JPH07114701B2 - 真核生物遺伝子の発現方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は、エシェリヒア属の微生物による真核生物の
遺伝子の発現方法に関する。

従来の技術 組換えDNA技術によりエシェリヒア属の微生物により真
核生物の遺伝子を発現せしめた例は数多く知られてい
る。

（例えば、ソマトスタチン:Itakura,K.,Hirose,T.,Cre
a,R.,Riggs,A.D.,Heynecker,H,L.,Boliver,F.,Boyer,H.
W.:Science,198,1056（1977），インシュリン:Goeddel,
D.V.,Kleid,D.G.,Bolivar,F.,Heynecker,H.L.,Yansure,
D.G.,Crea,R.,Hirose,T.,Kraszewski,A.,Itakura,K.,Ri
ggs,A.D.:Proc.Natl.Acad.Sci.USA 76,106（1976），α
−インターフェロン:Goeddel,D.V.,Yelverton,E.,Ullri
ch,A.,Heynecker,H.L.,Miozzari,G.,Holmes,W.,Seebur
g,P.H.,Dull,T.,May,L.,Stebbing,N.,Crea,R.,Maeda,
S.,McCandliss,R.,Sloma,A.,Tabor,J.M.,Gross,H.,Fami
lletti,P.C.,Pestka,S.:Nature,287,411（1980）,Nagat
a,S.,Taira,H.,Hall,A.,Johnsrud,L.,Streuli,M.,Ecs
di,J.,Boll,W.,Cantell,K.,Weissmann,C.:Nature,284,3
16（1980），β−インターフェロン:Taniguchi,T.,Guar
ente,L.,Roberts,T.M.,Kimelman,D.,Dauhan III,J.,Pta
shne,M.:Proc,Natl.Acad.Sci.USA,77,5230（1980）,Der
ynck,R.,Remaut,E.,Saman,E.,Stanasens,P.,DeClercq,
B.,Contente,J.,Fiers,W.:Nature,287,193（1980），γ
−インターフェロン:Gvus Simons,Erik Remaut,Bernard
Allet,Rene Devos and Walter Fiers.Gene,28,55−64
（1984），ヒト成長ホルモン:Goeddel,D.V.,Heyneker,
H.L.,Hozumi,T.,Arentzen,R.,Itakura,K.,Yansura,D.
G.,Ross,M.J.,Miozzari,G.,Crea,R.,Seeburg,P.H:Natur
e,281,544（1979），α−ネオエンドルフィン:Tanaka,
S.,Oshima,T.,Ohsue,K.,Ono,T.,Oikawa,S.,Takano,I.,N
oguchi,T.,Kangawa,K.,Minamino,N.,Matsuo,H.:Nucleic
Acids,Res.,10,1741（1982），β−ネオエンドルフィ
ン:Shine,J.,Fettes,I.,Lan,N.C.Y.,Roberts,J.L.,Baxt
er,J.D.:Nature,285,456（1980），及びヒトインターロ
イキン−２−:Tadatsugu Taniguchi,Hiroshi Matsui,Ta
kashi Fujita,Chikako Takaoka,Nobukazu Kashima,Ryot
a Yoshimoto＆Junji Hamuro Seikagaku 55,772,1983.） 知られている知見によれば、目的とする真核生物遺伝子
を発現せしめるには、宿主細胞に適合するベクターDNA
内において、DNA鎖の上流より転写制御領域（以下「プ
ロモーター」と記す）、リポゾーム結合部位（以下「SD
配列」と記す）、翻訳開始コドン及び真核生物遺伝子が
配置されていなければならない（中村研三：化学の領
域,vol37,No.5,（1983）中村研三：化学と生物,vol20,4
7,（1982））。

一方、転写終結シグナルが真核生物遺伝子の発現効率に
影響があることが示唆されている報告があるが（Nakamu
ra,K.,Inouye,M.:The EMBOJ.1,771（1982）.,Rosenber
g,M.,Coutr,D.:Ann.Rev.Genetics 13,19（1979））、具
体的にどのような影響があるかについては、知られてい
なかった。ましてやどのように転写終結シグナルをDAN
鎖中に配置すればよいかについては、何も知られていな
かった。

発明が解決しようとする問題点 この発明は、従って、転写終結シグナルに関して、より
効率のよい真核生物遺伝子の発現する方法を見い出すこ
とにある。

問題点を解決するための手段 本発明者らは、エシェリヒア属微生物の宿主細胞に適合
しうるプラスミドベクターのDNA鎖の上流より、それぞ
れ宿主細胞で機能する転写制御領域、リボゾーム結合部
位、翻訳開始コドン、ポリペプチドをコードする真核生
物遺伝子及び翻訳終止コドンをこの順序で配置し、真核
生物遺伝子の３′側に存するポリＡ配列由来及び／もし
くはcDNAライブラリー作成の際形成されるデオキシアデ
ニル酸とデオキシチミジル酸の塩基対であってこれが10
塩基対以上連続したものを除去し、並びに／又はcDNAラ
イブラリー作成の際形成されるデオキシグアニル酸とデ
オキシシチジル酸の塩基対であってこれが10塩基対以上
連続したものを除去し、かつ翻訳終止コドンより500塩
基対以内に宿主細胞内で機能する転写終結シグナルを配
置して得られる組換えDNAを用いて、エシェリヒア属の
微生物を形質転換すれば、極めて高い効率で真核生物遺
伝子が発現されることを知った。

すなわち本願発明は、エシェリヒア属微生物の宿主細胞
に適合しうるプラスミドベクターのDNA鎖の上流より、
それぞれ宿主細胞で機能する転写制御領域、リボゾーム
結合部位、翻訳開始コドン、ポリペプチドをコードする
真核生物遺伝子及び翻訳終止コドンをこの順序で配置
し、真核生物遺伝子の３′側に存するポリＡ配列由来及
び／もしくはcDNAライブラリー作成の際形成されるデオ
キシアデニル酸とデオキシチミジル酸の塩基対であって
これが10塩基対以上連続したものを除去し、並びに／又
はcDNAライブラリー作成の際形成されるデオキシグアニ
ル酸とデオキシシチジル酸の塩基対であってこれが10塩
基対以上連続したものを除去し、かつ翻訳終止コドンよ
り500塩基対以内に宿主細胞内で機能する転写終結シグ
ナルを配置して得られる組換えDNAを、エシェリヒア属
微生物の宿主細胞内に導入することを特徴とする真核生
物遺伝子の発現方法である。

エシェリヒア属の微生物よりなる宿主細胞に適合するベ
クターDNAとしては、pSC101,pRK353,pRK646,pRK248,pDF
41など（ストリンジェント型）やColE1,pVH51,pAC105,R
SF2124,pCR1,pMB9,pBR313,pBR322,pBR324,pBR325,pBR32
7,pBR328,pKY2289,pKY2700,pKN80,pKC7,pKB158,pMK200
4,pACYC1,pACYC184,λdv1など（リラックス型）やλgt
・λC,λgt・λB,λWES・λC,λWES・λＢ′，λZJvir
・λＢ′，λALO・λB,λWES・T₅622,λDamなど（ファ
ージベクター）がある。

このようなベクターDNA内において、上流よりプロモー
ター,SD配列，翻訳開始コドン，ポリペプチドをコード
する真核生物遺伝子及び翻訳終止コドンがこの順序で配
置される。

プロモーターは、オペレーターをその下流に有している
こともあるが、有していないこともある。これらはいず
れも宿主細胞内でその機能を発現するものでなければな
らない。プロモーターの例としては、blaプロモータ
ーBolivar,F.,Rodriguez,R.L.,Greene,R.Y.,Betlack,M.
C.,Heynecker,H.L.,Boyer,H.W.,Crosa,Y.H.,Falkow,S.:
Gene2,95（1977）。Talmadge,K.,Gilbert,W.:Gene12,23
5（1980）.Itoh,T.,Tomizawa,J.:Nucleic Acids Res.,1
0,5949（1982）tacプロモーターde Boer,H.A.,Comsto
ck,L.J.,Vasser,M.Proc.Natl.Acas.Sci.USA80,21（198
3）。λ_PLプロモーターHorn,G.T.,Wells,R.D.:J.Bio
l.Chem.256,2003（1981）tufBプロモーター谷口維
紹，高岡千佳子，広瀬忠明，大野茂男：生化学53,966
（1981）．lppプロモーターNakamura,K.,Inouye,M.:C
ell18,1109（1979）.Inouye,M.,Nakamura,K.,Inouye,
S.,Masui,Y.:in“Future of Nucleic Acid Research",W
atanabe,I.,ed.,Academic Press,New York,in press.
T5 25,26プロモーターRosenberg,M.,Court,D.:Ann.Rev,
Genetics 13,19（1979）．tetプロモーターGentz,R.,
Langner,A.,Chang,A.C.Y.,Cohen,S.N.,Bujard,H.:Proc.
Natl.Acad.Sci.USA78,4936（1981）．T7ファージの後
期プロモーターRosa,M.P.:Cell,16,815（1979）λ_PE
プロモーターKuroki,K.,Ishii,S.,Kano,Y.,Imamoto,F.:
Gene,17,179（1982）lac UV5プロモーターPolisky,
B.,Bishop,R.J.,Gelfand,D.H.:Proc.Hatl.Acad.Sci.USA
73,3900（1976）.Fuller,F.:Gene9,43（1982）.Charna
y,P.,Perricaudet,M.,Galibert,F.,Tiollais,P.:Nuclei
c Acids Res.5,4479（1978）．trpプロモーターGoedd
el,D.V.,Yelverton,E.,Ullrich,A.,Heynecker,H.L.,Mio
zzari,G.,Holmes,W.,Seeburg,P.H.,Dull,T.,May,L.,Ste
bbing,N.,Crea,R.,Maeda,S.,McCandliss,R.,Sloma,A.,T
abor,J.M.,Gross,M.,Familletti,P.C.,Pestka,S.:Natur
e287,411（1980）。Hallewell,R.A.,Emtage,S.:Gene9,2
7（1980）。Goeddel,DV.,Heynecker,H.L.,Hozumi,T.,Ar
entzen,R.,Itakura,K.,Yansura,D.G.,Ross,M.J.,Miozza
ri,G.,Crea,R.,Seeburg,P.H.:Nature281,544（1979）.T
acon,W.,Carey,N.,Emtage,S.:Molec.Gen.Genet.177,427
（1980）．rrnBプロモーターGlaser,G.,Enquist,L.,C
ashel,M.:Gene2,159（1977）．等がある。

SD配列はJay,E.,Seth,A.K.,Rommens,J.,Sood,A.,Jay.
G.:Nucleic Acids Res.10,6319（1982）.Scherer,G.F.
E.,Walkinshaw,M.D.,Arntt,S.,Morre,D.J.:Nucleic Aci
ds Res.8,3895（1980）.Boyen,A.,Piette,J.,Cunin,R.,
Glansdorff,N.:J.Mol.Biol.162,715（1982）.Gold,L.,P
ribnow,D.,Schneider,T.,Shinedling,S.,Singer,B.S.,S
tormo,G.:Ann.Rev.Microbiol.35,365（1981）． に記載されているような機能及び塩基配列を有するもの
であり，ここに記載されているいずれのSD配列も本発明
において使用できる。

翻訳開始コドンはエシェリヒア属微生物においては通常
ATGであるが、GTGも翻訳開始コドンとして使用できる。

翻訳開始コドンの下流には目的とするポリペプチドをコ
ードする真核生物遺伝子が接続される。真核生物遺伝子
としては、どのようなものでもよく、例えば、ソマトス
タチン，インスリン，レンニン，α，β，γ−インター
フェロン，ヒト成長ホルモン，α，β−ネオエンドルフ
ィン，ヒトインターロイキン−2,マウスインターロイキ
ン−２等がある。

真核生物遺伝子の下流には翻訳終止コドンが存在する。
エシェリヒア属の微生物の細胞内において機能する翻訳
終止コドンとしては、TGA,TAA及びTAGがある。

翻訳終止コドンの下流の500塩基以内に、より好ましく
は10塩基以上下流に、エシェリヒア属微生物の細胞内で
機能する転写終結シグナルを配置する。このとき、真核
生物遺伝子の３′側に存するポリＡ配列由来及び／もし
くはcDNAライブラリー作成の際形成されるデオキシアデ
ニル酸とデオキシチミジル酸の塩基対であってこれが10
塩基対以上連続したものを除去し、並びに／又はcDNAラ
イブラリー作成の際形成されるデオキシグアニル酸とデ
オキシシチジル酸の塩基対であってこれが10塩基対以上
連続したものを除去する。転写終結シグナルとしてはtr
pAターミネーター（G.Zurawaki et al.,Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA,75,5988,1978;R.Gentz et al.,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA78,4936,1981）,lppターミネーター（K.Naka
mura et al.,The EMBO Journal,１,771,1982;T.Nishi e
t al.,Agric.Biol.Chem.,48,669,1984）やT₄ファージタ
ーミネーター（G.Simon et al.,Gene,28,55,1984）など
が知られている。

以上述べたように各々のDNAが配置されている組換えDNA
を調製する方法は、特定の方法である必要はなく、従来
知られている方法がそのまま使用できる。

かくして得られた組換えDNAは、エシェリヒア属の微生
物の細胞内に導入される。導入方法は通常のルビジウム
法，低pH法,Caコンピテント処理法，プロトプラストト
ランスホーメイション法などが使用できる。

組換えDNAの宿主として使用できるエシェリヒア属の微
生物としては、特にエシェリヒア・コリ（Escherichia
coli）が好適である。具体的には、Ｃ−600（F^-,thi−
1,thr−1,leuB6,LacY1,tonA21,supE44,λ⁻）,X1776（F
^-,tonA53,dapD8,minA1,glnV44（supE42），Δ（gal−uv
rB）40,λ^-,minB2,rfb−2,gryA25,thyA142,oms−2,metC
65,oms−1,（tte−１），Δ（bioH−sad）29,cycB2,cyc
A1,hsdR2）,HB101,（F^-,hadS20（r_B ^-,m_B ^-）,recA13,ara
−14,proA2,lacY1,galK2,rpsL20（Sm^r）,xyl−5,mtl−
1,supE44,λ⁻）,JM103（Δ（lacpro）,thi,strA,supE,
endA sbcB,hadR^-,F′traP36,proAB,lacI^q,ZΔM15）等が
ある。

作用 本発明の真核生物遺伝子の発現方法によれば、従来知ら
れている方法に比べ、真核生物遺伝子の発現効率が極め
て高い。

実施例１ エシェリヒア・コリー内でヒトインターロイキン−２を
生合成することのできるプラスミドを次のようにして構
築した。

まず第２図に示すようにインターロイキン−２全cDNAを
含むpILD−50A（Xho）（欧州特許出願公開91539号）よ
りインターロイキン−２遺伝子を含むHgiA1断片を調製
し、さらにDNAポリメラーゼＩ（クレノー）で処理する
ことによって３′側に突出した単鎖部分のヌクレオチド
を削りとった。この処理はT₄DNAポリメラーゼを用いて
も同様に出来る。この操作によってインターロイキン−
２遺伝子の５′側はCCT（アミノ酸コドンはプロリン）
で始まる断片が得られる。次にこの断片を制限酵素Xho
Iで処理してインターロイキン−２遺伝子を含む約750塩
基対の断片を得た。

一方、エシェリヒア・コリ内でインターロイキン−２を
発現させるためにはエシェリヒア・コリーで働く適当な
プロモーターが必要であるが、ここではtrpプロモータ
ーを用いた。trpプロモーターを搭載したプラスミドと
してpDR720を使用したが、pDR720はpKO−１（Russel,D.
R.and Bennett,G.N.,Gene,20,231（1982））のSma I切
断部位にtrpプロモーター，オペレーター断片が組込ま
れたものである。

pDR720をHpa I,Pst Iで切断してtrpプロモーターのプリ
ブナウボックス（Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79（1975）1
069）より上流部分を含むPst I−Hpa I断片を取得し
た。またpBR322のBal I切断部位にXho Iリンカーを導入
したpBR322（Xho）を作成した後、このPst I−Xho I断
片（約2.2kb）を取得した。

次にインターロイキン−２遺伝子を含む約750塩基対断
片とtrpプロモーター領域を含むPst I−Hpa I断片，さ
らにpBR322（Xho）のPst I−Xho I断片とtrpプロモータ
ーの１部とAAGGなるSD配列ならびに蛋白合成開始コドン
ATGと成熟インターロイキン−２蛋白のＮ末端のアラニ
ンをコードするGCAを含む合成オリゴマーａ（第２図）
とをT₄DNAリガーゼで結合させpT9−１なるプラスミドを
選び出した。本pT9−１プラスミドはtrpプロモーターの
制御下にＮ末端がメチオニン−アラニンで始まるインタ
ーロイキン−２成熟蛋白を作り出す暗号をコードしてい
る。

次に第３図に示すようにpT9−１をXho Iで切断しDNAポ
リメラーゼ（クレノウ）処理によって接着末端を平滑末
端にし、さらにBamH Iリンカーを導入してpT9−1Bを造
成した。同様にpT9−１のEcoR I−Xho I断片を調製し、
さらにDra Iで切断しインターロイキン−2cDNA遺伝子の
３′非構造遺伝子に存在するＡ−T,G−Ｃホモポリマー
を含む約300塩基対の断片を除去したところの550塩基対
断片を得た。そしてpBR322のテトラサイクリン耐性遺伝
子中にあるHinc II切断部位（Sal I切断部位でもある）
とEcoR I切断部位との間に450塩基対断片のインターロ
イキン−２遺伝子とBamH Iリンカーを組み込み、目的と
するpT9−7Bなるプラスミドを選定した。

次にpBR322をPvu IIとSal Iで切断し大断片の方を調製
した。そして第４図に示した転写終結シグナル（T₄ ter
minator（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,79 4937,（198
2））を含む合成オリゴマーｂを挿入しpT4Tを得た。そ
してpT4TをEcoR IとBamH Iで切断してEcoR I−BamH Iの
大断片を調製した。またpT9−1BとpT9−7BをそれぞれEc
oR IとBamH Iで切断しIL−２遺伝子を含むEcoR I−BamH
I断片を調製し、それぞれをpT4TのEcoR I−BamH I大断
片と連結することによってpT9−1BTとpT9−7BTを得た。

pT9−1BとpT9−7Bとをエシェリヒア・コリHB101に導入
し、これらの株を培養した。細胞は25μg/mlのストレプ
トマイシンおよび100μg/mlのアンピシリンを含むＬ培
地（１％バクトトリプトン,0.5％酵母エキス,0.5％NaC
l,0.1％グルコースpH7.0）10ml中で37℃で一晩生育させ
た。次いでこの10ml培養液をM9カザミノ酸培地（0.2％
グルコース,0.1％NH₄Cl,0.6％Na₂HPO₄,0.3％KH₂PO₄,0.0
5％NaCl,2mM MgSO₄,2mM CaCl₂,2mg/サイアミン,0.2％
カザミノ酸,pH7.4）100mlに接種し、28℃で培養した。6
50nmのO.D.がおよそ1.0−1.5に達した時点でインターロ
イキン−２遺伝子発現を誘導するために３−インドール
アクリル酸（IAA）20μg/mlを加えた。IAAの添加後温度
を23℃に落し、一晩振とう培養した。その後、細胞を集
め50mMトリス−塩酸,pH7.5と10mM EDTAと１％SDSを含む
溶液で可溶化しソニック（50W）,5℃,30秒処理後、遠心
分離し、その上清を採取した。抽出液のインターロイキ
ン−２活性は表１に示す如くである。

これで明らかな如くインターロイキン−2cDNAの３′非
構造領域を部分的に除いたプラスミドを持つpT9−7B/HB
101及びpT9−7BT/HB101の方が除いていないpT9−1B/HB1
01及びpT9−1BT/HB101よりも極めてすぐれたインターロ
イキン−２生産能を示しまた転写終結シグナルを挿入し
たものは更に高い生産能を示した。

実施例２ 第３図のpT9−7Bの構築法により実施例１において述べ
たのと全く同じ方法で第５図のpT9−7Xを構築した。但
し前者がBamH Iリンカーを導入したのに対し、ここでは
Xho Iリンカーを導入した。

一方、第２図に示したpT9−１のXho I−Pvu II部位のと
ころに第５図に示した合成DNA法で作ったtrpAターミネ
ーターを組み込んだpT9−３を造成した。

次にpT9−３をPat IとXho Iで切断し、trpAターミネー
ターを含む断片を得、同じくpT9−7XをPst IとXho Iで
切断し、インターロイキン−２遺伝子を含むPst I−Xho
I断片を得た。この２つの断片をT₄DNAリガーゼで連結
してpT9−10を得た。

次に第６図に示すようにまた別の構築法によってpT9−1
1を得た。即ち、インターロイキン−２全cDNAを含むpIL
2−50A（欧州特許出願公開91539号,Nature,302,305,198
3）よりPat Iで切断しインターロイキン−2cDNA断片を
得、さらにDra Iで消化してインターロイキン−2cDNA遺
伝子の３′非構造遺伝子に存在するＡ−T,G−Ｃホモポ
リマーを含む約300塩基対の断片を除去したところの530
塩基対断片を得た。そしてこの断片とBamH Iリンカー
と、pBR322のPst I−EcoR Iの大きい方の断片（EcoR I
部位はクレノウで平滑末端にした）とをT₄DNAリガーゼ
で連結し、インターロイキン−２構造遺伝子のおよそ50
塩基対下流の非構造遺伝子の後にBamH I切断部位の入っ
たプラスミドを造成した。そしてこのプラスミドをHgiA
1で消化しインターロイキン−２遺伝子を含むHgiA1断片
を得、これをDNAポリメラーゼＩ（クレノウ）処理で
３′側に突出した単鎖部分のヌクレオチドを削り取り平
滑末端にした。そしてさらにこの断片をBamH Iで切断し
て約450塩基対の断片を得た。

そして実施例１でpT9−１を構築したのと同じようにtrp
プロモーターを搭載したpDR720をHpa IとBamH Iで消化
し、大きいHpa I−BamH I断片を得、実施例１（第１
図）で用いたのと全く同じtrpプロモーターの１部とAAG
GなるSD配列ならびに蛋白合成開始コドンATGと成熟イン
ターロイキン−２蛋白のＮ末端のアラニンをコードする
GCAを含む合成オリゴマーとを第６図に示すように連結
しpM I−９を選びだした。

一方pBR322のPvu IIとSal I切断断片の大きい断片と、
合成したtrpAターミネーター配列を持つDNAとを連結さ
せpTrpAを得た。そしてpM I−９とpTrpAをともにEcoR I
とBamH Iで消化しpM I−９はインターロイキン−２遺伝
子を含む方の断片、pTrpAはtrpAターミネーターを含む
方の断片をそれぞれ調製し、この２者を連結してpT9−1
1を得た。そこでpT−3,pT9−10およびpT9−11をエシェ
リヒア・コリHB101に導入して得たpT9−3/HB101,pT9−1
0/HB101およびpT9−11/HB101を実施例１で述べた方法で
インターロイキン−２活性を比較したところ、表１に示
すようにターミネーターの有効性とともにインターロイ
キン−2cDNAの３′非構造遺伝子領域の除去の効果が顕
著に認められた。

実施例３ エシェリヒア・コリ内で、マウスインターロイキン−２
遺伝子を発現するために、実施例２、第５図に示した合
成DNA法で作成したtrpAターミネーターを組み込んだpT9
−３をベクターとして、マウスインターロイキン−2cDN
Aを連結したプラスミドpT9−M1を、第７図に示す方法に
より構築した。

プラスミドpT9−３を、制限酵素Xho IおよびHpa Iで切
断し、アガロースゲル電気泳動により、trpプロモータ
ーおよびtrpAターミネーターを含むDNA断片を、単離精
製した。

一方、マウスインターロイキン−2cDNAインサートは、
プラスミドpMIL2−45から、以下の方法により、調製し
た。即ち、pMIL2−45を制限酵素Pst Iで切断し、アガロ
ースゲル電気泳動により、Pst I切断cDNAインサートを
得、更に制限酵素Hha Iで切断し、T₄DNAホリメラーゼ処
理により突出した３′単鎖末端を削り取り、平滑末端と
した後、制限酵素Acc Iで切断し、アガロースゲル電気
泳動によりHha I−Acc I断片を単離精製した。

次に該Hha I−Acc I断片と、合成DNA ５′AACTAGTACGCAAGTTCACGTAAAAAGGGTATCGACAATGG3′と
３′GATCATGCGTTCAAGTGCATTTTTCCCATAGCTGTTACC5′は、
両方とも５′−末端でリン酸化されているが、これ等
を、6.6mM MgCl₂,1mM ATPおよび1mMジチオスレイトール
を含むpH7.5の6.6mMトリス塩酸緩衝液中で、T₄DNAリガ
ーゼと共に混合し、混合物を４℃に一晩保った。該反応
液を、DNAポリメラーゼＩ（クレノウ）で処理後、アク
リルアミドゲル電気泳動によりHha I−Acc I断片と、上
記合成DNAと連結したDNA断片を、単離精製した。該DNA
断片と、上記pT9−３のHpa I−Xho I断片の接着末端をD
NAポリメラーゼＩ（クレノウ）で埋め込み平滑末端とし
た後、T₄DNAリガーゼにより結合した。得られたプラス
ミドを、常法に従い、エシェリヒア・コリHB101へ導入
し、アンピシリンを含むＬ培地寒天プレート上に、コロ
ニーを形成した株を分離した。得られた株より、コロニ
ーハイブリダイゼーション法により、Hha I−Acc I断片
とハイブリダイズするDNAを有する株を選択した。こう
して選択したコロニーを、Ｌ培地を用いて、再び培養
（10ml）し、得られた細胞をリゾチーム処理および凍
結，融解処理して、プラスミドDNAを得た。このプラス
ミドDNAを、Bgl Iで切断し、それによる生成物を、アガ
ロースゲル電気泳動にかけ、cDNAが、ベクターの後に正
しい方向で連結しているpT9−M1を得た。対照のマウスI
L−2 cDNAの３′−下流にＡ−ＴおよびＧ−C tailをも
つインサートを含むpT9−M2プラスミドは、上記合成DNA
とマウスインターロイキン−2cDNAのHha I−Acc I断片
とを連結後、マウスインターロイキン−2cDNAのAcc I−
Pst I断片を結合し、T₄DNAポリメラーゼ処理することに
より、作成したDNA断片と、上記pT9−３のHha I−Xho I
断片の接着末端をDNAポリメラーゼＩ（クレノウ）で埋
め込み平滑末端とした後、T₄DNAリガーゼ処理すること
により構築した。

実施例１の場合と同様に、これらプラスミドを、エシェ
リヒア・コリHB101にトランスホームして得たトランス
ホーマントを培養し、インターロイキン−２活性を検討
したところ、表２に示すように、マウスインターロイキ
ン−2cDNAの３′非構造遺伝子領域の１部とＡ−Ｔおよ
びＧ−Ｃホモポリマーを除去した効果が、顕著に認めら
れた。

なおpTIL2−50Aを有するエシェリヒア・コリX1776はFER
M−BP−226として寄託されており、またpMIL2−45を有
するエシェリヒア・コリHB101はFERM−Ｐ−7758として
寄託されている。

またtrpプロモーターを持つ発現ベクターpDR720はPL−
ファルマシア社より市販されている。

【図面の簡単な説明】

第１図は、組換えプラスミドpT9−1B,pT9−7B,pT9−1B
T,pT9−7BT,pT9−3,pT9−10,pT9−11,pT9−M2及びpT9−
M1の説明図である。 第２図は、組換えプラスミドpT9−１の造成経過説明図
である。 第３図は、組換えプラスミドpT9−1B及びpT9−7Bの造成
経過説明図である。 第４図は、組換えプラスミドpT9−1BT及びpT9−7BTの造
成経過説明図である。 第５図は、組換えプラスミドpT9−３及びpT9−10の造成
経過説明図である。 第６図は、組換えプラスミドpT9−11の造成経過説明図
である。 第７図は、組換えプラスミドpT9−M1及びpT9−M2の造成
経過説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 谷口 維紹 大阪府茨木市美穂ヶ丘19―Ａ 207 審査官 斎藤 真由美

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】エシェリヒア属微生物の宿主細胞に適合し
   うるプラスミドベクターのDNA鎖の上流より、それぞれ
   宿主細胞で機能する転写制御領域、リボゾーム結合部
   位、翻訳開始コドン、ポリペプチドをコードする真核生
   物遺伝子及び翻訳終止コドンをこの順序で配置し、真核
   生物遺伝子の３′側に存するポリＡ配列由来及び／もし
   くはcDNAライブラリー作成の際形成されるデオキシアデ
   ニル酸とデオキシチミジル酸の塩基対であってこれが10
   塩基対以上連続したものを除去し、並びに／又はcDNAラ
   イブラリー作成の際形成されるデオキシグアニル酸とデ
   オキシシチジル酸の塩基対であってこれが10塩基対以上
   連続したものを除去し、かつ翻訳終止コドンより500塩
   基対以内に宿主細胞内で機能する転写終結シグナルを配
   置して得られる組換えDNAを、エシェリヒア属微生物の
   宿主細胞内に導入することを特徴とする真核生物遺伝子
   の発現方法。