JPH06509222A - Three types of highly informative microsatellite repeat polymorphic DNA markers - Google Patents
Three types of highly informative microsatellite repeat polymorphic DNA markersInfo
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- JPH06509222A JPH06509222A JP5500444A JP50044493A JPH06509222A JP H06509222 A JPH06509222 A JP H06509222A JP 5500444 A JP5500444 A JP 5500444A JP 50044493 A JP50044493 A JP 50044493A JP H06509222 A JPH06509222 A JP H06509222A
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】 三 の ミ ロ −−’ ＤＮＡマーカ挟監址団 この出願は、反復配列を有する冬型性ＤＮＡマーカを用いて遺伝的試験を行い、 核酸断片の大きさが異なるヒトの個体特定化によるヌクレオチドの相違に基づい て、標的核酸断片を識別するための迅速かつ便利な高分解能法を提供することに 関する。[Detailed description of the invention] Third Miiro--' DNA Marker Supervision Group This application conducts a genetic test using a winter-type DNA marker having a repetitive sequence, Based on nucleotide differences due to individualization of humans with different sizes of nucleic acid fragments We aim to provide a rapid, convenient, and high-resolution method for identifying target nucleic acid fragments. related.
！見挾血 遺伝科学においては、ヒトの個体特定化及び個体間の遺伝的関係の同定に、非常 な興味が持たれている。各個体は、その個体に特有の遺伝物質（ＤＮＡ、「ヌク レオチド」）及び多くの個体に関連する遺伝物質とを有している。ＤＮＡ類の鍋 内のヌクレオチド置換、挿入又は欠失によるＤＮＡ （ＤＮＡ多型性体）の変化 であるＤＮＡ類の変化の同定及び特徴付けに基づく方法が開発されてきた。! blood sample In genetic science, the identification of human individuals and the identification of genetic relationships between individuals is extremely important. There is a lot of interest. Each individual has genetic material (DNA) that is unique to that individual. leotide") and genetic material associated with many individuals. DNA pot Changes in DNA (DNA polymorphisms) due to nucleotide substitutions, insertions, or deletions within Methods have been developed that are based on the identification and characterization of changes in DNAs.
例えば、法医学の分野において、同定のために、そのような多型性体に非常な興 味がある。法医学の遺伝学者は、多（の技術を開発し、ＤＮＡの相同断片を比較 して、それらの断片が同一であるか、あるいはそれらが１つ又はそれ以上のヌク レオチドで異なるかを決定している。これらの技術の実際の応用は、法医学以外 の分野、例えば、遺伝病診断及びヒト・ゲノム遺伝地図作製に関するものである 。For example, in the field of forensic medicine, such polymorphisms are of great interest for identification purposes. It has taste. Forensic geneticists have developed techniques for comparing homologous fragments of DNA. whether the fragments are the same or whether they are related to one or more nuclei. It has been determined whether leotide is different. Practical applications of these techniques are outside of forensic science. fields, such as genetic disease diagnosis and human genome genetic mapping. .
当業界において、現今では、ＤＮＡ断片を比較する最も正確で情報量の多い方法 は、各ＤＮＡ断片の完全なヌクレオチド配列を提供する方法を必要とする。ヒト 遺伝子における突然変異を研究するために、実際の配列を決定する特定の技術が 開発された。例えば、Ｐ ｒ ｏ ｃ。Currently, the most accurate and informative method for comparing DNA fragments in the industry requires a method that provides the complete nucleotide sequence of each DNA fragment. human To study mutations in genes, specific techniques are used to determine the actual sequence. It has been developed. For example, Proc.
Ｎａｔ １．Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、８旦、５４４〜５４８（１９ ８８）及びＮａｔｕｒｅＳ３３０．３８４〜３８６ （１９８７）を参照された い。しかしながら、配列情報を決定し、理解し、また比較するのに、多大な時間 及び費用を要するので、現在ではほんのわずかではないＤＮＡ断片を比較するた めに、広大な配列決定法を用いるのは実用的でない。Nat 1. Acad, Sc, U, S, A,, 8th, 544-548 (19 88) and Nature S330.384-386 (1987). stomach. However, determining, understanding, and comparing sequence information takes a significant amount of time. Currently, it is difficult to compare DNA fragments, which are not very small, due to the high cost and cost involved. Therefore, it is impractical to use extensive sequencing methods.
遺伝地図作製において突然変異から生じるＤＮＡ多型性体に最もよく使用される スクリーニングは、制限エンドヌクレアーゼを有するＤＮＡ鎖を消化し、かつサ ザンプロットの手段によって得られた断片を分析することからなる。Ａｍ、Ｊ、 Ｈｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、、１旦、３１４〜３３１ （１９８０）又はＳｃ ｉ、Ａ ｍ、 、２旦１１４０〜４８ （１９８Ｂ）を参照されたい。突然変異は、しば しばでたらめに生じるので、それらはエンドヌクレアーゼの認識配列に影響を及 ぼし、また、その部位での酵素的切断を妨げるかもしれない。Most commonly used for DNA polymorphisms resulting from mutations in genetic mapping Screening involves digesting DNA strands with restriction endonucleases and It consists of analyzing the fragments obtained by means of Zamplot. Am, J. Hum, Genet, 1, 314-331 (1980) or Sci, A See 1140-48 (198B). Mutation is Shiba Because they often occur haphazardly, they do not affect the recognition sequences of endonucleases. It may also prevent enzymatic cleavage at that site.
制限酵素断片長条型地図（ＲＦＬＰＳ）は、制限部位での変化に基づいている。Restriction fragment long strip maps (RFLPS) are based on changes at restriction sites.
それらは正確であるが、あまり情報を提供しない（ＰＩＣ＜０．３）。ＲＦＬＰ ｓの大きな問題は、制限エンドヌクレアーゼでの切断に影響を及ぼさない変化を 検出する試験ができないことである。ＤＮＡ技術における多くの試験法における と同様に、ＲＦＬＰｓを検出するために使用される方法、特にサザンプロット分 析を含む技術は、非常に労力及び費用がかかる。They are accurate but do not provide much information (PIC<0.3). R.F.L.P. The big problem with S is that changes that do not affect restriction endonuclease cleavage There is no test to detect it. In many test methods in DNA technology as well as the methods used to detect RFLPs, especially the Southern blot fraction. Techniques involving analysis are very labor intensive and expensive.
特定のＤＮＡ断片中の特異の突然変異を検出する他の技術には、相補標識オリゴ ヌクレオチド・プローブを用いて分析されるＤＮＡ断片（標的ＤＮＡ）をハイブ リッド形成する方法がある。Ｎｕｃｌ。Other techniques for detecting specific mutations in specific DNA fragments include the use of complementary labeled oligos. Hive the DNA fragment (target DNA) to be analyzed using a nucleotide probe. There is a method of forming a lid. Nucl.
Ａｃ ｉｄｓ Ｒｅｓ、 、９．８７９〜９８４ （１９８１）を参照されたい 。単に１個の塩基対のミスマツチを有するＤＮＡ二本鎖は、高い熱不安定性を示 すので、示差融解温度を使用して、ただ１つのヌクレオチドだけが異なる標的Ｄ ＮＡ類からプローブに完全に相補的な標的ＤＮＡ類を識別することができる。こ の方法は、特異の制限部位が存在するかしないかを検出するために採用された（ 米国特許第４，６８３，１９４号）。この方法は、標的ＤＮＡにハイブリッド形 成される制限部位をスパンする末端標識オリゴヌクレオチド・プローブを使用す ることからなる。次に、ＤＮＡのハイブリッド形成された二本鎖は、その部位に 適した制限酵素でインキュベートさせる。リフォームされた制限部位は、制限エ ンドヌクレアーゼを用いることによってプローブと標的との間で二本鎖対中に消 化されて切断される。短縮されたプローブ分子が検出される場合には、特異の制 限部位は、標的ＤＮＡ中に存在する。See Acids Res, 9.879-984 (1981). . DNA duplexes with just a single base pair mismatch exhibit high thermal instability. Therefore, differential melting temperatures can be used to generate targets D that differ by only one nucleotide. Target DNAs that are completely complementary to the probe can be identified from the NAs. child The method was adopted to detect the presence or absence of unique restriction sites ( U.S. Pat. No. 4,683,194). This method involves adding a hybrid form to the target DNA. using end-labeled oligonucleotide probes that span the restriction sites created. It consists of things. The hybridized duplex of DNA then attaches to that site. Incubate with appropriate restriction enzymes. The reformed restriction site is A double-stranded pair is created between the probe and the target by using a DNA nuclease. cut into pieces. If a truncated probe molecule is detected, the specificity control Restriction sites are present in the target DNA.
ＤＮＡＪ造の相違を研究する他の方法は、標識オリゴヌクレオチドプライマーを 鋳型ＲＮＡ又はＤＮＡにハイブリッド形成し、次にＤＮＡポリメラーゼ及びデオ キシヌクレオシドトリホスフェートを用いて、プライマーを鋳型の５′末端まで 伸張させることからなるプライマー伸張法である。次に、標識プライマー伸張法 の分析を、例えば、変性ポリアクリルアミドゲルに対する電気泳動によって、大 きさに基づく分画化によって行う。この方法は、相同のＤＮＡ断片を比較するた めに、及びヌクレオチド置換又は欠失による相違を検出するためによく使用され る。大きさが、プライマー伸張生成物を特徴付けるために使用される唯一の尺度 であるので、ヌクレオチド置換による相違は検出されない。Another method to study differences in DNAJ structure is to use labeled oligonucleotide primers. Hybridize to template RNA or DNA, then DNA polymerase and Using xynucleoside triphosphate, primers are added to the 5' end of the template. This is a primer extension method consisting of elongation. Next, labeled primer extension method The analysis of This is done by size-based fractionation. This method is used to compare homologous DNA fragments. commonly used to detect differences due to nucleotide substitutions or deletions. Ru. Size is the only measure used to characterize primer extension products Therefore, no differences due to nucleotide substitutions are detected.
もう一つの方法は、ＤＮＡ中にいくつかのヌクレオチド類似体を岨み込むと、そ のＤＮＡを電気泳動等の大きさによる分画法にかける場合に、移動性が増大的に 変移することを利用することである。Another method is to insert some nucleotide analogs into DNA, When subjecting DNA to size-based fractionation methods such as electrophoresis, the mobility increases. It is to take advantage of change.
ヌクレオチド類似体は、電気泳動移動度の変移を生ずるので、それらを使用して 変化を同定することができる。米国特許第４．８７９゜２１４号参照。Nucleotide analogs produce shifts in electrophoretic mobility, so their use Changes can be identified. See U.S. Pat. No. 4,879°214.
都合の悪いことに、多型性体の同定に使用される上記の技術は、あまり情報を提 供しないか、又は実施するのに長い時間を要するかのいずれかである。例えば、 特定のＤＮＡ鎖の個々のヌクレオチドの変化を同定する技術は、実施するのに少 なくとも３〜４日かかることが多い。したがって、そのような試験は、実施する のに非常に労力及び費用がかかる。Unfortunately, the techniques described above used to identify polymorphisms are not very informative. Either they are not available or they take a long time to implement. for example, Techniques for identifying changes in individual nucleotides in a particular DNA strand require little effort to implement. It often takes at least 3 to 4 days. Therefore, such a test should be carried out It takes a lot of effort and cost.
さらに、ＤＮＡ鎖に置換されるヌクレオチドに関する関連個体の中の微妙な遺伝 的相違を検出するのが困難である。ＶＮＴＲの又はシェフレイ（Ｊｅｆｆｒｅｙ ）のプローブ（ＦＢＩがＤＮＡ鎖を試験及び同定するのに使用している）は、大 いに情報を提供するが、同様に情報を提供するＰＣＨに基づく多型性体である我 々のミクロサテライト（ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ）と対照的に、非常に 労力を要する。Additionally, subtle genetic differences among related individuals regarding the nucleotides substituted into the DNA strand Difficult to detect differences. VNTR's or Jeffrey ) probes (used by the FBI to test and identify DNA strands) However, the PCH-based polymorphism that provides information as well In contrast to microsatellites, very It takes effort.
ＤＮＡ断片を同定するか又は比較するために、ある種のヌクレオチド反復多型性 体を使用することは、ウニバー（Ｗｅｂｅｒ）＆メイ（Ｍａｙ）（８９年、Ａｍ 、Ｈｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、 、土工、３８８）、リット（Ｌｉｔｔ）＆ルーティ（ Ｌｕｔｈｙ）（８９年、Ａｍ、Ｈｕｍ。Certain nucleotide repeat polymorphisms can be used to identify or compare DNA fragments. Using the body is a concept that Weber & May (1989, Am , Hum, Genet, , Earthworks, 388), Litt & Rooty ( Luthy) (1989, Am, Hum.
Ｇｅｎｅｔ、 、１土、３９７）によって記載されている。しかしながら、本発 明の多型性体を同定するために（同定及び比較のために）使用する特定の冬型性 遺伝子断片及びプライマーは、これまでに知られても、推測されてもいない。Genet, 1st Sat., 397). However, the main Specific winter morphism used to identify (for identification and comparison) polymorphisms of light Gene fragments and primers have not been previously known or predicted.
したがって、個体間の関係及び関係の程度の相違を決定する非常に高い分解能を 有する迅速、簡単、安価かつ正確な技術を当業界で必要としている。また、非常 に少量の原ＤＮＡ試料を使用するが、なお非常に正確な結果を生じる、非常に正 確な遺伝的関係の試験方法を当業界では必要としている。非常に少量のＤＮＡを 何度も試験に利用することができるので、このことは法医学分野及び犯罪学に特 に当てはまる。Therefore, it is possible to obtain very high resolution to determine relationships between individuals and differences in the degree of relationships. There is a need in the industry for a fast, simple, inexpensive and accurate technique that has Also, very A highly accurate method that uses small amounts of raw DNA sample and still produces very accurate results. There is a need in the art for methods to test for accurate genetic relationships. a very small amount of DNA This is particularly useful in the forensic field and criminology, as it can be used for multiple exams. This applies to
及胛ｑ皿丞 本発明の目的は、遺伝的試験によって個体の微妙な相違を測定するための迅速か つ正確な試験法を提供することにある。胛ｑSarajo The purpose of the present invention is to provide a quick and easy way to measure subtle differences between individuals by genetic testing. The objective is to provide an accurate test method.
本発明の他の目的は、ヒト個体特定化に使用することができる冬型性マーカに関 する。Another object of the present invention relates to winterogenic markers that can be used for human individualization. do.
本発明のさらに他の目的は、多数の分野、例えば、法医学的なスクリーニング、 父子及び出生前スクリーニング、及び遺伝地図作製に応用できる、遺伝的試験に よって個体の微妙な相違を測定するための迅速かつ正確な試験法を提供すること にある。Still other objects of the invention apply to a number of fields, such as forensic screening, For genetic testing that can be applied to paternity and prenatal screening, and genetic mapping. Therefore, to provide a rapid and accurate test method for measuring subtle differences between individuals. It is in.
本発明のなおさらに他の目的は、有効量の本発明のヌクレオチドを使用してＰＣ Ｒ法を行うための改良方法を提供すること、及び有効量の本発明のヌクレオチド 及び補助的のＰＣＲ試薬からなるＰＣＲアッセイ・キットを提供することにある 。Still another object of the invention is to use an effective amount of the nucleotides of the invention to To provide an improved method for carrying out the R method and an effective amount of the nucleotide of the invention and auxiliary PCR reagents. .
欧１９皿生互説則 図１は、配列識別番号（ＳＥＱ ｒＤ Ｎｏ）１のヌクレオチド配列に関する。European 19 dish reciprocity rules FIG. 1 relates to the nucleotide sequence of sequence identification number (SEQ rD No. 1).
図２は、配列識別番号２のヌクレオチド配列に関する。FIG. 2 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2.
図３は、配列識別番号３のヌクレオチド配列に関する。FIG. 3 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO:3.
図４は、配列識別番号４のヌクレオチド配列に関する。FIG. 4 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
図５は、配列識別番号５のヌクレオチド配列に関する。FIG. 5 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5.
図６は、配列識別番号６のヌクレオチド配列に関する。FIG. 6 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6.
図７は、配列識別番号７のヌクレオチド配列に関する。FIG. 7 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7.
図８は、配列識別番号８のヌクレオチド配列に関する。FIG. 8 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO:8.
図９は、配列識別番号９のヌクレオチド配列に関する。FIG. 9 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9.
図１０は、配列識別番号１０のヌクレオチド配列に関する。FIG. 10 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10.
図１１は、配列識別番号１１のヌクレオチド配列に関する。FIG. 11 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11.
図１２は、配列識別番号１２のヌクレオチド配列に関する。FIG. 12 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 12.
図１３は、配列識別番号１３のヌクレオチド配列に関する。FIG. 13 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 13.
図１４は、配列識別番号１４のヌクレオチド配列に関する。FIG. 14 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 14.
図１５は、配列識別番号Ｉ５のヌクレオチド配列に関する。FIG. 15 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: I5.
図１６は、配列識別番号１６のヌクレオチド配列に関する。FIG. 16 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 16.
図１７は、配列識別番号１７のヌクレオチド配列に関する。FIG. 17 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 17.
図１８は、配列識別番号１８のヌクレオチド配列に関する。FIG. 18 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 18.
図１９は、配列識別番号１９のヌクレオチド配列に関する。FIG. 19 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 19.
図２０は、配列識別番号２０のヌクレオチド配列に関する。FIG. 20 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 20.
図２１は、配列識別番号２１のヌクレオチド配列に関する。FIG. 21 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 21.
図２２は、配列識別番号２２のヌクレオチド配列に関する。FIG. 22 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 22.
図２３は、配列識別番号２３のヌクレオチド配列に関する。FIG. 23 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 23.
図２４は、配列識別番号２４のヌクレオチド配列に関する。FIG. 24 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 24.
図２５は、配列識別番号２５のヌクレオチド配列に関する。FIG. 25 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 25.
図２６は、配列識別番号２６のヌクレオチド配列に関する。FIG. 26 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26.
図２７は、配列識別番号２７のヌクレオチド配列に関する。FIG. 27 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27.
図２８は、配列識別番号２８のヌクレオチド配列に関する。FIG. 28 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28.
図２９は、配列識別番号２９のヌクレオチド配列に関する。FIG. 29 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29.
図３０は、配列識別番号３０のヌクレオチド配列に関する。FIG. 30 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 30.
図３１は、配列識別番号３１のヌクレオチド配列に関する。FIG. 31 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 31.
図３２は、配列識別番号３２のヌクレオチド配列に関する。FIG. 32 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 32.
図３３は、配列識別番号３３のヌクレオチド配列に関する。FIG. 33 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 33.
図３４は、配列識別番号３４のヌクレオチド配列に関する。FIG. 34 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 34.
図３５は、配列識別番号３５のヌクレオチド配列に関する。FIG. 35 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 35.
図３６は、配列識別番号３６のヌクレオチド配列に関する。FIG. 36 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 36.
図３７は、配列識別番号３７のヌクレオチド配列に関する。FIG. 37 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 37.
図３８は、配列識別番号３８のヌクレオチド配列に関する。FIG. 38 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 38.
図３９は、配列識別番号３９のヌクレオチド配列に関する。FIG. 39 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 39.
図４０は、配列識別番号４０のヌクレオチド配列に関する。FIG. 40 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 40.
図４１は、配列識別番号４１のヌクレオチド配列に関する。FIG. 41 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 41.
図４２は、配列識別番号４２のヌクレオチド配列に関する。FIG. 42 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 42.
図４３は、配列識別番号４３のヌクレオチド配列に関する。FIG. 43 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 43.
図４４は、配列識別番号４４のヌクレオチド配列に関する。FIG. 44 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 44.
図４５は、配列識別番号４５のヌクレオチド配列に関する。FIG. 45 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 45.
図４６は、配列識別番号４６のヌクレオチド配列に関する。FIG. 46 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 46.
図４７は、配列識別番号４７のヌクレオチド配列に関する。FIG. 47 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 47.
図４８は、配列識別番号４８のヌクレオチド配列に関する。FIG. 48 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 48.
図４９は、配列識別番号４９のヌクレオチド配列に関する。FIG. 49 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 49.
図５０は、配列識別番号５０のヌクレオチド配列に関する。FIG. 50 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 50.
図５１は、配列識別番号５１のヌクレオチド配列に関する。FIG. 51 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 51.
図５２は、配列識別番号５２のヌクレオチド配列に関する。FIG. 52 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 52.
図５３は、配列識別番号５３のヌクレオチド配列に関する。FIG. 53 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 53.
図５４は、配列識別番号５４のヌクレオチド配列に関する。FIG. 54 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 54.
図５５は、配列識別番号５５のヌクレオチド配列に関する。FIG. 55 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 55.
図５６は、配列識別番号５６のヌクレオチド配列に関する。FIG. 56 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 56.
図５７は、配列識別番号５７のヌクレオチド配列に関する。FIG. 57 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 57.
図５８は、配列識別番号５８のヌクレオチド配列に関する。FIG. 58 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 58.
図５９は、配列識別番号５９のヌクレオチド配列に関する。FIG. 59 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 59.
図６０は、配列識別番号６０のヌクレオチド配列に関する。FIG. 60 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 60.
図６１は、配列識別番号６１のヌクレオチド配列に関する。FIG. 61 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 61.
図６２は、配列識別番号６２のヌクレオチド配列に関する。FIG. 62 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 62.
図６３は、配列識別番号６３のヌクレオチド配列に関する。−■ るための の １ 本発明は、遺伝的試験によって個体の微妙な遺伝的相違を測定するための迅速か つ正確な試験法を提供することにある。本発明は、さらにヒト個体特定化に使用 することができる冬型性マーカ（２種のテトラヌクレオチド及び１種のジヌクレ オチド反復冬型性体）に関する。本発明は、さらにヒト個体特定化に有用な２７ 種の冬型性マーカに関する。本発明の技術及びマーカは、例えば法医学的なスク リーニング、父子及び出生前スクリーニング、並びに遺伝地図作製において応用 される。FIG. 63 relates to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 63. −■ for 1 The present invention provides a rapid method for measuring subtle genetic differences in individuals through genetic testing. The objective is to provide an accurate test method. The present invention can further be used for human individualization. winter-type markers (two tetranucleotides and one dinucleotide) that can Concerning otid repeat winter type body). The present invention further provides 27 Concerning winter sex markers of species. The technology and markers of the present invention can be used, for example, in forensic screening. Applications in screening, paternity and prenatal screening, and genetic mapping be done.
本発明は、法医学的スクリーンのヒト個体特定化、及び父子及び出生前スクリー ニング、並びに遺伝地図作製に有用な冬型性マーカ（２種のテトラヌクレオチド 、１種のジヌクレオチド反復冬型性体及び２７種の他の独特の冬型性マーカ）に 関する。本発明のマーカは、高い冬型柱体情報量（Ｐ Ｉ Ｃ）値を有している 。最初の３種のマーカは、以下の通りのオリゴヌクレオチド・プライマー組によ って特徴付けられる。The present invention provides human identification for forensic screens and paternity and prenatal screens. winter-type markers (two types of tetranucleotides) useful for genetic mapping and genetic mapping. , 1 dinucleotide repeat winter-type body and 27 other unique winter-type markers). related. The marker of the present invention has a high winter column information content (PIC) value. . The first three markers were created using the following oligonucleotide primer sets: It is characterized as.
１、 １組、ＰＩＣｏ、９２ ａ、配列識別番号ｌのヌクレオチド配列す、配列識別番号２のヌクレオチド配列 ２．２組、ＰＩＣｏ、９１ ａ、配列識別番号３のヌクレオチド配列す、配列識別番号４のヌクレオチド配列 ３．３組、ＰＩＣｏ、９２ ａ、配列識別番号５のヌクレオチド配列す、配列識別番号６のヌクレオチド配列 。1, Group 1, PICo, 92 a, nucleotide sequence of sequence identification number 1, nucleotide sequence of sequence identification number 2 2.2 group, PICo, 91 a, Nucleotide sequence of SEQ ID NO: 3, Nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 3. Group 3, PICo, 92 a, Nucleotide sequence of SEQ ID NO: 5, Nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 .
ヒト個体特定化に使用することができるこれらの冬型性マーカ（発端及び末端ヌ クレオチド配列も伴う２種のテトラヌクレオチド及び１種のジヌクレオチド反復 長型性体）は、さらに以下のマーカ配列によって特徴付けられる。These winter markers (initial and terminal markers) can be used for human individualization. 2 tetranucleotides and 1 dinucleotide repeat with also cleotide sequence The long form) is further characterized by the following marker sequences.
１、配列識別番号７の反復冬型性体を有するヌクレオチド配列２、配列識別番号 ８の反復冬型性体を有するヌクレオチド配列３、配列識別番号９の反復冬型性体 を有するヌクレオチド配列。1. Nucleotide sequence having a repeating winter form of sequence identification number 7 2. Sequence identification number Nucleotide sequence 3 with repeat winter form of 8, repeat winter form of sequence identification number 9 A nucleotide sequence having.
冬型性マーカ及び指標遺伝子座は、「対」として存在するので、本発明のプライ マー・オリゴヌクレオチドを冬型性マーカに結合させることによって、断片対の ＰＣＲ増幅が可能となる。次に、増幅されたＤＮＡは、断片を電気泳動及びオー トラジオグラフィによって分解することができる。次に、得られたオートラジオ グラフィに関し、他のＤＮＡ断片オートラジオグラフィに対するその類似点を分 析することができる。ＰＣＲ増幅法に従って、電気泳動運動性を向上させるＤＮ Ａ類似体を必要に応じて使用して、電気泳動工程の精度を向上させることができ る。Since the winter-type marker and the indicator locus exist as a “pair”, the priority of the present invention is By linking the marker oligonucleotide to the winter-type marker, PCR amplification becomes possible. Next, the amplified DNA is electrophoresed and autographed to separate the fragments. Can be resolved by traradiography. Then the resulting autoradio and its similarities to other DNA fragment autoradiography. can be analyzed. DN that improves electrophoretic motility according to PCR amplification method A analogs can be used as needed to improve the accuracy of the electrophoresis process. Ru.
独特の多量性体を検出するための２７種の他の一次対配列は、配列識別番号１０ から配列識別番号６３の配列である。27 other primary pair sequences for detecting unique multimers are SEQ ID NO: 10 This is the sequence with sequence identification number 63.
上述の多量性体は、それらが高いＰＩＣ値を有しているので、ヒト個体特定化に 有用である。前記多量性体は、ポリメラーゼ連鎖反応に基づくものであるので、 微量のゲノムＤＮＡだけが各試験に必要である。標的配列の長さは、６９〜２６ ０ｂｐｓの範囲であるので、高分子量ＤＮＡを必要とせず、ＤＮＡの剪断等の通 常の問題は、アッセイの性能に最小限の衝撃しか及ぼさない。アッセイは、容易 に実施することができ、２４時間以内に結果を得ることができる。The above-mentioned multimers are suitable for human individualization because they have high PIC values. Useful. Since the multimer is based on polymerase chain reaction, Only a small amount of genomic DNA is required for each test. The length of the target sequence is 69-26 Since the speed is in the range of 0bps, high molecular weight DNA is not required and there is no need for conventional methods such as DNA shearing. Common problems have minimal impact on assay performance. Assay is easy It can be performed within 24 hours and results can be obtained within 24 hours.
ミクロサテライト反復長型性体は、ＤＮＡ分析における有用な道具であることが 示された。本明細書で記載する２７種の多量性体は、新規のものであり、前もっ て配列を決定されたヒト遺伝子に基づくものである。法医学的スクリーニングに おいて、最も普通に使用される技術は、ここに記載するＰＣＲ可能なミクロサテ ライトと対照的にミクロサテライト・マーカに基づくものである。Microsatellite repeat long forms have proven to be useful tools in DNA analysis. Shown. The 27 multimers described herein are new and previously It is based on a human gene whose sequence was determined by For forensic screening The most commonly used technique is the PCR-capable microsatellite technique described here. In contrast to light, it is based on microsatellite markers.
２７種のマーカは、以下のようなオリゴヌクレオチドのプライマー組によって特 徴付けられる。The 27 markers were identified using the following oligonucleotide primer sets. be commandeered.
また、本発明は、有効量の上記した本発明の少な（とも１種のヌクレオチドを使 用することからなるＰＣＲ法を行うための方法であって、前記ヌクレオチドが、 ａ）配列識別番号ｌに記載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識別番号 ２に記載のヌクレオチド配列：ｂ）配列識別番号３に記載の配列を有するヌクレ オチド配列、及び配列識別番号４に記載のヌクレオチド配列；Ｃ）配列識別番号 ５に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識別番号６に記載のヌクレ オチド配列：ｄ）配列識別番号１０に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及 び配列識別番号１１に記載のヌクレオチド配列：ｅ）配列識別番号１２に記載の 配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識別番号１３に記載のヌクレオチド配 列；ｆ）配列識別番号１４に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識 別番号１５に記載のヌクレオチド配列；ｇ）配列識別番号１６に記載の配列を有 するヌクレオチド配列、及び配列識別番号１７に記載のヌクレオチド配列；ｈ） 配列識別番号１８に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識別番号１ ９に記載のヌクレオチド配列；ｉ）配列識別番号２０に記載の配列を有するヌク レオチド配列、及び配列識別番号２１に記載のヌクレオチド配列；ｊ）配列識別 番号２２に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識別番号２３に記載 のヌクレオチド配列：ｋ）配列識別番号２４に記載の配列を有するヌクレオチド 配列、及び配列識別番号２５に記載のヌクレオチド配列；ｌ）配列識別番号２６ に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識別番号２７に記載のヌクレ オチド配列：ｍ）配列識別番号２８に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及 び配列識別番号２９に記載のヌクレオチド配列；ｎ）配列識別番号３０に記載の 配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識別番号３１に記載のヌクレオチド配 列；０）配列識別番号３２に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識 別番号３３に記載のヌクレオチド配列；ｐ）配列識別番号３４に記載の配列を有 するヌクレオチド配列、及び配列識別番号３５に記載のヌクレオチド配列；ｑ） 配列識別番号３６に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識別番号３ ７に記載のヌクレオチド配列；ｒ）配列識別番号３８に記載の配列を有するヌク レオチド配列、及び配列識別番号３９に記載のヌクレオチド配列；Ｓ）配列識別 番号４０に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識別番号４１に記載 のヌクレオチド配列；ｔ）配列識別番号４２に記載の配列を有するヌクレオチド 配列、及び配列識別番号４３に記載のヌクレオチド配列；Ｕ）配列識別番号４４ に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識別番号４５に記載のヌクレ オチド配列；■）配列識別番号４６に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及 び配列識別番号４７に記載のヌクレオチド配列；Ｗ）配列識別番号４８に記載の 配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識別番号４９に記載のヌクレオチド配 列：Ｘ）配列識別番号５０に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識 別番号５１に記載のヌクレオチド配列：ｙ）配列識別番号５２に記載の配列を有 するヌクレオチド配列、及び配列識別番号５３に記載のヌクレオチド配列：２） 配列識別番号５４に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識別番号５ ５に記載のヌクレオチド配列；ａａ）配列識別番号５６に記載の配列を有するヌ クレオチド配列、及び配列識別番号５７に記載のヌクレオチド配列：ｂｂ）配列 識別番号５８に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識別番号５９に 記載のヌクレオチド配列；ｃｃ）配列識別番号６０に記載の配列を有するヌクレ オチド配列、及び配列識別番号６１に記載のヌクレオチド配列；及びｄｄ）配列 識別番号６２に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識別番号６３に 記載のヌクレオチド配列からなるヌクレオチド対の群から選択されるヌクレオチ ドのプライマー対の一部であることを特徴とする方法に関する。The present invention also provides an effective amount of the above-mentioned nucleotides of the present invention. 1. A method for carrying out a PCR method, the method comprising: a) A nucleotide sequence having the sequence set forth in Sequence Identification Number 1, and Sequence Identification Number 2: b) a nucleotide sequence having the sequence set forth in Sequence ID No. 3; Otide sequence and the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 4; C) SEQ ID NO: a nucleotide sequence having the sequence set forth in No. 5, and a nucleotide sequence having the sequence set forth in Sequence ID No. 6; Otide sequence: d) A nucleotide sequence having the sequence set forth in Sequence ID No. 10, and and the nucleotide sequence set forth in Sequence ID No. 11; e) the nucleotide sequence set forth in Sequence ID No. 12; and the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 13. column; f) a nucleotide sequence having the sequence set forth in Sequence ID No. 14 and sequence identification; nucleotide sequence set forth in Separate No. 15; g) having the sequence set forth in Sequence ID No. 16; and the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 17; h) A nucleotide sequence having the sequence set forth in SEQ ID NO: 18, and SEQ ID NO: 1 9; i) a nucleotide sequence having the sequence set forth in Sequence ID No. 20; Reotide sequence and the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 21; j) Sequence identification Nucleotide sequence having the sequence set forth in number 22 and set forth in sequence identification number 23 nucleotide sequence: k) nucleotide having the sequence set forth in Sequence ID No. 24 sequence, and the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 25; l) SEQ ID NO: 26 and the nucleotide sequence having the sequence set forth in Sequence ID No. 27. Otide sequence: m) A nucleotide sequence having the sequence set forth in Sequence ID No. 28, and and the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 29; n) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 30; and the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 31. Column; 0) Nucleotide sequence having the sequence set forth in Sequence ID No. 32 and sequence identification nucleotide sequence set forth in Separate No. 33; p) having the sequence set forth in Sequence ID No. 34; and the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 35; q) A nucleotide sequence having the sequence set forth in SEQ ID NO: 36, and SEQ ID NO: 3 7; r) a nucleotide sequence having the sequence set forth in Sequence ID No. 38; Reotide sequence and the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 39; S) Sequence identification Nucleotide sequence having the sequence set forth in number 40 and set forth in sequence identification number 41 t) a nucleotide having the sequence set forth in SEQ ID NO: 42; sequence, and the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 43; U) SEQ ID NO: 44 and a nucleotide sequence having the sequence set forth in Sequence ID No. 45. octide sequence; ■) a nucleotide sequence having the sequence described in sequence identification number 46; and the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 47; W) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 48; and the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 49. Column: X) Nucleotide sequence having the sequence set forth in sequence identification number 50 and sequence identification Nucleotide sequence set forth in Separate No. 51: y) Having the sequence set forth in Sequence ID No. 52 and the nucleotide sequence set forth in Sequence ID No. 53: 2) A nucleotide sequence having the sequence set forth in SEQ ID NO: 54, and SEQ ID NO: 5 5; aa) a nucleotide sequence having the sequence set forth in Sequence ID No. 56; nucleotide sequence and the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 57: bb) sequence A nucleotide sequence having the sequence set forth in identification number 58, and a nucleotide sequence having the sequence set forth in sequence identification number 59. cc) a nucleotide sequence having the sequence set forth in Sequence ID No. 60; otide sequence, and the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 61; and dd) sequence A nucleotide sequence having the sequence set forth in identification number 62, and a nucleotide sequence having the sequence set forth in sequence identification number 63. Nucleotides selected from the group of nucleotide pairs consisting of the nucleotide sequences described The method is characterized in that the primer pair is part of a primer pair of a primer pair.
したがって、本発明は、さらに配列識別番号７の配列、配列識別番号８の配列、 及び配列識別番号９の配列からなる群から選択されるジヌクレオチド又はテトラ ヌクレオチド反復冬型性体の追加又は欠失組に関する遺伝物質の微妙な相違を測 定するためのアッセイであって、 ａ、 試験に有効な量の前記反復冬型性体からなるヌクレオチド断片を獲得し、 ｂ、 前記多量柱体含有断片を増幅することができるオリゴヌクレオチドプライ マー対を用いてＰＣＲ法によって前記断片を増幅し、Ｃ１ポリアクリルアミド・ ゲル電気泳動（ｐ ａ ｇ ｅ）を用いて前記増幅断片を分解し、そして ｄ オートラジオグラフィによって前記分解断片を比較して、長さの差による移 動パターンの相違を観察することを特徴とするアッセイに関する。Therefore, the present invention further provides the sequence of SEQ ID NO: 7, the sequence of SEQ ID NO: 8, and a dinucleotide or tetranucleotide selected from the group consisting of the sequence of SEQ ID NO: 9. Measuring subtle differences in genetic material related to additions or deletions of nucleotide repeats in winter-type bodies An assay for determining a. Obtaining an amount of the nucleotide fragment consisting of the repeat winter type body in an amount effective for the test, b. Oligonucleotide primer capable of amplifying the multicolumn-containing fragment The fragment was amplified by PCR using the mer pair, and C1 polyacrylamide The amplified fragments are resolved using gel electrophoresis (PAG), and d Compare the decomposed fragments by autoradiography to determine the migration due to length differences. The present invention relates to an assay characterized by observing differences in movement patterns.
好ましくは、本発明は、さらに配列識別番号７の配列、配列識別番号８の配列、 及び配列識別番号９の配列からなる群から選択されるジヌクレオチド又はテトラ ヌクレオチド反復冬型性体の追加又は欠失組に関する遺伝物質の微妙な相違を測 定するためのアッセイであって、 ａ、 試験に有効な量の前記反復冬型性体からなるヌクレオチド断片を獲得し、 ｂ４ 配列識別番号ｌの配列、配列識別番号２の配列、配列識別番号３の配列、 配列識別番号４の配列、配列識別番号５の配列又は配列識別番号６の配列からな る群から選択されるオリゴヌクレオチドプライマー対を用いてＰＣＲ法によって 前記断片を増幅し、Ｃ１ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動（ｐａｇｅ）を用い て前記増幅断片を分解し、そして ｄ、 オートラジオグラフィによって前記分解断片を比較して、長さの差による 移動パターンの相違を観察することを特徴とするアッセイに関する。Preferably, the present invention further comprises the sequence SEQ ID NO: 7, the sequence SEQ ID NO: 8, and a dinucleotide or tetranucleotide selected from the group consisting of the sequence of SEQ ID NO: 9. Measuring subtle differences in genetic material related to additions or deletions of nucleotide repeats in winter-type bodies An assay for determining a. Obtaining an amount of the nucleotide fragment consisting of the repeat winter type body in an amount effective for the test, b4 Sequence with sequence identification number 1, sequence with sequence identification number 2, sequence with sequence identification number 3, The sequence of sequence identification number 4, the sequence of sequence identification number 5, or the sequence of sequence identification number 6 by PCR method using an oligonucleotide primer pair selected from the group The fragments were amplified and analyzed using C1 polyacrylamide gel electrophoresis (page). to degrade the amplified fragment, and d. Comparing the decomposed fragments by autoradiography and determining the difference in length It relates to an assay characterized by observing differences in migration patterns.
本発明は、なおさらに、有効量の上記本発明の配列を有する少なくとも１種のヌ クレオチドからなるＰＣＲ法を行うためのアッセイ・キットであって、前記ヌク レオチドが、ａ）配列識別番号１に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及び 配列識別番号２に記載のヌクレオチド配列；ｂ）配列識別番号３に記載の配列を 有するヌクレオチド配列、及び配列識別番号４に記載のヌクレオチド配列：Ｃ） 配列識別番号５に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識別番号６に 記載のヌクレオチド配列；ｄ）配列識別番号１０に記載の配列を有するヌクレオ チド配列、及び配列識別番号１１に記載のヌクレオチド配列；ｅ）配列識別番号 １２に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識別番号１３に記載のヌ クレオチド配列；ｆ）配列識別番号１４に記載の配列を有するヌクレオチド配列 、及び配列識別番号１５に記載のヌクレオチド配列；ｇ）配列識別番号１６に記 載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識別番号１７に記載のヌクレオチ ド配列；ｈ）配列識別番号１８に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配 列識別番号１９に記載のヌクレオチド配列；ｉ）配列識別番号２０に記載の配列 を有するヌクレオチド配列、及び配列識別番号２Ｉに記載のヌクレオチド配列； ｊ）配列識別番号２２に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識別番 号２３に記載のヌクレオチド配列；ｋ）配列識別番号２４に記載の配列を有する ヌクレオチド配列、及び配列識別番号２５に記載のヌクレオチド配列；ｌ）配列 識別番号２６に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識別番号２７に 記載のヌクレオチド配列；ｍ）配列識別番号２８に記載の配列を有するヌクレオ チド配列、及び配列識別番号２９に記載のヌクレオチド配列；ｎ）配列識別番号 ３０に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識別番号３１に記載のヌ クレオチド配列：０）配列識別番号３２に記載の配列を有するヌクレオチド配列 、及び配列識別番号３３に記載のヌクレオチド配列；ｐ）配列識別番号３４に記 載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識別番号３５に記載のヌクレオチ ド配列；ｑ）配列識別番号３６に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配 列識別番号３７に記載のヌクレオチド配列：ｒ）配列識別番号３８に記載の配列 を有するヌクレオチド配列、及び配列識別番号３９に記載のヌクレオチド配列； Ｓ）配列識別番号４０に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識別番 号４１に記載のヌクレオチド配列；ｔ）配列識別番号４２に記載の配列を有する ヌクレオチド配列、及び配列識別番号４３に記載のヌクレオチド配列；Ｕ）配列 識別番号４４に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識別番号４５に 記載のヌクレオチド配列；Ｖ）配列識別番号４６に記載の配列を有するヌクレオ チド配列、及び配列識別番号４７に記載のヌクレオチド配列；Ｗ）配列識別番号 ４８に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識別番号４９に記載のヌ クレオチド配列：Ｘ）配列識別番号５０に記載の配列を有するヌクレオチド配列 、及び配列識別番号５１に記載のヌクレオチド配列：ｙ）配列識別番号５２に記 載の配列を育するヌクレオチド配列、及び配列識別番号５３に記載のヌクレオチ ド配列；２）配列識別番号５４に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配 列識別番号５５に記載のヌクレオチド配列：ａａ）配列識別番号５６に記載の配 列を有するヌクレオチド配列、及び配列識別番号５７に記載のヌクレオチド配列 ；ｂｂ）配列識別番号５８に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識 別番号５９に記載のヌクレオチド配列；ｃｃ）配列識別番号６０に記載の配列を 有するヌクレオチド配列、及び配列識別番号６１に記載のヌクレオチド配列；及 びｄｄ）配列識別番号６２に記載の配列を有するヌクレオチド配列、及び配列識 別番号６３に記載のヌクレオチド配列からなるヌクレオチド対の群から選択され るヌクレオチドのプライマー対の一部であり、また、有効量の補助的なＰＣＲ試 薬と組み合わされていることを特徴とするアッセイ・キットである。The present invention still further provides an effective amount of at least one protein having the above-described sequence of the present invention. An assay kit for performing a PCR method consisting of nucleotides, the kit comprising: leotide has a) a nucleotide sequence having the sequence set forth in SEQ ID NO: 1, and b) the nucleotide sequence set forth in Sequence ID No. 2; b) the sequence set forth in Sequence ID No. 3; and the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4: C) A nucleotide sequence having the sequence set forth in SEQ ID NO: 5, and a nucleotide sequence having the sequence set forth in SEQ ID NO: 6. d) a nucleotide sequence having the sequence set forth in SEQ ID NO: 10; nucleotide sequence and the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 11; e) SEQ ID NO: A nucleotide sequence having the sequence set forth in Sequence ID No. 12, and a nucleotide sequence having the sequence set forth in Sequence ID No. nucleotide sequence; f) a nucleotide sequence having the sequence set forth in Sequence ID No. 14; , and the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 15; g) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 16; and the nucleotide sequence having the sequence shown in Sequence ID No. 17. h) a nucleotide sequence having the sequence set forth in Sequence ID No. 18; the nucleotide sequence set forth in column identification number 19; i) the sequence set forth in sequence identification number 20; and the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 2I; j) A nucleotide sequence having the sequence set forth in Sequence ID No. 22, and Sequence ID No. nucleotide sequence set forth in No. 23; k) having the sequence set forth in Sequence ID No. 24; nucleotide sequence and the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 25; l) Sequence A nucleotide sequence having the sequence set forth in identification number 26, and a nucleotide sequence having the sequence set forth in sequence identification number 27. nucleotide sequence as described; m) a nucleonucleotide having the sequence as described in SEQ ID NO. nucleotide sequence and the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 29; n) SEQ ID NO: A nucleotide sequence having the sequence set forth in Sequence ID No. 30, and a nucleotide sequence having the sequence set forth in SEQ ID NO: 31. Creotide sequence: 0) Nucleotide sequence having the sequence described in Sequence ID No. 32 , and the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 33; p) the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 34; and the nucleotide sequence having the sequence shown in SEQ ID NO: 35. q) a nucleotide sequence having the sequence set forth in Sequence ID No. 36; Nucleotide sequence set forth in column identification number 37: r) Sequence set forth in sequence identification number 38 and the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 39; S) A nucleotide sequence having the sequence set forth in Sequence ID No. 40, and Sequence ID No. t) has the sequence described in Sequence ID No. 42; Nucleotide sequence and nucleotide sequence set forth in Sequence ID No. 43; U) Sequence A nucleotide sequence having the sequence set forth in identification number 44, and a nucleotide sequence having the sequence set forth in sequence identification number 45. nucleotide sequence as described; nucleotide sequence and the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 47; W) SEQ ID NO: A nucleotide sequence having the sequence set forth in Sequence ID No. 48, and a nucleotide sequence having the sequence set forth in Sequence ID No. 49. Creotide sequence: X) Nucleotide sequence having the sequence set forth in Sequence ID No. 50 , and the nucleotide sequence set forth in Sequence ID No. 51: y) the nucleotide sequence set forth in Sequence ID No. 52. 53, and the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 53. 2) a nucleotide sequence having the sequence set forth in Sequence ID No. 54; aa) the nucleotide sequence set forth in column identification number 55; aa) the sequence set forth in sequence identification number 56; and the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 57. ;bb) a nucleotide sequence having the sequence set forth in Sequence ID No. 58, and a sequence identification; cc) the nucleotide sequence set forth in Separate No. 59; cc) the sequence set forth in Sequence ID No. 60; and the nucleotide sequence set forth in Sequence ID No. 61; and dd) the nucleotide sequence having the sequence set forth in Sequence ID No. 62, and the sequence identification selected from the group of nucleotide pairs consisting of the nucleotide sequence set forth in Separate No. 63; is part of the primer pair of nucleotides used in The assay kit is characterized in that it is combined with a drug.
したがって、上述の冬型性体は、それらが高いＰＩＣ値を有しているので、ヒト 個体特定化に有用である。前記冬型性体は、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ ＣＲ） に基づくものであるので、微量（４０ナノグラム）のゲノムＤＮＡだけが各試験 に必要である。標的配列は、９２〜３１０塩基対の範囲であるので、高分子量Ｄ ＮＡを必要とせず、ＤＮＡの剪断等の通常の問題は、アッセイの性能に最小限の 衝撃しか及ぼさない。アッセイは、容易に実施することができ、２４時間以内に 結果を得ることができる。結果が３〜４時間以内に得られるのが珍しくない。そ れに比べて、従来技術の方法は、結果を得るまでに多くの日数を要し、通常は３ 〜４日が必要である。Therefore, the above-mentioned winter-type bodies have a high PIC value, so humans Useful for individual identification. The winter type body is caused by polymerase chain reaction (PCR) Because only a tiny amount (40 nanograms) of genomic DNA is used in each test. is necessary. The target sequence ranges from 92 to 310 base pairs, so the high molecular weight D No NA is required and normal issues such as DNA shearing have minimal impact on assay performance. It only causes shock. The assay is easy to perform and can be completed within 24 hours. You can get results. It is not uncommon for results to be obtained within 3-4 hours. So In comparison, prior art methods require many days to obtain results, typically 3 ~4 days are required.
また、上述のＩＡ〜２７Ａに対応し、また、配列識別番号ｌＯ〜６３に従うそれ らの２７種のプライマー対によりて特徴付けられる冬型性体も、それらが高いＰ ＩＣ値を有しているので、ヒト個体特定化に有用である。Also, those corresponding to the above-mentioned IA-27A and according to the sequence identification number lO-63 The winter-type bodies characterized by 27 types of primer pairs from et al. Since it has an IC value, it is useful for human individualization.
さらに、本発明のアッセイによれば、ヌクレオチド配列の非常に小さな相違を検 出することができる。反復配列のただ１種の欠失又は追加によって、移動度が標 的ヌクレオチド配列の電気的性質及び分子量のために変化される。これらの相違 は、電気泳動後のオートラジオグラフにはっきりと見ることができる。Furthermore, the assays of the invention detect very small differences in nucleotide sequences. can be released. Deletion or addition of just one repetitive sequence results in mobility at the target level. may vary due to the electrical properties and molecular weight of the specific nucleotide sequence. These differences can be clearly seen in the autoradiograph after electrophoresis.
ミクロサテライト反復多量性体は、ＤＮＡ分析における有用な道具であることが 示された。本明細書で記載する３種の冬型性体は、新規のものであり、前もって 配列を決定された遺伝子に基づくものである。法医学的スクリーニングにおいて 、最も普通に使用される技術は、本発明で記載するＰＣＲ可能なミクロサテライ トと対照的に、ミクロサテライト・マーカに基づ（ものである。Microsatellite repeat multimers may be useful tools in DNA analysis. Shown. The three winterers described herein are novel and previously It is based on sequenced genes. in forensic screening , the most commonly used technique is the PCR-enabled microsatellite system described in this invention. In contrast, it is based on microsatellite markers.
一般的なＰＣＲ法の工程は、参照として本明細書に組み入れられるマリス（Ｍｕ ｌ １ ｉ ｓ）等に付与された米国特許第４，６８３゜１９５号及びマリス 等に付与された米国特許第４，６８３，２０２号に記載されているように、一般 に行われる。さらに、電気運動性向上ＤＮＡ類似体を、必要に応じて複製及び増 幅ＰＣＲ手順中に使用することができる。The steps of the general PCR method are described by Mullis (Mu), which is incorporated herein by reference. U.S. Patent No. 4,683°195 issued to As described in U.S. Pat. No. 4,683,202 to et al. It will be held on. Furthermore, the electromotility-enhancing DNA analogs can be replicated and expanded as needed. Can be used during width PCR procedures.
冬型性体が高い情報量で個体特定化試験結果を与える本発明の遺伝子断片の条里 性の程度は、驚（べきであり、かつ、思いがけないものである。高いＰＩＣ値（ 約０．９）は、まったく思いもかけないものである。The gene fragment of the present invention that provides individualization test results with a high amount of information on winter-type bodies The degree of gender is surprising and unexpected. approximately 0.9) is completely unexpected.
したがって、ＰＣＲ法及び配列識別番号１〜６のプライマー配列等のＰＣＲプラ イマー対を使用して、本発明の条里性ＤＮＡ断片を検出すると、優れた結果が得 られる。さらに、配列識別番号１０〜６３に対応するプライマー断片を使用して 冬型性体を検出すると、優れた結果が得られる。そのような結果は、ＤＮＡ断片 を同定し、個々のＤＮＡ断片間の関係の度合いを決定するのに十分に正確で、か つ、情報量の多いものである。さらに、３組のＰＣＲ法それぞれに、本発明の異 なるＰＣＲプライマー対を使用しながら、同一のＤＮＡ断片試料にこれらの３組 のＰＣＲ法を行うと、並みはずれて正確なかつ情報量の多い試験結果が得られる 。これら３組の試験結果データを比較することによって、極めて正確なりＮＡ断 片の同定がなされる。Therefore, PCR methods and PCR protocols such as primer sequences with sequence identification numbers 1 to 6 The use of imer pairs to detect the striped DNA fragments of the present invention provides excellent results. It will be done. Furthermore, using primer fragments corresponding to sequence identification numbers 10 to 63, Detecting winter types gives excellent results. Such results indicate that DNA fragments accurate enough to identify and determine the degree of relationship between individual DNA fragments. First, it contains a large amount of information. Furthermore, each of the three sets of PCR methods is different from the present invention. Using these three pairs of PCR primers on the same DNA fragment sample, The PCR method provides exceptionally accurate and informative test results. . By comparing these three sets of test result data, extremely accurate NA Identification of the pieces is made.
以下の実施例は、本発明をさらに具体的に説明するものであり、本発明は、以下 の実施例に限定されない。The following examples further specifically illustrate the present invention. However, the present invention is not limited to this embodiment.
上述のオリゴヌクレオチド・プライマーを使用して、以下の条件下にＰＣＲを用 いて標的断片を増幅する：裏立且１ 試料はＤＮＡであり、次のようにして作成する。Using the oligonucleotide primers described above, use PCR under the following conditions: Amplify the target fragment using The sample is DNA and is prepared as follows.
６０ｎｇのゲノムＤＮＡを、最終反応容量１５マイクロリツトルで、８０ｎＨの 各オリゴヌクレオチド・プライマー、０．６単位の標識ポリメラーゼ、５０ｍＭ のＫＣＩ、１０ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ８゜３） 、１．５ｍＭのＭｇＣＩｔ 、０． Ｏ１％のゼラチン、各２００μＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ及びｄＴＴＰ 、２．５μＭのｄ ＣＴ Ｐ、及びｌＯマイクロキュリーのアルファＰ３２ｄＣ ＴＰと共に、ＰＣＲ用鋳型として使用する。各試料に１５マイクロリツトルの鉱 油をかぶせて蒸発を防止する。60 ng of genomic DNA was incubated at 80 nH in a final reaction volume of 15 microliters. Each oligonucleotide primer, 0.6 units of labeled polymerase, 50mM KCI, 10mM Tris buffer (pH 8°3), 1.5mM MgCIt , 0. O1% gelatin, 200 μM each dGTP, dATP and dTTP , 2.5 μM dCTP, and lO microcurie alpha P32dC Used together with TP as a template for PCR. 15 microliters of ore in each sample Cover with oil to prevent evaporation.
夫五且Ｉ ＰＣＲを上記実施例１に記載した各試料及びプライマーに実施する。Husband I PCR is performed on each sample and primers described in Example 1 above.
ＰＣＲを、９４℃で１．４分間の変性、５５℃で２分間のアニーリング及び７２ ℃で２分間の伸張という条件下に、ＴｅｃｈｎｅＭＷ−１マイクロプレート・サ ーモサイクラ−中で実施する。このサイクルを３０回繰り返し、最終伸張を７２ ℃で１０分間行う。PCR was performed by denaturing at 94°C for 1.4 min, annealing at 55°C for 2 min and TechneMW-1 microplate support under conditions of 2 min extension at °C. - Carry out in a mocycler. Repeat this cycle 30 times for a final stretch of 72 ℃ for 10 minutes.
夾立且ｌ 上記実施例２に記載した各試料から得た増幅ＤＮＡ断片を、以下のように電気泳 動によって分解する。夾辔且l The amplified DNA fragments obtained from each sample described in Example 2 above were subjected to electrophoresis as follows. Decompose by movement.
各ＰＣＲ反応混合物試料２マイクロリットルを６％ＰＡＧＥ配列決定用ゲルで電 気泳動させ、そしてオートラジオグラフィによって可視化した。オートラジオグ ラフィの露光時間は、３〜１６時間の範囲である。Electrolyte 2 microliters of each PCR reaction mixture sample on a 6% PAGE sequencing gel. Aerophoresed and visualized by autoradiography. autoradiolog Raffi exposure times range from 3 to 16 hours.
上述の実施例は、本発明の一般的な性質を明らかに示しているので、現在の知識 を応用することによって、他の人が一般的概念から逸脱することなく容易に改賀 することができ、及び／又は種々の用途にそのような実施例を応用することがで きる。したがって、そのような応用は、開示態様と同等の意味及び範囲内に包含 されるものと思われる。本明細書で使用した語句又は用語は、説明のためだけに 用いるものであり、限定するために用いるものではないことを理解すべきである 。The above-described embodiments clearly demonstrate the general nature of the invention and are therefore within the scope of current knowledge. By applying the and/or may apply such embodiments to a variety of applications. Wear. Therefore, such applications are included within the meaning and scope of the disclosed embodiments. It seems likely that it will be done. The words or terms used herein are for purposes of explanation only. It should be understood that it is used as a term and not as a limitation. .
図１ ＡＡＴＣＴＧＣ，ＧＣＧ ＡＣＡＡＧＡＧＴＧＡ ２０図２ ＡＣＡＴＣＴＣＣＣＣＴＡＣＣＧＣＴＡＴＡ、 ２０図３ ＴＣＣＡＧＣＣＴＣＧ ＧＡＧＡＣＡＧＡＡＴ ２０図４ ＡＧＴＣＣＴＴｒＣＴ ＣＣＡＧＡＧＣＡＧＧ Ｔ ２１図５ ＧＣＣＡＧＴＧＡＴＧ ＣＴＡＡＡＧＧＴＴＧ ２０図６ ＡＡＣＡＴＡＣＧＴＧ ＧＣＴＣＴＡＴＧＣＡ ２０ＡＡＴＣＴＧＧＧＣＧ Ａ ＣＡＡＧＡＧＴＧＡ ＡＡＣＴＣＣＧＴＣＡ ＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡ ＡＧＡＡ ＡＧＡＧＡＣ５０図８ 図９ 図１Ｏ ＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧ ＴＧＴＣＴＧＡＡＴ １９図Ｉ＋ ＡＣＡＣＡＧＴＴＧＣＴＣＴＡＡＡＧＧＧＴ ２０図１２ ＣＴＡＧＧＴｒＧＴＡ ＡＧＣＴＣＣＡＴＧＡ ２０図１３ ＴｒＧＡＧＣＡＣＴＴ ＡＣＴＣＴＧＴＧＣＣ２０図１４ ＡＡＣＴＣＡＧＡＡＣＡＧＴＧＣＣＴＧＡＣ２０図１５ ＡｍＣＣＣＴＣＡ ＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧ Ｔ ２１図１６ ＣＴＧＡＴＣＴＴＧＣＴＣＡＣＣＴＴＣＧＡ ２０図１７ ＧＣＧＴＴＴＧＣＴＧ ＡＡＡＴＧＡＡＧＧＡ ２０図１８ ＧＣＡＧＧＴＡＣ’ｒＴ ＡＧＴＴＡＧＣＴＡＣ２０図１９ ＴＴＡＣＡＧＴＧＡＧ ＣＣＡＡＧＧＴＣＧＴ ２０図２０ ｍＧＴｃＴＧＧＡ ＴＡＧＡＣＴＧＧＡＧ ２０図２１ ＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴ ＧＴＧＧＣＴＧＴＡ １９図ｎ ＣＴＡＡＴＧＣＡＧＡ ＧＡｍＡＧＧＧＣ２０図ｎ ＧＴＧＧＴＧＴＡＡＡ ＧＡＣＴＧＣＡＴＡＧ ２０図２４ ＡＴＧＴＧＡＣＴＧＡ ＴＧＴＧＧＧＴＣＡＧ ２０図５ ＣＡＴＣＴＧＣＡＣＴ ＣＡＴＧＣＴＣＣＡＴ ２０図あ ＴＣＣＣＡＧＡＴＣＧ ＣＴＣＴＡＣＡＴＧＡ ２０図２７ ＣＡＣＡＧＣ’ｒＴＣＡ ＧＡＡＧＴＣＡＣＡＧ １９図路 ＧＡＧＣＡＡＴＧＴＴ ＧＣＴＴＡＧＧＡＴＧ ２０図２９ ＴＧＧＡＡＧＴＧＴＣＡＣＴＧＧＣＡＴＧＴ ２０図（資） ＴＧＴＧＴＣＣＡＧＣＣＴＴＡＧＴＧＴＧＣＡ ２１図３１ ＴＣＡＴＣＡＣＴＴＣＣＡＧＡＡＴＧＴＧＣ２０図ｎ ＡＣＴＧＣＣＴＣＡＴ ＣＣＡＧＴＴＴＣＡＧ ２０図（ ＧＡＧＣＡＧＧＣＡＣＴｒＧＴｒＡＧＡＴＧ ２０図あ α：ＴＣｎ’ＧＧＣｒ ＣＴＡＡＣＡＧＣＡＡ ２０図あ ＡＧＣＡＡＧＡＣＣＣＴＧＴＣＴＣＡＡＧＡ ２０図あ ＣＡＡＧＧＣＣＣＡＴ ＣＴｒＣＡＧＴＡＧＡ ２０図Ｍ ＣＣＴＴＣＴＣＡＣＴ ＣＣＴｒＴＡＣＴＡＧ ２０図羽 ＧＡＡＧＡＣＴＧＡＧ ＧＡＧＧＴＣＡＧＡＡ ２０図５７゜ 図郭 ＧＧＡＡＡＧＡＡＡＣＡＧＴＧＡＡＡＧＡ １９図５９ ＡＴＣＣＡ、ＴＣＧＡＣＣＴＣＴＧＧＧＴＴＡ ２０図（イ） ＧＡＣＣＣＣＡＣＡＧ ＣＣＴＡＴｒＣＡ、ＧＡ ２０図６１ ＴＴＧＡＣＴＧＣｒＧ ＡＡ、ＣＧＧＣＴＧＣＡ ２０図６２ ＣＡＧＣＴＧＣＣＣＴ Ａ、ＧＴＣＡ、ＧＣＡＣ１９図６３ ＧＣＴｒＣＣＧＡＧＴ ＧＣＡＧＧＴＣＡＣＡ ２０補正書の翻訳文の提出書く 特許法第１８４条の８）Figure 1 AATCTGC, GCG ACAAGAGGTGA 20 Figure 2 ACATCTCCCCTACCGCTATA, 20 Figure 3 TCCAGCCTCG GAGACAGAAT 20 Figure 4 AGTCCTTrCT CCAGAGCAGG T 21 Figure 5 GCCAGTGATG CTAAAGGTTG 20 Figure 6 AACATACGTG GCTCTATGCA 20AATCTGGGCG A CAAGAGGTGA AACTCCGTCA AAAGAAAGAA AGAA AGAGAC50Figure 8 Figure 9 Figure 1O TTTCTGGGTG TGTCTGAAT 19 Figure I+ ACACAGTTGCTCTAAAGGGT 20Figure 12 CTAGGTrGTA AGCTCCATGA 20 Figure 13 TrGAGCACTTACTCTGTGCC20Figure 14 AACTCAGAACAGTGCCTGAC20Figure 15 AmCCCTCA AGGCTCCAGG T 21 Figure 16 CTGATCTTGCTCACCCTTCGA 20 Figure 17 GCGTTTGCTG AAATGAAGGA 20 Figure 18 GCAGGTAC'rTAGTTAGCTAC20Figure 19 TTACAGTGAG CCAAGGTCGT 20Figure 20 mGTcTGGA TAGACTGGAG 20 Figure 21 CCATCTTCCT GTGGCTGTA 19 Figure n CTAATGCAGA GAmAGGGC20 figure n GTGGTGTAAA GACTGCATAG 20 Figure 24 ATGTGACTGA TGTGGGTCAG 20 Figure 5 CATCTGCACT CATGCTCCAT Figure 20A TCCCAGATCG CTCTACATGA 20Figure 27 CACAGC’rTCA GAAGTCACAG 19 diagram route GAGCAATGTT GCTTAGGATG 20 Figure 29 TGGAAGTGTCACTGGCATGT Figure 20 (fund) TGTGTCCAGCCTTAGTGTGCA 21Figure 31 TCATCACTTCCAGAATGTGC20Figuren ACTGCCTCAT CCAGTTTCAG Figure 20 ( GAGCAGGCACTrGTrAGATG 20 diagram a α: TCn’GGCr CTAACAGCAA 20Fig. AGCAAGACCCTGTCTCAAGA 20 diagram a CAAGGCCCAT CTrCAGTAGA Figure 20 M CCTTCTCACT CCTrTACTAG 20 figure wings GAAGACTGAG GAGGTCAGAA 20 Figure 57゜ map outline GGAAAGAAACAGTGAAAGA 19Figure 59 ATCCA, TCGACCTCTGGGGTTA Figure 20 (a) GACCCCACAG CCTATrCA, GA 20 Figure 61 TTGACTGCrG AA, CGGCTGCA 20 Figure 62 CAGCTGCCCT A, GTCA, GCAC19 Figure 63 GCTrCCGAGT GCAGGTTCACA 20 Submission of translation of written amendment Patent Law Article 184-8)
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