JPH06503578A - ペプチド用液相法 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ペプチド用液相法
本発明は、ペプチド
L−His−D−Trp−L−Ala−L−Trp−D−Phe−L−Lys−
NH2の製造法に関する。
このペプチドは、下垂体成長ホルモン放出活性を有する。
また、本発明は、本発明の製造法において使用される中間体に関する。
発明の背景
米国特許第4.411.890号には、ペプチド L−His−D−Trp−L
−^1a−L−Trp−D−Phe−L−Lys−N[12が下垂体成長ホルモ
ン放出活性を有すると記載されている。該ペプチドは、成長ホルモン欠損に関連
した症状の治療に有用である。
米国特許第4.411.890号に例示されているこのペプチドの製造法は、出
発物質アミノ酸を樹脂に結合させ、ついで適当なアミノ酸と逐次力・ツブリング
させる固相法である。したがって、該面相法における中間体は、ペプチド−樹脂
化合物である。所望のペプチド生成物を、フッ化水素と処理することにより該樹
脂から開裂させる。米国特許第4.411.890号には、当該分野で公知の溶
液法はペプチドの製造に使用できると述べられているが、溶液法は何ら例示され
ていない。液相法について記載されている唯一の中間体は、保護されたヘキサペ
プチ本発明は、L−His−D−Trp−L−へ1a−L−Trp−D−Phe
−L−Lys−NH2の有利な製造法を提供する。該製造法は、容易に単離精製
される固体の再結晶可能な中間体を与える液相法(solution phas
e method)である。こねらの固体の中間体(ま一般に結晶性であり、再
結晶により精製してもよい。固体の再結晶可能な中間体は、特に製造法の全工程
においては、ペプチド化学では珍しく、精製における利点を与える。
したがって、本発明は、
a ) L−Lys(BOC)−NHzをZ−D−Pheとカップリングさせ、
b)Z基を除去し、得られたD−Phe−L−Lys(BOC)−+tH2をZ
−L−Trp−NH2とがツブリングさせ、
c)Z基を除去し、得られたL−Trp−D−Phe−L−Lys (BOC)
−NH2をZ−L−Alaと力・ツブリングさせ、
d)Z基を除去し、得られたL−Ala−L−Trp−D−Phe−L−Lys
(BOC)−Nu 、をZ−D−Trpとカップリングさせ、
e)Z基を除去し、得られたD−Trp−L−^1a−L−Trp−D−Phe
−L−Lys(BOC)−NHzを(BOC) 2−L−Hisとカップリング
させ、およびf)BOC基を除去し、L−His−D−Trp−L−^1a−L
−Trp−D−Phe−1,−Lys−)JH2を得ることを特徴とする式
%式%
で表される化合物の製造法である。
不純物の成長を防ぐため、好ましくは、該製造法の各工程で該中間体を再結晶す
る。該製造法の次工程で使用する前に各中間体を精製する場合には、最終生成物
の精製が容易になる。
さらに、本発明の液相法が、樹脂から生成物を開裂させるために固相法において
使用される腐食性のフッ化水素の使用を避けられることは、有利である。本発明
の液相法は、アミノ保護基を除去するために該反応法の終わりに、ただ1回の酸
処理を要するのみであり、したがって、トリプトファン残基の分解を最小限化す
る。一方、固相法は反復的酸処理を含む。
本発明の製造法における保護されたペプチド中間体もまた、本発明の特徴である
。該中間体は固体であり、一般に結晶性であり、再結晶により容易に精製される
ため、本発明の製造法において特に有用である。
本発明の製造法は、以下のとおり表されてもよい。
Z−L−Lys(BOC)−NB2(1)1)再結晶
2)触媒H2
3) Z−D−Phe
Z−D−Phe−L−Lys−(BOC)−NEz (II)1)再結晶
2)触媒H2
3) Z−L−Trp
Z−L−Trp−El−Phe−L−Lys(BOC)=NHt (III)1
)再結晶
2)触媒H2
3)’ Z−L−Ala
Z−L−Ala−L−Trp−D−Phe−L−Lys(BOC)−NB12
(IV)1)再結晶
2)触媒H2
3) Z−D−Trp
Z−D=Trp−L−Ala−L−’Trp−D−Phe−L−Lys(BOC
)−Nl12(V)1)再結晶
2)触媒H2
3) BOC−L−His (BOC)BOC−L−His−D−Trp−L−
^1a−L−Trp−D−Phe−L−Lys(BOC)−Nl12およびBO
C−L−His(BOC)−D−Trp−L−^1a−L−Trp−D−Phe
−L−Lys(BOC)−NH2(vT)1)再結晶
2)酸
L−Hi 5−D−Trp−L−A 1a−L−Trp−D−Phe−L−Ly
s−NU 2 (V I I )本発明の中間体化合物は、上記構造式(I)
−(VI)で表される。
本明細書中で使用するアミノ酸/残基についての略語は、標準的なペプチド命名
法に従う。かかる略語および本明細書中で使用する他の語は以下のとおりである
。
L−His = L−ヒスチシン
D−T、 = D−トリプトファン
D−Phe −D−フェニルアラニン
L−LysIIL−リンノ
2 −ペンシルオキシカルボニル
BOC=t−ブチルオキ7カルボニル
TFA=トリフルオロ酢酸
冒SC=水溶性力ルホシイミド[1−(3−ジメチルアミノプロピル)−3−エ
チルカルボジイミド塩酸]
DMF =ジメチルホルムアミド
上記した製造法の工程においては、次工程で使用する前に中間体(1)−(mを
再結晶する。中間体(II) −(VI)は、接触水素化分解によりペンジルレ
オキシカルボニル基(Z)を除去し、ついで適当なアミノ酸と力・ノブ1ノング
させることにより製造する。
出発物質であるN(α)−ベンジルオキシカルボニル−N(ε)−1−ブチルオ
キシカルボニル−し−リシンアミド(1)は、N(α)−ベンジルオキシカルボ
ニル−N(ε)−1−ブチルオキ/カルボニル−し−リジンから、アンモニア、
水溶性カルホンイミド[すなわち、1−3(ジメチルアミノプロピルイミド
り製造する。接触水素化分解によりペンノルオキシカlレボニル基を中間体(1
)から除去した後、水溶性カルボジイミドおよび1−ヒドロキシベン゛/ト1ノ
ア・/−ルを使用して、得られたアミンをベンジルオキシカルボニル−D−フェ
ニルアラニンにカップリングさせる。ベンジルオキシカルボニル−L−ト’Jブ
トファン、ベンジルオキシカルボニル−し−アラニン、ペンジルオキシカルボニ
ル−D−トリプトファンおよびN(α)、N(im)−ジ−t−ブチフレオキシ
カルボニル−スチジンでこの脱保護(Z基の除去)およびカップリングの順序を
繰り返して、ジ−t−ブチルオキシカルボニルへキサペプチドおよびトリーtー
プチルオキシカルポニルへキサペプチド(Vl)の混合物を得る。t−ブチルオ
キシカルボニル基を酸で除去して、所望のペプチド生成物(VII)を得る。ペ
プチド生成物(VII)は、例えば、逆相液体クロマトグラフィーを使用して精
製される。
t−ブチルオキシカルボニル基は、酸および所望によりカルボニウムイオン捕捉
剤を使用して除去する。t−ブチルオキシカルボニル基を除去するのに適当な酸
は当該分野でよく知られており、鉱酸または有機強酸、例えばトリフルオロ酢酸
を包含する。カルボニウムイオン捕捉剤もまた当該分野でよく知られており、求
電子性アリール化合物およびメルカプタン類、例えばn−プロピルメルカプタン
を包含する。
2保護基を除去するための水素化分解は、適当な触媒、例えば5〜10%パラジ
ウム炭素のようなパラジウム炭素を使用して行う。好ましくは、10%パラジウ
ム炭素を使用する。水素化分解を行う圧力は重要でなく、大気圧から数百psl
であってもよい。典型的には、大気圧から100psiで行う。水素圧を上げる
と反応速度が増大する。約100ps iで反応を行うことが好ましい。オート
クレーブ中での激しい撹拌(例えば600rpm)は、反応速度を上げるのに非
常に有利である。
カップリング反応は当該分野てよく知られており、例えば、ハロゲン化アシル、
活性化エステルまたは活性化無水物を形成させて中間体のカルボキシル基を活性
化させることにより、または、例えばンシクロへキシルカルボジイミドまたは水
溶性カルボジイミド、PPA (1−プロパンホスホン酸環状無水物)、DPP
A(ジフェニルホスホリルアジド)またはBOP試薬(ベンゾトリアゾール−1
=イルオキシ−トリス(ジメチルアミノ)−ホスホニウムヘキサフルオロホスフ
ァート)のようなカルボジイミドのようなカップリング試薬でカップリングさせ
ることにより行ってもよい。水溶性カルボジイミドが好ましい。カルボジイミド
によるカップリング反応を促進するために、N−ヒドロキシーベンゾトリアゾー
ルのような追加的試薬を加えてもよい。
完了の際に、カップリング反応溶液を、例えば、中間体(II) −(V)にお
ける水性塩基に注ぎ、カップ盲ルグ反応溶液を、炭酸カリウムまたは炭酸水素カ
リウム水溶液に激しく撹拌しながら注ぐ。
ジーBOCおよびトリーBOC中間体(VI)の製造においては、好ましくは、
カップ1ルグ反応溶液を炭酸水素カリウム水溶液に注ぐ。カップ1ルグ溶液の添
加の間、該水性炭酸水素カリウムを激しく撹拌する。好ましくは、添加の速さく
ま約500m1〜ILZ分とすべきである。
中間体(VI)を濾過により集める場合、濾液が中性になるまでこれをよく洗浄
すべきである。湿っぽい生成物は、再結晶および/またはBOC保護基の除去前
に一定重量になるまで乾燥すべきである。
BOC保護基は、酸により、所望によりカルボニウムイオン捕捉剤の存在下で除
去する。トリフルオロ酢酸は、BOC基を除去するのに適切な酸である。カルボ
ニウムイオン捕捉剤を使用することが好ましい。典型的なカルボニウムイオン捕
捉剤は、アニソール、ジメトキシベンゼンおよびメルカプタンである。n−プロ
ピルメルカプタンが適切である。
以下の実施例は、本発明の特定の実施を例示するものであり、本発明の範囲を限
定するものではない。
実施例I
Z−L−Lys(BOC)−)JH2(7)製造塔頂撹拌tl&CD)イf=
丸1i17 ラスコ中、Z−L−Lys(BOC)−0H(682,0g、1.
79mo +)および1−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾール水和物(330,4
g。
2、15mo 1)を順次DMF (1,06L)に溶解した。得られた溶液を
水浴中0〜5℃に冷却し、温度が12℃を越えない速さで粉末漏斗を通してWS
C(377、0g、1.98mol)を加えた。添加後、水浴を除き、該混合物
を30分間室温で撹拌した。次に、これを水浴中0〜5℃に再度冷却し、濃水酸
化アンモニウム(225mL、3.59mo l NH3)のDMF (500
ml)溶液を、温度が25度未満を維持する速さで加えた。得られた溶液を室温
で1.5時間撹拌し、ついで、激しく撹拌しながら、炭酸カリウム水溶液(5,
6%w/v、36L)にゆっくり加えた。分離した該白色固体をポンプで集め、
洗浄液がpH試験紙で中性になるまで脱イオン水(約25L)で洗浄し、−夜空
気乾燥した。この固体を、イソプロパツール(3,95L)および脱イオン水(
5,55L)の混合物から再結晶して白色結晶を得、これをポンプで集め、イソ
プロパノ−ルー水(2:3v/v、2L)で洗浄し、一定重量になるまで真空中
45℃で乾燥した(436g、64.1%) 。’HNMR(DMSO−de、
360MHzM 7.4−7.15(m、6H)、 6.93(s、2H)。
6.72(br t、IH)、 5.02(s、2H)、 3.93−3.83
(m、IH)、 2.91−2.80(m、211)、 1D65−1.20
(t 6H)、1.36(s、 9tl) : MS(FAB) tm/e 3
.80.3[M+III]”; TLCRf O,57(シ潟J、 90:8:
2
クロロホルム:メタノール:酢酸); HPLCRT 7.0分(5μアルテツ
クス・ウルトラスフイア−(Altex Ultrasphere) (登録商
標) ODS、4.6 X 250+n、1ml/分、グラジェント、A: 1
/9 v/vアセトニトリル/水−0,3Mリン酸二水素アンモニウムB: 1
/1 v/vアセトニトリル/水−0,3Mリン酸二水素アンモニウム、0%−
100%B10分かけて、100%B35分、220nmでUV検出)。
Z−L−Lys(BOC)−Nut (20,0g、53mmo + )をDM
F (100ml)に溶解した。この溶液を水素化反応に適切なオートクレーブ
(容量300m1)に移した。これに、10%パラジウム炭素触媒(0,67g
)のDMF (20ml)懸濁液を加えた。該オートクレーブに水素を100p
siで充填し、タービン撹拌機を約600rpmで作動させた。温度を22〜2
4℃に維持した。2時間後、撹拌を停止し、オートクレーブを開けた。HPLC
は出発物質が存在しないことを示した。
反応混合物をDMF洗浄セライト(Celite) (登録商標)吸着床を通し
て濾過した。ついで、該固体をDMF (35ml)で洗浄し、濾液および洗浄
液を集めL−Lys(BOC)−NB2 (53mm o I )およびトルエ
ンのDMF (155ml)溶液よりなるこの全生成物を、塔頂撹拌機のついた
丸底フラスコに入れ、0〜5℃に冷却した。Z−D−Phe (,17,1g、
58mmo +)および1−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(9,6g、
63mmo+)をこの溶液に順次溶解した。激しく撹拌しながら、粉末添加漏斗
を通して、温度を10℃未満に維持する速さでWSC(12,8g、67mmo
l)を加えた。WSCが溶解したら、該反応混合物を外界温度で1時間撹拌した
。該反応混合物をDMF洗浄セライト(登録商標)吸着床を通して濾過し、つい
で炭酸カリウム水溶液(5%w/v、1.6L)に激しく撹拌しながらゆっくり
加えた。沈殿した固体をブフナー漏斗上で集め、溶出液がpH試験紙で中性にな
るまで濾過ケーキを脱イオン水(約1.2L)で洗浄した。該固体を沸騰イソプ
ロパツール(240ml)に溶解した。沸騰溶液に、曇り点まで脱イオン水(約
240m1)を加え、得られた溶液を0〜5℃で一夜冷却した。該固体をブフナ
ー漏斗上で集め、水性イソプロパツール(1:1v/v、100m1)で洗浄し
た。該固体を真空中40℃で乾燥した(26.3g。
95%) 。’HNMR(DMSO−da、360MHz) 68.09(d、
IB、J−7Hz)、 7.54(d、 IHj=7Hzj、 7゜
4−7.15(m、10H)、 7.04(s、2H)、 6.70(br t
、IH)、 4゜95(a+、2H)、 4.3−4.15im、2H)、 3
0−2.7(m、4H)、1.7−1.0(a+、6H)、1.36(s、9H
): MS(FAB) Ill/e 527.4[M+[lR゛、525J
Jll−H]−; TLCRf O,60(ノリ力、 90:8:2クロロホル
ム:メタノール:酢酸)、ErPLCR716分(5μアルテツクス・ウルトラ
スフイア−(Altex Ultrasphere) (登録商標)ODS、4
.6X250+ma、1ml/分、グラジエンl−,、A: 1/9 v/vア
セトニトリル/水−領3Mリン酸二水素アンモニウムB: 1/1 v/vアセ
トニトリル/水−063Mリン酸二水素アンモニウム、75%B5分間、75%
−100%B 7.5分かけて、100%B35分、220nmでUV検出)。
Z−D−Phe−L−Lys(BOC)−NHt (26,0g、 49mmo
I )をDMF (100ml)に溶解した。この溶液を水素化反応に適切な
オートクレーブ(容量300m1)に移した。これに、10%パラジウム炭素触
媒(1,3g)のDMF (20ml)懸濁液を加えた。該オートクレーブをシ
ールし、ついで100ps iまでの水素の充填および放出を数回行った。該オ
ートクレーブに100psiの水素を充填し、タービン撹拌機を約600rpm
で作動させた。温度を22〜24℃に維持した。約2時間後、撹拌を停止し、オ
ートクレーブを開けた。TLCおよびHPLCは出発物質が存在しないことを示
した。
反応混合物をDMF洗浄セライト(Celite) (登録商標)吸着床を通し
て濾過した。ついで、該固体をDMF (50ml)で洗浄し、濾液および洗浄
液を集めた。
D−Phe−L−Lys(BOC)−NB2 (49mm o l )およびト
ルエンのDMF (約170m1)溶液よりなる全生成物を、塔頂撹拌機のつい
た丸底フラスコに入れ、0〜5℃に冷却した。Z−L−Trp (18,6g、
55mmo 1)および1−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(9,02g
、59mmol)をこの溶液に順次溶解した。
激しく撹拌しながら、粉末添加漏斗を通して、温度を10℃未満に維持する速さ
でWSC(12g、62mmo 1)を加えた。WSCが溶解したら、該反応混
合物を外界温度で2.5時間撹拌した。この時、TLCはD−Phe−L−Ly
s(BOC)−NBzが存在しないことを示した。該反応混合物をDMF洗浄セ
ライト(登録商標)吸着床を通して濾過し、ついで炭酸カリウム水溶液(5%w
/v、l。6L)に激しく撹拌しながらゆっくり加えた。固体として分離した生
成物をポンプで集め、洗浄液が塩基性でなくなるまで脱イオン水(1,2L)で
洗浄した。この湿った固体を沸騰メタノール(500m l )に溶解し、曇り
点まで脱イオン水(150ml)を加えた。該溶液を0〜5℃で一夜冷却した。
分離した該固体をブフナー漏斗上で集め、水性メタノール(50%v/v、10
0m1)で洗浄した。該固体を真空中40℃で乾燥した(33.3g、95%)
、 ’HNMR(DMSO−ds、360MHz)610、73(d、 IH
,J=IHz)、 8.45(d、 IH,J−7Hz)、 8.05(d、
IH,J=7Hz)、 7.6(dA 11 J−711z)。
7.4−6.9(m、17H)、 6.70(br t、LH)、 4.92(
m、2H)、 4.6.4.25.4.15各シグナル(aB
IH)、3.0−2.6(m、6■)、1.7−1.0(i、6[1)、1.3
6(s、9H); MS(FAB) race 713.6bM+Hコー。
711.4[M−■]−: TLCRf O,46(シリカ、 90:8:2ク
ロロホルム:メタノール:酢酸):HPLCRT 21分(5μアルテツクス・
ウルトラスフイア−(Altex Ultrasphere) (登録商標)
ODS、4.6 X 250mm、1ml/分、グラジェント、A: 1/9
v/vアセトニトリル/水−0,3Mリン酸二水素アンモニウムB: 1/1
v/vアセトニトリル/水−0,3Mリン酸二水素アンモニウム、75%B 5
分間、75%−100%B 7.5分かけて、100%B35分、220nmで
UV検出)。
実施例4
Z−L−Ala−L−T −D−Phe−L−Lys(BOC)−Nutの製造
Z−L−Trp−D−Phe−L−Lys(BOC)−Nut (33,0g、
46 mm o I )をDMF(100ml)に溶解した。この溶液を水素
化反応に適切なオートクレーブ(容量300m1)に移した。これに、10%パ
ラジウム炭素触媒(2,2g)のDMF (20ml)懸濁液を加えた。該オー
トクレーブをシールし、100ps iまでの水素の充填および放出を数回行っ
た。該オートクレーブに100psiの水素を充填し、タービン撹拌機を約60
Orpmで作動させた。温度を20−28℃に維持した。約3時間後、撹拌を停
止し、オートクレーブを開けた。TLCは出発物質が存在しないことを示した。
HPLCは痕跡量の残留を示した。
反応混合物をDMF洗浄セライト(Celite) (登録商標)吸着床を通し
て濾過した。ついで、該固体をDMF (50ml)で洗浄し、濾液および洗浄
液を集めた。
L−Trp−D−Phe−L−Lys(BOC)−NH3(46mm o ]
)のDMFおよびトルエン(約20m1)溶液を、塔頂撹拌機のついた丸底フラ
スコに入れ、0〜5℃に冷却した。
Z−L−Ala (11,3g、50mmo 1)および1−ヒドロキシベンゾ
トリアゾール水和物(8,47g、50mmol)をこの溶液に順次溶解した。
激しく撹拌しながら、粉末添加漏斗を通して、1度を10℃未満に維持する速さ
でWSC(11,1g、58mmol)を加えた。WSCが溶解したら、該反応
混合物を外界温度で2.5時間撹拌した。該反応混合物をDMF洗浄セライト(
登録商標)吸着床を通して濾過し、ついで炭酸カリウム水溶液(5%w/v、1
.6L)に激しく撹拌しながらゆっくり加えた。固体として分離した生成物をポ
ンプで集め、洗浄液が中性になるまで脱イオン水(1,6L)で洗浄した。吸引
して可能な限り乾燥した後、この湿った濾過ケーキを沸騰メタノール(700m
l)に溶解し、曇り点まで脱イオン水(300ml)を加えた。得られた溶液を
0〜5℃で一夜冷却した。該固体をブフナー漏斗上で集め、メタノール−水(1
: 1. v/v。
200m1)で洗浄し、真空中40℃で乾燥した(34.8g、95%)。′H
NMR(DIISO−ds、360M11z) 610.73(d、IH,J=
IHz)、 8.27.8.15.7.88各シグナル(dAI
LJ港7Hz)、 7.5(d、IH,J−7Hz)、 7.4−6.9(+m
、1711)、 6.69(br t、lH)、 5.0(香A2B)。
4、6−4.0(m、 4E[)、 3.0−2.7(m、 6111)、 1
.7−L O(m、 611)、 1.36(s、 9H)A 1.12(d、
311. J−81iz); ll5(FAB) race 784.6[M
+Bコ゛、 782.5[M−H]−; TLCRf O,46(シリカ、 9
0:8:Qクロ
ロホルム:メタノール:酢酸);HPLC訂19分(5μアルテツクス・ウルト
ラスフイア−(Altex Ultrasphere) (登録商標) 005
. 4.6X250mm+、1ml/分、グラジェント、A: 1/9 v/v
アセトニトリル/水−0,3Mリン酸二水素アンモニウムB: 1/1 v/v
アセトニトリル/水−0,3M リン酸二水素アンモニウム、75%B 5分間
、75%−100%B 7.5分かけて、100%B35分。
22OnllでUV検出)。
Z−L−Ala−L−Trp−D−Phe−L−Lys(BOC)−Nflz
(34、5g 、 43 mm o l )をDMF(100ml)に溶解した
。この溶液を水素化反応に適切なオートクレーブ(容量300m1)に移した。
これに、10%パラジウム炭素触媒(3,45g)のDMF (20ml)懸濁
液を加えた。該オートクレーブをシールし、ついで10Qpsiまでの水素の充
填および放出を数回行った。該オートクレーブに100pslの水素を充填し、
タービン撹拌機を約60Orpmで作動させた。温度を20〜28℃に維持した
。約3.5時間後、撹拌を停止し、オートクレーブを開けた。TLCは出発物質
が存在しないことを示し、HPLCは痕跡量の残留を示した。
反応混合物をDMF洗浄セライト(Celite) (登録商標)吸着床を通し
て濾過した。ついで、該固体をDMF (50m l )で洗浄し、濾液および
洗浄液を集めた。
L−^1a−L−Trp−D−Phe−L−Lys(BOC)−NH2(43m
m o ] )のDMFおよびトルエン(約200m1)溶液を、塔頂撹拌機の
ついた丸底フラスコに入れ、0〜5℃に冷却した。Z−D−Trp (16,0
g、48mmo 1)およびl−ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物(7,9
9g、52mmol)をこの溶液に順次溶解した。激しく撹拌しながら、粉末添
加漏斗を通して、温度を10℃未満に維持する速さでWSC(10,4g、54
mmo +)を加えた。WSCが溶解したら、該反応混合物を外界温度で3時間
撹拌した。この時、TLCはL−^1a−L−Trp−D−Phe−L−Lys
−(BOC)−N[I、が存在しないことを示した。該溶液をセライト(登録商
標)吸着床を通して濾過した。該反応混合物を炭酸カリウム水溶液(5%w/v
、1.6L)に激しく撹拌しながらゆっくり加えた。固体として分離した生成物
をポンプで集め、洗浄液が中性になるまで脱イオン水(1,6L)で洗浄した。
吸引して可能な限り乾燥した後、この湿った濾過ケーキを沸騰エタノール(1,
4L)およびDMF (100ml)に60℃で溶解した。曇り点まで脱イオン
水(400ml)を加えた。得られた溶液を0〜5℃で一夜冷却した。該固体を
ブフナー漏斗上で集め、エタノール−水(1: 1.v/v、200m1)で洗
浄し、真空中40℃で乾燥した(39.3g、93.6%) 、 ’HNMR(
DMSO−ds、360MFIz) 610.8.10.7各シグナル(d、
IH,J村Hz)、 8.20−7.85(m、 4[1)、 7.65−6.
9(m、 23EI)、 6.70(b秩@t、 IH)。
5.0(+m、2H)、 4.6−4.0(m、5H)、 3.15−2.6(
m、8H)、 1.7−0.9(!1.6H)、 1.37iS、9■)、1゜
04(d、3H,J−8Hz)+ MS(FAB) m/e 970.7[M+
H]−、968,6[1−H]−: TLCRf 0.30iシリカ。
90:8+2クロロホルム、メタノール:酢酸): E[PLCRT 25分(
52アルテツクス・ウルトラスフイア−(Altex Ultrasphere
) (登録商標) ODS、4.6 X 250wm。
1 ml/分、グラジェント、A: 1/9 v/vアセトニトリル/水−0,
3Mリン酸二水素アンモニウムB: 1/1 v/vアセトニトリル/水−0,
3Mリン酸二水素アンモニウム、75%B5分間、75%−100%B7.5分
かけて、100%B35分、220nmTUV検出)。
Z−D−Trp−L−Ala−L−Trp−D−Phe−L−Lys(BOC)
−NHt (39,0g、 40 mm o l )をDMF (100ml)
に溶解した。この溶液を水素化反応に適切なオートクレーブ(容量300m1)
に移した。これに、10%パラジウム炭素触媒(5g)のDMF (30ml)
懸濁液を加えた。該オートクレーブをシールし、ついで10Qpsiまでの水素
の充填および放出を数回行った。該オートクレーブに100psiの水素を充填
し、タービン撹拌機を約600rpmで作動させた。温度を20〜28℃に維持
した。約5時間後、撹拌を停止し、100pSiまでの窒素のオートクレーブへ
の充填および放出を数回行った。TLCおよびHPLCは出発物質が存在しない
ことを示した。
反応混合物をDMF洗浄セライト(Celite) (登録商標)吸着床を通し
て濾過した。ついで、該固体をDMF (50ml)で洗浄し、濾液および洗浄
液を集めた。
D−Trp−L−^1a−L−Trp−D−Phe−L−Lys(BOC)−N
H2(40mm o 1 )のDMFおよびトルエン(約200m1)溶液を、
塔頂撹拌機のついた丸底フラスコに入れ、水浴中で0〜5℃に冷却した。(BO
C)2−L−His (15,7g、44mmo り 、1−ヒドロキシベンゾ
トリアゾール水和物(7,39g、48mmol)およびWSC(9,63g、
50mmol)をこの溶液に順次溶解した。5分以内の間隔で各添加を行った。
WSCが溶解したら、該反応混合物を0〜5℃で1時間、ついで外界温度で一夜
撹拌した。D−Trp−L−Ala−L−Trp−D−Phe−L−Lys(B
OC)−Nutの消失はHPLCにより監視した。該反応混合物をセライト(登
録商標)吸着床を通して濾過した。得られた濾液を炭酸水素カリウム水溶液(1
0%w/v、3L)に激しく撹拌しながらゆっくり加えた。固体として分離した
生成物をポンプで集め、洗浄液が中性になるまで脱イオン水(約5L)で洗浄し
た。濾液が出なくなるまで吸引した後、この湿ったケーキを真空中35℃で乾燥
して45.4gの固体を得たく95%)。HPLCの示すところによれば、主要
な種がトリーBOC−へキサペプチド(88,3%)で、次がジーBOC−へキ
サペプチド(9,5%)であった。
トリーBOCおよびジーBOCヘキサペプチド(50g)の粗混合物をDMF(
130ml)1:60℃で溶解した。メタノール(1,3L)、ついで活性化炭
素(25g)を加えた。該混合物を2分間沸騰させ、セライトの吸着床を通して
熱時濾過した。該ケーキを熱メタノール(500ml)で洗浄した。集めた濾液
および洗浄液を一15℃で一夜冷凍した。分離した白色固体をポンプで集め、メ
タノール(200ml)で洗浄し、真空中室温で一夜乾燥した(37.1g、7
4.2%) 。’E NMR(DMSO−da、400M)Iz)δ10.8.
10.7各シグナル(d、111.J=IHz)、 8゜25−7.9(a’、
5H)、 8.1s、 IEI)、 7.55−6.9(m、 20H)、
6.75(br t、 IH)、 4D6−4.1f、 6H)。
3.1−2.6(m、10H)、 1.7〜1.0(m、6H)、 1.51(
s、9[1)、 1.36(s、9H)、 1.30(d、XH)、 1.0(
d。
3B、 J4Hz): MS(FAB) ra/e 1173.6[M+Hコ゛
(トリーBOC)、1073.5[M+H]”(ジーBOCj;
TLCRf O,44(ト’J −BOC)、 0.02(シーBOC)(シリ
カ、 90:8:2りOOホルム:メタノール:酢酸)、 Rf O,94(ト
’J−BOC)、 0.47(ン−BOC)(シリカ、 4:1:1ブタノール
:酢酸・水): EIPLCRT 31分(トIJ−BOC,90,2%)、8
分(ン−BOC,8,4%) (5+ フルテックス・ウルトラスフイア−(A
ltex Ultrasphere) 、(登録商標) ODS、4.6X 2
’50mm、1 ml/分、グラジェント 、A: 1/9 v/vアセトニ
トリル/水−0,3Mリン酸二水素アンモニウムB・ 1/I v/vアセトニ
トリル/水−0,3M リン酸二水素アンモニウム、75%B5分間、75%−
100%B 7.5分かけて、100%B35分、22QnmでL;V検出)。
実施例7
L−His−D−Trp−L−^1a−L−Trp−D−Phe−L−Lys−
NHtの製造トリフルオロ酢酸(960ml)およびn−プロパンチオール(1
50ml)を混合し、1分間撹拌した。BOC−L−Hi 5−D−Trp−L
−A 1a−L−Trp−D−Phe−L−Lys (BOC)−Nlhおよび
BOC−L−fl i s (BOC)−D−T rp−L−A 1 a−L−
T rp−D−Phe−L−Ly s (BOb)−NU tの混合物(6
00g)を撹拌しながら加えた。溶解が完了したら、該溶液を室温で2時間保っ
た。
この時、サンプルをHPLCで分析して、所望の生成物の存在および出発物質の
不存在を確認した。
該反応混合物を蒸発させてガムを得、これを蒸留水(300m l )に溶解し
、2回再蒸発させた。ついで、該混合物を蒸留水(IL)に溶解し、希水酸化ア
ンモニウム水溶液を滴下することにより、pHを約3に調整した。
この物質を逆相液体クロマトグラフィーにより精製した(YMC型AS−505
5、エンドキャップト・オクタデシル・シリカ、球形、粒径50μおよび細孔サ
イズ120人)。吸着床サイズは内径5cmx長さ50cmであり、吸着床容積
981m1に相当し、ステンレス綱HPLCカラム中に充填した。また、同一の
充填物(196ml)を含有する内径5cmx長さ10 c’mのガート・ドカ
ラムがあった。これは、ベックマン(Beck+*an)ブレツブ−350HP
LCシステムを用い、溶出液を254Mmで監視して、0.1M酢酸アンモニウ
ム水溶液pH4゜5(4L)で平衡化した。
上記のpHを調整した反応混合物を、蒸留水(300ml)でさらに希釈し、つ
いで流速100m1/分でカラムに載せた。該カラムを1.0M酢酸アンモニウ
ムpH8(6,OL) 、ついで0.IM酢酸゛アンモニウムpH4,5(2,
5L)で洗浄した。該生成物を、以下のO,1M水性酢酸アンモニウムpH4,
5中のアセトニトリルの溶液での逐次溶出により除去した:10%v/v (I
L) 、15%v/v (900ml) 、17%v/v (IL) 、20%
v/v (2,5L)、25%v/v (2,5L)。125m1からILの大
きさの画分を集めた。最後に、該カラムを、0.1M水性酢酸アンモニウムpH
4,5(3,5L)中の50%V / Vアセトニトリルで洗浄した。
該両分をHPLCで分析し、生成物を含有するものをプールした。アセトニトリ
ルを蒸発させ、水性残渣を凍結乾燥した。得られた固体を蒸留水に2回再溶解し
、再凍結乾燥してL4is−D−Trp−L−Ala−L−Trp−D−Phe
−L−Lys−NB2 (47、67g)を得た。
生成物を蒸留水に溶解し、集め、02μ膜(硝酸セルロース)と通して濾過した
。濾液を凍結乾燥してL−His−D−Trp−L−^1a−L−Trp−D−
Phe−L−Lys−NL (粉末)を得た。アミノ酸分析:His (0,9
9) 、Aha (1,0) 、Phe (1,0) 、Lys(1,01):
紫外線吸収によるTrpについての分析(1,93):R717分(5μアルテ
ツクス・ウルトラスフイア−(Altex Ultrasphere) (登録
商標) ODS。
4.6x250mm、1ml/分、グラジェント、A: 1/4 v/vアセト
ニトリル/水−0,1M リン酸二水素アンモニウム−0,8Mリン酸(トリエ
チルアミンでpH3゜0に!I!E) B・ 3/7v/vアセトニトリル/水
−0,1M リン酸二水素アンモニウム−0,8Mリン酸(トリエチルアミンで
pH3,01:調整)、O%B23分間、0%−100%B37分かけて、21
0止でUV検出)。
本製造法およびこれらの中間体の変形は、当業者に明らかである。本発明の範囲
は、開示した特定の実施例に限定されるものではなく、以下の請求の範囲内のす
べてを包含することを意図する。
国際調査報告
フロントページの続き
(51) Int、 C1,5識別記号 庁内整理番号C07K 5106 Z
8318−4H// C07K 99:00
I
Claims (20)
- 1. a)L−Lys(BOC)−NH2をZ−D−Pheとカップリングさせ、b) Z基を除去し、得られたD−Phe−L−Lys(BOC)−NH2をZ−L− Trp−NH2とカップリングさせ、 c)Z基を除去し、得られたL−Trp−D−Phe−L−Lys(BOC)− NH2をZ−L−Alaとカップリングさせ、 d)Z基を除去し、得られたL−Ala−L−Trp−D−Phe−L−Lys (BOC)−NH2をZ−D−Trpとカップリングさせ、 e)Z基を除去し、得られたD−Trp−L−Ala−L−Trp−D−Phe −L−Lys(BOC)−NH2を(BOC)2−L−Hisとカップリングさ せ、およびf)BOC基を除去し、L−His−D−Trp−L−Ala−L− Trp−D−Phe−L−Lys−NH2を得ることを特徴とする式: ▲数式、化学式、表等があります▼ で表される化合物の製造法。
- 2.それぞれのカップリング後に再結晶する請求項1記載の製造法。
- 3.保護基Zを接触水素化分解で除去する請求項1記載の製造法。
- 4.触媒が5〜10%パラジウム炭素である請求項3記載の製造法。
- 5.大気圧から約100psiで接触水素化分解を行う請求項3記載の製造法。
- 6.接触水素化分解を約100psiで行う請求項4記載の製造法。
- 7.酸およびカルボニウムイオン捕捉剤を使用して保護基BOCを除去する請求 項1記載の製造法。
- 8.酸がトリフルオロ酢酸で、カルボニウムイオン捕捉剤がn−プロピルメルカ プタンである請求項7記載の製造法。
- 9.水溶性カルボジイミドおよび1−ヒドロキシ−ベンゾトリアゾールを使用し てカップリング反応を行う請求項1記載の製造法。
- 10.式:Z−L−Lys(BOC)−NH2[式中、Zはベンジルオキシカル ボニル、およびBOCはt−ブチルオキシカルボニルを示す]で表される固体の 再結晶可能な化合物。
- 11.式:Z−D−Phe−L−Lys(BOC)−NH2[式中、Zはベンジ ルオキシカルボニル、およびBOCはt−ブチルオキシカルボニルを示す〕で表 される固体の再結晶可能な化合物。
- 12.式:Z−L−Trp−D−Phe−L−Lys(BOC)−NH2〔式中 、Zはベンジルオキシカルボニル、およびBOCはt−ブチルオキシカルボニル を示す]で表される固体の再結晶可能な化合物。
- 13.式:Z−L−Ala−L−Trp−D−Phe−L−Lys(BOC)− NH2[式中、Zはベンジルオキシカルボニル、およびBOCはt−ブチルオキ シカルボニルを示す]で表される固体の再結晶可能な化合物。
- 14.式:▲数式、化学式、表等があります▼[式中、Zはベンジルオキシカル ボニル、およびBOCはt−ブチルオキシカルボニルを示す]で表される固体の 再結晶可能な化合物。
- 15.式:▲数式、化学式、表等があります▼[式中、BOCはt−ブチルオキ シカルボニルを示す]で表される固体の再結晶可能な化合物。
- 16.▲数式、化学式、表等があります▼をBOC−L−His(BOC)およ びカップリング試薬と反応させることを特徴とする式:▲数式、化学式、表等が あります▼ [式中、BOCはt−ブチルオキシカルボニルを示す]で表される化合物の製造 法。
- 17.▲数式、化学式、表等があります▼をZ−D−Trpおよびカップリング 試薬と反応させることを特徴とする式: ▲数式、化学式、表等があります▼ [式中、Zはベンジルオキシカルボニル、およびBOCはt−ブチルオキシカル ボニルを示す]で表される化合物の製造法。
- 18.L−Trp−D−Phe−L−Lys(BOC)−NH2をZ−L−Al aおよびカップリング試薬と反応させることを特徴とする式: Z−L−Trp−D−Phe−L−Lys(BOC)−NH2[式中、Zはベン ジルオキシカルボニル、およびBOCはt−ブチルオキシカルボニルを示す]で 表される化合物の製造法。
- 19.D−Phe−L−Lys(BOC)−NH2をZ−L−Trpおよびカッ プリング試薬と反応させることを特徴とする式: Z−L−Trp−D−Phe−L−Lys(BOC)−NH2[式中、Zはベン ジルオキシカルボニル、およびBOCはt−ブチルオキシカルボニルを示す〕で 表される化合物の製造法。
- 20.L−Lys(BOC)−NH2をZ−D−Pheおよびカップリング試薬 と反応させることを特徴とする式: Z−D−Phe−L−Lys(BOC)−NH2[式中、Zはベンジルオキシカ ルボニル、およびBOCはt−ブチルオキシカルボニルを示す]で表される化合 物の製造法。
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