JPH0690753A - Production of hybridoma cell line - Google Patents

Production of hybridoma cell line


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JPH0690753A JP3157731A JP15773191A JPH0690753A JP H0690753 A JPH0690753 A JP H0690753A JP 3157731 A JP3157731 A JP 3157731A JP 15773191 A JP15773191 A JP 15773191A JP H0690753 A JPH0690753 A JP H0690753A
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PURPOSE: To provide a method for producing a stable hybridoma cell line for producing a human antibody.
CONSTITUTION: This method for producing a stable hybridoma cell line comprises fusing a xenogenic hybridoma cell to a lymphocyte for producing the objective antibody, genetically compatible with an untransformed cell partner cell to cause the xenogenic hybridoma and selecting the objective hybrid.



【0001】 [0001]

【産業上の利用分野】本発明はハイブリドーマ細胞系 BACKGROUND OF THE INVENTION The present invention is a hybridoma cell line
(セルライン)の製造法に関する。 It relates to a process for the preparation of (cell line).

【0002】 [0002]

【従来の技術】ハイブリドーマは、雑種を形成するために、「不死化」細胞(特に骨髄腫細胞)を、特定物質を産生する能力により通常選択した「正常」非形質転換細胞 BACKGROUND ART hybridomas to form a hybrid, the "immortalized" cells (particularly myeloma cells), "normal" and usually selected by the ability to produce a specific substance untransformed cells
(例、抗体を産生するリンパ球細胞)と融合させることによって形成される細胞に適用する用語である。 Is a term applied to the cells that are formed by fusing (e.g., antibody lymphocytes cells which produce). これらの雑種は、単一の構造および/または性質を有する物質を産生する細胞系を得るために選択し、クローン化することができる。 These hybrids are selected to obtain cell lines producing a substance having a single structure and / or properties may be cloned. 特に、リンパ球で形成されるかかるハイブリドーマは、モノクローン抗体を製造するのに使用することができる。 In particular, such a hybridoma formed by lymphocytes can be used to produce monoclonal antibodies. 近年のハイブリドーマ技術の開発は、安定で、取得希望の特定物質を高収率かつ特異的に産生する細胞系を得ることに向けられてきた。 Recent developments of hybridoma technology, stable, have been directed to obtaining a cell line to high yield and specifically produce specific substance desired to be acquired. この問題について各種のアプローチがなされたが、歴史的理由により、 Various approaches have been made on this issue, for historical reasons,
免疫グロブリン/抗体の分野に大きく集中していた。 It had been largely concentrated in the field of immunoglobulin / antibody. この分野での従前の活動を研究すると、直面した問題の類別の大要と、今までに試みられた各種の解決法を概観できる。 When you study the previous activities in this field, can overview and classification of the Compendium of the problems encountered, a variety of solutions have been tried so far. モノクローン性生産物を製造する雑種セルラインの研究の最初の衝動は、生産物がモノクローン抗体である免疫生物学の分野から発生した。 The first impulse of the study hybrid cell line to produce a mono-clonal product is product occurs from the field of immunobiology a monoclonal antibody. 通常の抗血清は、抗原結合部位において構造的には異なるがそれぞれ大または小なる持続性および/または特異性でもって同じ抗原に結合する非常に多数の抗体を一般に含有している。 Normal antisera is structurally in the antigen binding site containing generally a large number of antibodies that bind to the same antigen with different but in a sustained and / or specificity respectively large or small. 加えてまた、通常の抗血清は、他の抗原に対するもので、 Additionally addition, conventional antiserum, directed against other antigens,
抗血清が得られる宿主個体の以前の防御反応を反映する多数の抗体を含有している。 It contains a number of antibodies that reflect the previous defense reaction of the host individual antisera is obtained. ほとんどの目的には、かかる広範な抗血清で充分であるが、よりすぐれた特異性や再現性を与えることが特に診断と療法の分野において重大な前進をもたらし、すばらしい能力をもつ科学的手段を付与することになるであろうと考えられた。 For most purposes, it is sufficient this broad antiserum resulted in significant advances in the field, especially diagnostics and therapy to provide a more excellent specificity and reproducibility, a scientific means having a great capacity It was thought that it would become possible to impart. 最初であり且つ現在では古典的な解決法は、KohlerとMilstein First a and and classical solution currently in, Kohler and Milstein
がNature, 256 ,495〜497(1975)に報告したが、彼らは免疫化マウス脾臓細胞を薬物感受性マウス骨髄腫細胞に融合させることに成功した。 But Nature, 256, was reported to 495-497 (1975), they succeeded in fusing immunized mouse spleen cells to drug-sensitive mouse myeloma cells. こうして不死化した融合細胞はインビトロで生育しそして単一細胞レベルからクローン化して、均質な抗体集団(モノクローン抗体)を産出する均質な細胞集団を製造することができた。 Fused cells immortalized in this way could be grown in vitro and cloned from a single cell level, to produce a homogeneous population of cells that produce a homogeneous antibody population (monoclonal antibody). 多くのユニークな細胞から選択し、且つ選択的な再クローニングによって、所望の抗原特異性をもつ抗体を産生する細胞を取得し、生育することが可能となった。 Select from many unique cell, by and selective recloning acquires Cells which produce antibodies with the desired antigen specificity, it was possible to grow. このような方法で製造されたマウス抗体は、研究や診断の目的には有用であることが証明されており、またあるものはヒトの治療にさえ用いられていた。 Such methods mouse antibodies produced in, for the purposes of research or diagnostic have been proven useful, while others had been even used in the treatment of humans. しかし、 But,
同様な特異性と再現性のヒト抗体がこの方法で得ることができるのであれば、ヒトの免疫グロブリン療法において大きな前進となるであろう。 If it is possible to reproducibility of the human antibody with similar specificity obtained with this method it would be a huge step forward in immunoglobulin therapy in humans. またこのことは感作の危険性を減少するであろう。 In addition This will reduce the risk of sensitization.

【0003】インビトロでかかるヒト抗体を製造する問題へのアプローチがいくつか試みられたが、それらは現在のところ大きく成功していない。 [0003] Although the approach to the in vitro such a problem that the production of human antibodies have been tried some, they have not been successful largely at the moment. これらには以下のことが挙げられる。 These include the following. (i)Epstein−Barrウイルス(EBV)による正常なヒトリンパ球の形質転換。 (I) Transformation of normal human lymphocytes by Epstein-Barr virus (EBV). このタイプの細胞は樹立するに長くて冗長な工程を必要とし、またクローンおよび選択することが非常に困難であるので、この方法はほとんど成功しなかった。 This type of cell requires a lengthy process with long establish, also it is very difficult to clone and select, this method was hardly successful. (ii)ヒト骨髄腫細胞との正常な(ヒト)リンパ球の融合。 (Ii) fusion of normal (human) lymphocytes with human myeloma cells.
この方法はマウス−マウスハイブリドーマの法に明らかに類似性を表わしているが、ヒト系ではただ一つの骨髄腫細胞系のみしか容易に入手できないという問題に直面し、またこの系は融合の成功を妨害するマイコプラスマでもって汚染されていることが判明した。 The method mice - but clearly represents a similarity law murine hybridoma, faced with the problem of not being available only only easily just one myeloma cell line in human systems, also the success of this system is fused it has been found that is contaminated with at interfering mycoplasma. (iii)EBV−形質転換ヒトリンパ芽球様のB細胞系への正常なヒトリンパ球の融合。 (Iii) the EBV-fusion of normal human lymphocytes to transformed human lymphoblastoid B-cell line. おそらくこれはすでに報告されたものでは最も確実で再現性ある方法であるが、 Perhaps this is intended already reported a method that is the most reliable and reproducible,
リンパ芽球様細胞が出会う基本的なインビトロの欠点をもつ。 With basic in vitro drawback to meet the lymphoblastoid cells. 上記細胞はクローン化することが非常に困難である。 The cells are very difficult to clone. またB細胞分化系統の早期段階に該当するので、それらの抗体を産生し分泌する能力が真性骨髄腫のそれより約10倍低い。 Since true early stages of B cell differentiation lineage, about 10 times lower than that of the intrinsic myeloma ability to produce and secrete the antibodies. (iv)マウス骨髄腫へのヒトリンパ球の融合。 (Iv) fusion of human lymphocytes to mouse myeloma. この方法はマウス−マウスハイブリドーマと同様に優れたインビトロ特性を有する細胞を製造し得るが、それは雑種が固有の遺伝学的不安定性を有するという大きな欠点を備えている。 The method mice - may produce cells with similar excellent vitro characteristics and murine hybridoma, but it has a major disadvantage hybrids have an inherent genetic instability. これから生ずる厄介な結果の1つは、免疫グロブリンの軽カッパー鎖を形成するためのゲノムが位置するヒト染色体を上記細胞が追放するということである。 One troublesome consequences arising from this, the human chromosome genomic for forming the immunoglobulin light kappa chain located is that the cells are expelled. 従って、要約すれば、方法(i)は実施するにはあまりにも冗長で非能率的である。 Thus, in summary, the method (i) are inefficient in too redundant to implement. 方法(ii)は未だ実用的意義を有していない。 The method (ii) has not yet have a practical significance. 方法(iii)は現在利用可能なものでは最良である。 The method (iii) is the best than those currently available. 方法(iv)は実行可能であるが、細心の注意を払うクローニング手段でもってしても生産性を維持できない。 The method (iv) can be executed, but can not maintain productivity even when advance cloning means to pay close attention. 以上の検討も現在までのほとんどの研究も抗体製造に集中しているが、生産性ある細胞パートナーを、取得希望の特定物質の分泌に関して選択し、また不死化セルラインに融合できるということが明らかである。 Clear that more study also has focused on even antibody production most studies to date, the productivity of a cell partner, chosen for secretion of a specific substance desired to be acquired, and can be fused to an immortalized cell line it is.

【0004】 [0004]

【発明の記載】今回、他の細胞に更に融合させるために親として異種間ハイブリドーマ細胞を使用することにより、安定性を大きく改良されたハイブリドーマを得ることができるということが判明した。 This DESCRIPTION OF THE INVENTION By the use of xenogeneic hybridoma cells as a parent for further fused to other cells, it was found that it is possible to obtain is greatly improved stability hybridomas. 従って、本発明は、 Accordingly, the present invention is,
不死化細胞が異種間ハイブリドーマ細胞であり、予定された物質を産生する細胞が異種間ハイブリドーマの非形質変換パートナーと遺伝学的に適合できることを特徴とする、上記予定物質産生細胞に融合された不死化細胞を含むハイブリドーマセルラインの提供を可能とする。 Immortal immortalized cells are xenogeneic hybridoma cells, the cells that produce the scheduled substances characterized by their ability to genetically compatible with the non-transformed partner xenogeneic hybridomas, which are fused to the scheduled substance producing cell enabling provision of a hybridoma cell line that contains the cells. かかる細胞の安定性は、正しく培養される場合に抗体の如き予定された物質の産生を維持する能力をもたらす。 Stability of such cells results in the ability to maintain the production of scheduled substances such as antibodies when correctly culture. ある具体例においては、不死化細胞として選択された異種間ハイブリドーマは、免疫グロブリンを産生するそれ自体の能力を失った骨髄腫雑種である。 In certain embodiments, xenogeneic hybridoma selected as immortalized cells, myeloma hybrids that have lost the ability of its own to produce immunoglobulins. かかる異種間ハイブリドーマの具体例は、骨髄腫細胞とリンパ球細胞の間のものであると思われる。 Specific examples of such cross-species hybridomas are believed to be of between myeloma cells and lymphoid cells. 適切な骨髄腫細胞の具体例は、マウスとラットから得られたものであり、免疫グロブリンは産生しないものが好ましい。 Examples of suitable myeloma cells are those obtained from mice and rats, it is preferable not to produce immunoglobulins. これらの骨髄腫はそれ自体、実際上骨髄腫の性質をもつ雑種(例、マウス骨髄腫/マウスリンパ球)であり得る。 These myeloma themselves may be hybrids having the properties of practically myeloma (eg, murine myeloma / mouse lymphocytes). かかる細胞は例えばマウスSP−2骨髄種セルラインである。 Such cells are mouse SP-2 myeloma cell lines, for example. 次いでこれを例えば、他の種から得られるリンパ球(例、ヒトリンパ球細胞)に融合させる。 Then for example this is fused to obtained from other species lymphocytes (e.g., human lymphocyte cells). 好ましい実施態様では、免疫グロブリンをもはや産生しないかかる融合で生ずる異種間ハイブリドーマを、物質産生細胞に更に融合させるために選択する。 In a preferred embodiment, the xenogeneic hybridoma produced by such fusion no longer produce immunoglobulin is selected to further fused to the substance-producing cells. これらの異種間ハイブリドーマは、染色体喪失の点ですぐれた安定性を得るため、より一層好適な環境を与える。 These xenogeneic hybridoma, to obtain a good stability in terms of chromosomal loss, provide a more suitable environment. 不死化に使用する異種間ハイブリドーマは、通常の方法で更に融合する以前に薬剤耐性にする。 Xenogeneic hybridoma used for immortalization, to drug resistance prior to further fusion in the usual way. 方法の例は8−アザグアニン耐性に関する選択である。 Examples of the method is selective about the 8-azaguanine-resistant. このようにして得られるハイブリドーマは、更に融合するための安定な親を与える。 Hybridomas obtained in this manner gives a stable parent for further fusion. 他の融合パートナーは、予定物質を産生する能力で選択したもので(例えば抗体の産生の場合リンパ球の選択である)、異種間ハイブリドーマの非形質変換パートナーと遺伝学的に適合するものである。 Other fusion partners, by those selected by ability to produce scheduled substances (for example production of antibodies is the selection of lymphocytes), is to genetically compatible with the non-transformed partner xenogeneic hybridoma . 必要度の特異性を得るには、選択細胞をあらかじめ感作して所望物質産生性にすることが望ましい。 To obtain the required degree of specificity, it is desirable to desired substance producing previously sensitized selected cells. このことは例えば抗体の場合には、特定抗原でもって宿主を免疫化し次いで対応する抗体を産生する免疫細胞(即ち、免疫適格細胞)を採集することによって達成できる。 This is the case, for example an antibody can be accomplished by collecting the immune cells that produce antibodies immunized then the corresponding host with a specific antigen (i.e., immunocompetent cells). これらは例えば脾臓、リンパ節または血球であり得る。 These can be, for example, spleen, lymph nodes or blood cells.

【0005】異種間ハイブリドーマ細胞である親の物質産生細胞への融合は、通常の方法で行なう。 [0005] The fusion of the parent of substance-producing cells that are different between the hybridoma cells is carried out in the usual way. これには通常、融合を促進する物質(例、PEG1500)と共に適当な培地で同等量の各細胞をインキュベートすることが含まれる。 This usually substance (eg, PEG 1500) to promote fusion involves incubating the cells in comparable amounts in an appropriate medium with. 所望の雑種の選択も、通常の方法でよく、選択培地(例、不死化細胞がヒポキサンチンホスホリボシル転移酵素を含有しない場合にはHAT(ヒポキサンチン/アミノプテリン/チミジン))で実施することができる。 Desired selection of hybrids also may in the usual way, be carried out in a selective medium (e.g., when the immortalized cells do not contain hypoxanthine phosphoribosyl transferase is HAT (hypoxanthine / aminopterin / thymidine)) it can. 得られるセルラインは安定で、抗体を高収率で産生する。 Cell lines obtained are stable, the production of antibody in a high yield. これらはクローン化することもでき、また要すれば再選択することもできる。 It can also be cloned can also be re-selected, if desired. 従って、本発明は安定なハイブリドーマセルラインの製造法に関し、該方法は異種間ハイブリドーマ細胞である親を好ましくは薬剤耐性にし、これを異種間ハイブリドーマの非形質変換パートナーと遺伝学的に適合する物質産生細胞に融合させ、そして所望の雑種を選択することから成る。 Accordingly, the present invention relates to a method for the production of stable hybridomas cell lines, the method of the parent is a xenogeneic hybridoma cell preferably a drug resistance, which a non-transformed partner xenogeneic hybridoma genetically compatible substances fused to producing cells, and consists of selecting the desired hybrid. これら細胞を使用する抗体製造は、適当な培地(例、希釈牛胎児血清を含むもの)でインビトロでまたは宿主(例、ヌードまたは無胸線のマウスまたはラット)への注入および腹水液の収穫によってインビボで、通常の方法によって実施することができる。 Antibodies produced using these cells, appropriate medium by harvesting injection and ascites fluid of the in vitro or in a host in (e.g., including those diluted fetal bovine serum) (e.g., a mouse or rat nude or no thymus) in vivo, it can be carried out by conventional methods. 方法の選択により、一つまたはそれ以上の精製工程が必要となり得る。 The choice of method, one or more purification steps may be required. 本発明はまた、かかる細胞系を使用する抗体の製造を可能にする。 The present invention also allows the production of antibodies using such cell lines. 所望の性質を有する単純ハイブリドーマセルラインが経済的理由により好ましいことは明らかであるが、所望または必要であれば、かかるセルラインを更に融合することも可能である。 Although simple hybridoma cell line with the desired properties it is clear that preferred for economic reasons, if desired or necessary, can be further fused such cells lines. 本発明による典型的な抗体産生ハイブリドーマは、 A typical antibody-producing hybridomas in accordance with the present invention,
親としてのヒトリンパ球と融合したマウス骨髄種を抗体産生者としての前感作ヒトリンパ球と融合させて形成されるものである。 It is that formed by a mouse myeloma fused to human lymphocytes as a parent are fused with presensitized human lymphocytes as antibody living. 適当な場合には、骨髄種細胞自体が Where appropriate, the myeloma cells themselves
(例えばマウス/マウス雑種自体であるSP−2マウス細胞系のように)雑種であり得る。 (For example, in the SP-2 murine cell line is a mouse / mouse hybrid itself) may be hybrids.

【0006】通常の技術と従前の研究を述べている文献の例は以下の通りである。 [0006] Examples of the literature that describes the conventional techniques and previous studies are as follows. (1) Kohler,G.およびMilstein,C.Nature, 25 (1) Kohler, G. And Milstein, C.Nature, 25
,495−497(1975) (2) Nadler,L.M.等Cancer Research, 40 ,31 6, 495-497 (1975) (2 ) Nadler, L.M. , Etc. Cancer Research, 40, 31
47−3154(1980) (3) Cosimi,A.B.等N,Eng1.J.Med., 305 ,3 47-3154 (1980) (3) Cosimi , A.B. , Etc. N, Eng1.J.Med., 305, 3
05−314(1981) (4) Zurawski,V.R.等Science, 199 ,1439− 05-314 (1981) (4) Zurawski , V.R. Etc. Science, 199, 1439-
1441(1978) (5) Koskimies,S.,Scand.J.Immunol., 11 ,73 1441 (1978) (5) Koskimies , S., Scand.J.Immunol., 11, 73
−77(1980) (6) Steinitz,M.等Nature, 287 ,443−445 -77 (1980) (6) Steinitz , M. , Etc. Nature, 287, 443-445
(1980) (7) Olsson,L.およびKaplan,H.S.,Proc.Natl. (1980) (7) Olsson, L., And Kaplan, H.S., Proc.Natl.
Acad.Sci.U,S.A., 77 ,5429−5431(19 Acad.Sci.U, S.A., 77, 5429-5431 (19
80) (8) Croce,C.M.等Nature, 288 ,488−489 80) (8) Croce, C.M . Such as Nature, 288, 488-489
(1980) (9) Nowinski,R.等Science. 210 ,537−53 (1980) (9) Nowinski, R. , Etc. Science. 210, 537-53
9(1980) (10) Croce,C.M.等Proc.Natl.Acad.Sci.U.S. 9 (1980) (10) Croce, C.M., And the like Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.
A., 76 ,3416−3419(1979) (11) Galf A., 76, 3416-3419 (1979) (11) Galf
re,G.等Nature 266 ,550(1977) (12) Miller,R.A.等N.Engl.J.Med. 306 ,51 re, G., etc. Nature 266, 550 (1977) ( 12) Miller, R.A. , etc. N.Engl.J.Med. 306, 51
7(1982) (13) Sikora K.,等Lancet,i 11(1982)および例えば米国特許第4172124号、EP出願公開第0043718号と0044722号。 7 (1982) (13) Sikora K., etc Lancet, i 11 (1982) and for example U.S. Pat. No. 4,172,124, EP Publication No. 0,043,718 and No. 0,044,722. また、Mclntyreによってモノクローン抗体に関する書籍が最近発行されている。 In addition, books on monoclonal antibodies have been issued recently by Mclntyre. 異種間融合の親(これは予定物質産生能力を喪失している)を使用することによって、本発明は、安定、急速な成長、クローン容易であり、所望物質(例、ヒト抗体)の高産生率を有するハイブリドーマの取得を可能にする。 By using the parent xenogeneic fusion (which have lost scheduled substance producing capability), the present invention is stable, rapid growth, a clone easy, high production of the desired substance (e.g., human antibodies) allowing the acquisition of hybridomas having rate. 本発明に従って製造されるヒト抗体は、通常の如く抗体に使用できる。 Human antibodies produced in accordance with the present invention can be used for normal as antibodies. かかる使用分野の例は以下の通りである。 Examples of such fields of application are as follows. 感染症: ウイルス(サイトロメガロウイルス、帯状痘疹ウイルス、単純ヘルプスウイルス、肝炎AおよびBウイルス、風疹ウイルス等)、バクテリア(抗毒素、抗細胞壁)、 真菌(カンジダ)悪性疾患: 毒素の抱合ありおよびなしにかかわらずあらゆる種類の悪性腫瘍に対する抗体 中毒: 抗毒物抗体(解毒薬、ジギタリス、オピエート剤、三環性抗うつ剤、バルビツレート剤等) 抗イデイオタイプ: 抗・抗膵臓β細胞、抗・抗アセチルコリンレセプター、抗リウマチ様因子 血液型抗原: 抗Rh 移植: 拒絶を抑制する抗T細胞、移植片の刺激能力を減少する強化抗体 アレルギー: アレルゲンに対するIgG抗体、感受性減退化の代換物 ホルモン: 避妊薬として使用する絨毛性性腺刺激ホルモン抗体 ハイブリドーマ細胞自体は、免疫グロブリン遺伝子のクローニ Infection: virus (site b cytomegalovirus, belt-like vaccinia virus, a simple help scan virus, hepatitis A and B virus, rubella virus, etc.), bacteria (antitoxin, anti-cell wall), fungi (Candida) malignant disease: conjugation of the toxin Yes and antibodies addiction to all types of malignancies or without: anti poison antibody (antidote, digitalis, opiate agents, tricyclic antidepressants, barbiturates, etc.) anti-idiotype: anti-anti-pancreatic β cells, anti-anti acetylcholine receptor, anti-rheumatoid factor blood group antigens: anti-Rh transplantation: suppressing rejection anti-T cell, enhance antibody allergy reducing the stimulatory capacity of the graft: IgG to allergens antibodies, sensitivity decline of cash Kanbutsu hormone: contraceptive chorionic gonadotropin antibody hybridoma cells themselves to be used as a medicine, cloning of the immunoglobulin gene グを試みる場合にはmRNA源としても使用できる。 It can also be used as a source of mRNA in the case of attempting to grayed.

【0007】本発明の特定の実施態様においては、元来P3−X63−Ag8系と羊の赤血球細胞に対する抗体を産生するマウス脾臓細胞のハイブリドーマ自体であったSP−2細胞系であって抗体産生能力を喪失したものが使用される(C.F.M.Shulmann等,Nature, 276 , [0007] In certain embodiments of the present invention, there is provided a hybridoma itself and which was SP-2 cell line antibody production mouse spleen cells producing antibodies against P3-X63-Ag8-based and sheep red blood cells originally those that have lost the capacity is used (C.F.M.Shulmann like, Nature, 276,
269(1978))。 269 ​​(1978)). これは例えばNIGMS Human This is, for example, NIGMS Human
Genetic Mutant Cell Repository Ref.GM356 Genetic Mutant Cell Repository Ref.GM356
69Aから入手できる(US DHHS 1982 Catal Available from 69A (US DHHS 1982 Catal
og of CellLines 参照)。 Reference og of CellLines). このセルラインは、通常の技術によって薬剤耐性にされ次いで正常なヒト抹消リンパ球と融合される(C.F.G.Galfre等,Nature, 26 This cell line is fused with the by conventional techniques in drug resistance then normal human peripheral lymphocytes (C.F.G.Galfre like, Nature, 26
,550(1977)およびR.Nowinski等Science, 6, 550 (1977) and R.Nowinski like Science, 2
10 ,537(1980))。 10, 537 (1980)). 多数の雑種を得、約5週間後に急速な成長を示し且つ抗体を産生しない5クローンを選択する。 Give a number of hybrids, selecting the 5 clones which do not produce and antibodies showed rapid growth after about 5 weeks. これらの細胞を8−アザグアニン耐性に関して選択し、かかる系の3つでもって、20μg/mlの8 These cells were selected for 8-azaguanine resistance, I even three such systems, the 20 [mu] g / ml 8
−アザグアニンに耐性の変異体を得ることが可能である。 - it is possible to obtain a mutant resistant to azaguanine. これらの細胞は同時にヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン(HAT)培地に感受性であり、これらがヒポキサンチンホスホリボシル転移酵素を産生する能力を喪失していることを示す。 These cells simultaneously hypoxanthine - aminopterin - sensitive to thymidine (HAT) medium, indicating that they have lost the ability to produce hypoxanthine phosphoribosyl transferase. これらのセルライン(SP These cell line (SP
AZ−4)の一つを、次いで2×10 7 SPAZ−4細胞と10 8扁桃腺細胞を使用して、ヒト扁桃腺リンパ球とインビトロで融合させる。 One of AZ-4), then used 2 × 10 7 SPAZ-4 cells and 10 8 tonsil cells are fused with human tonsil lymphocytes in vitro. 融合は標準法に従って実施する。 Fusion is carried out according to standard methods. 比較のために、SP/2セルラインも融合させる。 For comparison, SP / 2 cells lines also fused.
得られる細胞集団を、必要な雑種を回収するためにHA The resulting cell population, HA to recover the required hybrid
T培地で選択する。 It is selected in the T medium. 非融合対照培養物の全細胞が死滅すると直ちに、HAT培地を正常な非選択性生育培地と置きかえる。 As soon as all cells of the non-fusion control cultures are killed, replacing the HAT medium and normal non-selective growth medium. 生育2週間後に抗体産生について最初の試験を行い、各融合からの47培養体の全部がヒト抗体を産生したことが判明する。 Growth after 2 weeks for antibody production make the first test, all of the 47 cultures from each fusion is found that produced human antibodies. 更に4週間後に再試験すると、 When retested after a further 4 weeks,
SP/2ハイブリドーマの55%に対してSPAZ−4 SP / 2 SPAZ-4 against 55% of hybridomas
ハイブリドーマの83%が未だに抗体を産生していることが認められる。 It is observed that 83% of the hybridomas are still producing antibodies. SP/2ラインのわずか3%に対してSPAZ−4の28%において、高い産生率が認められる。 In 28% of SPAZ-4 relative to only 3% of the SP / 2 line, it is observed a high production rate. 抗体産生喪失の主たるファクターがL鎖ゲノムの喪失であるという事実にかんがみ、軽鎖産生の特異的試験を行う。 In view of the fact that the main factor of antibody production loss is the loss of L chain genomic performs specific tests of the light chain production. SPAZ−4ラインの67%がカッパー鎖、その88%がラムダー鎖を生産することが認められる。 67% kappa chain of SPAZ-4 line, it is recognized that the 88% to produce a lambda chain. S
P/2の対応する値はそれぞれ39%と61%である The corresponding value of P / 2 is 39% and 61%, respectively
(勿論、これらのパーセント値は特定の試験と使用免疫グロブリン(1g)についてのみ比較可能である)。 (Of course, it is comparable only for these percentage values ​​a particular test and use immunoglobulins (1 g)). 結果は第1表に示す。 The results are shown in Table 1. すべての場合において、SPAZ−4がSP/2より優れており、特に実用的見地からして最も重要である強力な生産性に関して優れている。 In all cases, SPAZ-4 are superior to SP / 2, it is superior with respect to strong productivity is most important especially with the practical standpoint. これらのすべての実験を、安定なクローンに対する圧力を最大にするために、非クローン細胞について行う(安定なクローンは多くの遺伝物質を有し、彼らに不必要な染色体の追放に成功した細胞よりも常に成長が悪い)。 All of these experiments, in order to maximize the pressure on the stable clones, carried out on non-clonal cell (stable clones have many genetic material from them to cells which successfully expelled unnecessary chromosome also always bad growth). しかし、 But,
細胞をクローンするために実験を行った。 The cells were carried out experiments to clone. 現在までに得られた結果では、安定で生産性のSP/2雑種はただ1 The results obtained to date, stable productivity of SP / 2 hybrid just 1
つも得られなかったことを示す(即ち、すべての生育細胞が抗体を産生するセルラインはない)が得られることを示す。 One also obtained did not show that (i.e., all the growth cell is not a cell line that produces an antibody) indicate that can be obtained. 他方、SPAZ−4雑種ではかかるクローンを誘導することが可能である。 On the other hand, it is possible to induce such a clone is SPAZ-4 hybrids. 本発明は、不安定性問題の解決により、従来の公知方法よりも実質的に良好な結果を得ることを可能にする。 The present invention is, by solving the instability problems, makes it possible to obtain a substantially better results than conventional known methods. 古典的なマウス−マウスハイブリドーマが不安定であり、そしてわずらわしいサブクローニングが常に必要であるとしても、それが実用に供し得ることは一言の価値がある。 Classical mouse - is unstable mouse hybridoma, and even cumbersome subcloning is always necessary, is worth a word that it can be put to practical use. SPAZ−4ハイブリドーマの示す不安定度はマウス−マウスハイブリドーマのそれよりも低いので、後者はより一層実用的でさえある。 Instability indicated by SPAZ-4 hybridomas mouse - is lower than that of the murine hybridoma, the latter is more even and more practical.

【0008】次に実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。 [0008] Next, examples illustrate the present invention. 実施例1: SPAZ−4系の製造 Ficoll−Isopaque遠心分離によって、健康な提供者のヘパリン化血液から末梢血液リンパ球(PBLs)を単離する。 Example 1: The preparation Ficoll-Isopaque centrifugation SPAZ-4 system, isolated peripheral blood lymphocytes (PBLs) from healthy donor heparinized blood. 洗浄後、pH8.0に調節したDulbeccosH21培地50ml中の5×10 7 SP/2細胞と10 8 PBLsを混合する。 After washing, mixing 5 × 10 7 SP / 2 cells and 10 8 PBLs in DulbeccosH21 medium 50ml adjusted to pH 8.0. 細胞を600×gで5分間ペレット化し、その後上澄液を注意深く除去する。 Cells were 5 minutes pelleted at 600 × g, carefully removed then supernatant. 細胞を37℃に保ちながら、50%PEG4000/H21の1mlを1分で徐々に加える。 While keeping the cells to 37 ° C., slowly added 1ml of 50% PEG 4000 / H21 in 1 minute. 更に10mlのH21を2分で加える。 Further addition of H21 in 10ml 2 minutes.
細胞を遠心分離によって集め(ペレット化)、55mlのHAT培地に懸濁し(HAT培地: 20%胎児牛血清1 Cells were harvested by centrifugation (pelleting), were suspended in HAT medium 55 ml (HAT medium: 20% fetal calf serum 1
0%NCTC109、1%非必須アミノ酸、0.5%ピルビン酸塩、0.2U/mlインスリン、1mMオキサル酢酸、10 -4ヒポキサンチン、4×10 -7 Mアミノプテリンおよび1.6×10 -3 Mチミジンを含むDulbeccos 0% NCTC109,1% non-essential amino acids, 0.5% pyruvate, 0.2 U / ml insulin, 1mM oxalacetate, 10-4 hypoxanthine, 4 × 10 -7 M aminopterin and 1.6 × 10 - Dulbeccos, including 3 M thymidine
H21)、平底組織培養マイクロプレート中の0.1ml H21), 0.1ml of flat-bottomed tissue culture microplates
培養物528個に播種する。 Seeded into culture 528. 2週間毎3〜5日で新しいHAT培地を培養物に与え、その後培地をHT培地(1 A new HAT medium given to the culture at 2 weeks every 3 to 5 days, then the medium HT medium (1
0%FCS、10 -4ヒポキサンチンおよび1.6×10 0% FCS, 10 -4 hypoxanthine and 1.6 × 10
-3チミジンを含むDulbeccos H21)に変える。 Changing the Dulbeccos H21) including -3 thymidine. 15日後ヒト抗体試験のために試料を取る。 Take a sample for human antibody test after 15 days. 良好な成長を示し抗体産生を示さない5個の培養物を選択する。 Showed good growth selects five cultures show no antibody production. 次いでこれらを8−アザグアニン耐性サブラインの製造に選択する。 Then select these for the preparation of 8-azaguanine-resistant sublines. 10%FCSおよび20μg/ml8−アザグアニンを含むDulbeccos H21に5個のセルラインを2×1 10% FCS and 20μg / ml8- azaguanine 2 × a Dulbeccos H21 to five cells lines including 1
5細胞/mlで播種する。 0 5 seeded at cells / ml. これらの培養物の3個から、 From three of these cultures,
二、三週間後に生育成長する細胞を回収することができる。 Second, it is possible to recover the cells that grow growth after three weeks. これらの1個はHATに感性のSPAZ−4であり、更に試験するのに使用する。 One of these is the SPAZ-4 sensibility in HAT, used to further testing.

【0009】実施例2: 扁桃腺リンパ球との融合 小児から扁桃腺を結合組織部で切り取り、微細金属網を通過させて、単一細胞プレパラートを得る。 [0009] Example 2: the tonsils from the fusion children with tonsillar lymphocytes Cut on connective tissue portion, passed through a fine metal mesh, to obtain a single cell preparation. 赤血球の数を減ずるために、全細胞をFicoll−Isopaqueで分画する。 In order to reduce the number of red blood cells, fractionating total cell with Ficoll-Isopaque. 得られる細胞集団の10 8の細胞を、実施例1で述べたのと同じ方法でもって2×10 7のSPAZ−4またはSP/2細胞に融合させる。 10 8 cells of the resulting cell populations are fused to SPAZ-4 or SP / 2 cells 2 × 10 7 with in the same manner as described in Example 1. その後細胞をHAT培地の培養物0.5mlの47個に播種し、この時にシクロスポリンA0.5μg/mlを補給する。 The cells were then seeded in 47 cultures 0.5ml HAT medium, to replenish the cyclosporin A0.5μg / ml at this time. 1日後にシクロスポリンAを含まないHAT培地0.5mlを加える。 Add HAT medium 0.5ml that does not include cyclosporine A after one day. 3
日目にすでに培地の50%がHT培地に変化する。 50% of the medium already day eyes is changed to HT medium. この後毎3〜5日の経過でもって細胞をHT培地に維持する。 With in the course of every 3-5 days thereafter to maintain the cells in HT medium. 免疫グロブリン製造試験 従来のELISA(固相酵素免疫検定)システムを使用する。 Using the immunoglobulin production test conventional ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) systems. pH9.6の重炭酸塩緩衝剤中1:400の希釈でウサギ抗ヒト免疫グロブリンをNunc EIAプレートに捕捉させる。 During bicarbonate buffer of pH 9.6 1: Rabbit anti-human immunoglobulin is captured on Nunc EIA plates at a dilution of 400. 該プレートを洗浄後、培養上清を37℃で3 After washing the plates, the culture supernatant at 37 ° C. 3
0分インキュベートする。 0 minutes and incubated. 再度洗浄後、1:400の希釈でペルオキシダーゼ抱合ウサギ抗ヒトIgG、IgM、 After washing again, 1: 400 peroxidase-conjugated rabbit anti-human IgG at a dilution of, IgM,
IgA試剤(Miles−Yeda)でインキュベーション物を処理する。 Processing the incubations with IgA reagent (Miles-Yeda). 洗浄後酵素反応物を1,2−フェニレンジアミン二塩酸塩とH 22で発色させる。 The color is developed washing after enzymatic reaction with 1,2-phenylenediamine dihydrochloride and H 2 O 2. ヤギ抗ヒトラムダーまたはヤギ抗ヒトカッパー試剤(Tago)を1:3000の希釈でウサギ抗ヒトIgG、IgM、IgAの代わりに使用する以外は同じ方法で、軽鎖産生試験を行う。 Goat anti Hitoramuda or goat anti-human kappa reagent a (Tago) 1: 3000 rabbit anti-human IgG at a dilution of, IgM, but using in place of IgA in the same way, performing a light chain production test. 結果をTitertek Multiscan Elisa 光度計で評価し、第1表の「4」と「7」の値をこの光度計からの低い読みと高い読みとしてそれぞれ表示する。 The results were evaluated in Titertek Multiscan Elisa photometer respectively display the value of "4" and "7" of the first table as a low reading and a high reading from the photometer.

【0010】実施例3: インフルエンザAおよびB型に対するモノクローン抗体の製造(インビボ免疫後) 使用したインフルエンザワクチンは、A/バンコック、 [0010] Example 3: Production of monoclonal antibodies against influenza type A and B (after in vivo immunization) influenza vaccine used was, A / Bangkok,
A/ブラジルおよびB/シンガポールからの赤血球凝集素とノイラミニダーゼを含む商品名SANDOVACである。 It is a trade name SANDOVAC including hemagglutinin and neuraminidase from the A / Brazil and B / Singapore. 3人の健康な志願者を免疫化し、3、7、10、 3 healthy volunteers immunized, 3, 7, 10,
14および17日に採血する。 Bled to 14 and 17 days. 各回50〜60mlの血液をひじ静脈からヘパリン含有注射器へ抜く。 Pull out each time 50~60ml blood from cubital vein into heparin-containing syringes. リンパ球をFicoll−Paque(Pharmacia)上の遠心分離によって単離し、使用前に塩水で2回洗う。 Lymphocytes were isolated by centrifugation on Ficoll-Paque (Pharmacia), washed twice with brine prior to use. 融合の親は a) SPAZ−4(実施例1参照) b) SP/2(上記参照) c) WISTAR INSTITUTEで8−アザグアニン耐性にしたGM1500ヒトリンパ芽球様細胞(ヒトIgG2カッパーを産生する) である。 The parent fusion a) SPAZ-4 (see Example 1) b) SP / 2 (see above) c) Wistar was 8-azaguanine resistant INSTITUTE GM1500 human lymphoblastoid cells (producing human IgG2 kappa) is there. SPAZ−4とSP/2は全く同じに融合する。 SPAZ-4 and SP / 2 is fused in exactly the same. 骨髄腫(10 7細胞)とヒトリンパ球(約3×10 7細胞)を、pH8.0でDMEM無血清培地の存在下試験管で混合する。 Myeloma (10 7 cells) and human lymphocytes (approximately 3 × 10 7 cells) are mixed in the presence tubes DMEM serum-free medium at pH 8.0. 細胞を600×gで5分遠心分離にかける。 Cells subjected to 5 minutes centrifugation at 600 × g. 得られるペレットを50%PEG4000で1分処理し、その後PEGを培地で徐々に希釈する。 The resulting pellet was treated 1 minute by 50% PEG 4000, and then gradually diluted PEG in medium. 1回洗浄後、20%胎児牛血清を含むDMEM−HAT培地の1 After washing once, 1 DMEM-HAT medium containing 20% ​​fetal bovine serum
00μl培養物176個に細胞を播種する。 Seeding cells in 00μl culture 176. 細胞を湿気のある10%CO 2 −大気で37℃で培養する。 10% of a cell moisture CO 2 - culturing at 37 ° C. in air. GM GM
1500細胞(10 7細胞)をpH8.0の無血清DMEM 1500 serum-free DMEM of cells (10 7 cells) pH8.0
中でヒトリンパ球(約3×10 7細胞)と混合し、600 Was mixed with human lymphocytes (approximately 3 × 10 7 cells) in the middle, 600
×gで5分遠心分離する。 × 5 min centrifugation at g. ペレットを50%PEG60 The pellet 50% PEG60
00で5分処理し、その間に細胞を600×gで遠心分離する。 00 for 5 minutes, centrifuged the cells at 600 × g therebetween. この後PEGを培地で徐々に希釈する。 Gradually dilute the PEG in the medium after this. 1回洗浄後、20%胎児牛血清を含むRPMI 1640−H After washing once, RPMI 1640-H containing 20% ​​fetal bovine serum
AT培地の100μl培養物176個に細胞を播種する。 Seeding cells in 100μl culture 176 pieces of AT medium. 細胞を湿気のある5%CO 2 −大気で37℃で培養する。 5% of cells moisture CO 2 - culturing at 37 ° C. in air. 6160個の培養物(GM1500により264 6160 pieces of culture (GM1500 by 264
0体、SPAZ−4により2464体、SP/2により1056体)を行ない全体で35個の融合(GM1500 0 body, 2464 body by SPAZ-4, 35 pieces of fused across performs 1056 body) by SP / 2 (GM1500
に15体、SPAZ−4に14体、SP/2に6体)を得る。 Obtaining 15 body, 14 body to SPAZ-4, the SP / 2 the six bodies) to. 一般に毎3〜5日間で、細胞増殖が必要とするときはいつでも、培地を培養物に変える。 Generally in every 3-5 days, whenever the cell proliferation requires, changing the medium to the culture. 上澄液に抗インフルエンザ抗体が存在することをELISA法で検定する。 Assayed by ELISA that the anti-influenza antibody is present in the supernatant. 関連インフルエンザ抗原をマイクロプレートウエル Wells to the relevant influenza antigen
(Nunc)に捕捉し、上澄液を加え、抗原と相互作用させる。 Were captured (Nunc), it was added the supernatant, to interact with the antigen. 洗浄後ぺルオキシダーゼ抱合ウサギ抗ヒトIgG、 After washing peroxidase conjugated rabbit anti-human IgG,
IgA、IgM(Miles)をウエルに加える。 Add IgA, IgM and (Miles) to the wells. インキュベーション後非結合ペルオキシダーゼ抱合体を洗浄除去し、 Washed to remove unbound peroxidase conjugate after incubation,
酵素発色物質をウエルに加える。 The enzyme is added coloring substance to the wells. 反応を視覚で評価し、 The reaction was evaluated by visually,
Titertekマイクロプレート光度計で証明する。 Demonstrated in Titertek microplate photometer. 陽性結果を示す培養物を、マウス胸線細胞供給細胞と共に10 Cultures showing positive results, with mouse thymocytes supply cell 10
0μlのDMEM+20%胎児牛血清中に(SPAZ− DMEM + 20% fetal bovine serum in 0μl (SPAZ-
4およびSP/2由来細胞)、またはMRC−5供給細胞のRPMI 1640+20%胎児牛血清中にGM 4 and SP / 2-derived cells), or MRC-5 RPMI supply cell 1640 + 20% fetal bovine serum in GM
1500由来細胞)、1細胞/培養物で細胞を播種する88個の新しいウエルに限界希釈条件でクローン化する。 1500-derived cells), cloned by limiting dilution conditions to 88 new wells for seeding cells at 1 cell / culture. 生産性細胞は大スケールで生育させ、液体N 2中に凍結する。 Producing cells are grown in large scale, frozen in liquid N 2. 合計86個の培養物をクローン化した(GM A total of 86 pieces of the cultures were cloned (GM
1500から58体、SPAZ−4から26体、SP 1500 from 58 bodies, 26 bodies from the SPAZ-4, SP
/2から2体)。 / 2 from the two-body). 細胞をクローン化すべきであるか否かについては、その決定に全く自由な基準を適用するがこれはクローン化後に真に陽性の細胞の収率が低い結果を招き得る。 Cells for whether it is to be cloned is applied entirely free reference to the decision which truly cells yield positive after cloning can lead to low results. . 例えばGM 1500は高産生細胞を製造しないのでこの決定が必要となる。 For example GM 1500 This decision is necessary because it does not produce the high producing cells. SPAZ−4細胞からは4個の陽性クローンが確認され、SP/2からは1 From the SPAZ-4 cell is confirmed four positive clones, 1 from the SP / 2
個が確認されるが、しかし後者は雑種ではなく、自然に生起したEBウイルス形質変換細胞であった。 Pieces but is confirmed, but the latter is not a hybrid, was EB virus transformed cells occur naturally. 産生細胞はGM 1500からは誘導されない。 Producing cells are not derived from the GM 1500. 融合の結果を下記表に要約して示す。 The results of the fusion are summarized in the table below.

【0011】 [0011]

【表1】 [Table 1]

【0012】5個の陽性セルラインを数回再クローンし、大スケールで成長させる。 [0012] The five-positive cell line was re-cloned several times, it is grown on a large scale. これはEBV系の消滅をもたらす(かかる細胞コロニーが低密度クローニングを生存させないことはよく知られている)。 This leads to disappearance of EBV-based (such cell colonies is well known that not survive the low density cloning). 4個の陽性S 4 positive S
PAZ−4ハイブリドーマセルラインをC15、C2 The PAZ-4 hybridoma cell line C15, C2
8、C29およびC75として確認した。 8, was confirmed as the C29 and C75.

【0013】実施例4: 抗インフルエンザハイブリドーマの製造(インビトロ免疫後) ヒト脾臓細胞をFalcon2051チューブ中の2mlに1 [0013] Example 4: 1 to 2ml of anti-influenza production of hybridomas (after in vitro immunization) human spleen cells Falcon2051 the tube
6 /mlで播種し、全体で34℃10 6の細胞を使用する。 0 seeded at 6 / ml, using a total of 34 ° C. 10 6 cells. 最適量の庶糖濃度勾配精製A/バンコックウイルスを加え、培養物を5%ヒト熱不活化血漿を含むRPMI The optimal amount of sucrose gradient purified A / Bangkok virus was added, RPMI culture containing 5% human heat-inactivated plasma
1640培地で空気中5%CO 2の雰囲気下37℃で1 1 in an atmosphere under 37 ° C. in 5% CO 2 in air at 1640
01時間維持する。 To maintain 01 hours. 回収した9×10 6細胞を実施例3 Collected 9 × 10 6 cells EXAMPLE 3
に述べたのと同様にして同数のSPAZ−4細胞に融合する。 In a similar manner as described fused to an equal number of SPAZ-4 cells. 細胞を176個の培養物に播種し、20%胎児牛血清、HATおよび1μg/mlシクロスポリンAを含むDulbeccosのMEMで成長させる。 Cells were seeded in 176 cultures, 20% fetal bovine serum, grown in MEM in Dulbeccos containing HAT and 1 [mu] g / ml cyclosporin A. 2日後HAT培地をHT培地で次第に置換し、その後4〜5日の間隔で変える。 HAT medium was gradually replaced with HT medium after two days, changing at intervals thereafter 4-5 days. 融合後12日と19日目に培養物を抗インフルエンザ抗体についてスクリーニングし、陽性培養物をクローン化する。 The cultures in 12 days and 19 days after the fusion and screened for anti-influenza antibody, clone the positive culture. 陽性クローン(B 2として確認)を得、これは大スケールで成長させることができ、また薬剤用の純粋抗体をインビトロで製造するのに使用することができる。 Give positive clone (identified as B 2), which can be grown on a large scale and can be used to produce pure antibodies for drug in vitro.

【0014】実施例5: ヒト抗インフルエンザモノクローン抗体の特性確認 a) 抗体/C15 この抗体はIgG1クラスのものであり、カッパー軽鎖を有する。 [0014] Example 5: Human anti-influenza characterization a of monoclonal antibody) antibody / C15 This antibody is of the IgG1 class, having a kappa light chain. 抗体は試験したすべてのインフルエンザA型ウイルス(H1N1、H2N2、H3N2)に反応し、それは恐らくウイルスの核タンパクに向けられている。 Antibody response to all of the influenza type A viruses tested (H1N1, H2N2, H3N2), it is probably directed to the nuclear protein of the virus. 抗体はインビトロで中和活性を有せず、またインビボで保護効果を有していない。 Antibodies do not have a neutralizing activity in vitro, also it has no protective effect in vivo. b) 抗体/C28 この抗体はIgG1クラスのものであり、ラムダー軽鎖を有している。 b) Antibody / C28 This antibody is of the IgG1 class, have a lambda light chain. 抗体はH3N2型のインフルエンザウイルスに反応するのみであり、それは恐らくウイルスの赤血球凝集素に向けられている。 Antibody is only reactive to H3N2 type of influenza virus, which is probably directed to hemagglutinin of the virus. 抗体はインビトロで強い中和効果を有し、またインビボで劇的な保護活性を有している。 Antibodies have strong neutralizing effect in vitro, also has a dramatic protective activity in vivo. それは試験したすべてのH3N2ウイスル(即ち、1968、1969、1973、1974、197 All of H3N2 Uisuru it tested (ie, 1968,1969,1973,1974,197
5、1977、1979および1980からのウイルス)を中和することができる。 It can neutralize the virus) from 5,1977,1979 and 1980. MDCK細胞上の197 On the MDCK cells 197
3A/ポートチャーマーズで試験すると、純粋抗体1. When tested in a 3A / Port Chalmers, pure antibody 1.
5mg/mlを含む抗体製品は、中和価12800を有することが認められる。 Antibody product containing 5 mg / ml is found to have neutralizing titers 12800. 同一実験において、標準ヒト免疫グロブリン製剤(Sandoglobulin)は濃度60mg/m In the same experiment, the standard human immunoglobulin preparation (Sandoglobulin) concentration 60 mg / m
lで中和価50を有することが認められる。 It is found to have a neutralization number 50 l. このことは、モノクローン抗体C28がタンパク質当量レベルで正常な免疫グロブリンよりも10240倍高い能力を有していることを意味している。 This means that the monoclonal antibody C28 has a 10240-fold higher ability than normal immune globulin protein equivalent level. これに関連して、抗インフルエンザ抗体が正常な免疫グロブリン製剤の越的成分一つであるということを指摘したい。 In this connection, I like to point out that the anti-influenza antibody is one Yue components of normal immune globulin preparations. このことは、C2 This is, C2
8と同じ中和能力を有し、例えばサイトメガロウウイルスまたは帯状痘疹ウイルス(この場合正常な免疫グロブリン製剤の抗体レベルはかなり低い)に対する抗体は、 Have the same neutralizing ability as 8, for example, site antibodies to mega wax virus or band vaccinia virus (in this case an antibody level of normal immunoglobulin preparations is quite low) is
相対的能力がより一層高い値に達することを意味する。 The relative ability means that more reach even higher values. c) 抗体/C29 この抗体はIgG1クラスのものであり、ラムダー軽鎖を有している。 c) Antibody / C29 This antibody is of the IgG1 class, it has a lambda light chain. 抗体はB/シンガポール型インフルエンザに反応する。 Antibody reaction to B / Singapore influenza. 他のB型ウイルスに対する試験は行わなかった。 Test against other B-type virus was performed. A型ウイルスに対しては活性を有していない。 It has no activity against type A virus. d) 抗体/C75 この抗体はIgG3クラスのものであり、カッパー軽鎖を有している。 d) the antibody / C75 This antibody is of the IgG3 class, and a kappa light chain. これはH3N2型ウイルスに反応するのみであり、恐らくはウイルスの赤血球凝集素に向けられている。 This is only responsive to H3N2 virus type, it is possibly directed to hemagglutinin of the virus. これはインビトロで中和活性を有せず、インビボで保護効果を有しない。 It does not have the neutralizing activity in vitro, no protective effect in vivo. e) 抗体/B2 この抗体はIgG1クラスのものであり、カッパー軽鎖を有している。 e) an antibody / B2 This antibody is of the IgG1 class, have a kappa light chain. これはH3N2型ウイルスに反応するのみであり、恐らくはウイルスの赤血球凝集素に向けられている。 This is only responsive to H3N2 virus type, it is possibly directed to hemagglutinin of the virus. 抗体はインビトロで中和効果を有せず、インビボ保護試験は行わなかった。 Antibodies did not have a neutralizing effect in vitro, in vivo protection studies were not performed.

【0015】 [0015]

【表2】 [Table 2]

【0016】本発明により実施可能となるものを列挙すると次の通りである。 [0016] is as the follows enumerating what becomes feasible by the present invention. 1. 1. 不死化細胞が異種間ハイブリドーマ細胞であり、予定物質産生細胞が異種間ハイブリドーマの非形質転換パートナーと遺伝学的に適合することを特徴とする、上記予定物質産生細胞に融合した不死化細胞を含むハイブリドーマセルライン。 Immortalized cells are xenogeneic hybridoma cells will substance producing cells, characterized in that genetically compatible with the non-transformed partner xenogeneic hybridoma includes immortalized cells fused to the scheduled substance producing cell hybridoma cell line. 2. 2. 物質産生細胞が異種間ハイブリドーマ細胞母体の非形質転換パートナーと同一種のものである上記第1項記載のハイブリドーマセルライン。 Non-transformed partner hybridoma cell line of the first term described is of the same type of material producing cells xenogeneic hybridoma cell parent. 3. 3. 物質産生細胞パートナーと、異種間ハイブリドーマ細胞母体の非形質転換パートナーがヒト起源のである上記第2項記載のハイブリドーマセルライン。 Substance-producing cells partners, xenogeneic hybridoma cell parent untransformed partner hybridoma cell line of the second term, wherein it is of human origin. 4. 4. 産生物質が抗体である上記第1〜3項のいずれか1 Either produced substance is the first to third term is an antibody 1
項記載のハイブリドーマセルライン。 Hybridoma cell line of claim wherein. 5. 5. 物質産生細胞が予定物質を産生するようにインビトロまたはインビボで前感作されている上記第4項記載のハイブリドーマセルライン。 Hybridoma cell line of the section 4 above, wherein the substance producing cell is presensitized in vitro or in vivo to produce expected substance. 6. 6. 物質産生細胞がリンパ球である上記第1〜5項のいずれか1項記載のハイブリドーマセルライン。 Substance-producing cells are hybridoma cell line according to any one of the first to fifth term is a lymphocyte. 7. 7. リンパ球がヒト起源のものである上記第6項記載のハイブリドーマセルライン。 Hybridoma cell lines in which the sixth Claims ones lymphocytes of human origin. 8. 8. リンパ球が抗体を産生するようにインビボまたはインビトロであらかじめ感作されている上記第6または第7項記載のハイブリドーマセルライン。 The sixth or hybridoma cell lines of paragraph 7, wherein the lymphocytes are previously sensitized in vivo or in vitro to produce antibodies. 9. 9. 異種間ハイブリドーマ細胞の骨髄腫パートナーが免疫グロブリンを産生しないネズミ骨髄腫である上記第1 The myeloma partner xenogeneic hybridoma cell is a murine myeloma which does not produce immunoglobulin first
〜8項のいずれか1項記載のハイブリドーマセルライン。 Hybridoma cell line according to any one of 8 Section. 10. Ten. ネズミ骨髄腫がマウス骨髄腫である上記第9項記載のハイブリドーマセルライン。 Hybridoma cell line of the ninth Claims murine myeloma are murine myeloma. 11. 11. マウス骨髄腫がSP−2細胞系によってもたらされる上記第10項記載のハイブリドーマセルライン。 Hybridoma cell lines of the paragraph 10, wherein the mouse myeloma is provided by SP-2 cell line. 12. 12. 異種間ハイブリドーマ細胞母体が予定物質を産生する能力を失っているかまたは他の理由で産生することができない上記第1〜11項のいずれか1項記載のハイブリドーマセルライン。 Xenogeneic hybridoma cell parent hybridoma cell line according to any one of the first 1 to 11 wherein which can not be produced by or for other reasons have lost the ability to produce expected substance. 13. 13. マウス骨髄腫細胞と親細胞としてのヒトリンパ球の融合による異種間ハイブリドーマ細胞および物質産生細胞としてのあらかじめ感作された抗体産生ヒトリンパ球を含む上記第1〜12項のいずれかのハイブリドーマセルライン。 Either hybridoma cell line of the first 1-12 wherein containing mouse myeloma cells and between different by fusion human lymphocytes as a parent cell hybridoma cells and pre-sensitized antibody-producing human lymphocytes as a substance producing cell. 14. 14. 異種間ハイブリドーマ細胞を薬剤耐性にし、これを異種間ハイブリドーマの非形質転換パートナーと遺伝学的に適合する物質産生細胞に融合させ、そして所望の雑種を選択することを特徴とする安定なハイブリドーマセルラインの製造法。 The xenogeneic hybridoma cells in drug resistance, stable hybridomas cell lines, characterized in that it is fused to a non-transformed partner and genetically compatible substance producing cells of xenogeneic hybridomas, and selecting the desired hybrid method of production. 15. 15. 使用する融合パートナーを上記第1〜13項のいずれかに述べたものから選択する上記第14項記載の方法。 The method of the paragraph 14, wherein selecting a fusion partner to use from those described in any one of the first 1 to 13 wherein. 16. 16. 薬剤耐性を8−アザグアニンに耐性の細胞から選択することによって達成する上記第14または15項記載の方法。 The method of the first 14 or 15 Claims achieved by selecting a drug resistance from resistant cells to 8-azaguanine. 17. 17. 融合をこれを促進する物質の存在下に行う上記第1 The first carried out in the presence of substances that promote this fusion
4〜16項のいずれか1項記載の方法。 Any one method according 4 to 16 wherein. 18. 18. 促進物質がポリエチレングリコールである上記第1 It said promoting substance is polyethylene glycol first
7項記載の方法。 The method of item 7, wherein. 19. 19. 所望雑種の選択を、HAT感受性の欠如と予定物質産生能力の検定を基礎として行う上記第14〜18項のいずれか1項記載の方法。 The selection of desired hybrid method according to any one of the first 14 to 18 wherein performing the test lack scheduled substance producing ability of HAT-sensitive basis. 20. 20. 異種間ハイブリドーマ細胞である親と物質産生細胞を、これら細胞の融合促進剤と共に栄養培養培地に含むことから成る細胞融合システム。 The parent and substance producing cell is a xenogeneic hybridoma cells, cell fusion system consisting comprise a nutrient culture medium with these cells of the fusion accelerator. 21. twenty one. 細胞パートナーが上記第1〜13項のいずれかに述べられているものである上記第20項記載の細胞融合システム。 Cells partner cell fusion system according the paragraph 20 are those as stated in any one of the first 1 to 13 wherein. 22. twenty two. 融合促進剤がポリエチレングリコールである上記第20または21項記載の細胞融合システム。 Cell fusion system of the first 20 or 21 wherein wherein the fusion promoting agent is polyethylene glycol. 23. twenty three. 上記第1〜13項のいずれかのまたは上記第14〜 Any or the first 14 of the first 1 to 13 wherein
19項のいずれかに従って製造されたハイブリドーマセルラインをそのためのインビトロまたはインビボ培養培地で培養し、その後該培地から予定物質を単離することを特徴とする該物質の製造法。 Preparation of the material that the produced hybridomas cell lines were cultured in vitro or in vivo culture medium therefor, characterized in that before isolating scheduled substances from the medium according to any one of paragraphs 19. 24. twenty four. 得られる物質が抗体である上記第23項記載の方法。 The resulting material is an antibody method of the paragraph 23, wherein. 25. twenty five. インビボ培養を無胸線(ヌード)マウスまたはラット中で行う上記第23または24項記載の方法。 It said first 23 or method according 24, wherein performing vivo cultured Mumune line (nude) mice or rats. 26. 26. ハイブリドーマセルラインを製造するために細胞融合においてパートナーとして使用するものである上記第9〜13項のいずれか1項記載の異種発生性ハイブリドーマセルライン。 Xenogenic hybridomas cell lines according to any one of the first 9-13 term is intended to be used as partners in cell fusion to produce a hybridoma cell line. 27. 27. マウス/ヒト/ヒトハイブリドーマセルライン。 Mouse / human / human hybridoma cell line. 28. 28. 予定の特異性を有するヒト抗体を産生可能な安定なマウス/ヒト/ヒトハイブリドーマセルライン。 Producing human antibodies having the specificity of appointment, stable murine / human / human hybridoma cell lines. 29. 29. マウス細胞がマウス/マウスハイブリドーマ自体である上記第27または28項のハイブリドーマセルライン。 The 27 or 28 wherein the hybridoma cell line a mouse cell is a mouse / mouse hybridoma itself. 30. 30. 抗体産生能力を喪失している薬剤耐性のマウス/ヒトハイブリドーマを製造し、別のヒト染色体に好都合な環境を与え且つ抗体産生維持に高安定性を示すヒト化マウス骨髄腫細胞を構築することを特徴とする、長期間にわたってヒト抗体を産生するセルラインの製造法。 To produce a mouse / human hybridoma of drug resistance have lost antibody production ability, to build a humanized mouse myeloma cells that exhibit high stability to provide and maintain antibody production a favorable environment to another human chromosome wherein, the preparation of cell lines producing human antibodies over a long period of time. 31. 31. 通常の方法でSP−2セルラインを正常なヒトリンパ球と融合させ、抗体産生なしに急速成長を示す取得雑種からクローンを選択し、これを更に8−アザグアニン耐性に関して選択し、これを再びヒトリンパ球と融合させ、そしてHAT培地中で得られた細胞集団を選択することを特徴とする上記第30項記載の方法。 Fusing SP-2 cells lines and normal human lymphocytes in the usual way, clones were selected from the obtained hybrids without antibody production indicating a rapid growth, selected for further 8-azaguanine-resistant this, which again human lymphocytes fused with, and the method of the paragraph 30, wherein the selecting a cell population obtained in HAT medium.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl. 5識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 (C12N 5/28 C12R 1:91) (C12P 21/08 C12R 1:91) ────────────────────────────────────────────────── ─── front page continued (51) Int.Cl. 5 identification symbol Agency in Docket No. FI art display portion (C12N 5/28 C12R 1:91) (C12P 21/08 C12R 1:91)

Claims (3)

    【特許請求の範囲】 [The claims]
  1. 【請求項1】 異種間ハイブリドーマ細胞を異種間ハイブリドーマの元になった形質転換されていないパートナー細胞と遺伝学的に適合する目的抗体産生リンパ球に融合させ、そして目的とする雑種を選択することを特徴とする、安定なハイブリドーマセルラインの製造法。 1. A xenogeneic hybridoma cell is fused to a partner cell with genetically compatible target antibody-producing lymphocytes that are not transformed was the source of the xenogeneic hybridoma and selecting the hybrids of interest wherein the method for producing a stable hybridomas cell lines.
  2. 【請求項2】 異種間ハイブリドーマ細胞をリンパ球と融合させる前に薬剤耐性にする、特許請求の範囲第1項記載の方法。 Wherein to drug resistance prior to fusion with lymphocytes xenogeneic hybridoma cells, the method of the claims preceding claim.
  3. 【請求項3】 異種間ハイブリドーマ細胞である親とリンパ球を、これら細胞の融合促進剤と共に栄養培養培地中に含む細胞融合培地。 3. A parent lymphocyte is a xenogeneic hybridoma cells, cell fusion medium containing the nutrient culture medium with these cells of the fusion accelerator.
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