含まれる。このようなケイジド化合物は、反応開始
剤を化学修飾した化合物をケイジド化合物の骨格をなす
化合物と反応させたものであり、紫外又は可視領域の光
を照射することによって解離をして反応開始剤を放出す
る。
で、Ｒ１〜Ｒ５は任意の官能基で、その中には反応開始
剤が含まれる。このようなケイジド化合物は、反応開始
剤を化学修飾した化合物をケイジド化合物の骨格をなす
化合物と反応させたものであり、紫外又は可視領域の光
を照射することによって解離をして反応開始剤を放出す
る。
【００１５】光照射により解離する前のケイジド化合物
がいくらかの発光反応を開始させる場合も存在するが、
光照射前の発光反応で生じた発光量はブランクとしてデ
ータから差し引くことによって補正することができる。
がいくらかの発光反応を開始させる場合も存在するが、
光照射前の発光反応で生じた発光量はブランクとしてデ
ータから差し引くことによって補正することができる。
【００１６】
【実施例】本発明を第２抗体固相法を用いた抗原抗体反
応に適用した例を図１を参照して説明する。第２抗体固
相法はある物質（抗原）の量を求めるために用いられる
方法であり、図１で（１）第２固相法プロセスに示され
ているように、〜の３つのステップを含んでいる。
応に適用した例を図１を参照して説明する。第２抗体固
相法はある物質（抗原）の量を求めるために用いられる
方法であり、図１で（１）第２固相法プロセスに示され
ているように、〜の３つのステップを含んでいる。
【００１７】第１抗体と標識化抗原をそれぞれ所定量
含む反応溶液に分析対象物質（非標識化抗原）を添加し
て反応させ、非標識化抗原と標識化抗原を第１抗体に競
合して反応させる。記号Ｅとして示されているのは標識
として用いられているグルコースオキシダーゼ酵素であ
る。
含む反応溶液に分析対象物質（非標識化抗原）を添加し
て反応させ、非標識化抗原と標識化抗原を第１抗体に競
合して反応させる。記号Ｅとして示されているのは標識
として用いられているグルコースオキシダーゼ酵素であ
る。
【００１８】第１抗体と抗原との結合体をさらに固相
化第２抗体と反応させて結合させ、結合しなかった標識
化抗原などを除去する（Ｂ・Ｆ分離）。 検出のステップでは発光反応を開始させ、発光量を測
定する。ここで、非標識化抗原である分析対象物質が多
いほどのステップで第１抗体と結合する標識化抗原が
少なくなるため、分析対象物質が多いほど観測される発
光量が少なくなる。標識化抗原と非標識化抗原の量の分
かった標準試料を用いて予め検量線を作成しておけば、
発光量から分析対象物質を定量することができる。
化第２抗体と反応させて結合させ、結合しなかった標識
化抗原などを除去する（Ｂ・Ｆ分離）。 検出のステップでは発光反応を開始させ、発光量を測
定する。ここで、非標識化抗原である分析対象物質が多
いほどのステップで第１抗体と結合する標識化抗原が
少なくなるため、分析対象物質が多いほど観測される発
光量が少なくなる。標識化抗原と非標識化抗原の量の分
かった標準試料を用いて予め検量線を作成しておけば、
発光量から分析対象物質を定量することができる。
【００１９】検出ステップの具体的なプロセスについ
て、図１の（２）検出プロセスを参照して以下に説明す
る。 ケイジドグルコースを光照射することによりグルコー
スを放出させる。 グルコースは抗原に標識化されたグルコースオキシダ
ーゼ（Ｅ）によりグルコン酸に変換され、このときＨ2
Ｏ2が生成する。
て、図１の（２）検出プロセスを参照して以下に説明す
る。 ケイジドグルコースを光照射することによりグルコー
スを放出させる。 グルコースは抗原に標識化されたグルコースオキシダ
ーゼ（Ｅ）によりグルコン酸に変換され、このときＨ2
Ｏ2が生成する。
【００２０】生成したＨ2Ｏ2はＴＣＰＯと反応し、
１，２−ジオキセタジオンが生成する。 １，２−ジオキシタジオンとＡＮＳ（アニリノナフタ
レン−１−スルホン酸）は電荷移動鎖体を形成し、励起
状態のＡＮＳとＣＯ2となる。 励起状態のＡＮＳから発光が起こる。
１，２−ジオキセタジオンが生成する。 １，２−ジオキシタジオンとＡＮＳ（アニリノナフタ
レン−１−スルホン酸）は電荷移動鎖体を形成し、励起
状態のＡＮＳとＣＯ2となる。 励起状態のＡＮＳから発光が起こる。
【００２１】図２に本発明で化学発光又は生物発光を検
出する検出系の例を示す。セル２には反応開始剤を添加
すれば化学発光又は生物発光を起こすように調製された
反応溶液が入れられ、その反応溶液に反応開始剤をケイ
ジド化合物とした試薬が添加され、均一に分散してい
る。セル２内のケイジド化合物を光解離させるための励
起光を照射する照射光源部４は紫外ないし可視領域の光
を発生する光源６とその光源６からの光を平行光束とし
てセル２に均一に照射する光学系８とを含んでいる。セ
ル２内での反応溶液の化学発光又は生物発光を検出する
ために、セル２からの発光１０を集光させる集光光学系
１２と、集光された発光を分光して検出する検出器１４
が設けられている。
出する検出系の例を示す。セル２には反応開始剤を添加
すれば化学発光又は生物発光を起こすように調製された
反応溶液が入れられ、その反応溶液に反応開始剤をケイ
ジド化合物とした試薬が添加され、均一に分散してい
る。セル２内のケイジド化合物を光解離させるための励
起光を照射する照射光源部４は紫外ないし可視領域の光
を発生する光源６とその光源６からの光を平行光束とし
てセル２に均一に照射する光学系８とを含んでいる。セ
ル２内での反応溶液の化学発光又は生物発光を検出する
ために、セル２からの発光１０を集光させる集光光学系
１２と、集光された発光を分光して検出する検出器１４
が設けられている。
【００２２】
【発明の効果】本発明では、反応開始剤を添加すれば化
学発光又は生物発光により目的物質を定量できるように
調製された反応溶液に、反応開始剤を光照射により反応
開始剤を放出できる状態のケイジド化合物として添加
し、その反応溶液に均一に光照射を行なって化学発光又
は生物発光を反応溶液で均一に開始させるようにしたの
で、反応開始時点を一義的に定めるのが容易になり、か
つ検出感度も高まる。
学発光又は生物発光により目的物質を定量できるように
調製された反応溶液に、反応開始剤を光照射により反応
開始剤を放出できる状態のケイジド化合物として添加
し、その反応溶液に均一に光照射を行なって化学発光又
は生物発光を反応溶液で均一に開始させるようにしたの
で、反応開始時点を一義的に定めるのが容易になり、か
つ検出感度も高まる。
【図１】本発明を第２抗体固相法によるエンザイムイム
ノアッセイに適用した反応機構を示す図である。
ノアッセイに適用した反応機構を示す図である。
【図２】本発明での化学発光又は生物発光を検出する検
出系を示す概略平面図である。
出系を示す概略平面図である。
Claims (1)
- 【請求項１】 反応開始剤を添加すれば化学発光又は生
物発光により目的物質を定量できるように調製された反
応溶液に、光照射により反応開始剤を放出可能なケイジ
ド化合物の状態にして反応開始剤を添加し、その反応溶
液に均一に光照射を行なって前記ケイジド化合物を解離
させて反応開始剤を放出させ、化学発光又は生物発光を
均一に開始させることを特徴とする定量分析方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29388993A JPH07128238A (ja) | 1993-10-30 | 1993-10-30 | 化学発光等を用いた定量分析方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP29388993A JPH07128238A (ja) | 1993-10-30 | 1993-10-30 | 化学発光等を用いた定量分析方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07128238A true JPH07128238A (ja) | 1995-05-19 |
Family
ID=17800468
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP29388993A Pending JPH07128238A (ja) | 1993-10-30 | 1993-10-30 | 化学発光等を用いた定量分析方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07128238A (ja) |
-
1993
- 1993-10-30 JP JP29388993A patent/JPH07128238A/ja active Pending
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