JPH06504613A

JPH06504613A - 分析方法

Info

Publication number: JPH06504613A
Application number: JP3514605A
Authority: JP
Inventors: ケル，ダグラス・ブルース; ウッドワード，アンドリュー・マイケル
Original assignee: ユニバーシティ・カレッジ・オブ・ウェールズ・アベリストウィス
Priority date: 1990-08-30
Filing date: 1991-08-30
Publication date: 1994-05-26
Anticipated expiration: 2014-10-18
Also published as: ATE147165T1; AU649070B2; DE69123973T2; EP0546044A1; JP2964166B2; AU8495791A; EP0546044B1; CA2090699A1; DE69123973D1; WO1992004630A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】分析方法技術分野本発明は、生物の細胞物質の分析方法に関し、特に膜内の酵素からなる物質の分析や、そのような細胞の物質及び酵素の基質の分析に関するが、これらに限定されるわけではない。

背景技術生物の細胞物質が線形の受動可聴及び無線周波数電気特性を有することについては周知である。約１０ＭＨｚ以下の周波数範囲では、これらの特性が、好都合にも調査中の系を入れた電気化学セルの等価並列導電率及び静電容量として測定される。これらの無線周波数までは、大部分の生物の細胞物質が、α分散及びβ分散として知られる２つの主要な分散を示す。これらの主要な分散には、その他の副次的分散が寄与しており、時にはそれらから区別できるが、組織及び細胞の懸濁液のβ分散は、主に本質的に不導電性の細胞膜の面に於ける電荷の蓄積によって生じる。α分散は、必ずしも媒体のイオン強度に依存するものではないが、主として細胞膜及び細胞外包の荷電面に対して接線方向の対イオンの緩和という形で説明されるのが、通例である。

誘電緩和、永久双極子モーメントを有する「剛体」球（ｈａｒｄ”　５ｐｈｅｒｅ）の再配向の最も簡単な場合では、双極子が電場との間に形成する角度のコサインの統計的平均値が、ランジュバン（Ｌａｎｇｅｖｉｎ）関数、ｃＯ８〈θ＞＝ｃｏｔｈ　ｘ　−１／ｘ。

ここで、ｘ　＝　Ｅ　／　ｋ　Ｔ。

に従う電界依存関係を示す。この級数のテーラ−展開は、約１より小さいＸの値について、及びより十分な近似値ｃｏｓ　＜θ〉＝μＥ／３ｋＴまで、線形性から実質的にズレが生じないことを示している。このように誘電変位電流は、励起電界の大きさ及びそれらの比率、それから独立しているアドミッタンスに比例する。これらの特性は、揺動散逸定理に従う線形システムの特徴を有する。

生物誘電体は、導電性の水性媒体に懸濁されまたは溶解されることから、　「損失的Ｊ　（１ｏｓｓｙ）である。　従って電気化学的反応、及び特にジュール熱の発生によって、それらに印加されるＡＣ電圧が制限されるので、生物細胞物質の誘電特性は、一般に０．　１〜５Ｖ−ａｎ−＋程度の巨視的電界Ｅを用いて測定される。有効双極子モーメントに一般に出くわした場合、ランジュバン因数μ Ｅ／に丁は通常非常に小さく、測定したアドミッタンスが励起電界に依存していないことから判断されるように、十分に線形性の範囲内にある。

基本周波数以外の周波数に於ける電流及び電圧をフィルタ除去するように構成されたインビードメータ的機器（ｉｍｐｅｄｉｍｅｔｒｉｃ　ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を月いて生物物質の線形特性を測定することが知られている。この結果得られる物質は、−見越形特性を有するように見えるが、実際には非線形の誘電体である。

本願発明者は驚くべきことに、単一周波ＡＣ電流を印加して生物の細胞物質を励起させることによって、印加した周波数に於ける前記ＡＣ電流のみを観測するのではなく、関連する周波数範囲全体を観測した場合に、従来線形特性のみを呈すると思われていた電圧レベルに於いて、生物物質から非線形誘電スペクトルが発生することを見出した。

関連する前記周波数範囲全体については、信号を例えばフーリエ変換などにより変換することによって調べることができる。

発明の開示本発明の第１の側面によれば、生物の細胞物質、その基質、またはそのような細胞物質の細胞代謝の阻害剤を分析する方法であって、非線形誘電スペクトルを発生するように生物物質の試料にＡＣ電位を生じさせる過程と、得られたスペクトルに対応する検出可能な信号を得る過程とからなる方法が提供される。

本発明の第２の側面によれば、生物の細胞物質、その基質、またはそのような細胞物質の細胞代謝の阻害剤を分析する方法であって、前記生物物質に単一または複数の初期周波数の電位を作用させる過程と、少なくとも１つの応答周波数に於て前記物質の応答を測定する過程とからなり、　前記少なくとも１つの応答周波数が実質的に前記初期周波数と重複しないようにした方法が提供される。

２個またはそれ以上の巨視的電極間にある細胞の懸濁液に適度に低い周波数の電界をかけたとき、膜キャパシタンスの荷電によって、膜に於ける巨視的電界は、小さいが有効に「増幅」される。関連する膜が適当な酵素を含んでいるような場合には、これによって電界及び周波数に依存する形で有用な生物学的作用を働かせることができる。このような効果の基礎をなす一般的なメカニズムは、酵素が双極性の「玉突きの球Ｊでなく、かつ互いに異なるベクトルの双極子モーメントを有するものと有しないものとを含む異なるコンホーメーション（立体配座）の閏で緩和できることである。

生物物質の試料に印加される電位は、該物質を励起させるために印加される比較的高い電界と、該物質の電界依存誘電特性を記録するための比較的低いＡＣプローブ電圧とから構成することができる６しかしながら、単一周波ＡＣ電流を用いて物質を励起させ、試料の非線形性が高調波の発生によって証明されるような範囲を見られるように変換を行うことによって、関連する周波数範囲全体を観測することが好ましい。励起電流の周波数及び振幅を変化させることによって、検査中の試料の誘電指紋として機能し得る２次元の非線形誘電スペクトルを組み立てることができる。

その導電率が生物物質の試料のそれと実質的に一致するように調整される生物物質の上澄みを用いて、非線形誘電参照スペクトルを生成すると好都合である。次に前記試料からのスペクトルを参照スペクトルで割ると、生物細胞自体による効果から電気化学系内の非線形性による効果が解放されることになる。

非線形誘電スペクトルの第３高調波は、その大きさが生物試料内のセル濃度を表示することから、特に利益がある。従って、本発明によれば、生物試料から得られた非線形誘電スペクトルの第３高調波を観測する方法が得られる。また、本発明によれば、第３高調波の大きさが、細胞懸濁液内のセル濃度を表示することから、このような懸濁液内のセル濃度を決定する方法が得られる。また、本発明によれば、外因性の電界エネルギーを変換する生きた細胞の能力を観測する方法が得られる。本願発明者は、生物試料から得られる非線形誘電スペクトルに存在する特定の高調波が、生物試料内の生きた細胞の代謝状態を示すことを見出した。

さらに本発明によれば、上述した方法を実行するための装置であって、ａ）生きた細胞物質の試料を保持するための保持手段と、ｂ）非線形誘電スペクトルが生成されるように前記試料にＡＣｑ位を印加する手段と、Ｃ）前記スペクトルに対応する検出可能な信号を得るための手段とからなる装置が提供される。

フーリエ変換を用いたパワースペクトルの生成は、相情報（ｐｈａｓｅ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を失なうことになり、従って第３高調波（又は、実際には他のあらゆる高調波）の大きさのみを月いて、当該系に於て細胞によって基本周波数から所定の高調波に変換されるエネルギーを表示する。

従って、負の高調波の存在は、単に所定の高調波に於て生物学的に生成される信号と外部信号発生源からの信号との間で弱め合う干渉によるものである。細胞は、励起信号に存在する第３高調波からエネルギーを「取り入れ」たすしないが、これは、励起信号の基本電圧または周波数が、該基本周波数を２Ｖ−ａｍ−１及び２０Ｈｚに設定したときに信号発生源から生成されるものに変えたときに、高調波が全く観測されないからである。従って、高調波の大きさの変化は、その絶対的な大きさの変化及び／または励起信号に存在する第３高調波の位相に関する位相の変化によって生じる。データは対数目盛（ｄ　Ｂ）で表されるが、これは、高調波の観測可能な大きさの変化を記録する精度を強調するのに役立つからである。

第３高調波の正確な大きさには、いくらかの日々の変化があるＣデシベル対数目盛でみた場合）のに対して、得られたデータは、数ｄＢの範囲内で特に所定のバッチのセルについて非常に再現可能である。同様に、両方の電気化学セル内に同一の「試料」　（または「参照」上澄み）を用いた場合、高調波は全く観測されず、　（ｉ）それらの電極の界面電気化学が良好に整合した状態にあること、及び（ｉｉ）生きた細胞が実は観測された第３高調波の発生源であることを示している。

以下の実験に関連する電界は、　（ランジュバン因数に換算して）極めて小さいので、系は一般に十分に線形性の範囲内にあると考えられる。実際、ヒユーレット−パラカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）　ｆｌＪ　４１９２　Ａインピーダンス・アナライザを用いた線形インピーダンスの測定及び基本周波数の観測結果は、線形インピーダンスが（実験誤差の範囲内で）ＩＩ査範囲内の励起電圧の大きさから独立していることを示していた。従って、インピーダンスは線形のように表れるが、実際には非線形であるような系の存在は極めて可能性がある６　２層膜の電位依存静電容量（厚さ）は、その両側に於ける電位差に対する２次従属関係を示す場合がある。しかしながら、ここで用いられる電位では、　２次の項を無視することができる。

膜のタンパク質は、以下の様々な理由から電界と相互作用する特に強力な対象である。即ち、　（１）膜のタンパク質は、腹の一方の側から他方の側へ回転して、この型式の簡単なデバイ状回転（Ｄｅｂｙｅ−１ｉｋｅ　ｒｏｔａｔｉｏｎ）によって電気エネルギーを消散させることができないこと、（ｉｉ）上述したように、膜は励起信号を「増幅Ｊできること、及び（ｉｉｉ）膜のタンパク質は実質的に双極子モーメントを有することである。さらに、当然ながら、全てのタンパク質について共通であるが、膜のタンパク質は。

異なる双極子モーメントを有する異なる立体配座状態間に於ける遷移を可能にする。　ここで観測されるような顕著な非線形誘電状態の発生に関するメカニカルな根拠を追求しようとすれば、この有機体の膜の特性を考慮しなければならない。

炭素基質を全く添加しない、通常使用される比較的濃縮された懸濁液に固有の仮想上本賞的に嫌気性の条件下でゆっくりと代謝する内因性の蓄えを有するサツカロミケスセレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の洗浄した細胞懸濁液は、基質レベルのリン酸化によってＡＴＰ（アデノシン三リン酸）を生成するものと考えられる。

「スリップＪ　（ｓｌｉｐ）または「オーバーフロー代謝」（ｏｖｅｒｆｌｏｗ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ）の主要な潜在的なメカニズムのように、このＡＴＰは、この有機体の中に存在するＨ−ＡＴＰａｓｅ　（アデノシン三リン酸分解酵素）によって、ＡＴＰの加水分解の自由エネルギーかに一勾配で蓄えられている（及び実際には他のイオンの）自由エネルギーに対して平衡するような「静水頭」（５ｔａｔｉｃ　ｈｅａｄ）の状態が得られるまで、外部の媒体からに４のような陽イオンを取り込むために利用されると考えられる。このとき、酵素の立体配座の巨視的な状態の分布は、その基本自由エネルギーによってほぼ決定され、かつ酵素のネット（正味）回転速度（エントロピーの発生速度）が最小になる。

この意味に於て、酵素のエネルギーの巨視的な状態は、対称的なポテンシャルウェルと考えることができる。これによって次に、偶数ではなく奇数高調波の発生が説明される。この有機体の細胞膜内のＨφ−ＡＴＰａｓｅが、使用される生理学的条件下で潜在的に活性な主要な酵素として、観測された非線形誘電応答の主要な原因であると決定した。

本願発明者は、細胞の懸濁液に於て初めて、酵素の立体配座の可変性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）が、ランジュバン因数が極めて小さくかつ従来は全く線形の挙動が期待されていた励起電界の非常に小さな値に於ける非線形誘電スペクトルの発生に現れることを示した。

図面の簡単な説明本発明について、以下に添付図面を参照しつつ実施例を月いて説明する。

第１図は、本発明による方法を実行するための非線形分光計を概略的に示す図である。

第２図は、第１図の分光計に使用される電気化学セルを概略的に示す図である。

第３図は、人為結果的な電気化学現象によって汚染されていない非線形誘電スペクトルを得るために使用される特定の方法を示すブロック図である。

第４図は、サッカロミケスセレビシェの非線形誘電スペクトルを示す線図である。

第５図は、参照セルから得られた非線形誘電スペクトルを示す図である。

第６図は、第３図のスペクトルから第４図のスペクトルを引いて得られたスペクトルを示す図である。

第７図は、ボイルした細胞の懸濁液から得られた非線形誘電スペクトルを示す図である。

第８図（ａ）〜（Ｃ）は、それぞれサッカロミケスセレビシエの非線形誘電スペクトルへの平均化の効果を示す図である。

第９図は、サッカロミケスセレビシエの非線形誘電スペクトルの第３高調波の大きさへのセル濃度の効果を示す図である。

第１０図は、サッカロミケスセレビシエの非線形誘電スペクトルの第３高調波の大きさへの励起周波数の効果を示す図である。

第１１図は、サッカロミケスセレビシエの非線形誘電スペクトルの第３高調波の大きさへの励起電界の強さの効果を示す図である。

第１２図は、サッカロミケスセレビシエの非線形誘電スペクトルの第３高調波の大きさへのメタバナジン酸ナトリウムの効果を示す図である。

第１３図は、サッカロミケスセレビシエの非線形誘電スペクトルへのグルコースの影響を示す図である。

第１４図は、サッカロミケスセレビシエの細胞の非線形誘電スペクトルの別の実施例を示す図である。

第１５図は、ミクロコックスルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ１ｕｔｅｕｓ）の嫌気性懸濁液の非線形誘電スペクトルを示す図である。

第１６図は、ミクロコックスルテウスの好気性懸濁液の非線形誘電スペクトルを示す図である。

発明を実施するための最良の形態第１図に於て、本発明による方法を実行する際に使用するための非線形誘電分光計が、参照符号１０を付して示されている。分光計１０は、２個の電気化学セル１】、１２を有する。セル１１は、その非線形誘電特性を調査している生物系の試料を入れた試験セルである。この実施例では、前記生物系が、サッカロミケスセレビシエの懸濁液からなる系からなる。前記セルの濃度は、２０ｍＭのＫ　Ｈ、Ｐ　Ｏ、，３０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣ１，、ｐＨ６，５の培地中、約５０■乾燥重量・ｍｌ’であった。

試験は、前記懸濁液を調製する４時間の間に行われた。

セル１２は、試験懸濁液の上澄みからなる参照セルであり、その導電率は、前記試料中に存在する細胞の容量分画が関連する周波数に於ける前記試料の一致するように補償するべく蒸留水で調製されていた。セル１１、１２は、正弦波発生器１３に接続され、データ変換アナログ−デジタル変換器を介して８０３８６ベースのマイクロコンピュータ１４に接続されている。

前記システムは、　Ｉ　ＢＭ−ＰＣ−ＡＴコンパチブルのマイクロコンピュータ（英国ロンドンに所在するビグレン・リミテッド（Ｖｉｇｌｅｎ　Ｌｔｄ、）のＶｉｇｌｅｎ　ｍ、８ｏ３８６メインプロセツサ）を中心に構成された。数学的処理の性能を最大にするために、８０３８７コンパチブルのコプロセッサ（サイリックス（Ｃｙｒｉｘ）　８３　Ｃ８７）を用いた。前記コンピュータの拡張ボートの１つには、データ変換モデル２８２３・ＡＤＣ／ＤＡＣボードが取り付けられた。高調波信号の大きさは小さいであろうとの考えから、４個の作動入力を有しかつ１００キロサンプル（ｋｉｌｏｓａｍｐｌｅ）　７秒の一定の上側周波数を有する１６ビツトのボードを遺択した。

第２図には、電気化学セル２１が示されている。電極の分極現象の影響を最小にするために、金ビン型式の電極２２をベースとする４電極システムを用いた。信号は、サンドール（Ｔｈａｎｄｏｒ）　Ｔ　Ｇ　５０１関数発生器（アールニス・コンポーネンツ・リミテッド（Ｒ３Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ　Ｌｔｄ、）によって外部の電流電極に印加された。これらの信号の周波数及び振幅は、ソーラートロン（Ｓｏｌａｒｔｒｏｎ）　ｌ　２００シグナルプロセツサ（英国ハンプシャー州ファーンボローのシュラムバーガー・インストラメンツ（Ｓｃｈｌｕｍｂｅｒｇｅｒ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）　）及びバーメグ（Ｈａｍｅｇ）　ＨＭ　２０８デジタル・ストレッジ・オシロスコープを用いて確認した。

データの入手及びその後に続く処理及び表示は、制御ファイルに基づいて動作するＩＬＳソフトウェア（米国カリフォルニア州ジオリータのシグナル・テクノロジー・インコーボレイテ・ソド（Ｓｉｇｎａ１丁ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ、）　）を用いて実行された。

スペクトルは、以下の方法を用いて収集された。即ち、試料の細胞懸濁液をピペットで電極セル１１　（第１図）の中に入れ、試験波形を（外部）電流電極に印加し、かつサンプリング周波数（一般に基本周波数の２５倍であった）に於てオペレータが指定した時間に亘って（内部）電圧電極からデータを記録した。時間は、それぞれに５１２のサンプルからなるブロックの数で特定した。特定した時間の最後に、データを以下のようにフーリエ変換した。１ｗ々のサンプルからブロックの平均値を引くことによって予備的な前置白色化を実行した。次に、各ブロックはブラックマンウィンドウ（Ｂｌａｃｋｍａｎ　ｗｉｎｄｏｗ）を月いて窓処理がなされ、かつ前記ＩＬＳソフトウェア内のルーチンを用いて高速フーリエ変換されて、パワースペクトルの集団を形成した。次にこれらを、信号対ノイズ比を大きくするために平均化した。このスペクトルデータは、前記コンピュータのハードディスクに記録した。

参照スペクトルは、セル１２の上澄み（第１図）を用いて入手したが、その導電率は、試料内に存在する細胞の容量分画が関連する周波数に於ける試料のそれと一致するように補償するべく（蒸留水で）　＊＃されていた。

同じ組の電極を用いて、または（本明細書中に記載される実験でなされたように）別個のマツチドセルを用いて参照値を記録するかどうかによって、２つの異なる型の制御ファイルが用いられた。いずれの場合にも、ロギング即ち記録、窓処理（ｗｉｎｄｏｗｉｎｇ）、及びフーリエ変換のルーチンは同一であって、　「参照」セルのパワースペクトルが得られ、同様に前記コンピュータのハードディスクに記録された。最後に、このようにして得られた「試料」のパワースペクトルを「参照」パワースペクトルで割り、同様にハードディスクに記録した。誘電スペクトルを得るのに必要な合計時間（２０Ｈｚ、１０ブロツクについて毎秒５００サンプル）は約２．５分であった。非線形誘電スペクトルの生成に関連する過程が、第３図のブロック図に示されている。この方法の利点は、電気化学系内の非線形性による効果を生物細胞自体による効果から解放できたことである。

分光計１０は、非線形な生物誘電スペクトルの記録に用いられて、初めてそれらが細胞懸濁液内に於て容易に観測されることを示し、かつサッカロミケスセレビシエの細胞膜内のＨ・−ＡＴＰａｓｅが、このように観測される非線形誘電応答の主な原因であることを示すことができる。

第４図は、励起電圧（外部電極間で測定）を１．５Ｖ（２、ＯＶ−ｃｍ−＋）及び周波数を２０Ｈｚとして、第１図の分光計を用いてサッカロミケスセレビシエの残りのセルの懸濁波から得られた典型的な非線形誘電スペクトルを示しており、試料からのスペクトル（ｊ！！ｉ４図）、参照セルからのスペクトル（第５図）、及びそれらの差（第６図）が表示されている。発信器の不備及び電気化学系に固有の非線形性のために、適用された波形は純粋な単一周波ではないが、基本周波数のエネルギーと比較して非常に小さいにも拘らず、現在の（１６ビツト）感度及び対数表示を有する測定システムを月いてなお観測され得る高調波成分を含んでいる。　「試料ノセルと「参照ｊセルとの間の高調波のパターンは明らかに異なり、参照スペクトルを試料スペクトルから引くと、非常に強い明らかに負の第３高調波６１（！６図）が得られる。　（正の）第７高調波６２が同様に再現可能に観測される（かつ場合によっては第１１高調波）が、一定の条件下では偶数高調波は表れない。

参照スペクトル法を用いたことから、第３高調波の発生が酵母菌細胞の存在によるものであることは明らかであった。第７図は、死んだ（煮沸した）細胞を用いた場合に第３高調波が全く発生しないことを示している。これは、潜在的に活性な酵素の存在が第３高調波の発生の前提条件であることを示したものである。

高調波のみが発生したか、またはパワースペクトルが非高調波成分を含んでいたかどうかを証明するために、平均化されているブロックの数を変化させた。代表的なランの組から得られたデータが第８図（ａ）乃至（Ｃ）に示されており、第３高調波８１の大きさが、ブロックの数に比例して（予想通り）その変化が減少する高度に変化するノイズの度合いに拘らず、実質的に一定のままであり、それによって真の非高調波成分を識別することができないことが認められる。

セルの濃度の関数として第３高調波の大きさの依存関係が第９図に示されており、ｄＢ単位に於ける第３高調波の大きさが、プラトー領域への遷移が認められる約２５■乾燥重量・ｍト夏のセル濃度まで、セル濃度に対して実質的に線形であることが認められる。

発生した第３高調波は、一般に励起周波数が約１５〜２０Ｈｚの場合に最大であった。第１０図は、励起周波数の関数としての第３高調波の大きさを示している。周波数が約１５〜２０Ｈｚ以上に増加しまたは以下に減少すると、第３高調波の大きさががなり急激に低下することが認められる。

上述した周波数の窓と同様に、その範囲に於て非線形誘電作用が認められるようなより鋭い電圧または振幅の窓が存在した。第１１図は、第３高調波の大きさが、約０．６〜２．１　Ｖ　（０，８〜２，８Ｖ−ｃｍ−’）　（７）間の電圧の窓に於てのみ意味があることを示している。励起周波数を変化させたとき、観測された振幅の窓は、重大な変化を示さなかった（データは省略）。前記測定を追加の静電界（ＤＣ）の存在下で実行した場合には、第３高調波の大きさが大幅に減少し、前記静電界が０．４Ｖ−ａｎ−＋を超えた（及び励起ＡＣ電界が２　、ＯＶ　−ＣＩｌ＋−１）ときに完全に消滅した。

この型式の酵素（所ｎＥ、Ｅ２ｆ＃素）の触媒サイクルが、酵素の結合したリン酸中間体に関係しており、かつその活動が、その三方晶双角錐構造が加水分解の際にリン酸塩の遷移状態を模倣して前記酵素をそのＥ２コンホーメーションに捕捉すると考えられる１価のバナジウム化合物の濃度を低くすることによって、抑制し得ることがよく知られている。

第１２図は、かなり低い濃度のバナジン酸塩が第３高調波の大きさに与える影響を示しており、この高調波の発生が、　１ｍＭのメタバナジン酸ナトリウムによって実質的に完全になくなり、かつＫ　、Ｉｌｌ・が（縦座標をｄＢ目盛でプロットしたとき）約０．１５Ｍｍであることが認められる。これは同様に、これらのセルの細胞膜内のＨ”−ＡＴＰａｓｅが非線形誘電応答の主要な原因であり、更に観測される非線形性の原因として誘電泳動のような現象を残す役目を持つことを強く示唆している。高調波は、同様に濃度０．２ｐｍｏｌ／ｍｇ乾燥重量のセルに於てＨ゛−ＡＴＰａｓｅ阻害ジベンズヒドリル・カルボジイミド（ｄｉｂｅｎｚｈｙｄｒｙｌ　ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）によって完全になくなっていた。

上述したように、サッカロミケスセレビシェの残りのセル懸濁液については第３高調波が再現的に観測された。

これは、この有機体内の８４−ＡＴＰａｓｅの存在に基づくものと認めることができ、かつ酵素が静水頭にあるような状況を反映していると考えるべきである。

酵素が静水頭から離されて活動できる（またはそのようにと思ゎれる）際に、この挙動をどのように変化させるかを決定するための実験を行った。残りのセルを取り、それらの（通常の）非線形誘電スペクトルを記録し、がっ代謝可能な炭素源（Ｄグルコース）を添加した。約２０分の短い誘導時間の後、第１３図に示されるスペクトルを記録した。注目すべきことに、第３高調波が消滅し、かつ相当大きな第２及び第４高調波によって置き換えられていた。これらの偶数高調波も同様にバナジン酸に対する感度を有していた。静水頭が再び得られたとき、その開始時の形状に戻ったスペクトルには大きな第３高調波が認められたが、偶数高調波はなかった。この挙動は、正味の仕事（エネルギー変換）を実行する際に酵素が外因性の電界エネルギーの吸収に必要な整流作用を有する非対称なポテンシャルウェルであるという考え方に一致している。０．３ＭＨｚに於ける誘電率の平行測定、もとのままの細胞の生物量のモニタでは、この実験に於て観測可能な変化は全く示されなかった。従って、非線形誘電分光学によって、生きた細胞の代謝状態を区別する高感度な手段が得られる。

また、非線形誘電特性は、複数の基本周波数を混合した周波数として明示することができる。第１４図は、サッカロミケスセレビシェの懸濁液が、　ＩＨｚ及び１５Ｈｚの周波数の電界（それぞれ０．９Ｖ−ａｍ”）について励起されたときに記録された非線形誘電スペクトルを示している。その合計及び差が基本周波数の正数倍である信号を生成する周波数混合であることは明らかである。

（球状）酵母菌細胞膜に於て発生する電位Ｖｍは、Ｅを顕微鏡電界、　ｒを細胞半径、及びθを電界と細胞膜の法線との角度とした場合に、Ｖｍ＝１．５ｒＥ　ｃｏｓθ で与えられる。

本実施例に於て細胞半径を３ミクロンとしかつ電界を２Ｖ−ｃｍ−’とした場合に、０．９ｍＶの最大膜電位（に於ける電界依存関係従属の変化）が得られた。

腹の厚さが５ｎｍの場合、最大振動膜電界Ｅ、が１８００Ｖ−ｃｍ−＋である。

一般的な膜タンパク質は、　１００〜１０００デバイユニツト（Ｄｅｂｙｅ　ｕｎｉｔ）の永久双極子モーメントｍを有する。簡単のために、標的酵素の電界依存コンホーメーションの変化による双極子モーメントの関連する変化が５００Ｄ（Ｌかしながら、５００Ｄは膜の両側に於ける１０回の完全充電の変位に等しいことからそれより大幅に少ないと考えられる）であると仮定する。このとき、ランジュバン因数μＥ／ｋＴは約０．０７５に等しく、即ち実質的に１より小さい、従って、通常は非常に小さいと考えられる電界を適用しているにも拘らず、サツカロミケスセレビシエの細胞による大きな第３次高調波の発生が観測されたのである。

上述したように本発明は、グルコースを含むまたは含まないサッカロミケスセレビシエの懸濁液を用いて実行されたが、本発明の方法は汎用的な用途を有するものであって、上述した基質を使用する場合に限定されるものではない。第１５図は、ミクロコックスルテウスの嫌気性懸濁液の非線形誘電動作を示すスペクトルである。この有機体は発酵し得ないことから、このような細胞は休止しており、奇数（第３）高調波を示す。第１６図は。

有機体が呼吸することができるミクロコックスルテウスの好気性懸濁液を示しており、それによって偶数（第２）高調波が発生する。

本発明による方法によって決定することができる基質には、酸素、グルコース、乳酸または乳酸塩またはこれらの類似物が含まれる。同様に、本発明による方法によって細胞代謝の阻害剤が決定されるが、このような阻害剤の例には、第１２図に関連して上述したバナジン酸塩が含まれる。

肩濱段　（Ｈｚ）明嫂校　（Ｈｚ）洲＝ｔｉ−ａ（Ｈｚ））？Ｉ褒数　（Ｈｚ）局儂数−（Ｈｚ）尚仮駁　（Ｈｚ）［娼Ｅ　］　（ｍｇ　ｄｗ　／ｍｌ）爲π 、、２０ ”　１０ヂ　８午　６　− 励起虜玖狡　（Ｈｚ）Ｆ／θ〃電Ｍ、煙／ｉ　（Ｖ／［バナレ゛ン酔％］　（ｍＭ）周ｉ玖　（Ｈｚ）ノｕ　＝Ｌ（６ｔ　（Ｈｚ）ｂ　７５ミクロコ１ソフス　ルナウス補正書の翻訳文の提出書（特許法第１８４条の８）鴎平成５年　２月２７日

Claims

【特許請求の範囲】

１．生物の細胞物質、その基質または前記細胞物質の細胞代謝の阻害剤を分析する方法であって、非線形誘電スペクトルを生成するように生物物質の試料にＡＣ電位を作用させる過程と、前記スペクトルに対応する検出可能な信号を得る過程とからなることを特徴とする方法。
２．生物の細胞物質、またはその基質、または前記細胞物質の細胞代謝の阻害剤を分析する方法であって、前記生物物質に単一または複数の初期周波数の電位を作用させる過程と、少なくとも１つの応答周波数に於て前記物質の応答を測定する過程とからなり、少なくとも１つの応答周波数が、前記初期周波数と実質的に重複しないことを特徴とする方法。
３．前記電位が、系を励起させるために印加される比較的高い電界と、前記生物物質の電界依存誘電特性を記録するための比較的低い探査ＡＣ電圧とからなることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
４．前記電位が単一周波であり、かつ関連する全周波数範囲が、前記物質の非線形性が高調波の発生によって明示される程度を確認するべく移行することによって観測されることを特徴とする請求項１乃至３のいずれかに記載の方法。
５．前記物質が組織または細胞の懸濁液からなることを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載の方法。
６．前記分散または懸濁の上澄みにさらにＡＣ電位が印加され、前記上澄みの導電率が、前記生物物質のそれと実質的に一致するように調製されることを特徴とする請求項５に記載の方法。
７．さらに前記非線形誘電スペクトルの第３高調波を観測する過程からなることを特徴とする請求項１乃至６のいずれかに記載の方法。
８．前記非線形誘電スペクトルの偶数高調波を観測する過程からなることを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載の方法。
９．生物の細胞物質、その基質、または前記細胞物質の細胞代謝の阻害剤を分析するための装置であって、ａ）前記生物物質の試料を保持するための保持手段と、ｂ）非線形誘電スペクトルを生成するように前記試料にＡＣ電位を作用させるための手段と、ｃ）前記スペクトルに対応する検出可能な信号を得るための手段とからなることを特徴とする装置。