JPH06509947A

JPH06509947A - キメラ抗ｃｅａ抗体

Info

Publication number: JPH06509947A
Application number: JP6501788A
Authority: JP
Inventors: シブレイ，ジョン・イー; フィッシャー，ライナー; ウ，アナ; パクストン，レイモンド; ヤン，ワイ・エイチ・ジョイ
Original assignee: シティ・オブ・ホープ
Priority date: 1992-06-15
Filing date: 1993-06-15
Publication date: 1994-11-10
Also published as: EP0606430A1; CA2115346A1; AU4536693A; WO1993025237A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】金型の分野本発明は、Ｔａ２．１２と命名された、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対するマウス −ヒトキメラ抗体に関する。

従来の技術ＣＥＡは広く使われている腫瘍マーカーである。その発現は、全てのヒト結腸癌の９５％以上において検出することができる。ＣＥＡは免疫グロブリンスーパーファミリーの一員であり、ＮＣＡおよびＢＧＰと近縁関係にある。

種々の有用なＣＥＡ特異的モノクローナル抗体の中で、マウスＴ８４．６６抗体はＣＥＡに対して最も高い特異性および親和性を示す（ワゲナー（Ｙａｇｅｎｅｒ）ら、Ｊ、Ｉｍｍｕｏｌｏ　１３０：２３０８−２３１５（１９８５）　）　、それはマウスおよびヒトにおける１ｎｖｉｖｏの腫瘍のイメージ化にうまく用いられてきた。それはヒト結腸癌の免疫検出および免疫療法によく適している。

Ｔａ２．６６のヒトにおける±ｎ　ｖｉｖｏでの利用は、それがマウス由来であるために異種の免疫グロブリンに対する免疫応答をもたらすことから制限される。ヒトにおける抗原性を減らすために、組み換え遺伝子技術を用いてキメラＴ８４．６６を作製した。ノイメアー（Ｎｅｕｍａｉｅｒ）ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５０：２１２８−２１３４　（１９９０）および米国特許第５．０８１．２３５号を参照して頂きたい。免疫グロブリンプロモーターを含むクローン化した抗体遺伝子を、電気穿孔法により５Ｐ２１０ミエローマ細胞、若しくはリボフエクシコンを用いてＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。発現したキメラｍａｂ（モノクローナル抗体）は種々の酵素イムノアッセイおよびウェスタンプロットで性格付けされた。よく知られたサンガーの鎖成長停止法を用いて重鎮および軽鎖遺伝子のＶ領域の配列を決定した。

合服の概！マウスＴ８４．１２は、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプの、よく知られた別のＣＥＡ特異的モノクローナル抗体である。それはＴａ２．６６と同じＣＥＡエピトープを認識するが、約１０倍低い親和定数を持つ。この理由から、Ｔａ２．　１２は、本発明に従って、ヒトにおける治療目的に関してマウス−ヒトキメラ抗体を作るために選択された。

ヒトＩｇＧ１重鎖もしくは軽鎖の定常ドメインのエクソン（５−−ＵＴ　（非翻訳領域）およびリーダーペプチドを含む）をマウスＴ８４．１２の重鎖および軽鎖遺伝子の可変部に組み替えることにより、ｃＤＮＡクローンをヒト化（キメラ化）した。得られたハイブリドーマは、とりわけヒトの治療目的に有用なキメラＴ８４．１２抗ＣＥＡ抗体を有意な量で生産する。

発明Ω詳裡債悦明本発明のキメラ抗ＣＥＡ抗体の産生には、とりわけ、マウスＴ８４．１２のアミノ末端の蛋白質配列の同定、Ｔａ２．１２のマウス軽鎖および重鎖クローンのｃＤＮＡ配列並びに相当するアミノ酸ＥＷすの決定、そしてマウスＴ８４．１４ｃＤＮＡクローンのキメラ化を含めた、一連の工程を含んでいる。本発明のある観点には、マウスＴ８４．１２軽鎖クローンのｉｎ　ｖｉｔｒｏ変異導入が含まれる。

マウスＴ８４．１２のアミノ末端の配夕（マウス７８４．１２特異的軽鎖（Ｌ鎖）クローンＬｌ−Ｌ４およびＴａ２１２重鎖クローン８ｌ−Ｈ４を既知の手法で調製し配列を決定した。４つの重鎖クローンはすべて、そのＶ領域において１００％の■領域相同性を示し、それ故、クローンＨ４をＩｇＧ２ａ重鎮定常部の配列決定用に選択した。軽鎖クローンＬ２、Ｌ３およびＬ４の可変ドメインば同一であった。クローンＬ１は、明らかに内因性の転写産物を表して、全体的に異なっていた。カッパ軽鎖定常ドメインおよび３′非翻訳領域を完全に特徴付けるため、軽鎖クローンＬ１、Ｌ４および重鎖Ｈ４を選択した。

表１はＴａ２．１２軽鎖およびＴａ２．１２重鎖のアミノ末端配列を示す。報告されている配列は、還元状態（ＤＴＴ）およびアルキル化状態（ヨード酢酸）の精製されたモノクローナル抗体を用いて決定された。重鎮および軽鎖は、還元条件下で流用緩衝液として１Ｍ酢酸を用いてセファデックスＧ１００カラム上で分離した。単離した鎖をアミノ末端配列決定にかけた。

老」− 残基　Ｔａ２．１２軽鎖　Ｔａ２．１２重鎖１１　Ｍｅｔ　Ｐｈｅｌ　５　−　ＧｌｙｃＤＮＡＴ８４．１２クローンの全長の配列を既知の手法で決定した（１０２０ｂｐ）。このクローンは、ＡＴＧ開始コドンの前に１　ｏｂｐという非常に短い５’−ＵＴ領領域含んでいた。完全なリーダーペプチド、■領域およびＣカッパ定常ドメインの存在を示すことができた。Ｃカッパ定常ドメインの端にＴＡＧ終止コドンが存在した。３′非翻訳領域（２８０ｂｐ）は、ポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）およびポリＡテール鎖を含んでいた。完全な全長ｃＤＮＡクローンのわきには破壊されたＳｍａＩ制限クローン化部位（ＧＧＧ−ＣＣＣ）があった。得られたヌクレオチド配列のアミノ酸配列への翻訳によって、２３６アミノ酸を生じるオープンリーディングフレーム（ｂｐ３４−７４１＝７０８ｂｐ）を得た。加えて、Ｃカッパ定常ドメインは、他の発表されたＣカッパ定常ドメイン配列（カバト（Ｋａｂａｔ）　）と９９．７％の相同性を示した。Ｔａ２．１２軽鎖ｕｌＪのｂｐ７１１　（ＣＡＴＴＧＴ）においてＣからＴへの置換があるだけであった（カバトら、’５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｓｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”、第４版、Ｕ、　Ｓ、　Ｄｅｐｔ、　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｄ　Ｈｕｍａｎ　５ｅｒｖｉｃｅｓ　ＰＨ３ＮＩＨ（１９８７）参照）。この塩基対の相違はサイレント変異をもたらす。

リーダーペプチドおよびＶ領域は、Ｔａ２゜６６とは異なっていた。

ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１では、マウスＴ８４．１２の軽鎖ｃＤＮＡ配列が示されており、以下の部分に（上から下に）下線を引いである：ＡＴＧ開始コドン、可変部の始め、Ｃ−カッパ定常ドメインの始め、ＴＡＧ終止コドン、およびポリアデニル化シグナル。

Ｔａ２．１２　Ｈ４のアミノ酸配置ｉ１（フレーム１＝３４−７４１）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、２には、７８４．１２の軽鎖のアミノ酸配列か示されており、以下の部分に（上から下に）下線を引いである：ＡＴＧ開始コドン、可変部の始め、Ｃ−カッパ定常ドメインの始め、およびＴＡＧ終止コドン。

マウス重鎮クローンＴ８４．１２　Ｔ（４のｃＤＮＡ配グ１配置ＮＡクローン７８４．１２全長の完全１ＥＦ１１を既知の手法で決定した（１６４５ｂｐ）。このクローンは、やはりＡＴＧ開始コドンの前に、軽鎖クローンＬ４よりｘｏｂｐ長い５−−ＵＴ領領域含んでいた。完全なリーダーペプチド、■領域、およびＩｇＧ２ａの３つの定常ドメイン全ての存在を示すことができた。

ＩｇＧ２ａのＣＨ３定常ドメインの端には、ＴＧＡ終止コドンが存在した。３− 非翻訳領域（１２０ｂｐ）にはポリアデニル化シグナルＡＡＴＡＡＡが含まれていた。完全な全長ｃＤＮＡクローンのわきには破壊されたＳｍａ　ｒ制限クローン化部位ＧＧＧ−ＣＣＣが存在した。得られたヌクレオチ）′ｆＪＩＪのアミノ酸配列への翻訳によって、４７８アミノ酸を生じるオープンリーディングフレーム（ｂｐ５２−１４８５＝１４３４ｂｐ）を得た。加えて、ＩｇＧ２ａ定常ドメインは、他の発表されたＩｇＧ２ａ定常ドメイン配列（カバト）と９８．７％の相同性を示した。ヒンジ部もカバトの配列と１００％の相同性を示した。ＣＨＩドメイン中の２つの異なるコドンは１ｇＧ３と同一であり、ＣＨ３ドメイン中の３つの異なるコドンはＭＯＰＣ２１と同一であった。

ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、３には、Ｔａ２．１２の重鎖ｃＤＮＡ配列が示されており、以下の部分に（上から下に）下線を引いである：ＡＴＧ開姶コドン、可変部の始め、ＣＨＩ定常ドメインの始め、ヒンジ部の始め、ＣＨ２定常ドメインの始め、ＣＨ３定常ドメインの始め、ＴＧＡ終止コドン、およびポリアデニル化シグナル。

Ｔａ２．　１２　Ｈ４のアミノ酸酊１　（フレーム２＝５２−１４８５）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＣＩ　４には、Ｔａ２．１２の重鎖Ｈ４のアミノ酸酊すが示されており、以下の部分に（上から下に）下線を引いである：ＡＴＧ開始コドン、可変部の始め、ＣＨＩ定常ドメインの始め、ヒンジ部の始め、ＣＨ２定常ドメインの始め、ＣＨ３定常ドメインの始め、およびＴＧＡ終止コドン。

キメラＴ８４．１２得られて特徴付けした全長ｃＤＮＡのマウスＴ８４．１２　Ｈ４およびＨ４クローンを、ヒトＩｇＧ１重鎖ｃＤＮＡの定常ドメインおよびヒトカッパ軽鎖ｃＤＮＡの定常ドメインを用いて、それぞれキメラ化した。ヒト重鎮およびカッパ鎖の定常部のｉＢりは、ジェフリー　シュロム博士（Ｄｒ、　Ｊｅｆｆｒｅｙ　５ｃｈｌｏｅ＋；Ｎａｔｏｎａｌ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ■ｅａｌｔｈ）から入手したプラスミドに由来するものであった。本プラスミドは、キメラＢ７２．３抗体を発現する細胞からクローン化された、キメラＢ７２４３のｃＤＮＡクローンを含んでいた（ヒュッチェル（Ｅｌｕｔｚｅｌｌ）ら、ＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ　３１：１８１−１８９　（１９９１）参照）。シュロム博士のグループは、それらのコンストラクトを作製するために、シェリー　モリソン博士（Ｄｒ、　５ｂｅｒｉｅ　Ｍｏｒｒｉｓｏｎ　；ＵＣＬＡ）からヒトガンマ鎖およびカッパ鎖ゲノム発現ベクター（オイ（Ｏｉ）、　Ｖ、　Ｔ、ら、　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉ　ｕｅｓ　４：２１４　（１９８６））を入手した。特異的なプライマーを用い、７８４．１２　（マウスｃＤＮＡ）の可変ドメインを、既知の手法で、スプライスオーバーラツプエクステンションＰＣＲを用いてキメラＢ７２．３のヒト定常ドメインにイン・フレーム（ｉｎ　ｆｒａｍｅ）で融合させた。ホー（Ｈ０）ら、Ｇｅｎｅ　７７：５ｌ−５９（１９８８）およびホートン（［１ｏｒｔｏｎ）ら、Ｃ１ｎｅ　７７：６１−６８　（１９８９）を参照して頂きたい。

これらの全長ｃＤＮＡをＣＨＩ　Ｔａ２．１２　Ｈ３、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ２およびＨ３と命名した。

キメラクローンは、Ｆａｂ、Ｆ　（ａｂ″）２−断片、Ｆｖ断片および合成ペプチドによって繋がれた単鎖抗体の生産に用いられた。

Ｔａ２．１２　Ｈ６のｃＤＮＡ配列全長ｃ全長Ａクローン　ｃｈｉＴ８４．１２　Ｈ６の完全な配列を既知の手法で決定した（９５６ｂｐ）、クローン　ｃｈｉＴ８４．１２　Ｈ６は、マウス−ヒトキメラＴ８４．１２軽鎖に関して正しい配列を示した。クローンｃｈｉＴ８４．１２Ｌ６を用いて、Ｉ）Ｈβ−Ａｐｒ−ｎｅｏベクター（ガニング（Ｇｕｎｎｉｎｇ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８４：４８３１ −４８３５　（１９８７））にさらにサブクローン化し、５Ｐ２１０ミエローマ細胞にトランスフェクトした。

クローン　ｃｈｉＴ８４．１２　Ｈ６にはＡＴＧ開始コドンの前に９ｂｐの短い５″−ＵＴ領領域含まれていた。完全なリーダーペプチド、■領域およびヒトＣカッパ定常ドメインの存在を確認することかできた。ヒトＣ力・り／々定常ドメインの端にＴＡＧ終止コドンか存在した。３′非翻訳領域（２１８ｂｐ）は、ポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）を含んでいた。得られたヌクレオチド配列のアミノ酸配列への翻訳によって、２３５アミノ酸を生じるオープンリーディングフレーム（ｂｐ３４−７３８＝７０５ｂｐ）を得た。加えて、ヒトＣカッパ定常ドメインは、他の発表されたＣカッパ定常ドメイン配列（カバト）と１００％の相同性を示した。

ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、７には、ｃｈｉＴ８４．１２　Ｈ６の軽鎖ｃＤＮＡ配列が示されており、以下の部分に（上から下に）下線を引いである：ＡＴＧ開始コドン、マウス可変部の始め、ヒトＣ−カッパ定常ドメインの始め、ＴＡＧ終止コドン、およびポリアデニル化シグナル。

ｃｈｉＴ８４．１２　Ｈ６のコード配置ｌ（ｂ　＝３４−７３８）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、８には、ｃｈｉＴ８４．１２　Ｈ６の軽鎖のアミノ酸配列か示されており、以下の部分に（上から下に）下線を引いである：ＡＴＧ開始コドン、マウス可変部の始め、ヒトＣ−カッパ定常ドメインの始め、およびＴＡＧ終止コドン。

キメラＴ８４．１２　Ｈ３のｃＤＮＡＤＮＡ配置ｃＤＮＡクローン　ｃｈｉＴ８４．１２　Ｈ３の完全な配列を既知の手法で決定した（１６４１ｂｐ）。クロー：／　ｃｈｉＴ８４．１２　Ｈ３は、マウス−ヒトキメラ７８４．１２２重鎖関して正しいｆ７１を示し、ＣＨ２ドメインの始めに１つ（４８４番目のＧＴＧがＧＣＧに＝バリンがアラニンに）、３’−ＵＴの端に１つの変異（ＡＡＡＴＡＡＡがＧＡＡＴＡＡＡに）を持っていた。しかし、これはポリアデニル化シグナルには影響しなかった。クローンｃｈｉＴ８４゜１２　Ｈ３を用いて、ｐＨβ−Ａｐｒ−ｇｐｔベクターにさらにサブクローン化し、ｃｈｉＴ８４．１２　カッパ軽鎖を発現している５Ｐ２１０ミエローマ細胞にトランスフェクトした。

本クローンにはＡＴＧ開始コドンの前に４１ｂｐの短い５−−ＵＴ領領域含まれたいた。完全なリーダーペプチド、マウスＶ領域および３つのヒトＩｇＧ１の定常ドメイン全ての存在を示すことができた。ＩｇＧ１のＣＨ３定常ドメインの端に、ＴＧＡ終止コドンが存在した。３′非翻訳領域（１５３ｂｐ）は、ポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）を含んでいた。得られたヌクレオチド配列のアミノ酸配列への翻訳によって、４７０アミノ酸を生じるオープンリーディングフレーム（ｂｐ５２−１４８５＝１４１０ｂｐ）を得た。加えて、ヒトＩｇＧ１定常ドメインは、他の発表されたＩｇＧ１定常ドメイン配列（カバト）と１００％の相同性を示した。ヒンジ部もカバトの配列と１００％の相同性を示した。

ＳＥＱ　［）Ｎｏ、９には、ｃｈｉＴ８４．１２　Ｈ３の重鎖ｃＤＮＡ配列が示されており、以下の部分に址から下に）下線を引いである・ＡＴＧ開始コドン、マウス可変部の始め、ヒトＣＨＩ定常ドメインの始め、ヒンジ部の始め、ＣＨ２定常ドメインの始め、ＣＨ３定常ドメインの始め、ＴＧＡ終止コドン、およびポリアデニル化シグナル。

ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１０には、ｃｈｉＴ８４．１２　Ｒ３の重鎖のアミノ酸配列が示されており、以下の部分に（上から下に）下線を引いである：ＡＴＧ開始コドン、マウス可変部の始め、ヒトＣＨＩ定常ドメインの始め、ヒンジ部の始め、ＣＨ２定常ドメインの始め、ＣＨ３定常ドメインの始めおよびＴＧＡ終止コドン。

マウスＴ８４．１２　Ｌ４　ｃＤＮＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏ変異導入いくつかの例外があるが、２つのシスティン残基が免疫グロブリンドメイン中に存在するのが典型である。Ｔａ２．１２軽鎖クローンＬ４のＣＤＲ３（Ｌ３）は、マウスのカッパ軽鎖可変ドメイン中にさらに３つ目のシスティン残基を含んでいた。この第３のシスティンの存在は、両路の解離およびホモ２官能性架橋剤を用いた化学的架橋の後にマウスＴ８４．１２による結合活性が喪失することと明らかに関係している。それ故３６４−３６６番目のシスティン（ＴＧＴ；アミノ酸残基９１．）（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、１を参照）を部位特異的変異導入によりセリン（ＴＣＴ）に変更した。

ＭＵＴＡ−ＧＥＮＥファージミドｉｎ　ｖｉｔｒｏ変異導入の概要変異導入は、バイオラド（ＢｉｏＲａｄ）からのＭＵＴＡ−ＧＥＮＥファージミド１ｎｖｉｔｒｏ変異導入キットを用いて行った。元の操作法を簡略化し、以下の１１工程に減らした：１、ｐＴＺ１８Ｕ若しくはｐＴＺ１９Ｕファージミド（ｐＵＣｌ　８中にクローン化されたｃＤＮＡの方向による）でのコードｃＤＮＡ鎖のサブクローン化。

２、変異導入するｃＤＮＡを含むｐＴＺｌ　８Ｕ若しくは１９Ｕによる大腸菌ＣＪ２３６の電気形質転換（プレートにはＬＢ−ａｍｐ＋３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを使用）。

３、組み換えＣＪ２３６の単一コロニーからのミニスケールによるＤＮＡ単離。

この大腸菌株はファージミドＤＮＡにウラシル残基を取り込ませる。

４、ウラシルを含むファージミドの、２ＸＹＴ培地（アンピシリン（５０Ｕｇ／ｍ１）およびクロラムフェニコール（３０Ｕｇ／ｍｌ）を含む）中での培養。

プレートからマークし、ミニ調製したＤＮＡを解析した単一コロニーから培養を開始する。１本鎖ファージミドＤＮＡを得るためにヘルパーファージＭ１３ＫＯ７を加える。

５．１本鎖ファージミドＤＮＡのＰＥＧ抽出および精製（ＰＣＩ）。

６、変異導入プライマー（マイナス鎖を表し、プラス鎖である１本鎖ファージミドＤＮＡに結合する）のリン酸化。

７　リン酸化した変異導入プライマーの精製した１本鎖ファージミドＤＮＡへのアニーリングによる、変異導入鎖の合成。相補マイナス鎖はＴ４ＤＮＡポリメラーゼにより作製され、ギャップはＴ４ＤＮＡリガーゼで埋める。

８、変異導入した２末鎖ｃＤＮＡによる大腸菌ＭＶ１１．９０の電気形質転換。

この株はウラシル残基を取り除く。

９　増殖している組み換えＭＶ１１９０の単一コロニーからの、ミニスケールによるＤＮＡ単離。インサートの大きさは、制限酵素消化により決定し野生型と比較する。

１０、い（つかの変異体からミニ調製したＤＮＡをシーフェンスし、それを野生型配列と比較する。

１１、正しい変異体を持つコロニーを選択し、より大量に培養する（１００ｍｌ）。キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）カラムを用いて変異導入したｃＤＮＡを精製し、変異ＣＤＮＡクローンの完全な配列を確認する。

そのようなりローンの１つ（Ｔａ２．１２　Ｌ４−１２−１と命名）を本発明の例示用に選択した。

Ｔａ２．１２　Ｌ４−１２−１のｃＤＮＡＤＮＡＵｃＤＮＡクローン　７８４．１２　Ｌ４−１．２−１の完全な配列を既知の手法で決定した（１９９９ｂｐ）。クローンは、マウスＴ８４．１２軽鎖、および導入されたシスティンからセリンへの変異に関して、正しい配列を示した。このクローンを用いて、ＰＨ６−Ａｐｒ−ｎｅｏベクター（ガニングら、Ｐｒｏｃ、　ＮａｔＬ　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　８４：４８３１−４８３５　（１９８７））にさらにサブクローン化し、５Ｐ２１０ミエローマ細胞にトランスフェクトした。

このＴａ２．１２　Ｌ４−１２−１クローンにはＡＴＧ開始コドンの前に１０ｂｐの非常に短い５′〜ＵＴ領域が含まれたいた。完全なリーダーペプチド、■領域およびＣカッパ定常ドメインの存在を示すことができた。Ｃカッパ定常ドメインの端にＴＡＧ終止コドンが存在した。３−非翻訳領域（２８Ｑｂｐ）は、ポリアデニル化シグナル（ＡＡＴＡＡＡ）を含んでいた。完全な全長ｃＤＮＡクローンのわきには、破壊されたＳｍａ　Ｉ制限クローン化部位（ＧＧＧ−ＣＣＣ）ｂ＜存在した。得られたヌクレオチド配列のアミノ酸配列への翻訳によって、２３６アミノ酸を生じるオープンリーディングフレーム（ｂｐ３４−７４１＝７０８ｂｐ）を得た。加えて、このＣカッパ定常ドメインは、他の発表されたＣカッパ定常ドメイン配列（カバト）と９９．７％の相同性を示した。Ｔａ２．１２軽鎖中にはｂｐ７１１　（ＣＡＴＴＧＴ）に唯一のＣ（カバト）からＴへの変更かあった。この塩基対の相違はサイレント変異をもたらす。

ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、５には、Ｔａ２．１２　Ｌ４−１２−１の軽鎖ｃ　ＤＮＡＵりが示されており、以下の部分に（上から下に）下線を引いである：　ＡＴＧ開姶コドン、マウス可変部の始め、ヒトＣ−カッパ定常ドメインの始め、ＴＡＧ終止コドン、およびポリアデニル化シグナル。ＴＧＴ（ｃｙｓ）からＴＣＴ（ｓｅｒ）に変異導入された部分は下線を施しイタリックで示した。

７８４．１２　Ｌ４−１２−１のアミノ酸配列（フレーム１＝３４−７４且ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ、６には、Ｔａ２．１２の軽鎖アミノ酸配列か示されており、以下の部分に（上から下に）下線を引いである：ＡＴＧ開始コドン、可変部の始め、Ｃ−カッパ定常ドメインの始め、およびＴＡＧ終止コドン。ＴＧＴ　（ｃｙｓ）からＴＣＴ　（ｓ　ｅｒ）に変異導入された部分は下線を施しイタリックで示した。他の全てのシスティン残基には下線を引いた。

大したマウスＴ８４．１２　ｃＤＮＡの発現変異軽鎖（７８４，１２Ｌ４−１２ −１）ｃＤＮＡと正常重鎮（Ｔａ２．１２　Ｈ４）ｃＤＮＡをβ−アクチン　ｃＤＮＡ発現ベクター（ガニングら、上記）に入れ、電気穿孔法により５Ｐ２１０ミエローマ細胞に一緒に形質転換した。

ベクターはヒトβ−アクチンプロモーター、介在配列、クローン化部位、およびポリアデニル化シグナルを含む。ベクターがネオマイシン耐性遺伝子を含んでいるので、形質転換体は薬ＪＩＧ　４１　ｇの存在下で選択された。クローンを増やし、抗体産生（カッパまたはガンマ鎖）およびＥＬＩＳＡによりＣＥＡ結合活性について評価した。発現レベルは低かったものの、培養液上滑中の抗体と抗ＣＥＡ活性の間に相関かあった。

１影（」ニー立りと１」ユズ冥村四治括性クローン　カッパ鎖（ｎｇ／ｍｌ）　ガンマ鎖（■／ｍｌ）　抗ＣＥＡ活性（■／ｍ１）４Ｈ９６−１８６−１８３− ８ＩＢ１．　６−１８　２−６　１４Ａ３　６−１８　２−６　１−３５Ａ、１１．　２−６　２−６　］−３配列表（２）ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：１：（ｉ）８りのネ寺１資動（Ａ）長さ：　］、　０４１（Ｂ）型：　核酸（Ｃ）ストランドニー水路（Ｄ）トポロジー二不明（１１）分子型：核酸（ｉｉｉ　）仮想翫ｊす：該当せず（ｉｖ）アンチセンス：該当せず（ｖ）フラグメント型：該当せず（ｖｉ　）起源：合成による（ｖｉｉ　）直接の起源：合成による（ｖｉｉＤゲノム中の部位：無しくｉｘ）特徴：無しくｘ）　公表の情報：無しくｘｉ）　酉１２りｌＪ：ｓＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１　：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２：（１）配列の特徴：（Ａ）長さ＝２３５（Ｂ）型：　アミノ酸（Ｃ）ストランドニー水路（Ｄ）トポロジー、不明（１１）分子型　アミノ酸（ｉｉｉ　）仮想配列：該当せず（ｉｖ）アンチセンス：該当せず（ｙ）フラグメント型：該当せず（ｖｌ）起源０合成による（ｖｉｉ　）直接の起源：合成による（ｖｉｉｉ）ゲノム中の部位：無しくｉｘ）特徴：無しくｘ）　公表の情報・無しくｘｌ）配列：ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：２：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３・（１）酉１２グリの中４１１！：（Ａ）長さ：１６４５（Ｂ）型　核酸（Ｃ）ストランドニー水路（Ｄ）トポロジー・不明（ｉｉ）分子型　核酸（ｉｉｉ　）仮想酊り：該当せず（ｉｖ）アンチセンス・該当せず（Ｖ）フラグメント型・該当せず（ｖｌ）起源：合成による（ｖｉｉ　）直接の起源二合成による（ｖｉｉｉ）ゲノム中の部位：無しくｉｘ）特徴：無しくｘ）　公表の情報、無しくｘｉ）　配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４：（ｉ）配列の特徴・（Ａ）長さ、４７７（Ｂ）型・　核酸（Ｃ）ストランドニー水路（Ｄ）トポロジー　不明（１１）分子型：核酸（ｉｉｉ　）仮想配列：該当せず（ｉｖ）アンチセンス：該当せず（Ｖ）フラグメント型：該当せず（ｖｌ）起源　合成による（ｖｉｉ　）直接の起源　合成による（ｖｉｉｉ）ゲノム中の部位、無しくｉｘ）特徴：無しくｘ）　公表の情報・無しくｘｌ）西１２ノリ５ＥＱＩＤＮＯ：４：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５：（１）西ｉ１７りの９望トモ５に＝（Ａ）長さ：１０４１（Ｂ）型：　核酸（Ｃ）ストランド、一本鎖（Ｄ）トポロジー・不明（ｉｉ）分子型、核酸（ｉｊｉ　）仮想配列：該当せず（ｉｖ）アンチセンス；該当せず（ｖ）フラグメント型：該当せず（ｖｌ）起源：合成による（ｖｉｉ）直接の起源・合成による（ｖｉｉｉ）ゲノム中の部位：無しくｉｘ）特徴：無しくｘ）　公表の情報；無しくｘｉ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６：（１）配列の特徴：（Ａ）長さ・２３５（Ｂ）型、　核酸（Ｃ）ストランド　一本鎖（Ｄ）トポロジー二不明（１１）分子型：核酸（ｉｉｉ　）仮想配列ＩＢＭ当せず（ｉｖ）アンチセンス：該当せず（Ｖ）フラグメント型、該当せず（ｖｉ）起源＝合成による（ｖｉｉ　）直接の起源：合成による（ｖｉｉｉ）ゲノム中の部位：無しくｉｘ）特徴：無しくｘ）　公表の情報　無上（Ｘｌ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア：（＋）西１２２りの牛４１宝に：（Ａ）長さ：９５７（Ｂ）型：　核酸（Ｃ）ストランドニー木調（Ｄ）トポロジー二不明（ｉｉ）分子型：核酸（ｉｉｉ　）仮想配列コ該当せず（ｉｖ）アンチセンス　該当せず（Ｖ）フラグメント型：該当せず（ｖｉ）起源：合成による（ｖｉｉ　）直接の起源二合成による（ｖｉｉｉ）ゲノム中の部位：無しくｉｘ）特徴：無しくｘ）　公表の情報：無しくｘｉ）Ｅり１：５ＥＱＩＤＮ０・７：（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８：（ｉ）　西１シ２りの中当囁１！：（Ａ）長さ：２３４（Ｂ）型−核酸（Ｃ）ストランドニー木調（Ｄ）トボロジー：不明（１１）分子型；核酸（ｉｉｉ　）仮想配列、該当せず（ｉｖ）アンチセンス：該当せず（ｖ）フラグメント型：該当せず（ｖｌ）起源：合成による（ｖｉｉ　）直接の起源・合成による（ｖｉｉｉ）ゲノム中の部位：無しく１Ｘ）特徴−無し軟）公表の情報・無も（Ｘｌ）酊り・　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８：（２）ＳＥＱ　ｒＤ　ＮＯ：９；（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：１６４１（Ｂ）型：　核酸（Ｃ）ストランドニー木調（Ｄ）トポロジー：不明（１１）分子型、核酸（ｉｉｉ　）仮想配列：該当せず（ｉｖ）アンチセンス・該当せず（Ｖ）フラグメント型：該当せず（ｖｉ）起源　合成による（ｖｉｉ　）直接の起源二合成による（ｖｉｉｉ）ゲノム中の部位：無しくｉｘ）特徴：無しくｘ）　公表の情報二無しくｘｌ）配列：ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９：（２）ＳＥＱ　Ｉ　ＮＯ：１０（］）配列の特徴・（Ａ）長さ＝４７７（Ｂ）型：　核酸（Ｃンストランド・−末鎖（Ｄ）トポロジー：不明（１１）分子型：核酸（ｉｉｊン仮想配列　該当せず（ｉｖ）アンチセンス、該当せず（Ｖ）フラグメント型：該当せず（ｖｉ）起源１合成による（ｖｉｉ　）直接の起源：合成による（ｖｉｉｉ）ゲノム中の部位：無しくｉｘ）特徴：無しくｘ）　公表の情報：無毛（ｘｉ）配列：ＳＥＱ　ｒｃ＋　ＮＯ：１０：フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　５／１０１５／１３　ＺＮＡ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０８Ｃ１２Ｒ１：９１）（７２）発明者　ウ、アナアメリカ合衆国カリフォルニア用９１４０３゜ジャーマン・オークス、サットン・ストリート１４９０９Ｉ（７２）発明者　バクストン、レイモンドアメリカ合衆国ワシントン州９８００６．ベレーヴユー、サウス・イースト・シックステイセカント・コート１４８１１（７２）発明者　ヤン、ワイ・エイチ・ジョイアメリカ合衆国カリフォルニア用９１００６゜アルカディア、サウス・フォース・アベニュー　１００１

Claims

【特許請求の範囲】

１．カッパ遺伝子およびガンマ遺伝子の各々がネズミ可変部およびヒト定常部を持つ、ネズミ−ヒトキメラＴ８４．１２抗体。
２．カッパ遺伝子がネズミ可変部およびヒト定常部を持つ、ネズミ−ヒトキメラＴ８４．１２抗体。
３．ガンマ遺伝子がネズミ可変部およびヒト定常部を持つ、ネズミ−ヒトキメラＴ８４．１２抗体。
４．ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．７若しくはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．９により示された配列を持つ、単離されたＤＮＡ。
５．ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．５により示された配列を持つ、単離されたＤＮＡ。
６．ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．３およびＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．５を含む発現ベクターで同時形質転換されたＳＰ２／０ミエローマ細胞。