JPH06503951A - 水性動物への化合物の超音波を媒介した投与 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 水生動物への化合物の 超音波を媒介した投与 発明の背景 本発明は一般に、水生動物に化合物の薬剤を送達する分野に属し、特に水生動物 が化合物を取り込むことを実現または増強するために超音波を用いるものである 。

近年、養魚業は最も急速に成長している農産業の１つとなってきた。商業上の養 魚業における主要な問題の１つは、薬剤、ペプチド、タンパク質、ワクチンおよ び他の化学化合物を魚に投与することである。現在、これらの化合物を魚に投与 する手法は、注射、インブラントの使用、食物への混入（こよって、または物質 の数は限られるが、水からの拡散（短時間の浸透圧性ショックが伴う場合と伴わ ない場合がある）を介して行われている。一般に、これらの方法はすべて、重労 働であり、しばしば非能率的であり、時には失敗に終わるものである。多くの場 合、商業的規模において個々の魚または甲殻類に薬剤を注射することは非実用的 である。食物と共に投与された、または水中に直接入れられたこれらの化合物の 取り込みは、非能率的で予測不能であり、しばしば高レベルの薬剤が必要である 。

超音波は、皮膚を通して薬剤を投与する手段として提案されてきた。薬剤を局所 的に皮膚に投与し、結合ゲルを塗布し、そのゲルと接触させて置いたプローブを 介して、薬剤（こ超音波を当てる。超音波は、制御された速度で皮膚を通って薬 剤の浸透を高める。この技術の利点は、超音波が強制的に、別の方法では経皮的 に送達され得ないい（つかの薬剤を皮膚を通らせ、そしてその移動が制御された 速度で起こる点にある。

このような方法は、Ｋｏｓｔらへの米国特許第４．７６７、４０２号に記載され ている。水生動物に経皮的に薬剤を送達するために超音波法を適用することは非 実用的であり、極めて重労働であり、そして特に魚の場合には、哺乳動物の皮膚 と魚のうろこ状の皮膚とが非常に異なるために結果が予測不能である。超音波は また、高度に制御された実験室条件下で、強制的に哺乳類の胚にＤＮＡを挿入す る際にも用いられてきた。

従って、本発明の目的は、種々の水生動物に化合物の投与を実現または増強する 方法を提供することである。

本発明のさらなる目的は、大きな、商業的に有用な規模で化合物を投与する方法 を提供することである。

発明の要旨 タンパク質（本明細書で用いているように、タンパク質はペプチド、ポリペプチ ドおよび高分子タンパク質を含む）、非タンパク質薬剤、および核酸を含む化合 物を、水性媒体中で、水生動物、特に魚に投与する方法であり、投与される化合 物を含む水性媒体に対して超音波を当てることにより、動物が水から化合物を取 り込むことを増強または実現する。

１つの例では、超音波を１．７１ｆ／ａｍ２の強度で１０から１５分間当てた水 を介して、ゴナドトロピン放出ホルモン類似体（ＧｎＲＨａ）を魚に投与した。

超音波が存在しない法帖でＧｎＲＨａにさらした魚のレベルが０．５０±０．２ ３ｎｇ／＋１であったのと比較すると、超音波にさらした魚の血液レベルはＧｎ ＲＨａが３．２９±１．０ｎｇ／ｍｌであった。

図面の簡単な説明 図１は、魚の血漿中のＧｎＲＨａ　（ｎｇ／ｍｌ）のレベルを時間（分）毎に示 したグラフであり、超音波が存在しない状態でＧｎＲＨａにさらした魚（［陰影 （ｄａｒｋ）］）と超音波が存在する状態でさらした魚（［／／／］　）とを比 較したものである。

発明の詳細な説明 投与される化合物を含む水性媒体を、短期間、一般には１時間未満、低い強度で 、一般には水生動物の表面に３Ｗ／ａｍ２未満で超音波にさらすことにより、水 性媒体中での水生動物への化合物の効率的な投与が実現または増強される。この 手法ヲ用イて、水から魚の血液系へのゴナドトロピン放出ホルモン類似体（Ｇｎ ＲＨａ）の非常に有意な取り込み（Ｐｒｏ、００１）が達成された。この方法は 、化学物質を水生動物に投与するための簡単で非常に効率的な方法として、商業 的養殖漁業において多大な利益をもたらすと期待されている。

この方法を用いて処理され得る動物の例としては、魚、甲殻類（例えば、小エビ およびロブスタ−）、および軟体類が挙げられる。最適条件は動物のタイプ、年 齢、および状態によって異なるが、胚、ふ化幼魚、および成体の水性動物のすべ てがこの方法で処理され得る。胚については、条件はまた卵のタイプによっても 異なる。魚の卵は、通常体外受精されるため、哺乳類または鳥類の卵とは全く異 なる特性を有する。

超音波を用いて水生動物に送達され得る化合物には、タンパク質（ペプチド、ポ リペプチドおよび高分子タンパク質）、核酸配列をコードするタンパク質、大抵 の抗生物質、抗真菌剤、ステロイド、ビタミン、および栄養素のような非タンパ ク質化学化合物、および無機質が含まれる。特定の例には、ホルモン（例えば、 ゴナドトロピン、ゴナドトロピン放出ホルモン、成長ホルモン、および甲状腺ホ ルモン）およびワクチンがある。これらの化合物は、生殖、成長速度、病気耐性 、および一般的性能を改善するために用いられ得る。そのメカニズムはまた、小 さいマイクロカプセル化されたインブラントを投与するために、または真珠の製 造のために、軟体類の「成長を促す（ｓｅｅｄ）Ｊためにも用いられ得る。

超音波は一般に、動物またはその卵の周囲にある水性媒体に対して当てられる。

化合物は組織、血液、または卵の場合には、細胞質または核に吸収され得る。超 音波は減衰することなく長距離にわたって水中を伝播し得、Ｉ　ＭＨｚの超音波 では、他の媒体は存在しないと仮定するなら、約１１．５メートルの水深ではエ ネルギーの５０％しか損失しない。超音波が伝播し得る距離は超音波の周波数に 依存する。約３８メートルの距離で、Ｉ　ＭＨｚでは超音波の強度の約９０％で 存在する。

超音波は２０ｋＨｚより大きい周波数を有する音であると定義される。医療診断 の目的で用いられる超音波は、通常０．７５から約１０ＭＨｚの範囲の周波数を 採用している。本明細書では、Ｏと３Ｗ／ｃｍ２との間の強度かある２０ｋＨｚ と１０ＭＨｚとの間の周波数が、一般に分子の移動を増強するために用いられる 。超音波に対する応答時間は非常に速いため、数分間さらすだけで通常は十分で ある。過剰にさらすこと、通常は１時間より長くさらすことがないように注意し なければならない。

パルス超音波および連続超音波の両方を発する装置が入手可能である。超音波装 置の特定の態様は重要ではない。どこでおよびどのように超音波を当てるのかに よって、プローブ、浴、および箱はすべて有用である。超音波装置は、５ｏｎｉ ｃｓ　ａｎｄ　Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、Ｉｎｃ、、　Ｄａｎｂｕｒｙ、　ＣＴ、お よびＥｎｒａｆ　Ｎｏｎ１ｕｓ、　ＡＩ−Ｄｅｌｆｔ、　Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒ ｌａｎｄｓにより製造されている。

超音波は空気中では良好に伝播せず、および水生動物の状態は水中の方が良好で あるため、超音波は好ましくは動物が置かれている水に対して当てられる。加え て、または他の方法として、好ましくはないが、過剰にさらされないように注意 しながら動物または卵に対して直接超音波を当ててもよい。

本発明をさらに以下の実施例を参照して説明する。なお、以下の実施例は本発明 を制限するものでない。

実施例１：ゴナドトロピン放出ホルモン類似体の金魚への投与。

コニ 全長１２から１５ｃｍ、体重２３．０±２．９ｇの金魚（Ｃａｒａｓｓｉｕｓ　 ａｕｒａｔｕｓ）を０ｚａｒｋ　Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、、５ｔｏｕｔｌ ａｎｄ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉから購入した。個々の魚に札（ｔａｇ＞で印を付け 、１８０リツトルの養魚槽に入れた。水温を２０°Ｃに保った。

魚を、それぞれ１０匹の魚からなる２つの実験グループに分けた。第１グループ （対照）の魚を、ゴナドトロピン放出ホルモン−［Ｄ−Ａｌａ６．Ｐｒｏ９−Ｎ ＥＴｌ−ＬＨＲＨ（ＧｎＲＨａ、　Ｂａｃｈｅｍ、　Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ　ＭＪ 、　１１６７）のナノペプチド類似体の溶液中に浸し、超音波にはさらさなかっ た。第２グループ（超音波にさらした）の魚を同様の濃度の溶液中に浸し、超音 波にさらした。それぞれの魚は、５００ｎｇ／ｍｌの濃度で１２００ｍ１Ｌ０１ ）ＧｎＲＨａ溶液を含有する２０００ｍ１のガラスビーカーに別々に入れた。ビ ーカーの直径は１３ｃｍであり、水深は約１０ｃｍであった。魚をビーカー中に １時間放置した。超音波グループの魚を最初の１０から１５分間超音波にさらし た。治療用超音波発生器（Ｓｏｎｏｐｕｌｓ　４３４．　Ｅｎｒａｆ　Ｎ。

ｎ１ｕｓ、　ＡＩ−Ｄｅｌｆｔ、　Ｔｈｅ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて 超音波を与えた。

有効発散面積が５０ｍ２であるＩ　ＭＨｚのプローブを用い、ビーカー中の溶液 の表面のちょうど下にプローブの表面を維持した。

超音波を当てている間、プローブをビーカー表面付近でゆっくりと動かした。当 てた超音波の強度は１．１１７ｃｍ２であった。

ホルモン溶液中に入れて１時間後、魚をすべて、ホルモンを含まない水の入った １８０リツトルの養魚槽に戻した。

各グループから５匹の魚を、ホルモン溶液に入れる前、ならびに３０および１２ ０分に採血した。各グループの残りの５匹の魚を、ホルモン溶液に入れてから１ ５．６０、および１８０分に採血した。血液の試料採取のため、２フエノキシエ タノール（Ｍａｒｃｋ）の３００ｐｐｎ＋溶液中で魚に麻酔をかけた。１ｍｌの 注射器および２３ｇの針を用いて尾の血管から２００−２５０μｌの血液を採取 した。

麻酔が切れた魚を早急に（２から３分以内に）水中に戻した。

血液試料を水の上に２から３時間放置し、次いで１０分間１５．００Ｏｒｐｍで 遠心分離した。血清を取り除き、ＧｎＲ［（ａのラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ ）のために摂氏−３０°で保存した。

Ｄ−Ａ　ａ６Ｐ　ｏ９−Ｎ　Ｔ　−ＨＲの一ジオ　ム／ア・・セイ。

［Ｄ−Ａｌａ’、　Ｐｒｏ９−ＮＥＴ］−ＬＨＲＨの特異的、相同的ＲＩＡを、 血清中のそのレベルを決定するために用いた。５０μｌの希釈血清試料または標 準を、２４時間４℃で、最終容積５００μｌ中で、５０μｌの［Ｄ−Ａｌａ６． 　Ｐｒｏ’−ＮＥＴ］−ＬＨＲＨに対するウサギ抗血清とともにインキュベート した。インキュベーシコンヲ、０．２％のＢＳＡヲ含有するＯ、　ＯＩＭ　！、 Ｉン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７，６中で行った。２４時間後、５０μｍの放射性 ｅ＋ｔｔａしたｌ　１２５−［Ｄ−Ａｌａ６．　Ｐｒｏ９−ＮＥＴ］−ＬＨＲＨ を、すべての試験管に添加し、同条件下でさらに２４時間続けてインキュページ 璽ンした。このインキユベーシヨンの最後に、［Ｄ−Ａｌａ’、Ｐｒｏ９−ＮＥ ＴＩ−Ｌｔ（ＲＨの結合フラクシヨンを、ウサギγグロブリンに対して生じた第 ２抗体を用いて沈澱させた。沈澱物をガンマ放射能計測器で計測した。標準曲線 をｌｏｇ−１ｏｇｉｔ直線化した後で、ＧｎＲＨａの血清レベルを計算した。Ｒ ＩＡの感度は０゜０２ｎｇ／ｍｌであり、その精度（アッセイ中の変動）は３． ２％であった。

！Ｌｌ： 研究前および研究の経過中の魚の血漿中におけるＧｎＲＨａのレベルを図１に示 す。期待したように、ホルモン溶液にさらす前には、魚の血液中にＧｎＲＨａは 測定されなかった。水から対照である魚がＧｎＲＨａを若干取り込み、ホルモン 溶液に浸して１時間後には、対照である魚の血漿中でのＧｎＲＨａの最大測定レ ベルが、０．５０±０．２３ｎｇ／ｍｌになった。魚を１０から１５分間超音波 にさらすと、水から魚へのＧｎＲＨａの取り込みが飛躍的に増加した。

超音波にさらして１５分後、血漿のＧｎＲＨａのレベルは３．２９±１．ＯＱｎ ｇ／ｍｌにまで増加し、それから４５分たってもなお増加した（２．８３±０． ４９１ｇ／ＩＩ）。魚を超音波に１０分間さらして３０分後、血液のＧｎＲＨａ のレベルは１，３６±０．２７ｎｇ／ｍｌであった。ＧｎＲＨａ溶液に浸してい た全期間中（６０分間）、超音波にさらされた魚の血漿中で測定されたＧｎＲＨ ａのレベルは、対照である魚の血漿中で測定されたＧｎＲＨａのレベルよりも有 意に高かった（Ｐ＜　０．００１）　（図１）。

ホルモンを含むビーカーから魚を取り除くと、ＧｎＲＨａは血液循環からなくな り、１８０分で（混ぜ物のない水に移して２時間後）、超音波処理された魚の血 漿のＧｎＲＨａのレベルは対照である魚で観測されたものと変わらかった（図１ ）。

従ってこのデータは明らかに、金魚を診断用レベルの超音波に短期間さらすこと は、水から魚の血液中へのナノペプチドの取り込みを飛躍的に増強することを示 している。

超音波を用いて水生動物が化合物を取り込むことを実現または増強する方法の改 変および変形は、前述の本発明の詳細な記載から当業者に明らかである。そのよ うな改変および変形もまた添付の請求項の範囲に含まれるものとする。

晴間　（分　） ＦＩＧＵＲＥグ 国際調査報告 ＤＩ＋〒ハ代　（Ｉｔ／Ｉ’ｌ＾直）膚ＰＣＴ／ＵＳ　９１１０６４２８ フロントページの続き （７２）発明者　コスト、ジョーゼフ イスラエル国　８４　９６５　オマー、ヒシタストリート　図 （７２）発明者　ランガー、ロバート　ニス。

アメリカ合衆国　マサチューセッツ ０２１５８　ニュートン、ロンバード　ストリート７７

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．水性媒体中で水生動物に化合物を投与する方法であって、投与される該化合 物を該水性媒体に添加する工程、および超音波にさらさない対照である動物と比 較して、該動物中の該化合物のレベルを増加させるために有効な時間、該化合物 を含有する水性媒体に対して超音波を当てる工程、を包含する方法。
2. ２．前記動物が、魚、甲殻類、軟体類、およびその卵からなる群から選択される 、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記化合物が、タンパク質、核酸配列をコードするタンパク質、非タンパク 質化学化合物および無機質からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
4. ４．前記化合物が、抗生物質、抗真菌剤、ステロイド、ビタミン、および栄養素 からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
5. ５．前記タンパク質が、ホルモンおよびワクチンからなる群から選択される、請 求項３に記載の方法。
6. ６．前記超音波が１分と５０分との間で当てられる、請求項１に記載の方法。
7. ７．前記超音波が、水生動物の表面に０と３Ｗ／ｃｍ２との間の強度がある２０ ｋＨｚと１０ＭＨｚとの間の周波数で当てられる、請求項１に記載の方法。
8. ８．すべての前記動物および投与される前記化合物を含有する水溶液に対して超 音波を当てることを用いて、化合物を多様な動物に投与する、請求項１に記載の 方法。
9. ９．水生動物に化合物を投与するシステムであって、投与される該化合物を含有 する水性媒体、ここで該水柱媒体は該水生動物に対して無害である、および化合 物で処理される該動物の表面に０と３Ｗ／ｃｍ２との間の強度がある２０ｋＨｚ と１０ＭＨｚとの間の周波数で、該水性媒体に対して超音波を当てる手段、を包 含するシステム。
10. １０．前記化合物が、タンパク質、核酸配列をコードするタンパク質、非タンパ ク質化学化合物および無機質からなる群から選択される、請求項９に記載のシス テム。
11. １１．前記化合物が、抗生物質、抗真菌剤、ステロイド、ビタミン、および栄養 素からなる群から選択される、請求項１０に記載のシステム。
12. １２．前記タンパク質が、ホルモンおよびワクチンからなる群から選択される、 請求項１０に記載のシステム。
13. １３．魚、甲殻類、軟体類、およびその卵からなる群から選択される動物を、さ らに含有する、請求項１０に記載のシステム。