JPH0670760A

JPH0670760A - デングウイルス

Info

Publication number: JPH0670760A
Application number: JP5127968A
Authority: JP
Inventors: Fuu Janrin; ジアンリン・フー; Tan Buun-Fan; ブーン−フアン・タン; Yapu Iuuhian; イウ−ヒアン・ヤプ; Chan Yo-Chon; ヨウ−チヨン・チヤン; Tan In-Uii; イン−ウイー・タン
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1992-04-30
Filing date: 1993-04-30
Publication date: 1994-03-15

Abstract

(57)【要約】【目的】１型デングウイルスの新規の株ＤＥＮＩ−Ｓ
２７５／９０（ＥＣＡＣＣＶ９２０４２１１１）を提
供する。【構成】上記ウイルスの全ｃＤＮＡ配列をクローニン
グし、そのタンパク質コーディングフラグメントを発現
プラスミドの構築に使用する。不活化形態のＤＥＮ１−
Ｓ２７５／９０、ＤＥＮ１−Ｓ２７５／９０ポリペプチ
ドまたはその融合タンパク質は、ＤＥＮ１−Ｓ２７５／
９０及び他のＤＥＮ１ウイルスに対する免疫用のワクチ
ンに組込むことができる。更に、診断試薬、例えばＤＥ
Ｎ１−Ｓ２７５／９０タンパク質に対する標識抗体及び
ＤＥＮ１ウイルスを検出するためのキットをも提供す
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は１型デングウイルスに関
する。

【０００２】

【従来技術】デングウイルス感染は、デング熱（ＤＦ）
またはそのより重度の状態である出血性デング熱（ＤＨ
Ｆ）及びデング熱ショック症候群（ＤＳＳ）を誘発し得
る。ＤＨＦは全世界、特に東南アジアで主要なウイルス
疾患である。

【０００３】デング熱ウイルスにはＦｌａｖｉｖｉｒａ
ｄａｅ科に属する４種類の血清型（ＤＥＮ１、ＤＥＮ
２、ＤＥＮ３及びＤＥＮ４）が存在する。

【０００４】ＤＥＮ２（Ｊａｍａｉｃａ）の完全なゲノ
ム配列は、Ｄｅｕｂｅｌｅｔａｌ；Ｖｉｒｏｌｏ
ｇｙ１６５，２３４−２４４（１９８８）により
報告されている。ＤＥＮ３（Ｈ８７）の完全なゲノム配
列は、ＯｓａｔｏｍｉａｎｄＳｕｍｉｙｏｓｈｉ；
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７６，６４３−６４７（１
９９０）により報告されている。ＤＥＮ４の完全なゲノ
ム配列は、Ｚｈａｏｅｔａｌ；Ｖｉｒｏｌｏｇｙ
１５５，７７−８８により報告されている。またこれ
までＤＥＮ１（ＮａｕｒｕＩｓｌａｎｄ）では、その
変異体の部分配列のみが決定されている（Ｍａｓｏｎ
ｅｔａｌ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１６１，２６２−
２６７１９８７）。

【０００５】本発明者らは、ＤＥＮ１のこれまで未知で
あった株を同定し、その完全ヌクレオチド配列を決定し
た。新規株ＤＥＮ１−Ｓ２７５／９０はブダペスト条約
の規定に基づいて１９９２年４月２１日付けでｔｈｅ
ＥｕｒｏｐｅａｎＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｏｆＡｎ
ｉｍａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣ
Ｃ），ＰｏｒｔｏｎＤｏｗｎ，ＧＢに寄託し、受託番
号Ｖ９２０４２１１１を付与されている。ＤＥＮ１−Ｓ
２７５／９０は、配列相同の点でＤＥＮ２、ＤＥＮ３及
びＤＥＮ４と著しく異なる。ＤＥＮ１−Ｓ２７５／９０
とＤＥＮ１（ＮａｕｒｕＩｓｌａｎｄ）の間にも多数
の顕著な相違が存在する。

【０００６】従って本発明は、ＤＥＮ１−Ｓ２７５／９
０（ＥＣＡＣＣＶ９２０４０１１１）を提供する。本
発明は更に、診断用試薬として使用されるＤＥＮ１−Ｓ
２７５／９０（ＥＣＡＣＣＶ９２０４０１１１）を提
供する。本発明は更に、診断用試薬またはワクチンとし
て使用される不活化形態のＤＥＮ１−Ｓ２７５／９０を
提供する。

【０００７】本発明は更に、配列番号１の核酸配列及び
配列番号１に実質的に対応するＤＮＡ配列、例えば１つ
以上のヌクレオチドが変異しているが翻訳されれば同じ
タンパク質配列を与え得るその変異体をも提供する。本
発明は更に、かかるＤＮＡポリヌクレオチドのフラグメ
ント、特にウイルスのゲノムのＣ、Ｃ’、ＰｒｅＭ、
Ｍ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４
Ａ、ＮＳ４Ｂ及びＮＳ５遺伝子をコードするフラグメン
トをも提供する。配列番号１の核酸配列における上記好
ましいフラグメントの開始点及び終結点を下記表１に示
す。表１には更に、配列番号１及び２のナンバリングを
使用してこれらの遺伝子によってコードされるタンパク
質の開始点及び終結点をも示す。

【０００８】

【表１】本発明の核酸配列は、ＤＥＮ１−Ｓ２７５／９０の存在
有無を決定するためのアッセイにプローブとして使用す
ることもできるし、ベクター、例えば発現ベクターに組
み込むこともできる。

【０００９】本発明の核酸フラグメントは既知の化学的
合成法により製造することもできるし、既知の組換技術
を使用してウイルス自体からクローニングすることもで
きる。更に本発明のフラグメントは、ＤＮＡもしくはＲ
ＮＡの複製、ＤＮＡからＲＮＡフラグメントへの転写ま
たはＲＮＡフラグメントからＤＮＡフラグメントへの逆
転写により製造することもできる。このような転写は無
細胞系で実施してもよいし、細胞内で例えばクローニン
グにより実施してもよい。無細胞系は、緩衝液及び任意
の必要なもしくは所望の補因子と共に、適当なレプレカ
ーゼ、転写酵素または逆転写酵素と、適当なヌクレオチ
ド前駆物質と、核酸鋳型または適当な配列とを含む。

【００１０】本発明は更に、配列番号１及び配列番号２
に示すようなポリプロテイン及びそのフラグメント、例
えば先の表１に明示したようなＣ、Ｃ’、ＰｒｅＭ、
Ｍ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４
Ａ、ＮＳ４Ｂ及びＮＳ５タンパク質を提供する。本発明
は従って、配列番号２に示す配列に実質的に対応するア
ミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそのフラグメン
トを提供する。更に、これらのペプチドを含む融合タン
パク質も提供する。

【００１１】本発明のポリプロテイン及びタンパク質
は、化学的ペプチド合成により製造することもできる
し、適当な細胞中でタンパク質をコードするＤＮＡを有
する発現ベクターを用いてＤＮＡを発現させた後、発現
されたタンパク質を回収することにより製造することも
できる。融合タンパク質を含む組換タンパク質を発現及
び回収する方法は当業者に周知である。

【００１２】例えば、本発明のポリペプチドを発現させ
るために発現ベクターを構築することができる。本発明
のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み、適当な
真核または原核宿主が提供されれば該ポリペプチドを発
現し得る発現ベクターを製造する。ＤＮＡ配列のプロモ
ーター、転写終結部位、翻訳開始コドン及び翻訳終結コ
ドンを含む適当な転写及び翻訳調節エレメントを与え
る。ＤＮＡ配列は、ベクターに適合可能な宿主内でポリ
ペプチドが発現し得るように適正な読取り枠内に提供す
る。発現ベクターは例えば、細菌（例えば大腸菌）、酵
母、昆虫または哺乳動物細胞中で本発明の核酸配列を発
現するのに適するように選択し得る。バキュロウイルス
発現系を使用してもよい。該核酸は、該フラグメント単
独でコードされるタンパク質またはペプチドを生産する
ために発現させることもできるし、或いは、ＤＥＮ１−
Ｓ２７５／９０もしくはそのタンパク質、例えば先の表
１に示したようなＥ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３またはＮ
Ｓ５を、第２アミノ酸配列、例えばグルタチオンＳ−ト
ランスフェラーゼもしくはマルトース結合タンパク質か
ら誘導されるＣ末端配列またはＣ末端もしくはＮ末端シ
グナル配列と融合させた融合タンパク質を得るために発
現させることもできる。このような配列により例えば融
合タンパク質を細胞から分泌させることができる。次
に、発現ベクターに適当な宿主を与える。ベクターを含
む細胞を増殖させ、発現を起こさせる。ベクターはプラ
スミドまたはウイルスベクターであり得る。

【００１３】回収及び、必要に応じて宿主細胞中で発現
ベクターによって産生されたタンパク質を更に精製する
工程は、当業者に既知の手段により実施することができ
る。このような手段は、宿主細胞の他のタンパク質から
本発明のタンパク質を分離するように設計される。適当
な手段としては、回収されたタンパク質をクロマトグラ
フィーによって分離することが挙げられる。

【００１４】本発明のポリプロテイン及びペプチドは、
ＤＥＮ１−Ｓ２７５／９０または他のＤＥＮ１ウイルス
に対するワクチン用の免疫原として使用することができ
る。死菌ワクチン組成物を調製するためには、本発明の
タンパク質及びペプチドを医薬的に容認可能な担体また
は希釈剤と組み合わせることが適当である。ワクチン組
成物は、ヒトをＤＥＮ１感染に対して免疫する方法に使
用することができる。

【００１５】ＤＥＮ１に対するワクチン組成物は２種以
上のペプチドの混合物を含むことが有利である。例え
ば、キャプシド（Ｃ）、ＭまたはＥペプチドと共に、１
種の非構造（ＮＳ）ペプチド、例えばＮＳ１またはＮＳ
３を含み得る。２種以上のＮＳペプチドの混合物を使用
してもよい。

【００１６】本発明のタンパク質及びペプチドは更に、
ＤＥＮ１、特にＤＥＮ１−Ｓ２７５／９０の存在有無を
検出するためのイムノアッセイに抗原として使用するこ
ともできる。タンパク質及びペプチドは、必要によって
は検出可能なラベル（例えば放射性同位体、ビオチンま
たは発蛍光団）で標識する。イムノアッセイは、ＤＥＮ
１に対する抗体を含む疑いのある試料に既知量の標識タ
ンパク質（抗原）を接触させ、標識抗原を含む抗体−抗
原結合体の存在有無を検出することにより実施し得る。

【００１７】本発明は更に、本発明の上記タンパク質及
びペプチドに対する抗体をも提供する。抗体はモノクロ
ーナルまたはポリクローナルであり得る。当業者に既知
のハイブリドーマ技術または組換手段によってモノクロ
ーナル抗体を製造して、ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅ
ｄａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）のようなハイブリッド抗体
を提供することができる。

【００１８】本発明の抗体はＤＥＮ１感染の治療法、例
えば受動免疫に使用することができる。更に、試料中の
ＤＥＮ１の存在有無を検出するための診断法、例えばイ
ムノアッセイに、抗体を使用することもできる。抗体は
本発明のタンパク質及びペプチドについて上述したよう
に標識することができる。抗体は更に、ウイルス感染細
胞を死滅させるように選択された毒素または同位体で標
識することもできる。ＮＳ１はデングウイルス感染細胞
の表面上で発現されるので、ＮＳ１に対する抗体は特に
有利である。

【００１９】本発明の抗体は、試料中のＤＥＮ１タンパ
ク質の存在有無を検出するための方法に使用することも
できる。該方法は、ＤＥＮ１タンパク質（抗原）を含む
疑いのある試料に抗体を接触させ、形成された抗体−抗
原結合体の量を検出することからなり得る。

【００２０】本発明のイムノアッセイは例えば競合法
（例えばラジオイムノアッセイ−ＲＩＡ）または非競合
法（例えば酵素結合イムノソルベントアッセイ−ＥＬＩ
ＳＡ）であり得る。

【００２１】以下、実施例により本発明を説明する。

【００２２】

【実施例】実施例１ＤＥＮ１ウイルスの株Ｓ２７５／９０は、１９９０年に
シンガポールのＤＨＦ患者の血清から、まずＡＰ６１
（Ａｅｄｅｓｐｓｕｅｄｏｓｃｕｔｅｌｌａｒｉｓ）
細胞中で３代継代し、次いでＣ６／３６（Ａｅｄｅｓ
ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）細胞中で３代継代することによ
り単離され、タイプ特異的モノクローナル抗体を使用す
る蛍光免疫測定法により同定された。Ｃ６／３６細胞中
で更に８〜１３代継代した後、ウイルス感染培養液を、
ポリエチレングリコールで沈降しさらに３０％スクロー
スクッション（６）上で超遠心することにより部分精製
した。ウイルスＲＮＡを精製ウイルスから、ドデシル硫
酸ナトリウムの存在下にフェノールで処理することによ
り抽出した。ランダムなプライマーを使用してｃＤＮＡ
を合成（ｃＤＮＡＳｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍ
Ｐｌｕｓ，Ａｍｅｒｓｈａｍ）した後、雑多のｃＤＮ
ＡをｐＵＣ１８ベクターのＥｃｏＲＩ部位中にＥｃｏＲ
Ｉアダプター（Ｐｒｏｍｅｇａ）によってクローニング
した。デング特異的配列を含むＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ形質転換体を、株Ｓ２７５／９０ＲＮＡの
逆転写によって調製した³²Ｐ標識ｃＤＮＡプローブを用
いてコロニーハイブリダイズすることによってスクリー
ニングした。クローニング操作によって、０．５ｋｂ〜
２．７ｋｂのサイズの挿入物を含む一部重複ｃＤＮＡク
ローンが得られた。これらの一次クローン及び繰り込み
欠失分析（ｎｅｓｔｅｄｄｅｌｅｔｉｏｎａｌａｎａ
ｌｙｓｉｓ）（Ｅｒａｓｅ−ａ−ＢａｓｅＳｙｓｔｅ
ｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ）によって得られたそれらのサブク
ローンの端部の二重鎖配列を決定した（Ｓｅｑｕｅｎａ
ｓｅＶｅｒｓｉｏｎ２．０，ＵｎｉｔｅｄＳｔａ
ｔｅｓＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）。生成された配列デ
ータは、Ｓ２７５／９０のゲノム配列の約９０％をカバ
ーしていた。

【００２３】フラビウイルスの５’及び３’末端におい
て、無傷の末端を有するクローンを得る上で問題を惹起
すると考えられる二次構造が仮定されている（４，７，
８）。かかる配列とゲノムの末端配列とを含むクローン
を得る機会を増大するために、５’及び３’の非コーデ
ィング領域を配列決定する別の方法を使用した。（ウイ
ルスＲＮＡの尾部にポリ（Ａ）を連結した後）ランダム
プライミング及びオリゴ（ｄＴ）プライミングによって
株Ｓ２７５／９０のｃＤＮＡを得、これらを、それぞれ
７９６及び１００９０／Ｂの特異的プライマーの存在下
にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。
次いで注目のｃＤＮＡをｐＵＣ１８ベクター中に連結し
た。プライマーのヌクレオチド配列は、プライマー７９
６が５’ＣＣＧＴＧＡＡＴＣＣＴＧＧＧＴＧ
ＴＣ３’であり、プライマー１００９０／Ｂが５’Ｇ
ＧＧＡＡＴＴＣＣＡＧＴＧＧＴＧＴＧＧＡ
ＴＣ３’であって且つその５’末端にはＢａｍＨＩ部
位を有していた。プライマーの配列は、株Ｓ２７５／９
０の初代クローンのものから選択した。５’非コーディ
ング領域における配列を得るために、まずランダムなｃ
ＤＮＡクローンを前述のごとく生産し、ＥｃｏＲＩアダ
プターに連結してから、ｐＵＣ１８ベクターのＥｃｏＲ
Ｉ部位に挿入した。ｐＵＣ１８ベクター中で、雑多のｃ
ＤＮＡ挿入物の連結産物の側部にＭ１３の逆方向及び正
方向の配列プライマーを連結した。正方向配列プライマ
ーはＰＣＲ用プライマーの１つとして使用した。連結ｃ
ＤＮＡクローンはＰＣＲ用鋳型として、プライマー７９
６（これは、鋳型の＋鎖に株Ｓ２７５／９０のヌクレオ
チド位置８０８〜８２５において結合する）及び市販の
Ｍ１３一重鎖プライマー（５’ＧＴＡＡＡＡＣＧＡ
ＣＧＧＣＣＡＧＴ３’，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の存
在下に使用した。増幅されたｃＤＮＡは、一方の末端に
ｐＵＣ１８ベクター由来のポリリンカーを、且つ他方の
末端に（ヌクレオチド位置７２８のところに）ＸｂａＩ
部位を含んでいた。３’非コーディング領域において
は、ｃＤＮＡ合成の前に追加ステップを含んだ。抽出
後、精製デングウイルスＲＮＡをＡＴＰの存在下にポリ
Ａポリメラーゼ（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によって伸長させた。これ
に次いで、オリゴ（ｄＴ）をプライマーとして使用して
ｃＤＮＡ合成を行ない、第１鎖ｃＤＮＡを合成した。同
じ操作を繰り返して、ＥｃｏＲＩアダプターを連結し、
ｐＵＣ１８ベクターのＥｃｏＲＩ部位に挿入した。連結
産物を、プライマー１００９０／Ｂ（これは、鋳型の−
鎖に株Ｓ２７５／９０のヌクレオチド位置１０，０８６
〜１０，０９９において結合する）及び市販のＭ１３一
重鎖プライマーを使用してＰＣＲ増幅した。

【００２４】それぞれ９４℃で１分間、５５℃で２分間
及び７２℃で３分間の熱変性（ｍｅｌｔｉｎｇ）、アニ
ーリング及び伸長（ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ）条
件下の３０サイクルのＰＣＲによって、全ての試料を増
幅した。増幅したＤＮＡを、まずアガロースゲル中で電
気泳動し、次いで適当な制限酵素で消化することによっ
て精製した。５’非コーディング領域におけるＰＣＲ増
幅ｃＤＮＡをＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩを用いて二重消化
し、３’非コーディング領域のものはＢａｍＨＩ及びＥ
ｃｏＲＩで消化してから、ｐＵＣ１８ベクターの適当な
部位中にクローニングした。クローンをスクリーニング
し、前述のごとき二重鎖配列決定を行った。

【００２５】一部重複ｃＤＮＡクローンから得られた配
列データを、Ｗｉｌｂｕｒ及びＬｉｐｍａｎ（９）のコ
ンピュータープログラムを使用し、４種のデング血清型
ＤＥＮ１、ＤＥＮ２、ＤＥＮ３及びＤＥＮ４の公開配列
との相同性により順位付けした。

【００２６】配列番号１は、ヌクレオチド１０，７１８
個の長さを有する株Ｓ２７５／９０の全ヌクレオチド配
列とその推定アミノ酸配列とを示す。読み枠は、ヌクレ
オチド８１〜８３に対応する最初のＡＵＧ開始コドンか
ら始まって、アミノ酸３３９６個のポリタンパク質をコ
ードするヌクレオチド１０，１８８個の読み枠を含む。
５’非コーディング領域には８０個のヌクレオチドが、
３’非コーディング領域には４５０個のヌクレオチドが
ある。読み枠の最初のＡＵＧコドンに先立つ５’非コー
ディング領域にある配列は、全てのデングウイルスタイ
プにおいて保存されていると見られる（１〜４）。株Ｓ
２７５／９０の３’非コーディング領域の長さは、ＤＥ
Ｎ２（ヌクレオチド４１２個）、ＤＥＮ３（ヌクレオチ
ド４３３個）及びＤＥＮ４（ヌクレオチド３８４個）よ
りも長い。

【００２７】株Ｓ２７５／９０のヌクレオチド組成は、
３１．９％がＡ、２５．９％がＧ、２１．５％がＴ、及
び２０．７％がＣであった。他のフラビウイルスについ
て報告されているように、同じくプリンに富む組成が認
められ、３’末端にポリ（Ａ）部分はない。

【００２８】個々のタンパク質をコードする断片は、４
種のデング血清型から決定される全てのタンパク質につ
いてのタンパク質配列データとの比較に基づいている。
かかる切断部位によって、タンパク質プロセッシングに
おけるウイルスまたは細胞プロテアーゼの関与が明らか
になり得る。Ｃ、ｐｒｅＭ、Ｍ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２
Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ及びＮＳ５
タンパク質を、それぞれ部位Ｍ／ＭＮＱＲＫＫ、Ａ／Ｆ
ＸＬ、ＲＸＫＲ／ＳＶ、Ｘ／ＭＲＣＸＧ、ＶＱＡ／ＤＸ
ＧＣＶ、ＶＸＡ／ＧＸＧ、Ｘ／ＳＷＰＬＮ、ＫＸＱＲ／
ＸＧ、ＧＲＸ／Ｓ、ＶＸＡ／ＮＥ及びＲ／Ｇで切断し
た。但し、Ｘは任意の残基を指す。ＮＳ２Ａ、ＮＳ３及
びＮＳ４Ｂの切断部位は、最初はＲｉｃｅら（１０）に
よって確立された周知のコンセンサス配列（４，５）と
一致する。

【００２９】（１９７４年に単離された）ナウル島（Ｎ
ａｕｒｕＩｓｌａｎｄ）ＤＥＮ１株及び株Ｓ２７５／
９０の構造領域及び非構造領域（ＮＳ１に対する５’非
コーディング末端，ヌクレオチド約２４００個の長さ）
のヌクレオチド配列を比較した。ヌクレオチド変異は、
トランジションが構造領域においては約８５．０％〔ト
ランジション／（トランジション＋トランスバージョ
ン）×１００％〕で、ＮＳ１領域においては９２．１％
であることが判った。構造領域においてはかかる塩基変
異の１５％が、またＮＳ１領域においては７．９％がト
ランスバージョンであった。全部で２３６個のヌクレオ
チド相違で、たった２７個のアミノ酸置換しか生じなか
った。表２に示したように、ヌクレオチドの相同率は９
３．１％であるが、翻訳されたときのアミノ酸の相同率
は、それより高くて９７．６％であった。両鎖は、１６
年を経て異なる地域から単離されたものであるが、２つ
の鎖間には高度の相同性が認められた。表２からは、株
Ｓ２７５／９０が、ＤＥＮ２及びＤＥＮ４よりもＤＥＮ
３とより高い相同性を示すことも判る。各遺伝子のヌク
レオチド分岐は、翻訳後のアミノ酸分岐よりも小さい。
最大のヌクレオチド及びアミノ酸変異、即ち最大の進化
は、４種全てのデング血清型において非構造遺伝子ＮＳ
２Ａに見られる。高い相同性は、保存配列を含むＮＳ３
及びＮＳ５において見られる。

【００３０】Ｃｈｕら（１１）は、ＤＥＮ１株の３種の
同地基準標本（タイ、フィリピン及び西インド諸島南東
部）をエンベロープ領域において遺伝的に比較した。彼
らは、ヌクレオチド変異は５％未満であるが、翻訳相違
はアミノ酸レベルで２％であることを見い出した。本発
明者らの株Ｓ２７５／９０は、エンベロープ領域におい
て７．７％のヌクレオチド変異及び２．６％のアミノ酸
変異を示す。Ｒｉｃｏ−Ｈｅｓｓｅ（６）は選択したＥ
／ＮＳ１領域内のヌクレオチド配列を比較し、地域及び
時間が異なる４０個のＤＥＮ１株における進化的関係を
推定した。

【００３１】

【表２】実施例２発現プラスミドの構築標準組換えＤＮＡ技術を使用して、図１に概略を示すと
共に以下に説明する発現プラスミドを構築した（Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌ
ｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａ
ｌ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏ
ｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．）。

【００３２】プラスミド構築のため、実施例１のごとき
ＤＥＮ１ウイルスシンガポール株Ｓ２７５／９０由来の
ＤＥＮ１ｃＤＮＡクローンＤＩ−２７５のＥ、ＮＳ
１、ＮＳ２、ＮＳ３及びＮＳ５に対するｃＤＮＡ領域を
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅し、制限
酵素で消化した。制限酵素部位は、表３及び配列番号３
〜１２に示したＰＣＲに使用したオリゴヌクレオチドプ
ライマー中に構築した。

【００３３】制限酵素で消化したＥ、ＮＳ３及びＮＳ５
ｃＤＮＡフラグメントはｐＧＥＸ−ＫＧベクター（Ｇ
ｕａｎａｎｄＤｉｘｏｎ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．１９２，２６２−２６７，１９９１）に連結し、Ｎ
Ｓ１及びＮＳ２ｃＤＮＡフラグメントは、ｐＭＡＬ−
ｃベクター及びｐＭＡＬ−ｃＲＩベクター（ＮｅｗＥｎ
ｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，それぞれＦｏｒｄｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒ．２，９６−１０
７，１９９１；Ｍａｉｎａｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅ
７４，３６５−３７３，１９８８；ｄｉＧｕａｎｅ
ｔａｌ．，Ｇｅｎｅ，６７，２１−３０，１９９１）
に連結した。ＮＳ５ｃＤＮＡは２段階で構築した。Ｎ
Ｓ５のヌクレオチド７５４４〜８３６５由来のｃＤＮＡ
フラグメントである５’領域をＰＣＲによって作製し、
ＳａｌＩ及びＣｌａＩで消化した。ＮＳ５の３’末端に
対するヌクレオチド８２７５（ＣｌａＩ）由来のフラグ
メントである３’領域は、クローンＤＩ−２７５のｃＤ
ＮＡ（Ｄ−２７５ｃＤＮＡ）から、ＣｌａＩ及びＳａ
ｃＩ二重消化によって直接単離した。ＮＳ５の２つの部
分を連結し、次いでそれをｐＧＥＸ−ＫＧベクター中に
連結した。組換えプラスミドをＥ．ｃｏｌｉＤＨ５α
またはｃ６００ＨＦ１株中に形質転換した。全てのプ
ラスミドが、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼまた
はマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）のＣ末端に融合
したデングウイルスタンパク質をコードした。

【００３４】実施例３組換えＥ．ｃｏｌｉ由来のＥ、ＮＳ３及びＮＳ５タンパ
ク質の精製Ｅ、ＮＳ３及びＮＳ５遺伝子を（別々に）含むＥ．ｃｏ
ｌｉを、Ａ₆₀₀が０．５のＬＢ培地中で３７℃で増殖さ
せ、次いで０．２ｍＭのＩＰＴＧを用いて３０℃で２時
間誘導した。細菌を回収し、氷上で、０．１ｍｇ／ｍｌ
リゾチーム、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、０．５
μｇ／ｍｌアプロチニン、０．０５μｇ／ｍｌロイペ
プチン、０．２５μｇ／ｍｌペプスタチン、５ｍＭＤ
ＴＴ及び０．１７５μｇ／ｍｌＰＭＳＦを含むＭＴＰ
ＢＳ緩衝液（０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１６ＭＮ
ａ₂ＨＰＯ₄、０．００５ＭＮａＨ₂ＰＯ₄）中に再懸濁
させ、氷上に１０分間維持した。細胞を、冷やしなが
ら、最大出力で１分間×３回超音波処理した。溶解物を
１２，０００×ｇで遠心した。上清を１ｍｌグルタチオ
ン−セファロース４Ｂビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に
加え、回転装置上で４℃で１時間インキュベートして融
合タンパク質を吸着させた。次いでビーズを遠心し、Ｐ
ＢＳ緩衝液で（遠心することにより）６回以上または分
光光度計のＡ₂₈₀における洗浄液読取り値がゼロとなる
まで洗浄した。ビーズをトロンビン切断緩衝液中に再懸
濁させ、デングウイルスタンパク質をトロンビンによっ
てビーズから、４℃で１時間かけて切断した。デングウ
イルスタンパク質を含む上清を遠心によって回収し、タ
ンパク質を−８０℃で貯蔵した。

【００３５】実施例４封入体由来のＮＳ１融合タンパク質の可溶化及び精製ＮＳ１融合タンパク質を含むＥ．ｃｏｌｉを上述のごと
く増殖させた。但し、０．３ｍＭのＩＰＴＧを用いて１
６時間かけてｔａｃプロモータを誘導した。細菌を回収
し、１ｇ湿潤重量のＥ．ｃｏｌｉを、１．６ｍｇ／ｍｌ
のリゾチームを含む５ｍｌの溶解緩衝液中に再懸濁さ
せ、１５秒間×２回超音波処理した。１０００×ｇで遠
心した後、上清を再度遠心した（２５，０００×ｇ）。
ペレットを２ｍｌの水に再懸濁させ、終濃度０．５％の
ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０ｍＭＥＤＴＡ及び１
００ｍＭＮａＣｌを加え、次いで２０，０００×ｇで
２回遠心した。ペレットを１ｍＭの２Ｍ尿素で２回洗浄
し、０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ８．８、０．１
４Ｍ２−メルカプトエタノール中に８Ｍの尿素を含む
溶液中に溶解した。水を加えることにより尿素濃度を１
Ｍまで低下させ、アミロース樹脂（ＮｅｗＥｎｇｌａ
ｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を加えて、２２℃で１時間、可
溶化融合タンパク質を吸着させた。アミロース樹脂を緩
衝液（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）で５
回、透明上清のＡ₂₈₀がゼロに近づくまで洗浄した。終
濃度５０ｍＭのマルトースを加えて融合タンパク質を溶
出し、遠心によってビーズを除去することにより回収し
た。

【００３６】実施例５可溶性ＮＳ２融合タンパク質の精製上記実施例３のごとくｐＭＡＬ−ｃＲＩ／ＮＳ２−１を
用いて形質転換したＥ．ｃｏｌｉを増殖、溶解及び超音
波処理し、上記実施例４のごとく可溶性ＮＳ２融合タン
パク質を含む透明な抽出物をアミロース樹脂上に吸着さ
せ、洗浄し、ＮＳ２融合タンパク質を溶出した。

【００３７】実施例６ウサギ及びマウスの免疫上記実施例３及び５のごとき組換えＥ．ｃｏｌｉから精
製したＥ、ＮＳ２、ＮＳ３及びＮＳ５の可溶性融合タン
パク質、及び実施例４のごとく２Ｍ尿素洗浄段階まで精
製したＮＳ１融合タンパク質を含む封入体を、１０％Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにおいて分離ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥを行なうためにＳＤＳ含有緩衝液中に直接入れ
た。０．０５％クーマシーブルーで１０分間染色するこ
とにより、タンパク質を可視化した。ゲルセグメントを
切り取り、無菌ＰＢＳ中でホモジナイズし、完全フロイ
ントアジュバントと混合し、シロウサギに、１回当たり
約２００〜５００μｇの融合タンパク質を１日目、６日
目及び２１日目に筋肉内または皮下注射した。最後の２
次投与から１４日間、ウサギを飼育した。マウスの免疫
に対しては、１２日齢雌スイスマウス（Ｓｗｉｓｓｍ
ｉｃｅ）を、フロイントアジュバントを含むまたは含ま
ない、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３及びＮＳ５可溶性融
合タンパク質で免疫した。１回当たり約２０μｇの融合
タンパク質を、１日目、４日目及び１４日目に腹腔内ま
たは皮下注射した。マウスは、最後の注射から１４日間
飼育した。ウサギ及びマウスの血清をＩＦＡ及び免疫沈
降アッセイに使用した。

【００３８】実施例７放射免疫沈降法Ｄ−２７５の構造及び非構造デングウイルス組換え融合
タンパク質に対するウサギ及びマウス抗体について、放
射免疫沈降法を実施した。Ｃ６／３６細胞をデングウイ
ルスＳ２７５／９０株に感染させてから３６〜４０時間
後に、細胞培地を３時間かけて３μｇ／ｍｌアクチノマ
イシンＤを含むメチオニン非含有培地で置換え、次い
で、２０μＣｉ／ｍｌの［36Ｓ］メチオニン及び３μｇ
／ｍｌのアクチノマイチンＤを含む新鮮な培地を更に３
時間かけて加えた。細胞を冷たいＰＢＳで洗浄し、ＲＩ
ＰＡ緩衝液〔１００ｍＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ７．
５、１５０ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、０．
１％ＳＤＳ、０．１％ＮＰ４０、１％ナトリウムデ
キソコレート、１００μｇ／ｍｌＰＭＳＦ〕中に氷上
で１時間かけて溶解し、次いで１０００×ｇで１０分清
澄化した。溶解物を正常血清及びプロテインＡ−セファ
ロースでプレクリアー（ｐｒｅｃｌｅａｒｅ）した。免
疫沈降のために、冷たいアセトンによって固定した正常
な未感染Ｃ６／３６細胞抽出物を予め吸収させたウサギ
及びマウス血清を標識抗原と一緒に４℃で一晩インキュ
ベートした。ウイルス−タンパク質結合体を、プロテイ
ンＡ−セファロースを用いて沈降させ、免疫沈降緩衝液
〔１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．４、０．０５
％アプロチニン、１％ＮＰ４０、２ｍＭＥＤＴＡ、
０．１５ＭＮａＣｌ〕で６回洗浄し、次いで２倍量の
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液を加え、２分間沸騰させ、上清
を１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルに適用した。
固定、増強及び乾燥した後、ゲルをＸ線フィルムに暴露
した。結果から、マウス（図２）及びウサギ（図３）に
おいて組換えＥ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３及びＮＳ５に
対する抗体が生産されていることが確証された。かかる
抗体は、感染Ｃ６／３６細胞中で合成された天然Ｅ、Ｎ
Ｓ１、ＮＳ２、ＮＳ３及びＮＳ５タンパク質と反応し
た。

【００３９】実施例８間接免疫蛍光法２日間でデングウイルスＳ２７５／９０に感染させたＣ
６／３６細胞を、免疫蛍光法のために、冷たいアセトン
を用いてガラスプレート上に固定した。ウサギ及びマウ
スの血清の２倍希釈液を固定した細胞と一緒に３７℃で
１時間インキュベートし、次いでＰＢＳで洗浄した。蛍
光顕微鏡を使用して観察するために、第二抗体をフルオ
レセインに結合させ、１時間インキュベートし、ＰＢＳ
で洗浄した。図４から、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３及
びＮＳ５に対する抗血清はデングウイルスＳ２７５／９
０感染細胞と特異的に反応したが、対照抗血清は反応し
なかったことが判る。（表４に示したように）結果を定
量化すると、マウス及びウサギの両方において、全ての
組換えデングウイルスタンパク質（Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ
２、ＮＳ３及びＮＳ５）に対する免疫応答が生じたこと
が判る。

【００４０】

【表３】

【００４１】

【表４】参考文献１．ＷＥＳＴＡＷＡＹ，Ｅ．Ｇ．，ＢＲＩＮＴＯＮ，
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【００４２】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：１０７１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＲＮＡハイポセティカル配列：Ｎｏアンチセンス：Ｎｏ起源生物名：１型デング熱ウイルス株名：Ｓ２７５／９０特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：８１．．１０２６８配列

【００４３】

【表５】

【００４４】

【表６】

【００４５】

【表７】

【００４６】

【表８】

【００４７】

【表９】

【００４８】

【表１０】

【００４９】

【表１１】

【００５０】

【表１２】

【００５１】

【表１３】

【００５２】

【表１４】

【００５３】

【表１５】

【００５４】

【表１６】

【００５５】

【表１７】

【００５６】

【表１８】

【００５７】

【表１９】配列番号：２配列の長さ：３３９６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列

【００５８】

【表２０】

【００５９】

【表２１】

【００６０】

【表２２】

【００６１】

【表２３】

【００６２】

【表２４】

【００６３】

【表２５】

【００６４】

【表２６】

【００６５】

【表２７】

【００６６】

【表２８】

【００６７】

【表２９】

【００６８】

【表３０】配列番号：３配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列

【００６９】

【表３１】配列番号：４配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列

【００７０】

【表３２】配列番号：５配列の長さ：２６配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列

【００７１】

【表３３】配列番号：６配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列

【００７２】

【表３４】配列番号：７配列の長さ：２９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列

【００７３】

【表３５】配列番号：８配列の長さ：３０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列

【００７４】

【表３６】配列番号：９配列の長さ：３１配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列

【００７５】

【表３７】配列番号：１０配列の長さ：２７配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列

【００７６】

【表３８】配列番号：１１配列の長さ：２５配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列

【００７７】

【表３９】配列番号：１２配列の長さ：２０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ配列

【００７８】

【表４０】

【図面の簡単な説明】

【図１】発現ベクター中の１型デングウイルス（シンガ
ポール株Ｓ２７５／９０）のｃＤＮＡ及びそのフラグメ
ントの概略図である。

【図２】完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を含む
または含まない、実施例２〜５に記載のごとく作製した
融合タンパク質で免疫した後のマウスにおける血清応答
の結果を示すゲルである。ゲルレーン：レーン１：Ｍ，レーン２：抗Ｅ，レー
ン３：抗Ｅ＋ＣＦＡ，レーン４：抗ＮＳ１，レーン
５：抗ＮＳ２，レーン６：抗ＮＳ２＋ＣＦＡ，レー
ン７：抗ＮＳ３，レーン８：抗ＮＳ３＋ＣＦＡ，レ
ーン９：抗ＮＳ５，レーン１０：抗ＮＳ５＋ＣＦＡ，
レーン１１：陽性ウサギ血清，レーン１２：陰性ウ
サギ血清，レーン１３：Ｍ。

【図３】実施例２〜５に記載のごとく作製した融合タン
パク質で免疫した後のウサギにおける血清反応の結果を
示すゲルである。但し、（−）は免疫前の血清であり、
（＋）は免疫後の血清である。ゲルレーン：レーン１：（−），レーン２：（＋）抗
Ｅ，レーン３：（−），レーン４：（＋）抗ＮＳ
１，レーン５：（−），レーン６：（＋）抗ＮＳ
２，レーン７：（−），レーン８：（＋）抗ＮＳ
３，レーン９：（−），レーン１０：（＋）抗ＮＳ
５，レーン１１：陽性デング，レーン１２：患者血
清。

【図４】１型デングウイルスＤＩ−２７５に感染させ、
組換え融合タンパク質に対する抗体を用いてプローブし
たＣ３／３６細胞の蛍光顕微鏡写真である。Ａ，対照抗
血清；Ｂ，抗Ｅ；Ｃ，抗ＮＳ１；Ｄ，抗ＮＳ２；
Ｅ，抗ＮＳ３；Ｆ，抗ＮＳ５。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成５年８月４日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図４

【補正方法】変更

【補正内容】

【図４】１型デングウイルスＤＩ−２７５に感染させ、
組換え融合タンパク質に対する抗体を用いてプローブし
たＣ３／３６細胞の生物の形態の蛍光顕微鏡写真であ
る。Ａ，対照抗血清；Ｂ，抗Ｅ；Ｃ，抗ＮＳ１；
Ｄ，抗ＮＳ２；Ｅ，抗ＮＳ３；Ｆ，抗ＮＳ５。

【手続補正２】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図４

【補正方法】変更

【補正内容】

【図４】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ０７Ｋ 13/00 8517−4ＨＣ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ 5/10 7/04 8931−4Ｂ 15/40 ＺＮＡ 15/62 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 8214−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ 33/569 Ｌ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ０７Ｋ 99:00 8931−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 Ａ (71)出願人 592115294 ヨウ−チヨン・チヤンシンガポール国、シンガポール・0511、ケント・リツジ・クレセント・10 (71)出願人 592031271 イン・ウイー・タンシンガポール国、シンガポール・0511、ケント・リツジ・クレセント・10 (72)発明者ジアンリン・フーシンガポール国、シンガポール・0511、ケント・リツジ・クレセント・10 (72)発明者ブーン−フアン・タンシンガポール国、シンガポール・0511、ケント・リツジ・クレセント・10 (72)発明者イウ−ヒアン・ヤプシンガポール国、シンガポール・0511、ケント・リツジ・クレセント・10 (72)発明者ヨウ−チヨン・チヤンシンガポール国、シンガポール・0511、ケント・リツジ・クレセント・10 (72)発明者イン−ウイー・タンシンガポール国、シンガポール・0511、ケント・リツジ・クレセント・10

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ＤＥＮ１−Ｓ２７５／９０（ＥＣＡＣ
ＣＶ９２０４２１１１）。
【請求項２】不活化形態のＤＥＮ１−Ｓ２７５／９０
（ＥＣＡＣＣＶ９２０４２１１１）。
【請求項３】実質的に配列番号１に示すような配列を
有するＤＥＮ１−Ｓ２７５／９０（ＥＣＡＣＣＶ９
２０４２１１１）をコードするＤＮＡポリヌクレオチ
ド。
【請求項４】ＤＥＮ１−Ｓ２７５／９０（ＥＣＡＣ
ＣＶ９２０４２１１１）のＣ、Ｃ’、ＰｒｅＭ、Ｍ、
Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、
ＮＳ４ＢまたはＮＳ５遺伝子をコードする請求項３に記
載のＤＮＡポリヌクレオチドのフラグメント。
【請求項５】発現ベクター中の請求項３または４に記
載のＤＮＡポリヌクレオチドまたはそのフラグメント。
【請求項６】ｐＧＥＸ−ＫＧ／ＥＸ−２０、ｐＭＡＬ
−ｃ／ＮＳ１−１０４、ｐＭＡＬ−ｃＲＩ／ＮＳ２−
１、ｐＧＥＸ−ＫＧ／ＮＳ３ＢＨｃ６００−１及び
ｐＧＥＸ−ＫＧ／ＮＳ５ｃ６００ＨＦ１から選択さ
れる請求項５に記載の発現ベクター。
【請求項７】請求項５または６に記載の発現ベクター
を担持する細胞。
【請求項８】Ｅ．ｃｏｌｉまたは昆虫細胞である請求
項７に記載の細胞。
【請求項９】ＤＥＮ１−Ｓ２７５／９０（ＥＣＡＣ
ＣＶ９２０４２１１１）のＣ、Ｃ’、ＰｒｅＭ、Ｍ、
Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、
ＮＳ４ＢまたはＮＳ５ポリペプチドである、実質的に単
離された形態のポリペプチド。
【請求項１０】融合タンパク質の形態である請求項９
に記載のポリペプチド。
【請求項１１】請求項６に記載の発現ベクターから選
択される発現ベクターによってコードされる請求項１０
に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】請求項９から１１のいずれか一項に記
載のポリペプチドの製造方法であって、請求項７または
８に記載の細胞系を培養し、該ポリペプチドを回収する
ことからなる方法。
【請求項１３】ラベルを有する請求項９に記載のポリ
ペプチド。
【請求項１４】医薬的に容認可能な担体または希釈剤
と共に、１種以上の請求項９から１１のいずれか一項に
記載のポリペプチドまたは請求項２に記載の不活化ウイ
ルスを含むワクチン。
【請求項１５】前記１種以上のポリペプチドが、ＤＥ
Ｎ１ウイルスタンパク質に対する抗体を誘発し得るＥ、
ＮＳ１、ＮＳ２、ＮＳ３、ＮＳ５及びその融合タンパク
質から選択される請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１６】必要によっては検出用ラベルを有す
る、ＤＥＮ１ウイルスタンパク質に結合し得る請求項９
から１１のいずれか一項に記載のポリペプチドに対する
抗体。
【請求項１７】固体支持体に固定された請求項１６に
記載の抗体または請求項９もしくは１３に記載のポリペ
プチドを含む、ＤＥＮ１ウイルスの存在有無の検出用テ
ストキット。