JPH067198A - Sizing and sorting of dna fragment by laser inductive fluorescence - Google Patents
Sizing and sorting of dna fragment by laser inductive fluorescenceInfo
- Publication number
- JPH067198A JPH067198A JP5037039A JP3703993A JPH067198A JP H067198 A JPH067198 A JP H067198A JP 5037039 A JP5037039 A JP 5037039A JP 3703993 A JP3703993 A JP 3703993A JP H067198 A JPH067198 A JP H067198A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- dye
- dna fragment
- fragment
- flux
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 177
- 238000004513 sizing Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 title 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 28
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 28
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims abstract description 18
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 claims abstract description 15
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 167
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 86
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 46
- 230000004907 flux Effects 0.000 claims description 23
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 20
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 13
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 13
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 11
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 8
- ZYVSOIYQKUDENJ-WKSBCEQHSA-N chromomycin A3 Chemical compound O([C@@H]1C[C@@H](O[C@H](C)[C@@H]1OC(C)=O)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1C)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](OC(C)=O)[C@@](C)(O)C3)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@@H]1C[C@@H](O)[C@@H](OC)[C@@H](C)O1 ZYVSOIYQKUDENJ-WKSBCEQHSA-N 0.000 claims description 7
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 claims description 7
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 6
- 230000010287 polarization Effects 0.000 claims description 5
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- XJGFWWJLMVZSIG-UHFFFAOYSA-N 9-aminoacridine Chemical compound C1=CC=C2C(N)=C(C=CC=C3)C3=NC2=C1 XJGFWWJLMVZSIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 4
- -1 Hoechst Chemical compound 0.000 claims description 4
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960001441 aminoacridine Drugs 0.000 claims description 4
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- CFCUWKMKBJTWLW-UHFFFAOYSA-N deoliosyl-3C-alpha-L-digitoxosyl-MTM Natural products CC=1C(O)=C2C(O)=C3C(=O)C(OC4OC(C)C(O)C(OC5OC(C)C(O)C(OC6OC(C)C(O)C(C)(O)C6)C5)C4)C(C(OC)C(=O)C(O)C(C)O)CC3=CC2=CC=1OC(OC(C)C1O)CC1OC1CC(O)C(O)C(C)O1 CFCUWKMKBJTWLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 2
- CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N mithramycin Chemical compound O([C@@H]1C[C@@H](O[C@H](C)[C@H]1O)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1C)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](C)[C@H](O)[C@H](O[C@@H]3O[C@H](C)[C@@H](O)[C@@](C)(O)C3)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@H]1C[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O1 CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N 0.000 claims description 2
- 229960003171 plicamycin Drugs 0.000 claims description 2
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims 3
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims 2
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 21
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 12
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 4
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 4
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 4
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- VYXSBFYARXAAKO-WTKGSRSZSA-N chembl402140 Chemical compound Cl.C1=2C=C(C)C(NCC)=CC=2OC2=C\C(=N/CC)C(C)=CC2=C1C1=CC=CC=C1C(=O)OCC VYXSBFYARXAAKO-WTKGSRSZSA-N 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 2
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 2
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 102000001218 Rec A Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010055016 Rec A Recombinases Proteins 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 2
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 2
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010001497 Agitation Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 108010066072 DNA modification methylase EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000093 cytochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- WDRWZVWLVBXVOI-QTNFYWBSSA-L dipotassium;(2s)-2-aminopentanedioate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O WDRWZVWLVBXVOI-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 230000005686 electrostatic field Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000003239 environmental mutagen Substances 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000383 hazardous chemical Substances 0.000 description 1
- 231100000206 health hazard Toxicity 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000001499 laser induced fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 235000013919 monopotassium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 238000004557 single molecule detection Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明はＤＮＡ分析に関する。さ
らにはＤＮＡ断片のサイズ分布分析およびソーティング
に関する。FIELD OF THE INVENTION The present invention relates to DNA analysis. Furthermore, it relates to size distribution analysis and sorting of DNA fragments.
【０００２】[0002]
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ヒト
ゲノムは22対の染色体に加えて２本の常染色体を形成す
る約30億のヌクレオチドからなり、各々は５千万から５
億のヌクレオチドの連続したＤＮＡ小片からなる。ヒト
ゲノムを形成するＤＮＡの構成および配列はＤＮＡを供
給するソースについて唯一の情報を含有する。この情報
を入手するための１つの方法は、既知の特徴を有する部
位でＤＮＡを断片化し、ついで断片のサイズの分布を分
析する、すなわち、各部位間の各断片におけるヌクレオ
チド数を分析することである。ゲノム構造の多型性は、
ＤＮＡ小片の断片化からえられる断片のサイズにかなり
の変化をもたらし、他人と区別させたり、ヒトの遺伝病
への感染のしやすさを評価する基礎を作る。これらの多
型性の分析はしばしばＤＮＡフィンガープリントとして
言及される。BACKGROUND OF THE INVENTION The human genome consists of 22 pairs of chromosomes plus about 3 billion nucleotides forming two autosomal chromosomes, each of which has 50 to 5 million nucleotides.
It consists of a continuous piece of DNA of 100 million nucleotides. The organization and sequence of the DNA that forms the human genome contains unique information about the source that supplies the DNA. One way to obtain this information is to fragment the DNA at sites with known characteristics and then analyze the size distribution of the fragments, ie, the number of nucleotides in each fragment between each site. is there. Genome structure polymorphism
Fragmentation of small pieces of DNA results in significant changes in the size of the fragment, which provides the basis for distinguishing it from others and assessing susceptibility to human genetic disease. Analysis of these polymorphisms is often referred to as the DNA fingerprint.
【０００３】ＤＮＡフィンガープリントは、法医学の同
定、医学的な遺伝学、環境変異原の効果のモニターおよ
び基礎的な分子生物学研究にさらに適用される重要な医
学的診断の道具である。ＤＮＡフィンガープリントの１
つの形態は、制限酵素が特定のソースからＤＮＡ小片を
ＤＮＡのより短い小片または断片に切るために用いられ
る「制限酵素で切断される断片の長さの多型性(restric
tion fragment lengthpolymorphism)」（ＲＦＬＰ）を
含む。ＤＮＡ試料が制限酵素によって分解されるばあい
には、ＲＦＬＰは断片のサイズによって並べられた特有
なＤＮＡ配列（ＤＮＡフィンガープリント）を含む、Ｄ
ＮＡ断片の特有のパターンを提供する。多数の既知の制
限酵素があり、各々４から12塩基対の特定のＤＮＡ配列
を認識し、そこでＤＮＡを切断し、その結果、より小さ
なＤＮＡ断片がえられる。DNA fingerprints are important medical diagnostic tools with further applications in forensic identification, medical genetics, monitoring the effects of environmental mutagens and basic molecular biology research. DNA fingerprint 1
One of the forms is a "polymorphism in the length of the fragment cut by the restriction enzyme" used by the restriction enzyme to cut a small piece of DNA from a particular source into shorter pieces or fragments of DNA.
section fragment length polymorphism) "(RFLP). If the DNA sample is digested with restriction enzymes, the RFLP contains a unique DNA sequence (DNA fingerprint) arranged by the size of the fragment, D
It provides a unique pattern of NA fragments. There are a number of known restriction enzymes, each recognizing a specific DNA sequence of 4 to 12 base pairs, where it cuts the DNA, resulting in smaller DNA fragments.
【０００４】いったんＤＮＡ小片を多数の断片に切断す
ると、通常はその断片をサイズによって分離するために
電気泳動を用いる。電界は断片を含むゲルを横切って配
置され、より大きな断片よりもより小さな断片がより速
く動くようになる。ゲル電気泳動はよく知られた技法で
あり、分析においてＤＮＡ小片の個々のソースを同定す
るためのフィンガープリントを形成する、ＤＮＡ断片の
バンドパターンをえるために用いられている。通常、特
異的なＤＮＡ配列のバンドパターンは分離されたＤＮＡ
断片に放射性ＤＮＡプローブを結合し、好ましいフィル
ムを、放射能で標識された断片にさらすことによって視
覚化される。たとえば、ジェー アイトーントン(J.I.
Thornton) 、「デーエヌエー プロフィーリング(DNA P
rofiling) 」、シー アンド イーエヌ(C & EN)、18〜
30頁（1989年11月20日）およびケー ヘイン(K. Hein
e)、「デーエヌエー オン トライアル(DNA on Tria
l)」、アウトルック(Outlook)26 巻：４、８〜14頁（19
89年）を参照されたい。１つの変形として、電気泳動用
ゲルにおける既知の軌道の長さ(path length) に沿った
断片の移動時間をオートメーション化された蛍光検出に
よって測定するために、断片の末端が蛍光色素を用いて
標識される。たとえば、エー ヴィ カラノ(A.V. Carr
ano)、「ア ハイ−リゾリューション、フルオレッセン
ス−ベースド、セミオートメーティッド メソッド フ
ォー デーエヌエー フィンガープリンティング(A Hig
h-Resolution, Fluorescence-Based, Semiautomated Me
thod forDNA Fingerprinting)」、４ ゲノミックス(Ge
nomics)、129 〜136 頁（1989年）を参照されたい。Once a piece of DNA has been cut into multiple fragments, electrophoresis is usually used to separate the fragments by size. The electric field is placed across the gel containing the fragments, causing smaller fragments to move faster than larger fragments. Gel electrophoresis is a well-known technique and has been used to obtain a banding pattern of DNA fragments that forms a fingerprint in an assay to identify individual sources of DNA pieces. Usually, the band pattern of a specific DNA sequence is isolated DNA
The fragments are visualized by attaching a radioactive DNA probe to the fragments and exposing the preferred film to the radioactively labeled fragments. For example, Jai Taunton (JI
Thornton), `` NNA Profiling (DNA P
rofiling) 」, C & EN (C & EN), 18〜
Page 30 (November 20, 1989) and K. Hein
e), `` DNA on Tria (DNA on Tria
l) ”, Outlook 26: 4, 8-14 (19
1989). In one variation, the ends of the fragments are labeled with a fluorescent dye to measure the migration time of the fragments along a known path length in an electrophoretic gel by automated fluorescence detection. To be done. For example, AV Carr
ano), `` Ahi-Resolution, Fluorescence-Bassed, Semi-Automated Method for Day NA Fingerprinting (A Hig
h-Resolution, Fluorescence-Based, Semiautomated Me
thod for DNA Fingerprinting), 4 Genomics (Ge
nomics), pages 129-136 (1989).
【０００５】しかしながら、ゲル電気泳動を使用するに
あたり、とくに大きな断片サイズおよび放射性標識が含
まれるばあいはいくつかの限定がある。この両者のばあ
い、電気泳動によって分離する方法では大きなサイズの
断片を分解するためにかなりの時間がかかる。放射性プ
ローブから像を現像することは追加の時間を消費する工
程となり、放射性物質と関連づけて考えられる健康に対
する危険性および環境問題が生じる。加えて、断片サイ
ズの分布は対数的であるので、大きな断片間の分離、す
なわち分解は小さな断片より少ない。また、電気泳動は
認識できるパターンをえるために比較的大量のＤＮＡを
必要とする。However, there are some limitations in using gel electrophoresis, especially when large fragment sizes and radiolabels are involved. In both cases, the electrophoretic separation method takes a considerable amount of time to decompose large-sized fragments. Developing an image from a radioactive probe becomes an additional time consuming process, creating potential health hazards and environmental problems associated with radioactive material. In addition, since the fragment size distribution is logarithmic, there is less separation between large fragments, or degradation, than smaller fragments. Electrophoresis also requires a relatively large amount of DNA to produce a recognizable pattern.
【０００６】少量のＤＮＡのみ（おそらく一本鎖のみ）
を用い、短時間でサイズ情報を提供し、さらに断片サイ
ズ間で高い分解能をもつ、ＤＮＡ断片のサイズ分布技法
を提供することが望ましい。従来の技術のこれらのおよ
び他の問題を改善すべく、ＤＮＡ小片からＤＮＡ断片サ
イズの分布をうるためにフローサイトメトリーをもとに
した技法を用いて本発明を完成するにいたった。Only a small amount of DNA (probably only a single strand)
It is desirable to provide a size distribution technique for DNA fragments, which provides size information in a short time and has high resolution between fragment sizes. To ameliorate these and other problems of the prior art, the present invention has been completed using a technique based on flow cytometry to obtain the distribution of DNA fragment sizes from DNA pieces.
【０００７】[0007]
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は複数
のヌクレオチドを含有するＤＮＡ断片を誘導された蛍光
によってサイジングする方法であって、ＤＮＡ小片を該
ＤＮＡ小片内の予め選別された部位で断片化することに
より複数のＤＮＡ断片を生じさせる工程、該ＤＮＡ小片
または該ＤＮＡ断片を該ヌクレオチドを化学量論的に染
色するのに有効な第１の色素で染色する工程および該第
１の色素から各々の該ＤＮＡ断片中のヌクレオチド数に
相関的に関連する蛍光強度シグナルを発生させるために
染色を行なったのちに、該ＤＮＡ断片を蛍光的に検査す
る工程からなるＤＮＡ断片のサイジング方法を提供す
る。That is, the present invention is a method for sizing a DNA fragment containing a plurality of nucleotides by induced fluorescence, wherein the DNA fragment is fragmented at a preselected site within the DNA fragment. Generating a plurality of DNA fragments by oxidization, staining the DNA pieces or the DNA fragments with a first dye effective for staining the nucleotide stoichiometrically, and from the first dye Provided is a method for sizing a DNA fragment, which comprises a step of fluorescently examining the DNA fragment after staining to generate a fluorescence intensity signal correlatively related to the number of nucleotides in each of the DNA fragments. .
【０００８】[0008]
【実施例】前記およびそのほかの課題を達成するため
に、本発明の目的にしたがって、実施例が示され、かつ
以下に概略的に説明されるように、本発明の方法はＤＮ
Ａ断片の長さを定量するために誘導された蛍光を使用す
ることからなる。ＤＮＡ小片は複数のＤＮＡ断片を産生
するために予め選択された部位で断片化される。すべて
のＤＮＡ断片は、ＤＮＡ断片に沿って化学量論的にヌク
レオチドを染色するのに効果的な色素で処理する。その
のち、染色されたＤＮＡ断片は、ＤＮＡ断片のひとつひ
とつについてヌクレオチド数に機能的に関連する出力の
発生を蛍光的に調べられる。１つの出力において、各断
片からの蛍光発光の強度が断片の長さに直接的に比例す
る。EXAMPLES In order to achieve the above and other objects, according to the objects of the present invention, the method of the present invention is DN
It consists of using the induced fluorescence to quantify the length of the A fragment. The DNA pieces are fragmented at preselected sites to produce multiple DNA fragments. All DNA fragments are treated with a dye effective to stain the nucleotides stoichiometrically along the DNA fragment. The stained DNA fragments are then fluorescently examined for the occurrence of an output functionally related to nucleotide number for each of the DNA fragments. At one output, the intensity of fluorescence emission from each fragment is directly proportional to the length of the fragment.
【０００９】本発明によりＤＮＡ多型性が特徴づけられ
る。すなわち、既知の配列部位でＤＮＡを切断するよう
に選ばれた１つまたはそれより多くの酵素を用いて、選
択されたＤＮＡ小片を断片化することによってえられる
ＤＮＡ断片のサイズを、迅速に分析することを提供する
フローサイトメトリーにもとづく技法を用いて「フィン
ガープリントされる(fingerprinted) 」のである。サイ
ジングの手順の一例は以下のようである。The present invention characterizes DNA polymorphisms. That is, the size of a DNA fragment obtained by fragmenting selected DNA pieces with one or more enzymes selected to cleave DNA at known sequence sites is rapidly analyzed. "Fingerprinted" using a technique based on flow cytometry that provides An example of the sizing procedure is as follows.
【００１０】１． 選択されたソースからえたＤＮＡ小
片を酵素分解によって断片化し、ＤＮＡ断片の溶液をえ
る。ＤＮＡ小片からなるヌクレオチドは染色されてもよ
い。すなわち、ＤＮＡ小片が断片化される前または後の
いずれかに適当な蛍光色素で標識される。1. DNA fragments obtained from the selected source are fragmented by enzymatic decomposition to obtain a solution of DNA fragments. Nucleotides consisting of small pieces of DNA may be stained. That is, the DNA pieces are labeled with a suitable fluorescent dye either before or after fragmentation.
【００１１】２． いつでも蛍光励起体積(fluorescenc
e excitation volume)中に１断片のみがえられるよう
に、染色されたＤＮＡ断片を効果的な濃度および速度で
検出装置に通す。2. The fluorescence excitation volume (fluorescenc
The stained DNA fragment is passed through the detector at an effective concentration and speed so that only one fragment is obtained in the e excitation volume).
【００１２】３． 各染色されたＤＮＡ断片を、励起体
積で、たとえばレーザー照射によって励起させ、その結
果として生じる蛍光強度を測定する。誘導された蛍光の
強度は断片における染色の量の測量であると同時に断片
の長さの測量である。3. Each stained DNA fragment is excited with an excitation volume, for example by laser irradiation, and the resulting fluorescence intensity is measured. The intensity of the induced fluorescence is a measure of the amount of staining on the fragment as well as a measure of the length of the fragment.
【００１３】４． それぞれ異なる強度での断片数は、
選択された１つまたはそれより多くの酵素によってＤＮ
Ａ小片から産生される各長さの断片数の分析をもたら
す。4. The number of fragments with different intensities is
DN by one or more selected enzymes
It provides an analysis of the number of fragments of each length produced from the A pieces.
【００１４】ＤＮＡ小片はまず、いくつかの適するソー
ス、たとえば血液、組織試料、精液、研究室での研究標
品などから選択されてもよい。ＤＮＡ小片はそののち、
分析の特定な適用のために選ばれた酵素を用いて断片化
される。ある特定に有効な型の酵素は特定の部位、すな
わち特定のヌクレオチド配列を認識する制限エンドヌク
レアーゼであり、同定された配列の内部でＤＮＡ小片を
切断する。たとえば、ＥcoＲＩ酵素は２本鎖の小片の認
識部位 ・・・ＧＡＡＴＴＣ・・・ ・・・ＣＴＴＡＡＧ・・・ で切断する。数百の異なる制限酵素とそれらのそれぞれ
の切断部位が知られている。単一のソースからえられる
同一のＤＮＡ小片を異なる酵素で分解し、一群のフィン
ガープリントをえられうることは価値のあることであろ
う。また、ＤＮＡ小片を多数の酵素で分解し、さらに断
片サイズの分布分析を特徴づけてもよい。The DNA pieces may first be selected from several suitable sources, such as blood, tissue samples, semen, laboratory research preparations and the like. After that, the small piece of DNA
Fragmented with the enzyme chosen for the particular application of the assay. One particular effective type of enzyme is a restriction endonuclease that recognizes a particular site, a particular nucleotide sequence, which cleaves small pieces of DNA within the identified sequence. For example, the EcoRI enzyme cleaves at a recognition site of a double-stranded fragment ... GAATTC ... CTTAAG ... Hundreds of different restriction enzymes and their respective cleavage sites are known. It would be valuable to be able to digest the same piece of DNA obtained from a single source with different enzymes to obtain a group of fingerprints. The DNA pieces may also be digested with multiple enzymes and further characterized by fragment size distribution analysis.
【００１５】ＤＮＡ小片の選択された酵素による断片
化、すなわち、分解はよく知られた方法であり、至適な
分解条件は酵素の製造業者によって特定されている。0.
2 〜１μｇのＤＮＡを用いる一般的な制限酵素法は、ジ
ェイ サムブロック(J. Sambrook) ら、モレキュラー
クローニング(Molecular Cloning) 、5.28〜5.33頁（19
89年）、コールド スプリング ハーバー ラボラトリ
ー プレス(Cold SpringHarbor Laboratory Press) に
以下のように記載されている。Fragmentation, or degradation, of selected small pieces of DNA with an enzyme is a well-known method, and optimal degradation conditions have been specified by the enzyme manufacturer. 0.
A general restriction enzyme method using 2-1 μg of DNA is described by J. Sambrook et al., Molecular.
Cloning (Molecular Cloning), 5.28-5.33 (19
1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press describes as follows.
【００１６】１． 滅菌したミクロフュージ チューブ
(microfuge tube)にＤＮＡ溶液を入れ、必要量の水と混
合して18μｌの体積にする。1. Sterilized microfuge tube
Put the DNA solution into the (microfuge tube) and mix with the required amount of water to make a volume of 18 μl.
【００１７】２． ２μｌの適当な制限酵素分解用緩衝
液を加え、チューブを軽くたたくこと(tapping) により
混合する。一例として、緩衝液は以下のように作成され
る。2. Add 2 μl of the appropriate restriction enzyme digestion buffer and mix by tapping the tube. As an example, the buffer solution is prepared as follows.
【００１８】 200ｍＭ グルタミン酸カリウム 50ｍＭ トリス−酢酸塩（ｐＨ7.5 ） 20ｍＭ 酢酸マグネシウム 100μｇ／ml ウシ血清アルブミン（分画Ｖ、シグマ
社製） １ｍＭ β−メルカプトエタノール ３． １〜２単位の制限酵素を加え、チューブを軽くた
たくことによって混合する。ここで、１単位の酵素と
は、推奨される緩衝液中、推奨される温度で20μｌの反
応において１時間で１μｇのＤＮＡの分解を完了するた
めに必要とされる量として定義される。200 mM potassium glutamate 50 mM tris-acetate (pH 7.5) 20 mM magnesium acetate 100 μg / ml bovine serum albumin (fraction V, Sigma) 1 mM β-mercaptoethanol 3. Add 1-2 units of restriction enzyme and mix by tapping the tube. One unit of enzyme is defined here as the amount required to complete the degradation of 1 μg of DNA in 1 hour in a recommended buffer at 20 μl reaction at the recommended temperature.
【００１９】４． 混合物を適当な温度で必要な時間イ
ンキュベートする。4. The mixture is incubated at the appropriate temperature for the required time.
【００２０】５． 最終濃度が10ｍＭとなるように0.5
Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ8.0 ）を加えることにより、反応を
停止する。5. 0.5 so that the final concentration is 10 mM
The reaction is stopped by adding M EDTA (pH 8.0).
【００２１】ＤＮＡは、さらなる制限酵素分解を加えた
ほかの種々の技法によって断片化することもできる。DNA can also be fragmented by a variety of other techniques with the addition of additional restriction enzyme digestion.
【００２２】１． ＤＮアーゼ過敏性(hypersensitivit
y)部位（ＤＮアーゼフットプリント） ＤＮアーゼによるクロマチン分解は、ＤＮＡに結合し、
その結合した部位でのＤＮアーゼによるＤＮＡの切断が
妨げられるようなタンパク質の違いによって種々の長さ
の断片を産生するであろう（デー ジェイ ガラス(D.
J.Galas) ら、ヌクレイック アシッド リサーチ(Nucl
eic Acids Res.)、５巻、3157頁（1987年）参照）。1. DNase hypersensitivity
y) Site (DNase footprint) Chromatin degradation by DNase binds to DNA,
Fragments of different lengths will produce fragments of varying lengths that differ in protein such that cleavage of the DNA by DNase at its binding site is impeded.
J. Galas) et al., Nucleic Acid Research (Nucl
eic Acids Res.), 5: 3157 (1987)).
【００２３】２． １対の塩基対の誤った組み合わせに
おけるＲＮアーゼの切断 蛍光で標識したＲＮＡプローブを対象のＤＮＡ配列の正
常な型または野生型に対して相補的に合成する。そのの
ちに、この相補的なプローブを分析される目標のＤＮＡ
にアニーリングする。蛍光標識したプローブ鎖と目標の
ＤＮＡ鎖の間に１対のヌクレオチドの誤りの組み合わせ
があるかどうかを測定するために、ＲＮＡとＤＮＡのハ
イブリッドをＲＮアーゼＡで処理する。ＲＮアーゼＡは
ＲＮＡの１本鎖領域を特異的に切断する。こうしてＲＮ
ＡとＤＮＡのハイブリッドの蛍光標識したＲＮＡ鎖にお
ける１対の塩基対の誤った組み合わせが切断される（ア
ール エム マイヤーズ(R.M. Myers)ら、サイエンス(S
cience)230巻、1242頁（1985年）およびイー エフ ウ
ィンター(E.F. Winter) ら、プロシーディング オブ
ナショナル アカデミー オブ サイエンス オブ ザ
ユナイテッド ステイト オブ アメリカを用いた(P
roc. Natl. Acad. Sci.)82巻、7525頁（1985年）参
照）。2. Cleavage of RNase at a wrong pair of base pairs A fluorescently labeled RNA probe is synthesized complementary to the normal or wild type of the DNA sequence of interest. The target DNA is then analyzed with this complementary probe.
Anneal to. RNA and DNA hybrids are treated with RNase A to determine if there is a pair of nucleotide error combinations between the fluorescently labeled probe strand and the target DNA strand. RNase A specifically cleaves the single-stranded region of RNA. Thus RN
An incorrect combination of a pair of base pairs in a fluorescently labeled RNA strand of a hybrid of A and DNA is cleaved (RM Myers et al., Science (S
Cience, 230, 1242 (1985) and EF Winter et al., Proceedings of
Using the National Academy of Science of the United State of America (P
Roc. Natl. Acad. Sci.) 82, 7525 (1985)).
【００２４】３． ＲecＡを用いた制限エンドヌクレア
ーゼ切断 ＲecＡタンパク質で覆われた短いオリゴヌクレオチドを
相補的な目標のＤＮＡ配列にアニーリングする。ＤＮＡ
とオリゴヌクレオチドのハイブリッドをＥcoＲＩメチラ
ーゼ酵素で処理する。オリゴヌクレオチドで保護されて
いないＥcoＲＩ部位はメチル化され、一方、オリゴヌク
レオチドで保護されたＥcoＲＩ部位は影響を受けないま
ま残る。ＥcoＲＩ制限エンドヌクレアーゼは保護された
（すなわち、メチル化されていない）部位でのみ切断す
る。この方法は500,000 塩基対より大きい断片を産生す
るために用いられる（エル ジェイ フェリン(L.J. Fe
rrin) 、サイエンス、254 巻、1494頁（1991年）参
照）。3. Restriction Endonuclease Cleavage with RecA Short oligonucleotides covered with RecA protein are annealed to complementary target DNA sequences. DNA
And the oligonucleotide hybrid are treated with the EcoRI methylase enzyme. The EcoRI site that is not protected by the oligonucleotide is methylated, while the EcoRI site that is protected by the oligonucleotide remains unaffected. The EcoRI restriction endonuclease cleaves only at protected (ie, unmethylated) sites. This method is used to produce fragments larger than 500,000 base pairs (LJ Feline
rrin), Science, 254, 1494 (1991)).
【００２５】４． ＤＮＡ断片化は酵素分解以外の技法
により行われることもできる。たとえば、異なる振動数
における超音波励起は１群のサイズの分布を産生するの
に用いられてもよい。種々の化学薬品もまたヌクレオチ
ドと反応し、ＤＮＡ小片の断片化に用いられてもよい。4. DNA fragmentation can also be performed by techniques other than enzymatic degradation. For example, ultrasonic excitation at different frequencies may be used to produce a population size distribution. Various chemicals also react with nucleotides and may be used to fragment DNA pieces.
【００２６】フローサイトメトリー分析のためには、Ｄ
ＮＡ断片は蛍光色素で染色されなければならない。蛍光
色素はＤＮＡ断片に化学量論的に結合するように選ばれ
る。複合体は異なる方法、すなわち１本鎖ＤＮＡ、２本
鎖ＤＮＡ、特定の塩基対などで形成されてもよい。よく
知られた色素としては、エチジウムブロミド、アクリジ
ンオレンジ、プロピジウムイオダイド、ＤＡＰＩ、ヘキ
スト、クロモマイシン、ミトラマイシン(mithramycin)
、9 アミノアクリジン(9 amino acridine)、エチジウ
ムブロミドヘテロジン(ethidium bromide heterodyne)
、非対称シアニン色素(asymmetric cyanine dyes) 、
またはエネルギー移送用のこれらの色素の組み合わせが
あげられる。選択された１種のまたは複数の色素はＤＮ
Ａ配列に沿って化学量論的にオリゴヌクレオチドと結合
する。すなわち、断片に沿った結合部位は、ＤＮＡの長
さに沿った色素分子の総数がＤＮＡを形成する塩基対の
（bpの）数に比例する、ということである。たとえば、
以下に述べる染色プロトコール下では、ＤＮＡ断片に結
合するエチジウムブロミドの分子数は化学量論的であ
り、塩基対の数の1.5 倍でありうる。たとえば、シー
アール カンター(C.R. Cantor) ら、バイオフィジカル
ケミストリー(Biophysical Chemistry) 、第３章、ザ
ビヘイビアー オブ バイオロジカル マクロモレキ
ュルズ(The Behavior of Biological Macromolecules)
、1251頁（1980年）、ダブリュー エイチフリーマン
アンド カンパニー(W.H. Freeman and Company)中の
「バインディング オブ スモーラー モレキュルズ
トゥー ヌクレイック アシッズ(Binding of Smaller
Molecules to Nucleic Acids) 」が参照される。For flow cytometric analysis, D
The NA fragment must be stained with a fluorescent dye. The fluorescent dye is selected to bind stoichiometrically to the DNA fragment. The complex may be formed in different ways, ie single-stranded DNA, double-stranded DNA, specific base pairs, etc. Well-known dyes include ethidium bromide, acridine orange, propidium iodide, DAPI, Hoechst, chromomycin, mithramycin.
, 9 amino acridine, ethidium bromide heterodyne
, Asymmetric cyanine dyes,
Alternatively, a combination of these dyes for energy transfer may be mentioned. One or more dyes selected are DN
It binds to the oligonucleotide stoichiometrically along the A sequence. That is, the binding sites along the fragment are such that the total number of dye molecules along the length of the DNA is proportional to the number of base pairs (bp) forming the DNA. For example,
Under the staining protocol described below, the number of ethidium bromide molecules bound to DNA fragments is stoichiometric and can be 1.5 times the number of base pairs. For example, sea
CR Cantor et al., Biophysical Chemistry, Chapter 3, The Behavior of Biological Macromolecules.
, 1251 (1980), "Binding of Smaller Moleculars" in W.H. Freeman and Company.
Too Nucleic Acids (Binding of Smaller
Molecules to Nucleic Acids) ".
【００２７】エチジウムブロミドを用いて染色する手順
の一例を以下に示す。An example of the procedure for staining with ethidium bromide is shown below.
【００２８】ＤＮＡ試料を１〜５μｇ／ml溶液のエチジ
ウムブロミドおよびＴＥ8.0 緩衝液（ＴＥ8.0 buffer)
を含有する溶液に加える。適する緩衝液はギブコ(GIBC
O) 社から入手され、10ｍＭ トリス−塩酸および１ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ8.0 ）である。反応は室温で５〜10
分間で完了する。A DNA sample was treated with ethidium bromide containing 1 to 5 μg / ml and TE8.0 buffer (TE8.0 buffer).
Is added to the solution containing. A suitable buffer is GIBC
O), 10 mM Tris-HCl and 1 m
M EDTA (pH 8.0). Reaction is 5-10 at room temperature
Complete in minutes.
【００２９】染色されたＤＮＡ断片はつぎに、検出領域
を通過し、隣接した断片のサイズを区別するために充分
に分解された、各断片から蛍光強度を測定するために感
度の高い蛍光検出技法を用いて分析される。理論上で
は、所望の分布分析をえるためには、１本のＤＮＡ小片
のみが必要とされるのであるが、典型的な溶液は多くの
ＤＮＡ小片から形成され、相対的なＤＮＡ断片のサイズ
の分布がえられる。ＤＮＡ断片は典型的には、100bp か
ら500,000bp の範囲のサイズを有する。The stained DNA fragments then pass through the detection region and are sufficiently resolved to distinguish the size of adjacent fragments, and sensitive fluorescence detection techniques are used to measure the fluorescence intensity from each fragment. Is analyzed using. In theory, only one piece of DNA is needed to obtain the desired distribution analysis, but a typical solution is formed from many pieces of DNA, and the size of the relative DNA fragments Distribution can be obtained. DNA fragments typically have a size in the range of 100 bp to 500,000 bp.
【００３０】フローサイトメーターまたは類似の感度の
高い蛍光検出装置に用いる粒子の連続する流束(flow st
ream) を形成する方法はよく知られている。たとえば、
フルウィラー(Fulwyler)らの1973年１月16日に発行され
た米国特許第3,710,933 号明細書およびエム アール
メラムド(M.R. Melamed)ら、フローサイトメトリーアン
ド ソーティング(Flow Cytometry and Sorting)、第２
版、ウィレイ−リス(Wiley-Liss)、ニューヨーク（1990
年）が参照される。１つの断片のみが励起体積(excitat
ion volume) 中に存在するように、断片が流束中でひっ
つくことのないような効果的な低濃度にするために、Ｄ
ＮＡ断片の希釈溶液を作製する。そののちに、そのＤＮ
Ａ断片の溶液を、１つの断片のレーザーによる励起を一
度にするための検出チャンバーを通過するための薄層状
のシース(laminar sheath)の流束の内に注入する。試料
とシースの流速は、粒子間の分離を維持し、各粒子に励
起光源中で至適時間を提供するように調整される。至適
時間は、サイジングの速度、検出感度および色素標識の
光安定性を考慮して決定される。適する励起光源は、Ｄ
ＮＡ断片の染色に用いられる色素において蛍光が発する
ように選択される。たとえば、エチジウムブロミドに60
0nm 付近のバンドの蛍光を生じさせるためには、488nm
のアルゴンレーザーが効果的である。A continuous flux of particles for use in a flow cytometer or similar sensitive fluorescence detector.
The method of forming ream) is well known. For example,
Fulwyler et al., US Pat. No. 3,710,933, issued Jan. 16, 1973, and MR.
MR Melamed et al., Flow Cytometry and Sorting, 2nd
Edition, Wiley-Liss, New York (1990
Year) is referred to. Only one fragment has the excitation volume (excitat
ion volume) so that the fragments are effectively low in concentration so that fragments do not stick in the flux, D
Make a diluted solution of NA fragments. After that, the DN
A solution of the A fragment is injected into the flux of a laminar sheath for passage through the detection chamber for one laser excitation at a time. The sample and sheath flow rates are adjusted to maintain separation between the particles and provide each particle with an optimal time in the excitation light source. The optimum time is determined in consideration of the sizing speed, the detection sensitivity, and the photostability of the dye label. A suitable excitation light source is D
It is selected to fluoresce in the dye used to stain the NA fragment. For example, 60 for ethidium bromide
488 nm for fluorescence in the band around 0 nm.
Argon laser is effective.
【００３１】通常のフローサイトメトリーシステムの感
度は、小さい励起体積、たとえば直径10〜20μｍおよび
長さ100 μｍ、に厳密に(tightly) 焦点を合わせられた
レーザービームを照射することにより向上する。たとえ
ば、11ｐＬのプローブ体積について記載されている、ジ
ェイ エイチ(J.H. Hahn) ら、「レーザー−インデュー
スド フルオレッセンス ディテクション オブ ロー
ダミン−６Ｇ アット６×10-5Ｍ(Laser-Induced Fluor
escence Detection of Rhodamine-6G at ６×10
-15 Ｍ）」、アプライド スペクトロスカピイ(Appl. S
pectrosc.)45巻、743 頁（1991年）が参照される。小さ
いプローブ体積により、出力シグナルにおける発光のバ
ックグラウンド量、すなわちノイズが大きく減少され
る。The sensitivity of conventional flow cytometry systems is improved by irradiating a laser beam that is tightly focused on a small excitation volume, eg 10-20 μm in diameter and 100 μm in length. For example, JH Hahn et al., Described for a probe volume of 11 pL, "Laser-Induced Fluorescence Detection of Rhodamine-6G at 6 × 10 -5 M (Laser-Induced Fluor).
escence Detection of Rhodamine-6G at 6 × 10
-15 M) ”, Applied Spectroscopy (Appl. S
pectrosc.) 45, 743 (1991). The small probe volume greatly reduces the background amount of emission, or noise, in the output signal.
【００３２】レーザーによる励起は、たとえば色素発光
光量子（遅発性の(delayed))とラマン拡散光量子（速効
性の(prompt)）の間に区別をつけるように導く時間であ
る、約70ps全幅（70ps full width)のパルスを用いるパ
ルスレーザーによってもよい。たとえば、イー ビー
シェラ(E.B. Shera)ら、「デテクション オブ シング
ル フルオレッセント モレキュルズ(Detection of Si
ngle Fluorescent Molecules) 」、ケミカル フィジッ
クス レターズ(Chem. Phys. Lett.)174巻、553 頁（19
90年11月）が参照される。遅発性用窓が蛍光光量子とラ
マン拡散光量子とを区別するのに効果的となるために、
色素発光が数ナノセコンドの寿命で退衰する間、速効性
の拡散光量子がレーザーパルス時間内に生ずる。Excitation with a laser is, for example, a time leading to distinguish between dye emission photons (delayed) and Raman diffuse photons (prompt), about 70 ps full width ( A pulsed laser using 70 ps full width pulse may be used. For example, EB
EB Shera et al., "Detection of Single Fluorescent Moleculars (Detection of Si
Fluorescent Molecules) ", Chemical Phys. Lett. 174, 553 (19
November 1990) is referred to. In order for the delayed window to be effective in distinguishing between fluorescence photons and Raman diffuse photons,
While the dye emission decays with lifetimes of a few nanoseconds, fast-acting diffuse photons occur within the laser pulse time.
【００３３】また、レーザーはｃｗレーザーでもよい。
たとえば、エス エイ ソーパー(S.A. Soper)、「シン
グル−モレキュル デテクション オブ ローダミン−
６Ｇイン エタノリック ソルーションズ ユージング
コンティニュアス ウェイブ レーザー エクサイテ
ィション(Single-Molecule Detection of Rhodamine-6G
in Ethanolic Solutions Using Continuous Wave Lase
r Excitation) 」、アナリティカル ケミストリー(Ana
l. Chem.) 63巻、432 頁（1991年）が参照される。発光
された光量子の数は、ＤＮＡ断片がレーザービームを通
過する時間を長くすることにより、そして色素および色
素のための高い光安定性を有する溶媒を選択することに
より増加しうる。検出された光量子（光電子）数はま
た、検出装置の感度を高めることにより増加する。さら
に、本発明は単一の分子よりもむしろＤＮＡ断片を含
み、そして断片の長さが長いほど強い出力の蛍光強度が
えられる。The laser may be a cw laser.
For example, SA Soper, “Single-Molecular Detection of Rhodamine-
6G In Ethanol Solutions Youth Continuous Wave Laser Excitation (Single-Molecule Detection of Rhodamine-6G
in Ethanolic Solutions Using Continuous Wave Lase
r Excitation) '', Analytical Chemistry (Ana
l. Chem.) 63, 432 (1991). The number of photons emitted can be increased by increasing the time that the DNA fragments pass through the laser beam, and by choosing dyes and solvents with high photostability for the dyes. The number of photons (photoelectrons) detected is also increased by increasing the sensitivity of the detection device. Furthermore, the present invention includes DNA fragments rather than a single molecule, and longer fragments give higher output fluorescence intensities.
【００３４】溶液は、ＤＮＡ断片に結合しなかったいく
らかの色素を含有してもよいことがわかるであろう。こ
の色素は結合した色素とともに励起されるであろうが、
システムは結合していない色素の蛍光と結合した色素の
蛍光とを区別しなければならない。１つの実施態様で
は、パルス化されたレーザーおよび誘導された検出技法
がこの区別を行なうのに用いられてもよい。たとえば、
結合していないエチジウムブロミドおよび結合している
エチジウムブロミドの励起された状態の寿命はそれぞれ
２nsおよび23nsである。したがって、検出システムは結
合しているエチジウムブロミドの蛍光のみを検出するこ
とができ、ＤＮＡ断片の長さに相関的(functionally)に
関連する出力シグナルを提供しうる。また、色素は結合
している状態および結合していない状態において異なる
蛍光または吸収波長を提供するように選択されてもよ
い。たとえば、一連の非対称シアニン色素がアイ デー
ジョンソン(I.D. Johnson)ら、「アシンメトリック
シアニン ダイズ フォー フルオレッセント ステイ
ニング アンド クウォンティフィケーション オブヌ
クレイック アシッズ(Asymmetric Cyanine Dyes for F
luorescent Stainingand Quantification of Nucleic A
cids)」、フルオレッセンス スペクトロスコーピィ(Fl
uorescence Spectroscopy) 、アブストラクト 1806、
エフエイエスイービー ジェイ(FASEB J.)６巻、Ａ314
頁、No.1（1992年１月）に報告されている。It will be appreciated that the solution may contain some dye which does not bind to DNA fragments. This dye will be excited with the bound dye,
The system must distinguish between the fluorescence of unbound and bound dye. In one embodiment, pulsed laser and guided detection techniques may be used to make this distinction. For example,
The excited state lifetimes of unbound ethidium bromide and bound ethidium bromide are 2 ns and 23 ns, respectively. Thus, the detection system can only detect the fluorescence of the ethidium bromide to which it is bound and can provide an output signal that is functionally related to the length of the DNA fragment. Also, the dye may be selected to provide different fluorescence or absorption wavelengths in the bound and unbound states. For example, a series of asymmetric cyanine dyes has been described by ID Johnson et al.
Cyanine Dyes For Fluorescent Staining and Quantification of Nucleic Acids
luorescent Staining and Quantification of Nucleic A
cids) '', Fluorescence Spectroscopy (Fl
uorescence Spectroscopy), Abstract 1806,
FASEB J. Volume 6, A314
Page, No. 1 (January 1992).
【００３５】偏光された(polarized) 蛍光発光もまた、
結合していない色素分子から結合している色素分子を区
別する手段を提供する。結合していないＤＮＡ色素の蛍
光偏光は0.05以下であるのに対し、ＤＮＡに結合した蛍
光色素の蛍光偏光は0.20から0.30の間でありうる。たと
えば、エル エス クラム(L.S. Cram) ら、「フルオレ
ッセンス ポラリゼーション アンド パルス ワイス
アナリシス オブクロモゾームス バイ ア フロー
システム(Fluorescence Polarization andPulse Widt
h Analysis of Chromosomes by a Flow System)」、ジ
ャーナル オブ ヒストケミストリー アンド サイト
ケミストリー(J. Histochem. Cytochem.) 27巻、445
頁、No.1（1979年）、およびティー エム ジョビン
(T.M. Jovin)、「フルオレッセンス ポラリゼーション
アンド エナジー トランスファー：セオリー アン
ド アプリケーション(Fluorescence Polarization and
Energy Transfer：Theory and Application) 」、エム
アール メラムド(M.R. Melamed)ら編、フローサイト
メトリー アンド ソーティング(Flow Cytometry and
Sorting)、156 頁、ジョン ウィレイ アンド サンズ
(John Wiley & Sons)（1979年）が参照される。偏光し
た励起光源(polarized excitation source) を用いるこ
とおよび蛍光検出器の前に置かれた偏光フィルターを通
して発光を検出することによって区別がなされる。偏光
フィルターは励起光源の偏光方向に平行な偏光方向に並
べられる。Polarized fluorescence emission is also
It provides a means of distinguishing bound dye molecules from unbound dye molecules. The fluorescence polarization of unbound DNA dye can be less than or equal to 0.05, while the fluorescence polarization of DNA-bound fluorescent dye can be between 0.20 and 0.30. For example, LS Cram et al., "Fluorescence Polarization and Pulse Widt Analysis of Chromosomes Via Flow System.
Analysis of Chromosomes by a Flow System), Journal of Histochem. and Cytochem. 27, 445.
Page, No. 1 (1979), and TM Jobim
(TM Jovin), “Fluorescence Polarization and Energy Transfer: Theory and Application
Energy Transfer: Theory and Application ", edited by MR Melamed et al., Flow Cytometry and Sorting
Sorting), page 156, John Willey and Sons
(John Wiley & Sons) (1979). A distinction is made by using a polarized excitation source and detecting the emission through a polarizing filter placed in front of the fluorescence detector. The polarization filter is arranged in a polarization direction parallel to the polarization direction of the excitation light source.
【００３６】連続的なｃｗレーザー励起には、エネルギ
ー移送式型が、結合している色素分子と結合していない
色素分子を区別するために用いられてもよい。第２の色
素がＤＮＡに結合するばあいもまた、断片のサイジング
に用いられる結合している第１の色素分子は、第２の色
素分子の励起が第２の色素分子から第１の色素分子への
エネルギー移送という結果になるように、第２の色素分
子に近接するであろう。周囲の流体中の結合していない
第１および第２の色素分子は、エネルギー移送に効果的
に近くには存在しないであろう。したがって、第２の色
素分子が励起されたばあいには、結合している第１の色
素分子のみが断片の長さを測定するために蛍光を発する
であろう。For continuous cw laser excitation, the energy transfer type may be used to distinguish between bound and unbound dye molecules. When the second dye binds to DNA, the bound first dye molecule used for sizing the fragment is also bound to the excitation of the second dye molecule from the second dye molecule to the first dye molecule. It will be in close proximity to the second dye molecule, resulting in energy transfer to. The unbound first and second dye molecules in the surrounding fluid will not effectively be in close proximity to the energy transfer. Thus, when the second dye molecule is excited, only the bound first dye molecule will fluoresce to measure the length of the fragment.
【００３７】例としては、ＤＮＡ特異的色素であるヘキ
ストとクロモマイシンがエネルギーを移送させうる。ヘ
キスト色素分子が励起されると、それらは数オングスト
ロームの移送半径内でクロモマイシン分子にエネルギー
を移送させうる。このエネルギー移送対(energy transf
er pair)はフローサイトメトリーによる染色体の蛍光分
析において用いられる。たとえば、アール ジー ラン
グロイス(R.G. Langlois) らによる「サイトケミカル
スタディーズ オブ メタフェーズ クロモソウムズ
バイ フローサイトメトリー(Cytochemical Studies of
Metaphase Chromosomes by Flow Cytometry) 」、クロ
モソウマ(Chromosoma)77巻、229 頁（1980年）を参照さ
れたい。エネルギー移送による励起はまた、ヌクレオチ
ドを 260nm付近で励起することによっても行なってもよ
く、そののち結合した色素分子にエネルギーが移送され
る。たとえば、ジェイ ビー レペック(J.B. LePecq)
らによる「ア フルオレッセント コンプレックス ビ
トゥィーン エチジウムブロミド アンド ヌクレイッ
ク アシッズ（A fluorescent Complex between Ethidi
um Bromide and Nucleic Acids）」、ジャーナル オブ
モレキュラー バイオロジー（J.Mol. Biol.) 27巻、
87頁（1967年）を参照されたい。As an example, the DNA-specific dyes Hoechst and Chromomycin can transfer energy. When the Hoechst dye molecules are excited, they can transfer energy to chromomycin molecules within a transfer radius of a few Angstroms. This energy transf
er pair) is used in fluorescence analysis of chromosomes by flow cytometry. For example, see “Chemical Chemicals” by RG Langlois et al.
Studies of Metaphase Chromosomes
By Flow Cytometry (Cytochemical Studies of
Metaphase Chromosomes by Flow Cytometry ", Chromosoma, Vol. 77, p. 229 (1980). Excitation by energy transfer may also be performed by exciting nucleotides around 260 nm, after which the energy is transferred to the attached dye molecules. For example, JB LePecq
Et al., “A Fluorescent Complex between Ethidium Bromide and Nucleic Acids (A fluorescent Complex between Ethidi
um Bromide and Nucleic Acids) ”, Journal of Molecular Biology (J. Mol. Biol.) Vol. 27,
See page 87 (1967).
【００３８】フローサイトメトリー型装置もまた、隣接
する断片の長さを区別するのに高い分解能を与える。実
際、分解能は一般的に蛍光発光から生じる光量子におけ
るショットノイズ(shot noise)によって限定され、ＤＮ
Ａ断片を形成する塩基対の（bp′s ）数が増えると分解
能（％）は増加する。Flow cytometric instruments also provide high resolution in distinguishing between adjacent fragment lengths. In fact, resolution is generally limited by shot noise in photons resulting from fluorescence emission,
The resolution (%) increases as the number of base pairs (bp's) forming the A fragment increases.
【００３９】分解能（％）（Ｒ）は断片の長さ（Ｌ）、
標識された断片の分画（ｆ）、１つの標識あたりに集め
られた光電子の数（ｂ）（ｂは典型的には約30）および
断片がサイズされた回数（Ｎ）によって決定される。平
均強度はμで示される。３σの標識偏差における分解能
Ｒは Ｒ（％）＝３×100 ×Ｎ1/2 ×（Ｌ×ｆ×ｂ）1/2 ／（Ｌ×ｆ×ｂ） （ただしμ＝Ｌ×ｆ×ｂ、σ＝μ1/2 ） で表わされる。Resolution (%) (R) is fragment length (L),
The fraction of labeled fragments (f) is determined by the number of photoelectrons collected per label (b) (b is typically about 30) and the number of times the fragment has been sized (N). Mean intensity is given in μ. The resolution R in the labeling deviation of 3σ is R (%) = 3 × 100 × N 1/2 × (L × f × b) 1/2 / (L × f × b) (where μ = L × f × b, σ = μ 1/2 ).
【００４０】たとえば、1000の塩基長さの断片のばあい
を考えると、Ｌ＝1000、ｆ＝0.5 （たとえばエチジウム
ブロミド）、ｂ＝30である。Ｎ＝１で、μ＝15000 、σ
＝122.474 およびＲ＝2.45％である。分解能はＮ1/2 で
向上する。Ｎ＝1000で、σ＝3.87およびＲ＝0.0775％で
ある。10、100 または10000 個の同一の断片のサイジン
グであっても問題はない。典型的な１本の電気泳動バン
ドにおいては10000 よりももっと多い断片が存在する。
したがって、100,000bp の断片については分解能は１％
よりずっと良くなりうるが、一方、ゲル電気泳動による
100,000bp の範囲の断片の分離においては、10〜20％の
分解能しか期待できず、断片の長さが大きくなると分解
能はさらに低下する。For example, considering the case of a fragment having a base length of 1000, L = 1000, f = 0.5 (eg ethidium bromide), and b = 30. N = 1, μ = 15000, σ
= 122.474 and R = 2.45%. The resolution improves with N 1/2 . With N = 1000, σ = 3.87 and R = 0.0775%. There is no problem with sizing 10, 100 or 10000 identical fragments. There are more than 10,000 fragments in a typical electrophoretic band.
Therefore, the resolution is 1% for 100,000bp fragments.
Can be much better, but by gel electrophoresis
In the separation of fragments in the 100,000 bp range, only 10 to 20% resolution can be expected, and the resolution decreases further as the fragment length increases.
【００４１】本発明によるＤＮＡフィンガープリントも
また、きわめて迅速に行なうことが可能である。電気泳
動による典型的なＤＮＡフィンガープリントは約50バン
ドを有する。100 断片／秒の速さの断片分析でフィンガ
ープリントを行なうためには、1000断片では50バンドに
約8.3 分が必要とされるのみである。１本のバンドのみ
が所望の分解に要求されるばあいには、分析時間はたっ
た約１秒である。したがって、所望の分解が１本のバン
ドあたり100 断片要求されるばあいには、50バンドの分
析はたった約50秒で行なわれるであろう。The DNA fingerprint according to the invention can also be carried out very rapidly. A typical DNA fingerprint by electrophoresis has about 50 bands. Only about 8.3 minutes are required for 50 bands with 1000 fragments to provide a fingerprint for fragment analysis at a rate of 100 fragments / sec. If only one band is required for the desired digestion, the analysis time is only about 1 second. Thus, if the desired digestion required 100 fragments per band, the analysis of 50 bands would take only about 50 seconds.
【００４２】本発明の適用において、ハイブリダイゼー
ション プローブはＤＮＡ制限断片(DNA restriction f
ragments) に結合することができ、断片長さのサイズ(f
ragment length sizes) と結びつけて考えられうる。通
常、ハイブリダイゼーションプローブはプローブ色素(p
robe dye) を含んで形成され、調べられるＤＮＡ小片か
ら形成されるＤＮＡ断片と塩基対のマッチングによって
ハイブリダイズする。そののち、ハイブリダイズしたＤ
ＮＡ断片の励起は、サイズ測定色素(size-measuring dy
e)とプローブ色素の両者の蛍光出力の相関関係がプロー
ブと種々の断片長さを関連づけるであろうように、サイ
ズ測定色素とプローブ色素を励起することができた。Ｄ
ＮＡへのin situプローブ ハイブリダイゼーションは
メソッズ イン セル バイオロジー（Methods in Cel
l Biology ）、33巻、ゼットダージンキエウック(Z. Da
rzynkiewicz)ら著、アカデミック プレス インク(Aca
demic Press, Inc.)（ニューヨーク 1990年）、37章、
「フルオレッセンスイン サイチュー ハイブリダイゼ
ーション ウィズ デーエヌエー プローブス(Fluores
cence In Situ Hybridization with DNA Probes) 」、
383 頁に論ぜられている。In the application of the present invention, the hybridization probe is a DNA restriction fragment.
ragments) and fragment length size (f
ragment length sizes). Hybridization probes are usually probe dyes (p
robe dye) and is hybridized by base pair matching with a DNA fragment formed from a DNA fragment to be examined. After that, hybridized D
The excitation of the NA fragment is performed by measuring the size-measuring dye.
It was possible to excite the sizing and probe dyes so that the correlation of the fluorescence output of both e) and the probe dye would associate different fragment lengths with the probe. D
In situ probe hybridization to NA is Mesozzu in-cell biology (Methods in Cel
l Biology), Vol. 33, Z. Dazin Kieuuk (Z. Da
rzynkiewicz) et al., Academic Press Ink (Aca
demic Press, Inc.) (New York 1990), Chapter 37,
"Fluorescence in Situ Hybridization with NNA Probes
cence In Situ Hybridization with DNA Probes) '',
Discussed on page 383.
【００４３】長さ測定に加えて、ＤＮＡ鎖からおおまか
な塩基組成情報を引き出すことが可能である。たとえ
ば、ＤＮＡ特異的色素ヘキストはＤＮＡにおけるＡＴの
豊富な領域に優先的に結合し、またクロモマイシンはＧ
Ｃの豊富な領域に優先的に結合する。これら２種の色素
の蛍光を励起することによって、二変量の染色体分析
（前記のラングロイス参照）においてなされるように、
断片のＡＴ：ＧＣの割合が測定されうる。この割合は断
片の長さに加えさらなるフィンガープリント情報を供与
するであろう。異なる配列特異性(specificities) をと
もなった他の結合色素が断片の塩基特性を描写するため
に用いられうる。さらに、蛍光標識されたヌクレオチド
前駆体の存在下にＤＮＡの小片を合成することにより、
その塩基組成にしたがったＤＮＡの小片に標識がなさ
れ、この情報はひき続いて断片長さの蛍光分析に関連づ
けることができる。たとえば、３つの正常なヌクレオチ
ドおよび１つの蛍光標識されたＣヌクレオチドを用いて
ＤＮＡの小片を複製すれば、標識されたＣヌクレオチド
はＧヌクレオチドにのみ結合するであろうために、もと
の小片におけるＧヌクレオチドの数についての情報がえ
られるであろう。In addition to length measurements, it is possible to derive rough base composition information from DNA strands. For example, the DNA-specific dye Hoechst binds preferentially to AT-rich regions in DNA, and chromomycin does
It preferentially binds to the C-rich region. By exciting the fluorescence of these two dyes, as done in bivariate chromosomal analysis (see Langlois above),
The AT: GC ratio of the fragment can be measured. This ratio will provide additional fingerprint information in addition to the fragment length. Other binding dyes with different sequence specificities can be used to characterize the basic character of the fragment. Furthermore, by synthesizing a small piece of DNA in the presence of a fluorescently labeled nucleotide precursor,
A small piece of DNA according to its base composition is labeled, and this information can subsequently be linked to a fluorescence analysis of the fragment length. For example, if a piece of DNA is replicated with three normal nucleotides and one fluorescently labeled C nucleotide, the labeled C nucleotide will only bind to the G nucleotide, so in the original piece. Information will be obtained on the number of G nucleotides.
【００４４】前記システムのさらなる能力は、フローサ
イトメーターと統合された種々のソーティングシステム
を用いることによってもたらされうる。たとえば、前記
の米国特許第3,710,933 号明細書および前記のフロー
サイトメトリー アンド ソーティングを参照された
い。ソーティングの能力は追加の処理または研究のため
に流束から１つまたはそれより多くの断片のサイズを選
り分けることを可能にするであろう。ハイブリダイゼー
ション プローブを用いるばあい、ソーティングにより
流束からハイブリダイズされた断片を分離することが可
能になる。A further capability of the system can be brought about by using various sorting systems integrated with the flow cytometer. For example, the aforementioned US Pat. No. 3,710,933 and the above flow.
See cytometry and sorting. The ability to sort will allow the size of one or more fragments from the flux to be sorted out for additional processing or research. When using a hybridization probe, sorting allows the hybridized fragments to be separated from the flux.
【００４５】通常のソーティング装置は、米国特許第3,
710,933 号明細書およびティー リンドモ(T. Lindmo)
、「フロー ソーターズ フォー バイオロジカル
セルズ(Flow Sorters for Biological Cells) 」、フロ
ー サイトメトリー アンドソーティング（Flow Cytom
etry and Sorting）、第２版、エム メラメド(M.Melam
ed) ら著、145 〜169 頁、ジョン ウィレイ アンド
サンズ(John Wiley &Sons) （1990年）に記載されたよ
うに、前述の蛍光出力シグナルを用いる。断片が出力を
生じるように励起体積を通過したのち、流体力学的な流
束(hydrodynamic flow stream)が、たとえば、超音波振
とう処理によって小滴にされ、各々の液滴は１より多く
ない断片を含む。ＤＮＡ断片を含有する液滴は励起に対
して選択された蛍光反応性をもち、液滴と交差する高電
圧パルスの適用により荷電され、そののち荷電された液
滴を選択的に偏向するように静電界を発生する帯電板を
通過する。選択された液滴に適用された電荷(charge)は
フローサイトメーター内の励起体積からの蛍光発光に対
応する電気回路の構成部分によってコントロールされ、
そこで荷電するパルスは活性化され、選択された波長お
よび強さで蛍光を発する材料を含有する液滴の偏向を生
じる。A conventional sorting device is described in US Pat.
710,933 and T. Lindmo
, "Flow Sorters For Biological
Cells (Flow Sorters for Biological Cells) ", Flow Cytometry and Sorting (Flow Cytom
etry and Sorting), 2nd edition, M. Melam
ed) et al., pp. 145-169, John Willeiand
The fluorescence output signal described above is used as described by John Wiley & Sons (1990). After the fragments have passed through the excitation volume to produce an output, the hydrodynamic flow stream is broken into droplets, for example by ultrasonic shaking treatment, each droplet not exceeding 1 including. The droplet containing the DNA fragment has a selected fluorescence reactivity to excitation and is charged by the application of a high voltage pulse intersecting the droplet such that the charged droplet is then selectively deflected. It passes through a charging plate that produces an electrostatic field. The charge applied to the selected droplets is controlled by the components of the electrical circuit that correspond to the fluorescence emission from the excited volume in the flow cytometer,
The charging pulse is then activated, resulting in the deflection of a droplet containing a material that fluoresces at a selected wavelength and intensity.
【００４６】前述の記載はＤＮＡ小片に関するものであ
るが、前記の方法はＲＮＡ鎖にも同等に適用しうる。本
明細書におけるＤＮＡについてのいかなる言及もＲＮＡ
を含むと解釈されるべきである。加えて、検出されるシ
グナルの形態は蛍光であると教示されている。しかしな
がら、「蛍光」という用語は燐光およびルミネッセンス
を含むと解釈されるべきであり、特異的な色素に依存し
て、いかなる形態の光の発光も利用しうる。さらに、全
ての生物が特異的な特性を決定するゲノムをもっている
ので、フィンガープリントに供されるＤＮＡまたはＲＮ
Ａは必ずしもヒト由来でなくてもよい。Although the above description relates to small pieces of DNA, the above method is equally applicable to RNA strands. Any reference to DNA herein is RNA
Should be construed as including. In addition, the form of signal detected is taught to be fluorescent. However, the term “fluorescence” should be construed to include phosphorescence and luminescence, depending on the specific dye, any form of light emission may be utilized. In addition, since all organisms have a genome that determines specific characteristics, DNA or RN to be fingerprinted
A does not necessarily have to be of human origin.
【００４７】本発明の好ましい実施態様についての前述
の記載は解説および記述する目的で示されている。これ
は本発明を包括するものでも開示された厳密な形式に限
定するものでもなく、明らかに多くの修飾および変形が
前述の教示を考慮して可能である。実施態様は本発明の
原理、および意図された特定の使用に合うように当業者
が種々の実施態様に種々の修飾をともなって本発明を的
確に利用することを可能にするために実際の適用を選択
し記載している。ここに添付されたクレームによって定
義された発明の範囲が意図される。The foregoing description of the preferred embodiment of the present invention has been presented for purposes of explanation and description. It is not intended to be exhaustive of the invention or limited to the precise form disclosed, as clearly many modifications and variations are possible in view of the above teachings. The embodiments are of practical application to enable those skilled in the art to make appropriate use of the invention with various modifications to the various embodiments to suit the principles of the invention and its particular intended use. Is selected and described. The scope of the invention as defined by the claims appended hereto is contemplated.
【００４８】[0048]
【発明の効果】本発明により、ＤＮＡ小片、とくに少量
のＤＮＡ小片から作製されるＤＮＡ断片を短時間でサイ
ジングすることが可能である。さらに、前記断片は従来
よりも長い断片を用いることが可能である。Industrial Applicability According to the present invention, it is possible to size a DNA fragment, particularly a DNA fragment prepared from a small amount of DNA fragment, in a short time. Further, it is possible to use a longer fragment than the conventional one.
【００４９】また、本発明では種々のソーティングシス
テムを併用することにより、前記サイジングとともにＤ
ＮＡ断片のソーティングも可能とする。Further, in the present invention, by using various sorting systems together, the sizing and D
It also enables sorting of NA fragments.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マーク エル ハモンド アメリカ合衆国、87544 ニューメキシコ 州、ロス アラモス、アイリタ ドライブ 64 (72)発明者 リチャード エイ ケラー アメリカ合衆国、87544 ニューメキシコ 州、ロス アラモス、ラ ローザ コート ４ (72)発明者 バベッタ エル マロン アメリカ合衆国、87544 ニューメキシコ 州、ロス アラモス、トウタビ ストリー ト 690 (72)発明者 ジョーン シー マーチン アメリカ合衆国、87544 ニューメキシコ 州、ロス アラモス、トリニティー ドラ イブ 4987 ─────────────────────────────────────────────────── ─── Continued Front Page (72) Mark El Hammond, United States, 87544 New Mexico, Los Alamos, Irita Drive 64 (72) Inventor Richard Akeler United States, 87544 New Mexico, Los Alamos, La Rosa Court 4 (72) Inventor Babetta El Maron, USA, 87544 New Mexico, Los Alamos, Toutavi Street 690 (72) Inventor, John Sea Martin, USA, 87544 New Mexico, Los Alamos, Trinity Drive 4987
Claims (24)
片を誘導された蛍光によってサイジングする方法であっ
て、ＤＮＡ小片を該ＤＮＡ小片内の予め選別された部位
で断片化することにより複数のＤＮＡ断片を生じさせる
工程、該ＤＮＡ小片または該ＤＮＡ断片を該ヌクレオチ
ドを化学量論的に染色するのに有効な第１の色素で染色
する工程および該第１の色素から各々の該ＤＮＡ断片中
のヌクレオチド数に相関的に関連する蛍光強度シグナル
を発生させるために染色を行なったのちに、該ＤＮＡ断
片を蛍光的に検査する工程からなるＤＮＡ断片のサイジ
ング方法。1. A method of sizing a DNA fragment containing a plurality of nucleotides by induced fluorescence, comprising fragmenting a plurality of DNA fragments at preselected sites within the DNA fragment to obtain a plurality of DNA fragments. The step of producing, the step of staining said DNA piece or said DNA fragment with a first dye effective for staining said nucleotide stoichiometrically, and the number of nucleotides in each said DNA fragment from said first dye A method for sizing a DNA fragment, which comprises a step of fluorescently inspecting the DNA fragment after staining to generate a fluorescence intensity signal correlatively related to.
の塩基対の組み合わせにおいて該小片を切断するために
選択された制限酵素にさらすことからなる請求項１記載
の方法。2. The method of claim 1, wherein the step of fragmenting the DNA pieces comprises exposing them to a restriction enzyme selected to cleave the pieces in known base pair combinations.
片に沿って選択された部位を同定するために、選択され
たＤＮＡ配列を該ＤＮＡ小片に結合させる工程および前
記複数のＤＮＡ断片を形成するために、該選択された部
位で該ＤＮＡ小片を切断する工程を含んでなる請求項１
記載の方法。3. The step of fragmenting the DNA pieces comprises the step of attaching a selected DNA sequence to the DNA pieces to identify selected sites along the pieces and the plurality of DNA fragments. 2. A step of cleaving the DNA piece at the selected site to form.
The method described.
第１の色素で染色する工程が、該ＤＮＡ小片または該Ｄ
ＮＡ断片を、エチジウムブロミド、アクリジンオレン
ジ、プロピジウムイオダイド、ＤＡＰＩ、ヘキスト、ク
ロモマイシン、ミトラマイシン、9 アミノアクリジンお
よびエチジウムアクリジンヘテロジンからなる群より選
ばれた色素を含有する溶液に加える工程を含む請求項１
記載の方法。4. The step of staining the DNA piece or the DNA fragment with a first dye comprises the step of dyeing the DNA piece or D.
A step of adding the NA fragment to a solution containing a dye selected from the group consisting of ethidium bromide, acridine orange, propidium iodide, DAPI, Hoechst, chromomycin, mithramycin, 9 aminoacridine and ethidium acridine heterozine. Item 1
The method described.
前記第１の色素で染色する工程が、該ＤＮＡ小片または
該ＤＮＡ断片をエチジウムブロミド、アクリジンオレン
ジ、プロピジウムイオダイド、ＤＡＰＩ、ヘキスト、ク
ロモマイシン、ミトラマイシン、9 アミノアクリジンお
よびエチジウムアクリジンヘテロジンからなる群より選
ばれた色素を含有する溶液に加える工程を含む請求項２
記載の方法。5. The step of staining the DNA piece or the DNA fragment with the first dye comprises the step of staining the DNA piece or the DNA fragment with ethidium bromide, acridine orange, propidium iodide, DAPI, Hoechst, chromomycin, mitra. A method comprising adding to a solution containing a dye selected from the group consisting of mycin, 9 aminoacridine and ethidium acridine heterozine.
The method described.
前記第１の色素で染色する工程が、該ＤＮＡ小片または
該ＤＮＡ断片をエチジウムブロミド、アクリジンオレン
ジ、プロピジウムイオダイド、ＤＡＰＩ、ヘキスト、ク
ロモマイシン、ミトラマイシン、9 アミノアクリジンお
よびエチジウムアクリジンヘテロジンからなる群より選
ばれた色素を含有する溶液に加える工程を含む請求項３
記載の方法。6. The step of staining the DNA piece or the DNA fragment with the first dye comprises the ethidium bromide, acridine orange, propidium iodide, DAPI, Hoechst, chromomycin, mitra. 4. A step of adding to a solution containing a dye selected from the group consisting of mycin, 9 aminoacridine and ethidium acridine heterozine.
The method described.
が、ＤＮＡ断片が順次間隔をおいて存在するような流束
を形成する工程、前記第１の色素に蛍光を生じさせるた
めに効果的なレーザーを該流束に照射する工程および該
流束中の各々の該ＤＮＡ断片から全蛍光強度を測定する
工程を含んでなる請求項１記載の方法。7. The step of fluorescently inspecting the DNA fragment is effective in forming a flux such that the DNA fragments are sequentially present at intervals, and is effective for causing fluorescence in the first dye. 2. The method according to claim 1, comprising the steps of irradiating the flux with a different laser and measuring the total fluorescence intensity from each of the DNA fragments in the flux.
に前記ＤＮＡ断片に結合した色素分子と結合していない
色素分子とを区別する工程を含む請求項７記載の方法。8. The method according to claim 7, wherein the step of measuring the total fluorescence intensity further includes a step of distinguishing a dye molecule bound to the DNA fragment from a dye molecule not bound to the DNA fragment.
が、ＤＮＡ断片が順次間隔をおいて存在するような流束
を形成する工程、前記第１の色素に蛍光を生じさせるた
めに効果的なレーザーを該流束に照射する工程および該
流束中の各々の該ＤＮＡ断片から全蛍光強度を測定する
工程を含んでなる請求項２記載の方法。9. The step of fluorescently inspecting the DNA fragment is effective for forming a flux such that the DNA fragments are sequentially present at intervals, and is effective for causing fluorescence in the first dye. 3. The method according to claim 2, comprising the steps of irradiating the flux with a different laser and measuring the total fluorescence intensity from each of the DNA fragments in the flux.
らに前記ＤＮＡ断片に結合した色素分子と結合していな
い色素分子とを区別する工程を含む請求項９記載の方
法。10. The method according to claim 9, wherein the step of measuring the total fluorescence intensity further includes a step of distinguishing a dye molecule bound to the DNA fragment from a dye molecule not bound.
程が、ＤＮＡ断片が順次間隔をおいて存在するような流
束を形成する工程、前記第１の色素に蛍光を生じさせる
ために効果的なレーザーを該流束に照射する工程および
該流束中の各々の該ＤＮＡ断片から全蛍光強度を測定す
る工程を含んでなる請求項３記載の方法。11. The step of fluorescently inspecting the DNA fragment is effective for forming a flux such that the DNA fragments are sequentially present at intervals, and is effective for causing fluorescence in the first dye. 4. The method of claim 3, comprising the steps of irradiating the flux with a different laser and measuring the total fluorescence intensity from each of the DNA fragments in the flux.
らに前記ＤＮＡ断片に結合した色素分子と結合していな
い色素分子とを区別する工程を含む請求項11記載の方
法。12. The method according to claim 11, wherein the step of measuring the total fluorescence intensity further includes a step of distinguishing a dye molecule bound to the DNA fragment from a dye molecule not bound.
程が、ＤＮＡ断片が順次間隔をおいて存在するような流
束を形成する工程、前記第１の色素に蛍光を生じさせる
ために効果的なレーザーを該流束に照射する工程および
該流束中の各々の該ＤＮＡ断片から全蛍光強度を測定す
る工程を含んでなる請求項４記載の方法。13. The step of fluorescently inspecting the DNA fragment is effective in forming a flux such that the DNA fragments are sequentially present at intervals, and is effective for causing fluorescence in the first dye. 5. The method of claim 4, comprising the steps of irradiating the flux with a different laser and measuring the total fluorescence intensity from each of the DNA fragments in the flux.
らに前記ＤＮＡ断片に結合した色素分子と結合していな
い色素分子とを区別する工程を含む請求項13記載の方
法。14. The method according to claim 13, wherein the step of measuring the total fluorescence intensity further includes a step of distinguishing a dye molecule bound to the DNA fragment from a dye molecule not bound.
程が、ＤＮＡ断片が順次間隔をおいて存在するような流
束を形成する工程、前記第１の色素に蛍光を生じさせる
ために効果的なレーザーを該流束に照射する工程および
該流束中の各々の該ＤＮＡ断片から全蛍光強度を測定す
る工程を含んでなる請求項５記載の方法。15. The step of fluorescently inspecting the DNA fragment is effective for forming a flux such that the DNA fragments are sequentially present at intervals, and is effective for causing fluorescence in the first dye. 6. The method of claim 5, comprising the steps of irradiating the flux with a different laser and measuring the total fluorescence intensity from each of the DNA fragments in the flux.
らに前記ＤＮＡ断片に結合した色素分子と結合していな
い色素分子とを区別する工程を含む請求項15記載の方
法。16. The method according to claim 15, wherein the step of measuring the total fluorescence intensity further includes a step of distinguishing a dye molecule bound to the DNA fragment from a dye molecule not bound to the DNA fragment.
程が、ＤＮＡ断片が順次間隔をおいて存在するような流
束を形成する工程、前記第１の色素に蛍光を生じさせる
ために効果的なレーザーを該流束に照射する工程および
該流束中の各々の該ＤＮＡ断片から全蛍光強度を測定す
る工程を含んでなる請求項６記載の方法。17. The step of fluorescently inspecting the DNA fragment is effective for forming a flux such that the DNA fragments are sequentially present at intervals, and is effective for causing fluorescence in the first dye. 7. The method according to claim 6, comprising the steps of irradiating the flux with a different laser and measuring the total fluorescence intensity from each of the DNA fragments in the flux.
ＤＮＡ断片に結合した色素分子と結合していない色素分
子を区別する工程を含む請求項17記載の方法。18. The method according to claim 17, wherein the step of detecting total fluorescence further comprises a step of distinguishing a dye molecule bound to the DNA fragment from a dye molecule not bound thereto.
第１の色素にエネルギー移送するのに効果的な第２の色
素で前記ヌクレオチドを染色する工程、該第１の色素に
エネルギー移送するための該第２の色素を励起する工程
および前記ＤＮＡ断片のサイズに機能的に関連するシグ
ナルを出力するために該第１の色素から蛍光強度を測定
する工程を含んでなる請求項８記載の方法。19. The step of distinguishing the dye molecules comprises the step of dyeing the nucleotides with a second dye effective to transfer energy to the first dye, for transferring energy to the first dye. 9. The method of claim 8 comprising the steps of exciting said second dye and measuring fluorescence intensity from said first dye to output a signal functionally related to the size of said DNA fragment. .
第１の色素を偏光させた光源で励起させる工程および該
偏光させた光源の偏光に対して平行な偏光方向に向けら
れた偏光フィルターを通して前記第１の色素から蛍光を
検出する工程を含んでなる請求項８記載の方法。20. Distinguishing the dye molecules comprises exciting the first dye with a polarized light source and passing through a polarizing filter oriented in a polarization direction parallel to the polarization of the polarized light source. 9. The method of claim 8, comprising detecting fluorescence from the first dye.
ＤＮＡ断片に結合していない色素分子の蛍光の寿命に関
連する第１の検出窓を配置する工程、前記第１の検出窓
の後ろにあり、前記ＤＮＡ断片に結合した色素分子の蛍
光の寿命に関連する第２の検出窓を配置する工程および
該第２の窓内で検出された全蛍光強度を測定する工程を
含んでなる請求項８記載の方法。21. The step of distinguishing the dye molecules comprises the step of arranging a first detection window relating to the lifetime of fluorescence of the dye molecules not bound to the DNA fragment, and behind the first detection window. The step of disposing a second detection window relating to the lifetime of fluorescence of the dye molecule bound to the DNA fragment and measuring the total fluorescence intensity detected in the second window. 8. The method according to 8.
するハイブリダイゼーションプローブを蛍光色素標識を
用いて形成する工程、該ハイブリダイゼーションプロー
ブと前記ＤＮＡ断片をハイブリダイズ化する工程および
該プローブと断片サイズの関係を測定するために該蛍光
色素標識を蛍光的に検査する工程を含有する請求項１記
載の方法。22. A step of forming a hybridization probe having a predetermined nucleotide sequence using a fluorescent dye label, a step of hybridizing the hybridization probe with the DNA fragment, and a relationship between the probe and the fragment size. The method of claim 1 including the step of fluorescently inspecting the fluorescent dye label for measurement.
前記蛍光強度シグナルの相関的要素としてソーティング
する工程を含む請求項１記載の方法。23. The method according to claim 1, further comprising the step of sorting the stained DNA fragments as a correlative element of the fluorescence intensity signal.
片を選択されたオレゴヌクレオチドに結合する第３の色
素で染色する工程および該選択されたオリゴヌクレオチ
ド含量を断片サイズと関連づけるために該第３の色素か
ら発光する該ＤＮＡ断片を蛍光的に検査する工程を含ん
でなる請求項１記載の方法。24. A step of staining the DNA strand or DNA fragment with a third dye that binds to a selected olegonucleotide, and the third dye to correlate the selected oligonucleotide content with fragment size. The method according to claim 1, comprising the step of fluorescently examining the DNA fragment which emits light.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US84111492A | 1992-02-25 | 1992-02-25 | |
| US841,114 | 1992-02-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH067198A true JPH067198A (en) | 1994-01-18 |
Family
ID=25284049
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5037039A Pending JPH067198A (en) | 1992-02-25 | 1993-02-25 | Sizing and sorting of dna fragment by laser inductive fluorescence |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH067198A (en) |
| CA (1) | CA2089423A1 (en) |
| FR (1) | FR2687687B1 (en) |
| GB (1) | GB2264496B (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021519432A (en) * | 2018-03-30 | 2021-08-10 | アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッドＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． | Flow cytometer, its laser optical assembly, and how to assemble the laser optical assembly |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6221654B1 (en) | 1996-09-25 | 2001-04-24 | California Institute Of Technology | Method and apparatus for analysis and sorting of polynucleotides based on size |
| US6540895B1 (en) | 1997-09-23 | 2003-04-01 | California Institute Of Technology | Microfabricated cell sorter for chemical and biological materials |
| US7351376B1 (en) | 2000-06-05 | 2008-04-01 | California Institute Of Technology | Integrated active flux microfluidic devices and methods |
| AU2002307152A1 (en) | 2001-04-06 | 2002-10-21 | California Institute Of Technology | Nucleic acid amplification utilizing microfluidic devices |
| AU2001286615A1 (en) * | 2001-08-22 | 2003-03-18 | Union Biometrica, Inc. | Improved axial pattern analysis utilizing organisms having defined marker patterns |
| US7691333B2 (en) | 2001-11-30 | 2010-04-06 | Fluidigm Corporation | Microfluidic device and methods of using same |
| JP4355210B2 (en) | 2001-11-30 | 2009-10-28 | フルイディグム コーポレイション | Microfluidic device and method of using microfluidic device |
| CA2480728A1 (en) | 2002-04-01 | 2003-10-16 | Fluidigm Corporation | Microfluidic particle-analysis systems |
| JP2006501056A (en) | 2002-09-25 | 2006-01-12 | カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー | Micro fluid large scale integration |
| AU2003299541A1 (en) | 2002-10-02 | 2004-05-25 | California Institute Of Technology | Microfluidic nucleic acid analysis |
| US20050145496A1 (en) | 2003-04-03 | 2005-07-07 | Federico Goodsaid | Thermal reaction device and method for using the same |
| US7476363B2 (en) | 2003-04-03 | 2009-01-13 | Fluidigm Corporation | Microfluidic devices and methods of using same |
| US7604965B2 (en) | 2003-04-03 | 2009-10-20 | Fluidigm Corporation | Thermal reaction device and method for using the same |
| US8828663B2 (en) | 2005-03-18 | 2014-09-09 | Fluidigm Corporation | Thermal reaction device and method for using the same |
| EP3184624A1 (en) * | 2015-12-22 | 2017-06-28 | Diagenode S.A. | Frequency optimized devices and methods for microfluidic sonication |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5102785A (en) * | 1987-09-28 | 1992-04-07 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Method of gene mapping |
| US4962037A (en) * | 1987-10-07 | 1990-10-09 | United States Of America | Method for rapid base sequencing in DNA and RNA |
| SE8802573D0 (en) * | 1988-07-08 | 1988-07-08 | Wallac Oy | MULTI-LABEL TIME-RESOLVED FLUORESCENCE ANALYSIS OF NUCLEIC ACID SEQUENCES USING LANTHANIDE CHELATES |
| DE69012109T2 (en) * | 1989-03-10 | 1995-01-26 | Millipore Corp | DNA SEQUENCING USING CHEMOLUMINESCENCE. |
| US5096554A (en) * | 1989-08-07 | 1992-03-17 | Applied Biosystems, Inc. | Nucleic acid fractionation by counter-migration capillary electrophoresis |
-
1993
- 1993-02-08 GB GB9302411A patent/GB2264496B/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-02-12 CA CA 2089423 patent/CA2089423A1/en not_active Abandoned
- 1993-02-24 FR FR9302100A patent/FR2687687B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-02-25 JP JP5037039A patent/JPH067198A/en active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2021519432A (en) * | 2018-03-30 | 2021-08-10 | アイデックス ラボラトリーズ インコーポレイテッドＩＤＥＸＸ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ． | Flow cytometer, its laser optical assembly, and how to assemble the laser optical assembly |
| US11662542B2 (en) | 2018-03-30 | 2023-05-30 | Idexx Laboratories, Inc. | Flow cytometer, laser optics assembly thereof, and methods of assembling the same |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB2264496B (en) | 1995-10-25 |
| CA2089423A1 (en) | 1993-08-26 |
| GB2264496A (en) | 1993-09-01 |
| FR2687687A1 (en) | 1993-08-27 |
| GB9302411D0 (en) | 1993-03-24 |
| FR2687687B1 (en) | 1997-05-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5558998A (en) | DNA fragment sizing and sorting by laser-induced fluorescence | |
| JPH067198A (en) | Sizing and sorting of dna fragment by laser inductive fluorescence | |
| Ambrose et al. | Application of single molecule detection to DNA sequencing and sizing | |
| US5721102A (en) | Surface enhanced Raman gene probe and methods thereof | |
| JP4264764B2 (en) | A method to directly prove a small number of nucleic acid chains | |
| Stokes et al. | Quantitative enhanced Raman scattering of labeled DNA from gold and silver nanoparticles | |
| Keller et al. | Single-molecule fluorescence analysis in solution | |
| Knemeyer et al. | Probes for detection of specific DNA sequences at the single-molecule level | |
| DE69702649T2 (en) | FLUORESCENCE DETECTION TEST FOR HOMOGENEOUS PCR HYBRIDIZATION SYSTEMS | |
| EP3587594B1 (en) | Particle-assisted nucleic acid sequencing | |
| US6383754B1 (en) | Binary encoded sequence tags | |
| US4962037A (en) | Method for rapid base sequencing in DNA and RNA | |
| EP2462245B1 (en) | Device and methods for epigenetic analysis | |
| Zelenin et al. | 7‐amino‐actinomycin D as a specific fluorophore for DNA content analysis by laser flow cytometry | |
| US20070166743A1 (en) | Quantum dots and methods of use thereof | |
| US20060281102A1 (en) | Methods for detecting genetic haplotypes by interaction with probes | |
| Werner et al. | Progress towards single-molecule DNA sequencing: a one color demonstration | |
| US20110267457A1 (en) | Systems and methods for nucleic acid sequencing | |
| JPH05322899A (en) | Method and instrument for measuring length of dna molecule | |
| Stöhr et al. | Extended application of flow microfluorometry by means of dual laser excitation | |
| US20090088982A1 (en) | Co-detection of single polypeptide and polynucleotide molecules | |
| WO1998010097A2 (en) | Method and apparatus for single molecule two color fluorescent detection and molecular weight and concentration determination | |
| JPH0560698A (en) | Detection method of molecular weight separation pattern for nucleic acid fragment | |
| Zander | Single-molecule detection in solution: a new tool for analytical chemistry | |
| Jett et al. | DNA fragment sizing and sorting by laser-induced fluorescence |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20031028 |