JPH0679552B2 - 電気的脈動によつて誘導される細胞融合の改良方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は電気的脈動によつて誘導される細胞融合の改良
法に関する。

細胞融合法は、親細胞の特性が反復されるような新規な
ハイブリツド種を実現させる。従つてこれは両親からの
利点のハイブリツドへの転移を可能にし、その反対は将
来の淘汰をする。従つて既存の細胞の利点を結びつける
新規な細胞種を探求することが、バイオテクノロジー分
野における優先的テーマである。従つて細胞ハイブリツ
ド形成が遺伝工学の形として考えることができる。

最近10年間に、細胞融合の二つの方法が開発された。両
者はウイルス（センダイウイルスの如き）または化学
（ポリエチレングリコール:PEGの如き）起源の外作用
（exogenic）剤または融合作用（fusogenic）剤を要求
している。かかる方法の作用形態は不適切に定義された
ままで、それらの経験のみが、外作用または融合作用剤
が細胞について致死効果を有するという事実により、生
存ハイブリツドにおける悪い収率をもたらすのみである
（親細胞100000について生存ハイブリツドが最良で約
１）。

更に培地からの外作用物質の続いての除去はアレアトリ
ー（aleatory）を残すこと、およびこれらの両方法の別
の欠点はかかる外作用物質の標的の定義の欠如にある。

更に最近新しい方法が提案された、即ち電気融合法であ
る。この最初の開発は、脈動培地（細胞浴培地ともい
う。）」（無機イオンが存在しない蛋白質分解酵素の存
在下における細胞のための等張培地）と称される適切な
媒体中の懸濁物の形で細胞に適用したとき共役する電気
的脈動および誘電泳動を必要とする。

殆どの場合、細胞は予め蛋白質分解酵素（ブロナーゼま
たはノイラミダーゼ型）で処理し、これによつてそれら
の抗原特性を失つている。未来の研究は、ペトリ箱に定
着させ、単分子層の形で成長する予め処理させてない細
胞に直接電気的脈動法を使用することを可能にしたこと
を示した。これらの条件の下、脈動培地は何ら蛋白質分
解酵素を含有しないが、かなりの鉱物イオン特にホスフ
エードバツフアーおよび塩化マグネシウムを含有する。
このとき細胞間で良好な接触が自然に生じ、従つて従来
法で得られた速度に比較して100倍台の速さでハイブリ
ツド形成速度が得られたことが判つた。

かかる増大した収率について提示された一つの理論的説
明は、細胞懸濁液に印加された電場が、細胞の大きさ、
それらの形およびかかる電場の強度によつて決る膜電位
を誘導することを説明することからなる。しかしなが
ら、可逆的小孔が膜電位の強度値によつて誘起されるこ
とが知られており、それらが脂質マトリツクスの構造欠
陥の大きさ増大によつて作られることが知られている。
従つて、電場が培養中の細胞の場合膜電位を誘起し、一
定の限界を越えて、後者が孔開放現象およびそれに電場
が印加される限り益々増大する大きさを有するチヤンネ
ルを作ることを開始するという説を進めることができ
る。これらのチヤンネルは脈動後に閉じる。細胞が接触
状態にあるとき、融合を誘導する細胞間閉鎖機構が通常
の細胞内閉鎖機構と競争する、これによつてこれは細胞
融合が可能なばかりでなく有利にも行なわれる理由を説
明するであろう。これは培養中細胞の接触をもたらすこ
とに寄与する意義を示している。

従つて本発明は微小キヤリヤー上での培養を利用するこ
とによつて処理した細胞の容積におけるかかる電気融合
の能力を更に増大させることを提供する。

従つて本発明による改良法は、粒状のキヤリヤー上で細
胞を成長させ、脈動培地中の細胞で被われた上記キヤリ
ヤーをそれ自体知られている電場の一連のパルスに供す
ることからなることを特徴とする。

本発明の他の特長によれば、 （ｉ）キヤリヤーが細胞分裂の非細胞毒性および非阻害
性物質であることが知られている天然または合計物質の
形である、 （ii）キヤリヤーが培養および脈動培地と非混和性の液
体または固体である、 （iii）キヤリヤーが有利には小球の形である、 （iV）キヤリヤーの粒子寸法または大きさが有利には10
0μｍを越える、 （Ｖ）キヤリヤーがポリエチレン、ポリデキストラン、
ポリスチレンの群の重合体からなる群から選択した種類
の合成樹脂のキヤリヤーである、 （Vi）キヤリヤーを鉱物、ガラスの種類の天然または合
成物質からなる群から選択する、 （Vii）培養および脈動培地をそれ自体知られている一
般に使用されている培地からなる群から選択する。

本発明の他の特長および利点は本発明の具体的例示の下
記の説明から更に明らかになるであろう。

実施例 直径50cmの「ヌンク培養箱」の名で知られている種類の
培養箱内に、新生子牛の血清８％、ペニシリン、ストレ
プトマイシンおよびＬ−グルタミンのイーグル最小培地
を基にした培地約0.2mlおよび1.8mlを占める直径200μ
ｍのポリエチレン球〔ビオシロンボール（Biosilon bal
ls）の名で市販されているものの如き〕の床を入れた。
本発明のこの例の場合の細胞はチヤイニーズハムスター
卵巣（CHO）細胞である。ポリカリオンおよびヘテロカ
リオンの両者の形成を得ることから見て、同一血縁また
は異種血縁の任意の細胞を同じ方法で培養できることは
理解すべきである。

37℃で、５％CO₂および95％空気の雰囲気中で（ヘラエ
ウス包囲）１時間培養後、1mlの細胞懸濁液をそれに指
数増殖で加える（3.2×10⁵C/mlの濃度）。培養はCO₂−
空気雰囲気で37℃で数日間培養する。次いで球を回収
し、脈動培地で洗い、次いでこの後者の培地中で懸濁液
中に再び入れる。これは10mMホスフエート、pH7.2、1mM
のMgCl₂および250mMのサツカロースからなる。

その後この球懸濁液200μｌを、相互に5mmの間隔を置い
た不銹鋼の二つの平行電極からなる適当な脈動セル中に
置く。懸濁液を１秒間隔で100μ秒の間、2KV/cmの強度
の電場の５パルスに供する。次いで懸濁液を例えば「ピ
ペツトマンコーン」で培地（約2ml）中に移し、２時間
培養させる。

これらの全ての操作は層状フラツクブース下通常の方法
で行なう。

その分析を行なうため、細胞をその後エタノール／ホル
ムアルデヒド／酢酸混合物によつてそれ自体知られた方
法で固定し、それらを水／エタノール混合物中で保存す
る。

試験のため、着色をギムザブルーで行ない、リバース顕
微鏡での観察を位相差なしで行ない、融合は、初期培養
中に存在しないポリヌクリエート化細胞の存在によつて
良く知られているように可視化される。

融合指数は自然発生レベルの８％に対し、40％に達する
ことが観察される。

本発明を純粋に説明で示したのみで、全く限定する方法
で示したのでないことを理解すべきであり、有用な改変
を発明の範囲を逸脱せずになしうることを理解すべきで
ある。

上記実施例は、細胞の選択またはそれ自体特別の種類の
ものである担持球の選択の何れにも全く限定するもので
はない。

本発明方法は、細胞が成長でき、細胞接触を生ぜしめ、
上述した基準に応じるあらゆる種類のキヤリヤーを適用
する。また安定で生存ハイブリツドのみならずホモカリ
オンおよびヘテロカリオンを得るための任意の細胞培養
にも適用する。

本発明方法は添付図面に示す如きいわゆる流出培地で行
なうことができることも判るであろう。

この第１図において、上記実施例に示した如き懸濁液中
に球（Ｂ）を最終的に入れる脈動培地のための貯蔵容器
１を示す。この培地は導管２が開いている回収容器４を
制御された減圧３中に入れることによつて制御された操
作で導管２で循環させる。この流れ中、培地は発生器Ｇ
から適用される電極Ｅ間の電場パルスに供される。

【図面の簡単な説明】

第１図は流出培地についての実施を示す図である。 Ｂは球、１は容器、２は導管、４は容器、３は減圧、Ｅ
は電極、Ｇは発生器。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】粒状のキヤリヤー上で細胞を成長せしめ、
   脈動培地中で細胞で被われた上記キヤリヤーを一連の電
   場パルスに供することを特徴とする電気的脈動によって
   誘導される細胞の融合改良方法。
2. 【請求項２】上記キヤリヤーが細胞分裂の非細胞毒性お
   よび非阻害性物質である特許請求の範囲第１項記載の方
   法。
3. 【請求項３】上記キヤリヤーが培養および脈動培地と混
   和しない固体および液体からなる群から選択する特許請
   求の範囲第１項記載の方法。
4. 【請求項４】上記キヤリヤーが小球の形である特許請求
   の範囲第３項記載の方法。
5. 【請求項５】上記キヤリヤーの粒子寸法が有利には100
   μｍを越えている特許請求の範囲第１項記載の方法。
6. 【請求項６】上記キヤリヤーがポリエチレン、ポリデキ
   ストランおよびポリスチレンからなる重合体からなる群
   から選択された合成樹脂である特許請求の範囲第２項記
   載の方法。
7. 【請求項７】上記キヤリヤーが鉱物、天然および合成ガ
   ラス物質からなる群から選択される特許請求の範囲第２
   項記載の方法。
8. 【請求項８】上記培養および脈動培地がこれらの目的に
   一般的に使用される培地からなる群から選択される特許
   請求の範囲第１項記載の方法。