FR2687687A1 - METHOD FOR MEASURING THE SIZE OF DNA FRAGMENTS - Google Patents
METHOD FOR MEASURING THE SIZE OF DNA FRAGMENTS Download PDFInfo
- Publication number
- FR2687687A1 FR2687687A1 FR9302100A FR9302100A FR2687687A1 FR 2687687 A1 FR2687687 A1 FR 2687687A1 FR 9302100 A FR9302100 A FR 9302100A FR 9302100 A FR9302100 A FR 9302100A FR 2687687 A1 FR2687687 A1 FR 2687687A1
- Authority
- FR
- France
- Prior art keywords
- dna fragments
- dna
- dye
- fluorescence
- stream
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 158
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 21
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 20
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 9
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 167
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 13
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 claims description 12
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 11
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- ZYVSOIYQKUDENJ-WKSBCEQHSA-N chromomycin A3 Chemical compound O([C@@H]1C[C@@H](O[C@H](C)[C@@H]1OC(C)=O)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1C)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]3O[C@@H](C)[C@H](OC(C)=O)[C@@](C)(O)C3)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@@H]1C[C@@H](O)[C@@H](OC)[C@@H](C)O1 ZYVSOIYQKUDENJ-WKSBCEQHSA-N 0.000 claims description 7
- 230000010287 polarization Effects 0.000 claims description 6
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- XJGFWWJLMVZSIG-UHFFFAOYSA-N 9-aminoacridine Chemical compound C1=CC=C2C(N)=C(C=CC=C3)C3=NC2=C1 XJGFWWJLMVZSIG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 4
- QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O Ethidium cation Chemical compound C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 QTANTQQOYSUMLC-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 4
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960001441 aminoacridine Drugs 0.000 claims description 4
- CFCUWKMKBJTWLW-UHFFFAOYSA-N deoliosyl-3C-alpha-L-digitoxosyl-MTM Natural products CC=1C(O)=C2C(O)=C3C(=O)C(OC4OC(C)C(O)C(OC5OC(C)C(O)C(OC6OC(C)C(O)C(C)(O)C6)C5)C4)C(C(OC)C(=O)C(O)C(C)O)CC3=CC2=CC=1OC(OC(C)C1O)CC1OC1CC(O)C(O)C(C)O1 CFCUWKMKBJTWLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N mithramycin Chemical compound O([C@@H]1C[C@@H](O[C@H](C)[C@H]1O)OC=1C=C2C=C3C[C@H]([C@@H](C(=O)C3=C(O)C2=C(O)C=1C)O[C@@H]1O[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2O[C@H](C)[C@H](O)[C@H](O[C@@H]3O[C@H](C)[C@@H](O)[C@@](C)(O)C3)C2)C1)[C@H](OC)C(=O)[C@@H](O)[C@@H](C)O)[C@H]1C[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O1 CFCUWKMKBJTWLW-BKHRDMLASA-N 0.000 claims description 4
- 229960003171 plicamycin Drugs 0.000 claims description 4
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 2
- -1 Hoechst Chemical compound 0.000 claims 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 abstract description 46
- 238000009826 distribution Methods 0.000 abstract description 9
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 abstract description 2
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 abstract 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 11
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 11
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 8
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 5
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 5
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 3
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 3
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 3
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001069 Raman spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 238000002875 fluorescence polarization Methods 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 2
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 1
- 230000007023 DNA restriction-modification system Effects 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004518 RNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003391 RNA probe Substances 0.000 description 1
- 102000001218 Rec A Recombinases Human genes 0.000 description 1
- 108010055016 Rec A Recombinases Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- VYXSBFYARXAAKO-WTKGSRSZSA-N chembl402140 Chemical compound Cl.C1=2C=C(C)C(NCC)=CC=2OC2=C\C(=N/CC)C(C)=CC2=C1C1=CC=CC=C1C(=O)OCC VYXSBFYARXAAKO-WTKGSRSZSA-N 0.000 description 1
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 1
- 230000000093 cytochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- WDRWZVWLVBXVOI-QTNFYWBSSA-L dipotassium;(2s)-2-aminopentanedioate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O WDRWZVWLVBXVOI-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 230000005686 electrostatic field Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000003239 environmental mutagen Substances 0.000 description 1
- 230000005281 excited state Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000012921 fluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000001506 fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000001499 laser induced fluorescence spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 235000013919 monopotassium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
- G01N15/10—Investigating individual particles
- G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Ce procédé est caractérisé en ce qu'il permet d'obtenir des cartes d'ADN en utilisant des systèmes de détection à vitesse élevée, comme la cytométrie, pour déterminer des caractéristiques uniques de fragments d'ADN à partir d'un échantillon choisi. Dans une caractérisation le morceau d'ADN est fragmenté à des sites choisis à l'avance pour produire un pluralité de fragments d'ADN. Le morceau d'ADN ou les fragments d'ADN résultants sont traités avec un colorant efficace pour les colorer de façon stœchiométrique. La fluorescence du colorant dans les fragments colorés est ensuite examinée pour générer une sortie fonctionnellement en rapport avec le nombre de nucléotides dans chacun des fragments d'ADN. Dans un mode de réalisation, l'intensité des émissions de fluorescence provenant de chaque fragment est directement proportionnelle à la longueur du fragment. Des colorants additionnels peuvent être liés au morceau d'ADN et aux fragments d'ADN pour fournir des informations additionnelles aux informations de longueur. Des colorants spécifiques d'oligonucléotides et/ou des sondes d'hybridation peuvent être liés aux fragments d'ADN pour fournir des informations sur la distribution des oligonucléotides ou l'hybridation de la sonde avec des fragments d'ADN de tailles différentes.This method is characterized in that it enables DNA maps to be obtained using high speed detection systems, such as cytometry, to determine unique characteristics of DNA fragments from a selected sample. In one characterization the piece of DNA is fragmented at sites chosen in advance to produce a plurality of DNA fragments. The resulting piece of DNA or DNA fragments are treated with a dye effective to stoichiometrically stain them. The fluorescence of the dye in the stained fragments is then examined to generate an output functionally related to the number of nucleotides in each of the DNA fragments. In one embodiment, the intensity of fluorescence emissions from each fragment is directly proportional to the length of the fragment. Additional dyes can be linked to the piece of DNA and the DNA fragments to provide additional information to the length information. Specific oligonucleotide dyes and / or hybridization probes can be linked to the DNA fragments to provide information on the distribution of the oligonucleotides or the hybridization of the probe with DNA fragments of different sizes.
Description
PROCEDE POUR MESURER LA TAILLE DE FRAGMENTS D'ADNMETHOD FOR MEASURING THE SIZE OF DNA FRAGMENTS
Contexte de l'invention Cette invention se rapporte à l'analyse de l'ADN et, plus particulièrement, à l'analyse de la Background of the Invention This invention relates to DNA analysis and, more particularly, to analysis of the
distribution par taille et au tri de fragments d'ADN. size distribution and sorting of DNA fragments.
Cette invention est le résultat d'un contrat avec le This invention is the result of a contract with the
"Department of Energy" (contrat NI W-7405-ENG-36). "Department of Energy" (NI contract W-7405-ENG-36).
Le génome humain comprend quelques trois milliards de nucléotides formant les 22 paires de chromosomes plus 2 autosomes, chacun avec des morceaux d'ADN continus de 50-500 millions de nucléotides L'organisation et la séquence de l'ADN formant le génome humain contiennent des informations uniques sur la source qui fournit l'ADN Un procédé pour avoir accès à ces informations est de fragmenter l'ADN à des sites avec des caractéristiques connues et ensuite d'analyser la distribution des tailles de fragments, c'est-à-dire le nombre de nucléotides dans chaque fragment entre chacun des sites Des polymorphismes dans la structure du génome conduisent à une variation importante de la taille des fragments obtenus à partir de la fragmentation de morceaux d'ADN et permettent de différencier une personne d'une autre ou de former une base d'évaluation de la susceptibilité d'une personne à des maladies génétiques L'analyse de ces polymorphismes est souvent désignée sous le nom de cartographie de l'ADN. La cartographie de l'ADN est un outil important de diagnostic médical, avec des applications additionnelles pour l'identification légale, la génétique médicale, le contrôle des effets de mutagènes de l'environnement et la recherche biologique moléculaire de base Une forme de cartographie de l'ADN met en jeu le "polymorphisme de longueurs de fragments de restriction" (restriction fragment length polymorphism RFLP) o des enzymes de restriction sont utilisées pour couper un morceau d'ADN provenant d'une source spécifique en morceaux plus courts, ou fragments, d'ADN Ce polymorphisme de restriction fournit un profil unique de fragments d'ADN contenant une séquence unique d'ADN ordonnée selon la taille des fragments (la carte de l'ADN) lorsqu'un spécimen d'ADN est digéré avec des enzymes de restriction Il existe de nombreuses enzymes de restriction connues et chacune reconnaît une séquence d'ADN spécifique de quatre à douze paires de bases à laquelle elle coupe l'ADN, ayant pour conséquence des The human genome comprises some three billion nucleotides forming the 22 pairs of chromosomes plus 2 autosomes, each with pieces of continuous DNA of 50-500 million nucleotides. The organization and sequence of the DNA that make up the human genome contain unique information about the source that provides the DNA A method to gain access to this information is to fragment the DNA at sites with known characteristics and then analyze the fragment size distribution, i.e. the number of nucleotides in each fragment between each of the sites Polymorphisms in the structure of the genome lead to a significant variation in the size of the fragments obtained from the fragmentation of pieces of DNA and make it possible to differentiate one person from another or to form a basis for assessing a person's susceptibility to genetic diseases The analysis of these polymorphisms is often referred to as e mapping of DNA. DNA mapping is an important medical diagnostic tool, with additional applications for legal identification, medical genetics, control of the effects of environmental mutagens, and basic molecular biological research. DNA involves "restriction fragment length polymorphism" (RFLP) restriction enzymes are used to cut a piece of DNA from a specific source into shorter pieces, or fragments This restriction polymorphism provides a unique profile of DNA fragments containing a single sequence of DNA ordered according to fragment size (the DNA map) when a DNA sample is digested with enzymes. There are many known restriction enzymes and each recognizes a specific DNA sequence of four to twelve base pairs to which it cuts the DNA. As a consequence of
fragments d'ADN plus petits.smaller DNA fragments.
Une fois que le morceau d'ADN a été coupé en de nombreux fragments, une électrophorèse est traditionnellement utilisée pour séparer les fragments par taille Un champ électrique est placé au travers d'un gel contenant les fragments, causant le déplacement plus rapide des fragments plus petits par rapport aux plus grands L'électrophorèse sur gel est une technique bien connue qui a été utilisée pour produire des profils de bandes de fragments d'ADN qui forment une carte, pour identifier la source individuelle du morceau d'ADN qui est analysé Les profils de bandes de séquences d'ADN spécifiques sont traditionnellement visualisés en liant des sondes d'ADN radioactives aux fragments d'ADN séparés et en exposant un film approprié aux fragments radioactifs marqués Voir, par exemple, de J I Thornton, "DNA Profiling", C&EN, pp 18-30 ( 20 novembre 1989); de K Heine, "DNA on Trial", Outlook 26:4, pp 8-14 ( 1989) Dans une variation, les extrémités des fragments sont marquées avec un colorant fluorescent de telle sorte que le temps de migration d'un fragment sur une longueur de parcours connue dans un gel électrophorétique peut être déterminé par détection de fluorescence automatique Voir, par exemple, de A V Carrano, "A High-Resolution, Fluorescence-Based, Semiautomated Method for DNA Once the piece of DNA has been cut into many fragments, electrophoresis is traditionally used to separate the fragments by size. An electric field is placed through a gel containing the fragments, causing the fragments to move more rapidly. Small in comparison to larger ones Gel electrophoresis is a well-known technique that has been used to produce band profiles of DNA fragments that form a map, to identify the individual source of the piece of DNA that is being analyzed. Specific DNA sequence stripe profiles are traditionally visualized by binding radioactive DNA probes to the separated DNA fragments and exposing a suitable film to labeled radioactive fragments. See, for example, JI Thornton, "DNA Profiling," C & EN, pp 18-30 (20 November 1989); of K Heine, "DNA on Trial", Outlook 26: 4, pp 8-14 (1989) In one variation, the ends of the fragments are labeled with a fluorescent dye such that the migration time of a fragment on a Known path length in an electrophoretic gel can be determined by automatic fluorescence detection. See, for example, AV Carrano, "A High-Resolution, Fluorescence-Based, Semiautomated Method for DNA
Fingerprinting", 4 Genomics, pp 129-136 ( 1989). Fingerprinting, 4 Genomics, pp 129-136 (1989).
Il existe, cependant, plusieurs limitations à l'utilisation de l'électrophorèse sur gel, en particulier quand de grandes tailles de fragments et le marquage radioactif sont impliqués Dans les deux cas, le processus de séparation électrophorétique prend un temps considérable pour fournir une résolution pour des fragments de grande taille Le développement d'images à partir de sondes radioactives est une étape additionnelle de longue durée, et des risques pour la santé et des inquiétudes sur l'environnement sont associés aux matériaux radioactifs De plus, la distribution des taillesde fragments est logarithmique de telle sorte que la séparation, c'est-à-dire la résolution, pour de grands fragments est inférieure à celle pour de petits fragments L'électrophorèse exige aussi des quantités relativement importantes d'ADN pour There are, however, several limitations to the use of gel electrophoresis, particularly when large fragment sizes and radioactive labeling are involved. In both cases, the electrophoretic separation process takes a considerable time to provide a resolution. for large fragments Development of images from radioactive probes is an additional long-term step, and health risks and environmental concerns are associated with radioactive materials In addition, the distribution of fragment sizes is logarithmic so that separation, i.e. resolution, for large fragments is smaller than for small fragments Electrophoresis also requires relatively large amounts of DNA for
obtenir un profil reconnaissable.get a recognizable profile.
Il est souhaitable de fournir une technique d'analyse de la taille des fragments d'ADN qui utilise seulement de petites quantités d'ADN (peutêtre seulement un brin unique), fournit des informations de taille en un temps court, et a une résolution élevée pour les tailles des fragments Ceux-ci et d'autres problèmes de la technique antérieure sont traités par la présente invention, dans laquelle des techniques basées sur la cytométrie en flux sont utilisées pour obtenir une distribution de la taille de fragments d'ADN It is desirable to provide a technique for size analysis of DNA fragments that uses only small amounts of DNA (perhaps only a single strand), provides size information in a short time, and has high resolution These and other problems of the prior art are addressed by the present invention, in which flow cytometric techniques are used to obtain a size distribution of DNA fragments.
à partir d'un morceau d'ADN.from a piece of DNA.
En conséquence, il est un objet de la présente invention de fournir une détermination rapide de la Accordingly, it is an object of the present invention to provide a rapid determination of the
taille de fragments d'ADN.size of DNA fragments.
Il est un autre objet de la présente invention d'obtenir une résolution élevée de fragments d'ADN, en It is another object of the present invention to obtain a high resolution of DNA fragments, in particular
particulier de fragments longs.particular of long fragments.
Un autre objet de la présente invention est d'exiger seulement un petit échantillon d'ADN pour fournir des cartes précises des tailles de fragments d'ADN. Un autre objet encore de la présente invention est de permettre la détection de la longueur de fragments Another object of the present invention is to require only a small sample of DNA to provide accurate maps of the sizes of DNA fragments. Yet another object of the present invention is to enable the detection of the length of fragments
sans l'utilisation d'indicateurs radioactifs. without the use of radioactive indicators.
Un objet supplémentaire de la présente invention est d'utiliser des intensités de fluorescence pour A further object of the present invention is to use fluorescence intensities for
déterminer la longueur de fi gments d'ADN. determine the length of DNA fragments.
Un autre objet toujours de la présente invention est d'utiliser les capacités de tri associées à la cytométrie en flux pour trier les fragments par taille, c'est-à-dire par longueur, pour une étude ultérieure. D'autres objets, avantages et caractéristiques nouvelles de l'invention seront exposés en partie dans Still another object of the present invention is to use the sorting capabilities associated with flow cytometry to sort fragments by size, i.e. by length, for further study. Other objects, advantages and novel features of the invention will be set forth in part in
la description qui suit, et deviendront en partie the description that follows, and will become partly
apparents aux experts en la matière lors de l'examen de ce qui suit ou peuvent être appris par la pratique de l'invention Les objets et avantages de l'invention peuvent être réalisés et atteints au moyen des objets et combinaisons désignés en particulier dans The objects and advantages of the invention can be realized and attained by means of the objects and combinations designated in particular in the following.
les revendications annexées.the appended claims.
Résumé de l'invention Pour réaliser les objets précédents et d'autres objets, et en accord avec les buts de la présente invention, tels que réalisés et décrits dans les grandes lignes ici, le procédé de cette invention peut comprendre l'utilisation d'une fluorescence induite pour quantifier la longueur de fragments d'ADN Un morceau d'ADN est fragmenté à des sites choisis à l'avance pour produire une pluralité de fragments d'ADN Tous les fragments d'ADN sont traités avec un colorant efficace pour colorer de façon stoechiométrique les nucléotides le long des fragments d'ADN Les fragments d'ADN colorés sont ensuite examinés par rapport à leur fluorescence pour générer un signal de sortie fonctionnellement en rapport avec le nombre de nucléotides dans chacun des fragments d'ADN A la sortie, l'intensité des émissions de fluorescence provenant de chaque fragment est SUMMARY OF THE INVENTION To achieve the foregoing objects and other objects, and in accordance with the objects of the present invention, as made and described in outline herein, the method of this invention may include the use of fluorescence induced to quantify the length of DNA fragments A piece of DNA is fragmented at pre-selected sites to produce a plurality of DNA fragments All DNA fragments are treated with an effective dye to color stoichiometrically the nucleotides along the DNA fragments The colored DNA fragments are then examined for their fluorescence to generate an output signal functionally related to the number of nucleotides in each of the DNA fragments at the output , the intensity of the fluorescence emissions from each fragment is
directement proportionnelle à la longueur du fragment. directly proportional to the length of the fragment.
Description détaillée de l'invention Detailed description of the invention
En accord avec la présente invention, les polymorphismes de l'ADN sont caractérisés, c'est-à-dire "cartographiés", en utilisant des techniques basées sur la cytométrie en flux pour fournir une analyse rapide de la taille de fragments d'ADN obtenus en fragmentant un morceau d'ADN choisi avec une ou plusieurs enzymes choisies pour cliver l'ADN à des sites de séquence connus Un exemple de procédure pour la mesure de la taille est le suivant: 1 Un morceau d'ADN provenant d'une source choisie est fragmenté par digestion par une enzyme pour fournir une solution de fragments d'ADN Les nucléotides compris dans le morceau d'ADN peuvent être colorés, c'est-à-dire marqués, avec un colorant fluorescent approprié avant ou In accordance with the present invention, polymorphisms of DNA are characterized, i.e., "mapped", using flow cytometric based techniques to provide a rapid analysis of the size of DNA fragments. obtained by fragmenting a selected piece of DNA with one or more selected enzymes to cleave the DNA at known sequence sites An example of a procedure for size measurement is as follows: 1 A piece of DNA from a selected source is fragmented by enzyme digestion to provide a solution of DNA fragments The nucleotides included in the piece of DNA can be stained, i.e. labeled, with a suitable fluorescent dye before or
après que le morceau d'ADN soit fragmenté. after the piece of DNA is fragmented.
2 Les fragments d'ADN colorés sont passés à travers un appareil de détection à une concentration et une vitesse efficaces pour fournir seulement un fragment dans le volume d'excitation de la fluorescence à un The stained DNA fragments are passed through a detection apparatus at a concentration and a rate effective to provide only a fragment in the fluorescence excitation volume at a steady state.
moment quelconque.any time.
3 Chaque fragment d'ADN coloré est excité, par exemple, avec un rayonnement laser, dans le volume d'excitation et l'intensité de la fluorescence résultante est mesurée, l'intensité de la fluorescence induite étant une mesure du montant de la coloration sur Each colored DNA fragment is excited, for example, with laser radiation, into the excitation volume and the intensity of the resulting fluorescence is measured, the intensity of the induced fluorescence being a measure of the amount of the staining. sure
le fragment et de la longueur concomitante du fragment. the fragment and the concomitant length of the fragment.
4 Le nombre de fragments à chaque intensité différente fournit une analyse du nombre de fragments de chaque longueur produits à partir du morceau d'ADN par 4 The number of fragments at each different intensity provides an analysis of the number of fragments of each length produced from the piece of DNA by
l'enzyme ou les enzymes choisie(s).the enzyme or enzymes chosen.
Un morceau d'ADN peut d'abord être choisi à partir d'une source quelconque convenable, par exemple, du sang, des échantillons de tissu, du sperme, des spécimens de recherche en laboratoire, etc Le morceau d'ADN est ensuite fragmenté en utilisant une enzyme A piece of DNA can first be chosen from any convenient source, for example, blood, tissue samples, sperm, laboratory research specimens, etc. The piece of DNA is then fragmented using an enzyme
choisie pour une application particulière de l'analyse. chosen for a particular application of the analysis.
Un type d'enzyme particulièrement utile est une endonucléase de restriction qui reconnaît des sites spécifiques, c'est-à-dire des séquences de nucléotides spécifiques, et qui clive le morceau d'ADN au niveau de la séquence identifiée Par exemple, l'enzyme Eco RI coupe au niveau du site de reconnaissance du brin double: One particularly useful type of enzyme is a restriction endonuclease that recognizes specific sites, i.e., specific nucleotide sequences, and cleaves the piece of DNA at the identified sequence. Eco RI enzyme cuts at the double strand recognition site:
GAATTCGAATTC
CTTAAGCTTAAG
Des centaines d'enzymes de restriction différentes et leurs sites de clivage respectifs sont connus Il sera apprécié que des morceaux d'ADN identiques provenant d'une source unique peuvent être digérés avec des enzymes différentes pour donner une famille de cartes Comme alternative, un morceau d'ADN peut être digéré avec des enzymes multiples pour particulariser davantage l'analyse de la distribution de la taille des fragments. La fragmentation, c'est-à-dire la digestion, d'un morceau d'ADN avec une enzyme choisie est un processus bien connu, o les conditions de digestion optimales sont spécifiées par le fabricant de l'enzyme Un processus générique d'enzyme de restriction à utiliser avec 0,2-1 gg d'ADN est donné par J Sambrook et al, Molecular Cloninc, pp 5 28-5 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press ( 1989): 1 Placer la solution d'ADN dans un tube microfuge stérile et mélanger avec suffisamment d'eau pour donner Hundreds of different restriction enzymes and their respective cleavage sites are known. It will be appreciated that identical DNA pieces from a single source can be digested with different enzymes to yield a family of cards. DNA can be digested with multiple enzymes to further particularize the analysis of fragment size distribution. Fragmentation, ie digestion, of a piece of DNA with a chosen enzyme is a well-known process, where optimal digestion conditions are specified by the enzyme manufacturer A generic process of Restriction enzyme for use with 0.2-1 μg of DNA is given by J Sambrook et al., Molecular Cloninc, pp. 28-53, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989): 1. Place the DNA solution in a sterile microfuge tube and mix with enough water to give
un volume de 18 iul.a volume of 18 iul.
2 Ajouter 2 Rl d'un tampon de digestion par enzyme de restriction approprié et mélanger en tapotant le tube Un exemple de tampon peut être formé comme suit m M de glutamate de potassium 50 m M de Tris- acétate (p H 7,5) m M d'acétate de magnésium gg/ml de sérum-albumine bovine (Fraction V; Sigma) Add 2 μl of a suitable restriction enzyme digestion buffer and mix by tapping the tube. An example of a buffer can be formed as follows: mM potassium glutamate 50 mM Tris-acetate (pH 7.5) mM magnesium acetate gg / ml bovine serum albumin (Fraction V, Sigma)
1 m M de 9-mercaptoéthanol.1mM 9-mercaptoethanol.
3 Ajouter 1-2 unités d'enzyme de restriction et mélanger en tapotant le tube, o 1 unité d'enzyme est définie comme le montant requis pour digérer 1 gg d'ADN jusqu'à 1 'achèvement en 1 heure dans le tampon recommandé et à la température recommandée dans 20 g 1 de Add 1-2 units of restriction enzyme and mix by tapping the tube, where 1 unit of enzyme is defined as the amount required to digest 1 g of DNA until completion in 1 hour in the recommended buffer. and at the recommended temperature in 20 g 1 of
mélange réactionnel.reaction mixture.
4 Incuber le mélange à la température appropriée 4 Incubate the mixture at the appropriate temperature
pendant la période de temps requise. during the required period of time.
5 Arrêter la réaction en ajoutant 0,5 M d'EDTA (p H 8,0) jusqu'à la concentration finale de 10 m M. L'ADN peut être fragmenté par une diversité d'autres techniques en plus de la digestion par une enzyme de restriction: 1 Sites d'hypersensibilité à la D Nase (cartographie par la D Nase): la digestion de la chromatine par là D Nase produira des fragments de diverses longueurs dues à des différences des protéines qui se lient à 1 DN et empêchent la coupure de l'ADN par une D Nase aux sites o une protéine est liée (D J. Stop the reaction by adding 0.5 M EDTA (pH 8.0) to the final concentration of 10 mM. The DNA can be fragmented by a variety of other techniques in addition to the digestion with a restriction enzyme: 1 Sites of hypersensitivity to D Nase (mapping by D Nase): the digestion of chromatin by D Nase will produce fragments of various lengths due to differences in proteins that bind to 1 DN and prevent cleavage of DNA by D Nase at sites where a protein is bound (J.
Galas et al, Nucleic Acids Res, 5:3157 ( 1987)). Galas et al, Nucleic Acids Res, 5: 3157 (1987)).
2 Clivage par l'AR Nase des défauts d'appariement à base unique Une sonde d'ARN fluorescente est synthétisée pour être complémentaire d'une séquence d'ADN normal, ou de type sauvage, donnée Cette sonde complémentaire est ensuite réunie à l'ADN cible qui doit être analysé Pour déterminer si un défaut d'appariement à un seul nucléotide existe entre le brin de la sonde fluorescente et le brin d'ADN cible, l'hybride ARN/ADN est traité avec l'AR Nase A L'AR Nase A clive spécifiquement des régions à brin unique d'ARN, clivant donc la région de défaut d'appariement à base unique dans le brin d'ARN fluorescent de l'hybride ARN/ADN (Voir, R M Myers et al, Science 230:1242 ( 1985) et, E F Winter et al, Proc Natl. 2 Cleavage by the AR Nase of single-base mismatches A fluorescent RNA probe is synthesized to be complementary to a given normal or wild-type DNA sequence. This complementary probe is then joined to the Target DNA to be Analyzed To determine if a single nucleotide pairing defect exists between the strand of the fluorescent probe and the target DNA strand, the RNA / DNA hybrid is treated with AR Nase A. AR Nase A specifically cleaves single-stranded regions of RNA, thus cleaving the single-base mismatch region in the RNA-DNA hybrid fluorescent strand (See, RM Myers et al, Science 230 1242 (1985) and EF Winter et al, Proc Natl.
Acad Sci 82:7525 ( 1985)).Acad Sci 82: 7525 (1985)).
3 Clivage par une endonucléase de restriction aidé par Rec A Des oligonucléotides courts couverts par la protéine Rec A sont réunis à la séquence d'ADN cible complémentaire L'hybride ADN/oligonucléotide est traité avec une enzyme Eco RI méthylase Les sites de l'Eco RI qui ne sont pas protégés par l'oligonucléotide sont méthylés tandis que les sites de l'Eco RI protégés par l'oligonucléotide restent inchangés L'endonucléase de restriction Eco RI clivera seulement les sites protégés (c'est-à-dire non méthylés) Ce procédé a été utilisé pour engendrer des fragments de plus de 500 000 paires Rec A restriction endonuclease cleavage Short oligonucleotides covered by Rec A protein are joined to the complementary target DNA sequence. The hybrid DNA / oligonucleotide is treated with an enzyme Eco RI methylase Eco sites. RIs that are not protected by the oligonucleotide are methylated while oligonucleotide-protected Eco RI sites remain unchanged Eco RI restriction endonuclease will cleave only protected sites (i.e., unmethylated sites). This process was used to generate fragments of more than 500,000 pairs
de bases (L J Ferrin, Science, 254:1494 ( 1991)). basic (Ferrin, J., Science, 254: 1494 (1991)).
4 La fragmentation de l'ADN peut aussi être accomplie par des techniques différentes de la digestion par une enzyme Par exemple, une excitation ultrasonore à différentes fréquences pourrait être utilisée pour produire une famille de distributions de tailles Divers produits chimiques réagissent aussi avec les nucléotides et peuvent être utilisés pour fragmenter des morceaux d'ADN. Les fragments d'ADN doivent être colorés avec un colorant fluorescent pour l'analyse cytométrique en flux Un colorant fluorescent est choisi pour se lier de façon stoechiométrique aux fragments d'ADN Le 4 DNA fragmentation can also be accomplished by different techniques of enzyme digestion. For example, ultrasound excitation at different frequencies could be used to produce a family of size distributions. Various chemicals also react with nucleotides and can be used to fragment pieces of DNA. DNA fragments to be stained with a fluorescent dye for flow cytometric analysis A fluorescent dye is chosen to bind stoichiometrically to the DNA fragments.
complexe peut être formé de manières différentes, c'est- complex can be formed in different ways, that is,
à-dire ADN à brin unique, ADN à doubles brins, paires de bases spécifiques, etc Des colorants bien connus incluent des colorants de bromure d'éthidium, acridine orange, iodure de propidium, DAPI, Hoechst, chromomycine, mithramycine, 9-amino-acridine, bromure d'éthidium hétérodyne, cyanine asymétrique, ou des combinaisons de ces colorants pour un transfert d'énergie Le colorant ou les colorants choisi(s) se lient aux oligonucléotides de façon stoechiométrique le long de la séquence d'ADN, c'est-à-dire que les sites de liaison le long des fragments sont tels que le nombre total de molécules de colorant sur une longueur quelconque d'ADN est proportionnel au nombre de paires de bases (pb) formant l'ADN Par exemple, avec le protocole de coloration exposé ci-dessous, le nombre de molécules de bromure d'éthidium liées à un fragment d'ADN est stoechiométrique et peut valoir jusqu'à la moitié du nombre de paires de bases Voir, par exemple, de C R Cantor et al, "Binding of Smaller Molecules to Nucleic Acids", dans Biophysical Chemistry, Part III: The Behavior of Biolocical Macromolecules, p 1251, W H. ie, single-stranded DNA, double-stranded DNA, specific base pairs, etc. Well-known dyes include ethidium bromide dyes, acridine orange, propidium iodide, DAPI, Hoechst, chromomycin, mithramycin, 9-amino Acridine, heterodyne ethidium bromide, asymmetric cyanine, or combinations of these dyes for energy transfer The selected dye or dyes bind stoichiometrically to oligonucleotides along the DNA sequence. that is, the binding sites along the fragments are such that the total number of dye molecules over any length of DNA is proportional to the number of base pairs (pb) forming the DNA For example, with the staining protocol set out below, the number of ethidium bromide molecules bound to a DNA fragment is stoichiometric and can be up to half the number of base pairs See, for example, CR Cantor et al, "Binding o Smaller Molecules to Nucleic Acids ", in Biophysical Chemistry, Part III: The Behavior of Biolocical Macromolecules, p 1251, W H.
Freeman and Company, 1980.Freeman and Company, 1980.
Un exemple de procédure pour colorer avec du bromure d'éthidium est: Ajouter un échantillon d'ADN à une solution contenant 1-5 gg de bromure d'éthidium par ml de solution et à un tampon TE 8,0 Un tampon convenable est disponible auprès de GIBCO et est composé de 10 m M de Tris-H Cl et 1 m M d'EDTA, p H 8,0 La réaction est complète en -10 minutes à température ambiante. Les fragments d'ADN colorés sont ensuite analysés en utilisant des techniques de détection sensibles à la fluorescence pour déterminer l'intensité de la fluorescence provenant de chaque fragment passant à travers une région de détection et ayant une résolution élevée pour distinguer les tailles de fragments voisines Théoriquement, bien que seulement un morceau unique d'ADN soit nécessaire pour obtenir l'analyse de distribution souhaitée, une solution typique sera formée à partir de nombreux morceaux d'ADN et une distribution An example procedure for staining with ethidium bromide is: Add a DNA sample to a solution containing 1-5 g of ethidium bromide per ml of solution and a TE 8.0 buffer. A suitable buffer is available from GIBCO and is composed of 10 mM Tris-HCl and 1 mM EDTA, pH 8.0 The reaction is complete in -10 minutes at room temperature. The colored DNA fragments are then analyzed using fluorescence-sensitive detection techniques to determine the intensity of fluorescence from each fragment passing through a detection region and having a high resolution to distinguish neighboring fragment sizes. Theoretically, although only a single piece of DNA is needed to obtain the desired distribution analysis, a typical solution will be formed from many pieces of DNA and a distribution
relative de la taille des fragments d'ADN est obtenue. relative size of the DNA fragments is obtained.
Les fragments d'ADN auront de façon typique des tailles The DNA fragments will typically have sizes
allant de 100 pb à 500 000 pb.ranging from 100 bp to 500,000 bp.
Comment former un flux séquentiel de particules pour une utilisation dans un cytomètre en flux ou un appareil de détection sensible à la fluorescence similaire est bien connu Voir, par exemple, le brevet des Etats-Unis NO 3,710,933, publié le 16 janvier 1973, de Fulwyler et al, et Flow Cytometry and Sortinc, 2nd Ed., ed M R Melamed et al, Wiley-Liss, New York, 1990, incorporé ici à titre de référence Une solution diluée des fragments d'ADN est formée jusqu'à une concentration faible efficace pour fournir des fragments espacés les uns des autres dans le flux, de telle sorte que seulement un fragment unique est présent dans le volume d'excitation La solution de fragments d'ADN est ensuite injectée dans une gaine de flux laminaire, pour passer à travers la chambre de détection pour l'excitation au laser d'un fragment à la fois Les débits de l'échantillon et de la gaine sont ajustés pour maintenir une séparation entre les particules et pour fournir le temps optimal pour chaque particule dans la source d'excitation Un temps optimal est déterminé à partir de la considération du taux de dimensionnement, de la sensibilité de la détection et de la photostabilité des marqueurs colorés Une source d'excitation convenable est choisie pour amorcer la fluorescence dans le colorant utilisé pour colorer les fragments d'ADN Par exemple, un laser à argon à 488 nm est efficace pour causer la fluorescence du bromure How to form a sequential flow of particles for use in a flow cytometer or similar fluorescence-sensitive detection apparatus is well known See, for example, US Patent No. 3,710,933, issued January 16, 1973, to Fulwyler et al., and Flow Cytometry and Sortinc, 2nd Ed., ed MR Melamed et al, Wiley-Liss, NY, 1990, incorporated herein by reference A diluted solution of DNA fragments is formed to a low concentration effective to provide spaced apart fragments in the flow, such that only a single fragment is present in the excitation volume The DNA fragment solution is then injected into a laminar flow sheath, to through the detection chamber for laser excitation of one fragment at a time The flow rates of the sample and the sheath are adjusted to maintain a separation between the particles and to provide the optimal time in For each particle in the excitation source An optimal time is determined from the consideration of the sizing rate, the sensitivity of the detection and the photostability of the colored markers. A suitable excitation source is chosen to initiate the fluorescence in the dye used to stain the DNA fragments For example, an argon laser at 488 nm is effective in causing the fluorescence of bromide
d'éthidium dans une bande aux environs de 600 nm. ethidium in a band at about 600 nm.
La sensibilité du système de cytométrie en flux classique est améliorée en fournissant un petit volume d'excitation, par exemple, de 10-20 gm de diamètre et 100 gm de longueur, avec un faisceau laser étroitement focalisé Voir, par exemple, de J H Hahn et The sensitivity of the conventional flow cytometry system is improved by providing a small excitation volume, for example, of 10-20 μm in diameter and 100 μm in length, with a tightly focused laser beam. See, for example, JH Hahn and
al., "Laser-Induced Fluorescence Detection of Rhodamine- al., "Laser-Induced Fluorescence Detection of Rhodamine-
6 G at 6 x 10-15 MI", Appl Spectrosc 45:743 ( 1991), décrivant un volume de sonde de 11 pl, incorporé ici comme référence Le petit volume de la sonde réduit 6 G at 6 x 10-15 MI ", Appl Spectrosc 45: 743 (1991), describing a probe volume of 11 μl, incorporated herein by reference The small volume of the probe reduced
de beaucoup le montant de l'émission du fond, c'est-à- much the amount of the issue of the fund, ie
dire du bruit, dans le signal de sortie. say noise, in the output signal.
L'excitation laser peut provenir d'un laser pulsé avec une impulsion de, par exemple, environ 70 ps de largeur, avec un déclenchement dans le temps pour différencier les photons d'émission du colorant The laser excitation can come from a pulsed laser with a pulse of, for example, about 70 ps in width, with a time trigger to differentiate the emission photons from the dye
(retardés) des photons de diffusion Raman (instantanés). (delayed) Raman scattering photons (snapshots).
il Voir, par exemple, de E B Shera et ai, "Detection of Single Fluorescent Molecules", Chem Phys Lett 174:553 (novembre 1990) Les photons diffusés instantanément sont produits pendant la durée d'impulsion du laser tandis que les émissions du colorant s'évanouissent avec une durée de vie de plusieurs nanosecondes, de telle sorte qu'une fenêtre retardée est efficace pour discriminer les photons de fluorescence des photons de See, for example, EB Shera et al, "Detection of Single Fluorescent Molecules", Chem Phys Lett 174: 553 (November 1990) Instantly scattered photons are produced during laser pulse duration while dye emissions fade with a lifetime of several nanoseconds, so that a delayed window is effective to discriminate fluorescence photons from photons of
diffusion Raman.Raman scattering.
Comme alternative, le laser peut être un laser As an alternative, the laser can be a laser
continu Voir, par exemple, de S A Soper, "Single- For example, see S A Soper, "Single-
Molecule Detection of Rhodamine-6 G in Ethanolic Molecule Detection of Rhodamine-6G in Ethanolic
Solutions Using Continuous Wave Laser Excitation", Anal. Solutions Using Continuous Laser Wave Excitation ", Anal.
Chem 63:432 ( 1991) Le nombre de photons émis peut être accru en accroissant le temps de transit des fragments d'ADN à travers le faisceau laser et en choisissant un colorant et un solvant avec une photostabilité élevée pour le colorant Le nombre de photons détectés (photoélectrons) est aussi accru en accroissant la sensibilité de l'appareil de détection En outre, la présente invention implique des fragments d'ADN plutôt que des molécules uniques, de telle sorte que plus le fragment est long, plus l'intensité de fluorescence Chem 63: 432 (1991) The number of photons emitted can be increased by increasing the transit time of the DNA fragments through the laser beam and by choosing a dye and a solvent with a high photostability for the dye The number of photons In addition, the present invention involves DNA fragments rather than single molecules, so that the longer the fragment, the higher the intensity of the detection. fluorescence
de sortie obtenue est grande.output obtained is great.
On comprendra aussi que la solution peut contenir un peu de colorant qui n'a pas été lié aux fragments d'ADN Ce colorant sera excité conjointement avec le colorant lié et le système doit discriminer la It will also be understood that the solution may contain some dye which has not been bound to the DNA fragments. This dye will be excited together with the bound dye and the system must discriminate against the dye.
fluorescence provenant du colorant non lié et du colo- fluorescence from the unbound dye and colourant
rant lié Dans un mode de réalisation, un laser puisé et une technique de détection à déclenchement peuvent être utilisés pour fournir cette discrimination Par exemple, les durées de vie des états excités pour le bromure d'éthidium non lié et lié valent 2 ns et 23 ns, respectivement Donc, le système de détection peut être déclenché pour détecter seulement la fluorescence provenant du bromure d'éthidium lié et, donc, fournir un signal de sortie fonctionnellement en rapport avec la longueur-du fragment d'ADN Comme alternative, un colorant qui fournit une fluorescence ou des longueurs d'onde d'absorption différentes dans les états lié et non lié,peut être choisi Par exemple, une série de colorants à la cyanine asymétrique est rapportée par I.D Johnson et al, "Asymmetric Cyanine Dyes for Fluorescent Staining and Quantification of Nucleic Acids", Fluorescence Spectroscopy, Abstract 1806, FASEB In one embodiment, a pulsed laser and a tripping detection technique can be used to provide this discrimination. For example, the excited state durations for unbound and bound ethidium bromide are 2 ns and 23. Therefore, the detection system can be triggered to detect only the fluorescence from the bound ethidium bromide and thus provide an output signal functionally related to the length of the DNA fragment. As an alternative, a dye which provides fluorescence or different absorption wavelengths in bound and unbound states, may be selected. For example, a series of asymmetric cyanine dyes is reported by ID Johnson et al., Asymmetric Cyanine Dyes for Fluorescent Staining and Quantification of Nucleic Acids ", Fluorescence Spectroscopy, Abstract 1806, FASEB
J 6:A 314, NO 1 (janvier 1992).J 6: A 314, NO. 1 (January 1992).
L'émission de fluorescence polarisée fournit aussi un moyen de discrimination des molécules de colorant liées et non liées La polarisation de la fluorescence de colorants non liés à l'ADN est inférieure ou égale à 0,05, alors que la polarisation de la fluorescence de fluorochromes liés à l'ADN peut être comprise entre 0,20 et 0,30 Voir, par exemple, de L S Cram et al, "Fluorescence Polarization and Pulse Width Analysis of The polarized fluorescence emission also provides a means of discriminating bound and unbound dye molecules. The polarization of fluorescence of non-DNA dyes is less than or equal to 0.05, whereas the polarization of the fluorescence of DNA-related fluorochromes can range from 0.20 to 0.30. See, for example, LS Cram et al, "Fluorescence Polarization and Pulse Width Analysis of
Chromosomes by a Flow System", J Histochem Cytochem. Chromosomes by a Flow System ", J. Histochem Cytochem.
27:445, NO 1 ( 1979); de T M Jovin, "Fluorescence Polarization and Energy Transfer: Theory and Application", Flow Cytometry and Sortinci, Ed M R. Melamed et al, pp 156, John Wiley & Sons ( 1979) La discrimination est accomplie en utilisant une source d'excitation polarisée et en détectant les émissions à travers un filtre polarisant placé devant un détecteur de fluorescence Le filtre polarisant est aligné avec la direction de polarisation parallèle à la direction de 27: 445, NO. 1 (1979); of TM Jovin, "Fluorescence Polarization and Energy Transfer: Theory and Application", Flow Cytometry and Sortinci, Ed M R. Melamed et al., pp. 156, John Wiley & Sons (1979) Discrimination is accomplished using an excitation source polarized and detecting emissions through a polarizing filter placed in front of a fluorescence detector The polarizing filter is aligned with the direction of polarization parallel to the direction of
polarisation de la source d'excitation. polarization of the excitation source.
Pour l'excitation continue par un laser continu, un schéma du type à transfert d'énergie peut être utilisé pour distinguer des molécules de colorant liées et non liées Si un deuxième colorant est aussi lié à l'ADN, les molécules liées du premier colorant utilisées pour la mesure de la taille des fragments se trouveront à proximité immédiate des molécules du deuxième colorant de telle sorte que l'excitation des molécules du deuxième colorant aura pour conséquence un transfert d'énergie des molécules du deuxième colorant aux molécules du premier colorant Les molécules non liées des premier et deuxième colorants dans le fluide environnant ne seront pas assez proches pour que s'effectue un transfert d'énergie Donc, seules les molécules liées du premier colorant seront fluorescentes pour la détermination de la longueur des fragments lorsque les molécules du deuxième colorant sont For continuous excitation by a continuous laser, an energy transfer type scheme can be used to distinguish bound and unbound dye molecules If a second dye is also bound to the DNA, bound molecules of the first dye used for measuring the size of the fragments will be in the immediate vicinity of the molecules of the second dye so that the excitation of the molecules of the second dye will result in a transfer of energy of the molecules of the second dye to the molecules of the first dye. Unbound molecules of the first and second dyes in the surrounding fluid will not be close enough for a transfer of energy to occur. Therefore, only the linked molecules of the first dye will be fluorescent for the determination of the length of the fragments when the molecules of the second dye are
excitées.excited.
A titre d'exemple, les colorants de Hoechst et de chromomycine spécifiques de l'ADN peuvent transférer de l'énergie Lorsque des molécules de colorant de Hoechst sont excitées, elles peuvent transférer de l'énergie à des molécules de chromomycine dans un rayon de transfert By way of example, DNA-specific Hoechst and chromomycin dyes can transfer energy. When Hoechst dye molecules are excited, they can transfer energy to chromomycin molecules within a radius of transfer
de quelques dizaines de nanomètres (quelques angstrôms). a few tens of nanometers (a few angstroms).
Cette paire de transfert d'énergie est utilisée dans l'analyse de la fluorescence de chromosomes par cytométrie en flux Voir, par exemple, de R G. Langlois et al, "Cytochemical Studies of Metaphase Chromosomes by Flow Cytometry", Chromosoma 77:229 ( 1980) L'excitation par transfert d'énergie peut aussi être faite en excitant les nucléotides à environ 260 nm avec un transfert d'énergie subséquent aux molécules de colorant liées Voir, par exemple, de J B Lepecq et al., "A Fluorescent Complex between Ethidium Bromide and This energy transfer pair is used in the analysis of chromosome fluorescence by flow cytometry. See, for example, R. Langlois et al., "Cytochemical Studies of Metaphase Chromosomes by Flow Cytometry", Chromosoma 77: 229. (1980) Excitation energy transfer can also be made by exciting the nucleotides at about 260 nm with subsequent energy transfer to the dye molecules related to, for example, JB Lepecq et al., "A Fluorescent Complex between Ethidium Bromide and
Nucleic Acids", J Mol Biol 27:87 ( 1967). Nucleic Acids, J Mol Biol 27:87 (1967).
L'appareil du type à cytométrie en flux fournit aussi une résolution élevée pour distinguer des longueurs de fragments voisines En effet, la résolution est généralement limitée par le bruit de grenaille dans les photons provenant des émissions de fluorescence et la résolution en pour-cent s'accroît au fur et à mesure que le nombre de paires de bases (pb) formant les The flow cytometry apparatus also provides a high resolution for distinguishing neighboring fragment lengths. Indeed, the resolution is generally limited by the shot noise in the photons from the fluorescence emission and the resolution in percent. increases as the number of base pairs (bp) forming the
fragments d'ADN s'accroît.DNA fragments grow.
La résolution en pour-cent (R) est déterminée par la longueur du fragment (L), la fraction du fragment marquée (f), le nombre de photoélectrons recueillis par marqueur (b) (b vaut de façon typique 30 environ), et le nombre de fois que la taille d'un fragment est mesurée (N) L'intensité moyenne est données par g La résolution en pour-cent, R, pour un écart type de 3 G, est donnée par: R (%) = 3 * 100 *N*(L*f*b*)>/(L*f*b*), o The resolution in percent (R) is determined by the length of the fragment (L), the fraction of the labeled fragment (f), the number of photoelectrons collected by marker (b) (b is typically about 30), and the number of times the size of a fragment is measured (N) The average intensity is given by g The resolution in percent, R, for a standard deviation of 3 G, is given by: R (%) = 3 * 100 * N * (L * f * b *)> / (L * f * b *), o
g = L*f*b; = g.g = L * f * b; = g.
Par exemple, considérons le cas d'un fragment long de 1000 bases L= 1000, f= 0,5 (par exemple, bromure d'éthidium), b= 30 Pour N= 1, g= 15 000, c= 122,474 et R= 2,45 % La résolution varie comme Ni Pour N= 1000, a= 3,87 et R= 0,0775 % Mesurer la taille de 10, 100 ou For example, consider the case of a 1000 bases long fragment L = 1000, f = 0.5 (for example, ethidium bromide), b = 30 For N = 1, g = 15 000, c = 122.474 and R = 2.45% The resolution varies as Ni For N = 1000, a = 3.87 and R = 0.0775% Measure the size of 10, 100 or
même 10 000 fragments identiques n'est pas un problème. even 10,000 identical fragments is not a problem.
Il y a bien plus que 10 000 fragments dans une bande d'électrophorèse typique Donc, on peut voir que la résolution peut être bien meilleure que 1 % sur un fragment de 100 000 pb, alors qu'une résolution de seulement 10-20 % pourrait être escomptée pour la séparation de fragments dans la zone de 100 000 pb par électrophorèse sur gel et la résolution se dégrade davantage au fur et à mesure que la longueur du fragment s'accroit. La cartographie de l'ADN selon la présente invention peut aussi être faite très rapidement Une carte d'ADN typique par électrophorèse a environ 50 bandes A 1000 fragments par bande, 50 bandes exigerait seulement environ 8,3 minutes pour développer une carte avec une vitesse d'analyse des fragments de 100 fragments par seconde Si seulement une bande unique est exigée pour la résolution souhaitée, le temps d'analyse serait seulement d'environ 1 seconde Si la résolution souhaitée exige 100 fragments par bande, alors l'analyse There are more than 10,000 fragments in a typical electrophoresis band So, we can see that the resolution can be much better than 1% on a fragment of 100,000 bp, while a resolution of only 10-20% could be expected for fragment separation in the 100,000 bp region by gel electrophoresis and the resolution further degrades as fragment length increases. The mapping of the DNA according to the present invention can also be done very quickly. A typical DNA map by electrophoresis has about 50 bands at 1000 fragments per band, 50 bands would require only about 8.3 minutes to develop a map with a speed if only a single band is required for the desired resolution, the analysis time would be only about 1 second If the desired resolution requires 100 fragments per band, then the analysis
de 50 bandes prendrait seulement environ 50 secondes. 50 bands would only take about 50 seconds.
Dans une adaptation de la présente invention, des sondes d'hybridation peuvent être liées aux fragments de restriction de l'ADN et associées à des longueurs différentes des fragments Les sondes d'hybridation contiennent traditionnellement un colorant de la sonde et sont hybridées avec des fragments d'ADN par appariement de paires de bases provenant du morceau d'ADN qui est étudié L'excitation des fragments d'ADN hybridés peut ensuite être conçue pour exciter à la fois le colorant de mesure de la taille et le colorant de la sonde, de telle sorte qu'une corrélation des sorties de fluorescence associe la sonde à diverses longueurs de fragments L'hybridation d'une sonde à l'ADN in situ est examinée dans Methods in Cell Biolocry, Vol 33, de Z. Darzynkiewicz et al Ed, Academic Press, Inc (New York, 1990), Chapter 37, "Fluorescence In Situ In an adaptation of the present invention, hybridization probes can be linked to DNA restriction fragments and associated with different lengths of fragments. Hybridization probes traditionally contain a probe dye and are hybridized with fragments. DNA pairing by base pairing from the piece of DNA being studied The excitation of the hybridized DNA fragments can then be designed to excite both the size-measuring dye and the probe dye, such that a correlation of the fluorescence outputs associates the probe with various lengths of fragments Hybridization of a probe with DNA in situ is examined in Methods in Cell Biolocry, Vol 33, by Z. Darzynkiewicz and al Ed. , Academic Press, Inc. (New York, 1990), Chapter 37, "Fluorescence In Situ
Hybridization with DNA Probes", pp 383. Hybridization with DNA Probes ", pp 383.
En plus de la détermination de longueur, il est possible de déduire des informations grossières sur la composition en bases à partir des brins d'ADN Par exemple, le colorant de Hoechst spécifique de l'ADN se lie de préférence à des régions de l'ADN riches en éléments AT et la chromomycine se lie de préférence à des régions riches en éléments GC En excitant la fluorescence de ces deux colorants, comme il est fait dans l'analyse des chromosomes à deux variables (voir, de Langlois, Supra), les rapports AT/GC pour des fragments peuvent être déterminés Ce rapport fournit des informations de cartographie supplémentaires, en plus de la longueur desfragments D'autres colorants de liaison avec différentes spécificités pour les séquences peuvent être In addition to the length determination, it is possible to deduce coarse information on the base composition from the DNA strands. For example, the DNA-specific Hoechst dye binds preferably to regions of the DNA. AT-rich DNAs and chromomycin binds preferentially to regions rich in GC elements by exciting the fluorescence of these two dyes, as is done in bivariate chromosome analysis (see, de Langlois, Supra), AT / GC ratios for fragments can be determined This report provides additional mapping information, in addition to the length of the fragments Other binding dyes with different specificities for the sequences can be
utilisés pour la caractérisation desbasesdes fragments. used for the characterization of the bases of the fragments.
De plus, la synthèse d'un morceau d'ADN en présence de précurseurs nucléotides marqués par fluorescence marquera le morceau d'ADN en fonction de sa composition en bases et cette information peut être associée ultérieurement à In addition, the synthesis of a piece of DNA in the presence of fluorescently labeled nucleotide precursors will mark the piece of DNA according to its composition in bases and this information can be associated later with
l'analyse par fluorescence de la longueur des fragments. fluorescence analysis of the length of the fragments.
Par exemple, la réplication d'un morceau d'ADN en utilisant trois nucléotides normaux et un nucléotide C marqué par fluorescence donnera donc des informations concernant le nombre de nucléotides G dans le morceau original, puisque les nucléotides C marqués se lieront seulement aux nucléotides G. Une capacité additionnelle du système peut être fournie en utilisant divers systèmes de tri associés aux cytomètres en flux Voir, par exemple, le brevet des Etats-Unis NO 3,710,933, supra, et Flow C Vtometrv and Sorting, supra Une capacité de tri permet de trier une taille de fragment ou plus à partir du flux pour un traitement ou une étude additionnel(le) Si des sondes d'hybridation sont utilisées, le tri peut séparer les For example, replication of a piece of DNA using three normal nucleotides and a fluorescently labeled nucleotide C will therefore give information regarding the number of nucleotides G in the original piece, since labeled nucleotides C will bind only to nucleotides G Additional system capacity can be provided using various sorting systems associated with flow cytometers See, for example, US Patent No. 3,710,933, supra, and Flow C Vtometrv and Sorting, supra. sorting a fragment size or more from the stream for further processing or study (le) If hybridization probes are used, sorting can separate the
fragments hybridés du flux.hybridized fragments of the flux.
Un appareil de tri traditionnel, tel que décrit dans le brevet des EtatsUnis NO 3,710,933 et dans, de T Lindmo, "Flow Sorters for Biological Cells", Flow Cvtometry and Sortinq Second Edition, Ed; M Melamed et al. , pp 145-169, John Wiley & Sons ( 1990), utilise les A conventional sorting apparatus, as described in U.S. Patent No. 3,710,933 and in, by Lindmo, "Flow Sorters for Biological Cells", Flow Cvtometry and Sortinq Second Edition, Ed; M Melamed et al. , pp 145-169, John Wiley & Sons (1990), uses the
signaux de sortie de fluorescence décrits ci-dessus. fluorescence output signals described above.
Après que les fragments sont passés à travers le volume d'excitation pour générer la sortie, le flux hydrodynamique est brisé en gouttelettes par, par exemple, des vibrations ultrasonores, chaque goutte ne contenant pas plus d'un fragment Les gouttes contenant des fragments d'ADN qui ont une réponse de fluorescence choisie à une excitation sont chargées par l'application d'une impulsion de tension élevée à travers les gouttes, qui passent ensuite à travers des plaques chargées qui génèrent un champ électrostatique pour dévier sélectivement les gouttes chargées La charge appliquée aux gouttes choisies est contrôlée par des éléments de circuit qui sont sensibles aux émissions de fluorescence provenant du volume d'excitation dans le cytomètre en flux, o l'impulsion de charge est activée pour produire une déviation de gouttes contenant une matière émettant de la fluorescence à une longueur d'onde et une After the fragments are passed through the excitation volume to generate the output, the hydrodynamic flow is broken up into droplets by, for example, ultrasonic vibrations, each drop containing no more than one fragment. Which have a selected fluorescence response to an excitation are charged by applying a high voltage pulse through the drops, which then pass through charged plates that generate an electrostatic field to selectively deflect the charged drops. charge applied to the chosen drops is controlled by circuit elements that are sensitive to fluorescence emissions from the excitation volume in the flow cytometer, where the charge pulse is activated to produce a drop drift containing a material emitting fluorescence at a wavelength and a
intensité choisies.chosen intensity.
Bien que la description ci-dessus a concerné des Although the above description has concerned
morceaux d'ADN, le processus est également applicable à des brins d'ARN Toute référence à l'ADN dans ce cas devra être interprétée pour inclure l'ARN De même, la forme du signal détecté est enseignée comme étant de la fluorescence Cependant, toute forme d'émission lumineuse peut être obtenue, en fonction du colorant spécifique, de sorte que le terme "fluorescence" devra être interprété pour inclure la phosphorescence et la luminescence De plus, l'ADN ou l'ARN cartographié peut ne pas provenir obligatoirement d'un être humain, puisque tous les organismes ont un génome qui détermine pieces of DNA, the process is also applicable to RNA strands Any reference to the DNA in this case will have to be interpreted to include RNA Similarly, the form of the detected signal is taught as being fluorescence However, any form of light emission can be obtained, depending on the specific dye, so that the term "fluorescence" should be interpreted to include phosphorescence and luminescence. In addition, the mapped DNA or RNA may not necessarily come from of a human being, since all organisms have a genome that determines
leurs caractéristiques spécifiques. their specific characteristics.
La description précédente des modes de réalisation The preceding description of the embodiments
préférés de l'invention a été présentée à des fins preferred embodiments of the invention has been presented for
d'illustration et de description Elle n'est pas illustration and description It is not
destinée à être exhaustive ou à limiter l'invention à la forme précise décrite et, évidemment, de nombreuses modification et variations sont possibles à la lumière de l'enseignement ci-dessus Les modes de réalisation ont été choisis et décrits afin de mieux expliquer les principes de l'invention et son application pratique, pour permettre par ce moyen aux experts en la matière de mieux utiliser l'invention dans divers modes de réalisation et avec diverses modifications selon ce qui convient pour l'utilisation particulière envisagée Le cadre de cette invention est intentionnellement défini intended to be exhaustive or to limit the invention to the precise form described and, obviously, many modifications and variations are possible in light of the teaching above. The embodiments have been chosen and described in order to better explain the principles of the invention and its practical application, thereby to enable those skilled in the art to better utilize the invention in various embodiments and with various modifications as appropriate for the particular use contemplated. is intentionally defined
par les revendications qui y sont annexées. by the claims appended hereto.
Claims (14)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US84111492A | 1992-02-25 | 1992-02-25 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2687687A1 true FR2687687A1 (en) | 1993-08-27 |
| FR2687687B1 FR2687687B1 (en) | 1997-05-23 |
Family
ID=25284049
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR9302100A Expired - Fee Related FR2687687B1 (en) | 1992-02-25 | 1993-02-24 | METHOD FOR MEASURING THE SIZE OF DNA FRAGMENTS. |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH067198A (en) |
| CA (1) | CA2089423A1 (en) |
| FR (1) | FR2687687B1 (en) |
| GB (1) | GB2264496B (en) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6221654B1 (en) | 1996-09-25 | 2001-04-24 | California Institute Of Technology | Method and apparatus for analysis and sorting of polynucleotides based on size |
| US6540895B1 (en) | 1997-09-23 | 2003-04-01 | California Institute Of Technology | Microfabricated cell sorter for chemical and biological materials |
| US7351376B1 (en) | 2000-06-05 | 2008-04-01 | California Institute Of Technology | Integrated active flux microfluidic devices and methods |
| EP1384022A4 (en) | 2001-04-06 | 2004-08-04 | California Inst Of Techn | Nucleic acid amplification utilizing microfluidic devices |
| AU2001286615A1 (en) * | 2001-08-22 | 2003-03-18 | Union Biometrica, Inc. | Improved axial pattern analysis utilizing organisms having defined marker patterns |
| US7691333B2 (en) | 2001-11-30 | 2010-04-06 | Fluidigm Corporation | Microfluidic device and methods of using same |
| WO2003048295A1 (en) | 2001-11-30 | 2003-06-12 | Fluidigm Corporation | Microfluidic device and methods of using same |
| WO2003085379A2 (en) | 2002-04-01 | 2003-10-16 | Fluidigm Corporation | Microfluidic particle-analysis systems |
| CA2500283A1 (en) | 2002-09-25 | 2004-04-08 | California Institute Of Technology | Microfluidic large scale integration |
| WO2004040001A2 (en) | 2002-10-02 | 2004-05-13 | California Institute Of Technology | Microfluidic nucleic acid analysis |
| US7476363B2 (en) | 2003-04-03 | 2009-01-13 | Fluidigm Corporation | Microfluidic devices and methods of using same |
| US20050145496A1 (en) | 2003-04-03 | 2005-07-07 | Federico Goodsaid | Thermal reaction device and method for using the same |
| US8828663B2 (en) | 2005-03-18 | 2014-09-09 | Fluidigm Corporation | Thermal reaction device and method for using the same |
| US7604965B2 (en) | 2003-04-03 | 2009-10-20 | Fluidigm Corporation | Thermal reaction device and method for using the same |
| EP3184624A1 (en) * | 2015-12-22 | 2017-06-28 | Diagenode S.A. | Frequency optimized devices and methods for microfluidic sonication |
| US10914913B2 (en) * | 2018-03-30 | 2021-02-09 | Idexx Laboratories, Inc. | Flow cytometer, laser optics assembly thereof, and methods of assembling the same |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0309969A2 (en) * | 1987-09-28 | 1989-04-05 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Method of gene mapping |
| WO1989003432A1 (en) * | 1987-10-07 | 1989-04-20 | United States Department Of Energy | Method for rapid base sequencing in dna and rna |
| WO1990000623A1 (en) * | 1988-07-08 | 1990-01-25 | Wallac Oy | Multi-label time-resolved fluorescence analysis of nucleic acid sequences using lanthanide chelates |
| WO1991002244A1 (en) * | 1989-08-07 | 1991-02-21 | Applied Biosystems, Inc. | Nucleic acid fractionation by counter-migration capillary electrophoresis |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH04504059A (en) * | 1989-03-10 | 1992-07-23 | ミリポア・コーポレーシヨン | Nucleic acid sequencing using chemiluminescent detection |
-
1993
- 1993-02-08 GB GB9302411A patent/GB2264496B/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-02-12 CA CA 2089423 patent/CA2089423A1/en not_active Abandoned
- 1993-02-24 FR FR9302100A patent/FR2687687B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-02-25 JP JP5037039A patent/JPH067198A/en active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0309969A2 (en) * | 1987-09-28 | 1989-04-05 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Method of gene mapping |
| WO1989003432A1 (en) * | 1987-10-07 | 1989-04-20 | United States Department Of Energy | Method for rapid base sequencing in dna and rna |
| WO1990000623A1 (en) * | 1988-07-08 | 1990-01-25 | Wallac Oy | Multi-label time-resolved fluorescence analysis of nucleic acid sequences using lanthanide chelates |
| WO1991002244A1 (en) * | 1989-08-07 | 1991-02-21 | Applied Biosystems, Inc. | Nucleic acid fractionation by counter-migration capillary electrophoresis |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CA2089423A1 (en) | 1993-08-26 |
| GB9302411D0 (en) | 1993-03-24 |
| FR2687687B1 (en) | 1997-05-23 |
| GB2264496B (en) | 1995-10-25 |
| JPH067198A (en) | 1994-01-18 |
| GB2264496A (en) | 1993-09-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5558998A (en) | DNA fragment sizing and sorting by laser-induced fluorescence | |
| Castro et al. | Single-molecule detection of specific nucleic acid sequences in unamplified genomic DNA | |
| FR2687687A1 (en) | METHOD FOR MEASURING THE SIZE OF DNA FRAGMENTS | |
| EP2362209B1 (en) | Apparatus for detection and discrimination of the type of a molecular object | |
| US20070166743A1 (en) | Quantum dots and methods of use thereof | |
| US9816931B2 (en) | Managing variation in spectroscopic intensity measurements through the use of a reference component | |
| Faulds et al. | DNA detection by surface enhanced resonance Raman scattering (SERRS) | |
| Yan et al. | Characteristics of different nucleic acid staining dyes for DNA fragment sizing by flow cytometry | |
| JP2007533971A (en) | How to improve the accuracy of particle detection | |
| JP2009540326A (en) | Increased specificity of analyte detection by measuring bound and unbound labels | |
| US20090088982A1 (en) | Co-detection of single polypeptide and polynucleotide molecules | |
| JP3097205B2 (en) | Electrophoretic separation detection method | |
| WO1998010097A2 (en) | Method and apparatus for single molecule two color fluorescent detection and molecular weight and concentration determination | |
| US20240156981A1 (en) | Polynucleotide-linked bioconjugates and methods of making and using | |
| EP2743684B1 (en) | Method for detecting fluorescent particles | |
| CN1886661B (en) | Improved homogeneous time-resolved energy transfer assay | |
| EP2669376B1 (en) | Method for identifying polymorphism of nucleic acid molecules | |
| US20200240992A1 (en) | Methods and compositions for biosensing | |
| Bowen et al. | Single‐molecule Fluorescence Spectroscopy of TOTO on Poly‐AT and Poly‐GC DNA¶ | |
| EP1831698B9 (en) | Analytical composition and method | |
| Jett et al. | DNA fragment sizing and sorting by laser-induced fluorescence | |
| JP3186753B2 (en) | Nucleic acid fragment sample and single-stranded DNA oligomer | |
| US20240175072A1 (en) | Method And Composition For Multiplexed And Multimodal Single Cell Analysis | |
| JP3264276B2 (en) | Method for detecting nucleic acid fragment molecular weight separation pattern | |
| Ambrose et al. | Flow cytometric sizing of DNA fragments |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| TP | Transmission of property | ||
| ST | Notification of lapse |