JPH06502577A - 有孔埋め込み物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 有孔埋め込み物 発明の分野 本発明は、埋め込み装置及び埋め込まれた、免疫学的に適合性の生物学的材料の 血管化のための方法に関する。

発明の背景 多くの疾患は、特定の生物学的システムの欠損または破壊によっている。例とし ては、糖尿病（高機能の欠損）、成長遅延（成長ホルモンの欠乏）、他の内分泌 欠陥（甲状腺、上皮小体、生殖腺、副腎、脳下垂体）、パーキンソン病（ドーパ ミンの欠乏）、血友病（血液凝固因子の欠損）、及び先天性代謝異常（特定の酵 素又は補因子の欠損）がある。各々の例において、それらの疾患状態は、特定の 、生物学的に産生される因子の欠乏の結果もたらされる。

これらの疾患の矯正には、その特定の生物学的機能の置換が必要である。例えば 、糖尿病は、正常な血中グルコース濃度を維持するために、工分毎の血中グルコ ースの変化に対して膵臓ホルモンの適切な遊離をもって応答しなければならない 。インシュリンによって治療されている糖尿病は、正常な血中グルコースレベル を維持しない。機能的なランゲルハンス島の埋め込みは疾患を治癒し、インシュ リン療法は単に疾患を治療するに過ぎない。

生きた細胞又は組織及び装置を埋め込むための、いくつかのアプローチが試みら れてきた。Ｖａｃａｎ　ｔ　ｉ及びＬａｎｇｅｒは、”Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　Ｎｅ ｏｒｎｏｒｐｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｏｒｇａｎｓ　ｂｙ　Ｃｏｎｔｒｏｌ ｌｅｄ　Ｃｅ１ｌｕａｒ　［ｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ＵｓｉｎｇＡｒｔｉｆｉ ｃｉａｌ　Ｍａｔｒｉｃｅｓ”、　ＷＯ特許出願８８１０３７８５に記述された システムを開発した。このシステムは、後に続く埋め込みのために細胞をその上 に増殖させる生分解性ポリマーでできた樹状のマトリクスである。装置は患者に 埋め込まれ、該細胞に対するホストの血管化が起こり、該マトリクスは分解され て偽器官が理論的に残存する。

最終的な機能的器官の形成には、明確でなく且つ制御不能の仕方による装置とホ ストの間の複雑な相互作用が必要である。この装置は、いかなる理由で働かなく なったとしても、ホストとの広範な連結のため除去が困難であろう。

免疫学的に適合性の患者における器官様構造の形成のための他のアプローチは、 Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、　Ａｎｄｅｒｓｏｎ、及びＭａｃｉａｇによって”Ｄｅｖｉ ｃｅｆｏｒ　Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎ ｄ　Ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　Ｓａｍｅ、　”　ＷＯ特許出願８９１０７９４４に 記述されている。このアプローチの最も重要な特徴は、Ｖａｃａｎ　ｔ　ｉ及び Ｌａｎｇｅｒのものと類似の構造の生体適合性マトリクス、ｉｎ　ｖｉｖｏの指 向性血管新生を誘導するために使用される血管形成性成長因子の被覆及びこれに 続く患者への埋め込みである。得られた構造は、オルガノイド（ｏｒｇａｎｏｉ ｄ）と名付けられたが、治療上の重要性を育する細胞のための埋め込み部位とし て有用であろう。

代わりに、埋め込み前に細胞を取り付けることも可能であろう。

Ｖａｌｅｎｔｉｎｉ等の米国特許第４，８７７、０２９は、細胞不透過性の平滑 な内側膜表面と１乃至２０μｍのサイズ範囲の縦に向けられた小柱を有する外側 表面とを備えたチャンネルよりなる、半透過性の神経案内チャンネルを記述して いる。この小柱形態は、装置の厚みを横断する孔を含まず、内側コンパートメン ト内への血管成長を許容しない。

Ｒｏｎｅｌ等の米国特許４．２９８．００２は、細胞を埋め込むための多孔性の 親水性チャンバーを記述している。このチャンバーは、該チャンバー内への血管 要素の侵入を許容しない。

５乃至５０μｍのサイズ範囲の孔を有する歯及び骨埋め込み物は、該埋め込み物 を組織内に係留するための繊維の内方生成を許容するが、細胞を埋め込むための チャンバーは提供せず、埋め込まれた細胞又は組織の血管化をもたらさない。

先行技術の追加の例には、米国特許第４．５５３，２７２　”Ｒｅｇｅｎｅｒａ ｔｉｏｎｏｆ　Ｌｉｖｉｎｇ　Ｔｉ５ｓｕｅｓ　ｂｙ　Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｌ ５ｏｌａｔｅｄ　Ｃｅ１ｌｓ　ｉｎ　Ｐｏｒｏｕｓ　Ｉｍｐｌａｎｔ　ａｎｄ　 Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｔｈｅｒｅｏｆ”及び米国特許第４．３７８．０１６”Ａｒｔ ｉｆｉｃｉａｌＥｎｄｏｅｒｉｎｅ　Ｇｌａｎｄ　Ｃｏｎｔａｉｎｉｇ　Ｈｏｒ ｍｏｎｅ　Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ　Ｃｅ１ｌｓ、”が含まれる。

発明の概要 出願人の発明は、ホスト内に埋め込まれるのに、及び該ホストと免疫学的に適合 性の生物学的材料を実質的に収容するのに適合させた生体適合性材料より作られ たチャンバーであって、壁を有し、膣壁は膣壁を横切る孔を有し、ここに抜孔は 最も狭い点においてもホストの毛細血管が膣壁の厚みを横切るのを許容するに十 分大きく、そしてここに前記孔が、前記ホストの毛細血管がそこに収容される生 物学的材料の生存力を支えることを許容するに十分多数存在するものであるチャ ンバーである。

図面の簡単な説明 図１．　チャンバー内の組織の血管化のために使用されるチャンバーの断面図。

該チャンバーは、外側ハウジング、有孔膜、０−リング・スペーサー及びシール 用リングより構成される。

図２Ａ、大孔チャンバー（７０Ｘ１１０μｍ孔）を埋め込まれたラットの体重変 化。大孔チャンバーを埋め込まれた３匹のラットの個々の体重変化（・、閣、ム ）が、ジャム（ｓｈａｍ）対照（０，Ｎ＝３．平均上平均偏差）及び糖尿病対照 （口、Ｎ＝３．平均上平均偏差）と比較された。糖尿病動物の１匹は３週目に死 亡した。３週後の値は、残っている２匹の糖尿病対照の平均値である。各動物は 、各々２０００個の島を含むチャンバー２個を第０日に埋め込まれた。大孔を形 成するため、膜は３０ゲージ針で破られた（７０Ｘ１１０μｍ孔）。いずれのチ ャンバーも副鳳丸脂肪褥内に埋め込んだ。チャンバーは「１」で示した時に除去 した。

図２Ｂ、無傷の（３μｍ孔）チャンバーを埋め込まれたラットの体重変化。無傷 の膜を埋め込まれた３匹のラットの個々の体重変化が、ジャム（０，Ｎ＝３）及 び糖尿病対照（口、Ｎ＝３）と比較された。動物は、チャンバーが３μｍ孔を含 むこと以外は図２Ａにおけると正確に同じように埋め込みを受けた。

図３．　大孔チャンバー（７０Ｘ１１０μｍ孔）を埋め込まれたラットの非絶食 時血中グルコース濃度。大孔装置埋め込み物を有する３匹の動物の血中グルコー ス濃度が、ジャム（○、Ｎ＝３）及び糖尿病対照（口、Ｎ＝３）動物と比較され ている。

図４．　無傷の（３μｍ孔）チャンバーを埋め込まれたラットの非絶食時血中グ ルコース濃度。３μｍ孔膜を埋め込まれた３匹の動物の血中グルコース濃度が、 ジャム（○、Ｎ＝３）及び糖尿病対照（口、Ｎ＝３）動物と比較されている。

図５．　大孔チャンバー（７０Ｘ１１０μｍ孔）を埋め込まれたラットの腹腔白 糖耐性試験（ＩＰＧＴＴ）。結果は、大孔チャンバーを埋め込まれた３匹の動物 の、埋め込み前（・）、取り出し１週前（ロ）、及び取り出し１週後（ム）にお ける曲線の平均上平均偏差である。

図６．　無傷の（３μｍ孔）膜を埋め込まれたラットの腹腔白糖耐性試験（ｒＰ ＧＴＴ）。結果は、３匹の動物の、埋め込み前（・）、取り出し１週前（ロ）、 及び取り出し１週後（ム）における［Ｐ　ＧＴＴ曲線の平均である。

図７．　大孔チャンバー（７０Ｘ１１０μｍ孔）のヘマトキシリン／エオシン染 色切片。このチャンバーは、４週後に取り呂された。非常に多数の大きい島塊が この大孔チャンバー内に明らかであった。広範な血管系が、島自体の内部に明ら かである毛細血管を以て該組織に侵入していた。同様の結果が７及び９週目に取 り出された装置からも認められた。

図８．　無傷の（３μｍ孔）膜チャンバーのヘマトキシリン／エオシン染色切片 。このチャンバーは４週後に取り出された。膜を取り囲む広範な血管応答にも拘 わらず、２．３の小さな島領域のみがチャンバー内に存在し、無傷の（３μｍ孔 ）チャンバーが島を支えることができないことを示している。

における１４日給仔同系肺組織の光学顕微鏡写真。チャンバー内において良好に 分化し、高度に血管化した組織に注意。この孔サイズはチャンバー内において組 織が大きくなり過ぎるのを防止した。

図１０．　１０乃至１５μｍ孔を有するチャンバー中の２１日間の埋め込み後に おける１４日胎仔同系肺組織の光学顕微鏡写真。装置内において良好に分化し、 高度に血管化した組織に注意。このチャンバーもまた、埋め込まれた組織が大き くなり過ぎるのを防止した。

図１１．　大孔（９０Ｘ１７０μｍ孔）を有するチャンバー中にて副毫丸脂肪褥 内に８日間埋め込まれた後の組換え組織の光学顕微鏡写真。該組換え体は、イン シュリン（Ａ）及びグルカゴン（Ｂ）に対する陽性の免疫細胞化学的染色を示す 。加えて、小管の多数の形態生成及び高度な血管化がある。

図１２．　大孔（９０Ｘ１７０μｍ孔）を有するチャンバー中にて副果丸脂肪褥 内に８日間埋め込まれた後の膵臓原基痕跡の光学顕微鏡写真。膵臓原基痕跡は、 インシュリン（Ａ）及びグルカゴン（Ｂ）陽性細胞、小管状形態生成及び高度な 血管化を示す。

図１３．　埋め込み３日後の別の大孔チャンバー（７０Ｘ１１０μｍ孔）の組織 学的外観。Ｌｅｗｉｓラット中の島約５００個を含んだチャンバーは、動物内で の僅か３日の後にチャンバーの中心を通る大きい血管によって示されるように、 迅速な血管応答を生じた。

図１４．　埋め込み３日後の３μｍチャンバーの組織学的外観。

Ｌｅｗｉｓラット中の島約５００個を含んだ装置は、組織チャンバー内での親密 な血管化応答を欠いていた。

発明の詳細な説明 本発明は、細胞、細胞オルガネラ又は組織を実質的に収容するためのチャンバー である。該チャンバーは、ホスト内への埋め込みに適合させた生体適合性材料で 作られる。チャンバーは、チャンバー壁の全厚みを横切る孔を備えて構成される 。抜孔は、真っ直ぐ又は均一である必要はない。それらは、チャンバーの外部か ら内部への不規則な通路を形成してよい。抜孔は、ホストの毛細血管のチャンバ ー内の細胞又は組織への内方生成とそこから出ることとを許容するに十分大きな 内径を有する。この装置は、ここでは有孔チャンバーと名付ける。このチャンバ ーは、チャンバー内に置かれた生物学的材料の生存力と治療的有効性との双方を ホストの血管系が支えることを許容する。収容された材料の生存力を支えるに十 分の孔をチャンバーの一部が有している限り、チャンバー全体が孔を有する必要 はない。孔のサイズの上限は、具体的用途に応じて変化するであろう。もし生物 学的材料が完全にチャンバー内に収容されていなければならないなら、孔のサイ ズの上限は、該チャンバー内に収容される細胞又は材料のサイズによって決定さ れるであろう。もし完全な収容が必要でないのなら、孔は、実質的に該生物学的 材料を収容するであろういかなるサイズでもよい。もしも材料が毛細血管が通る ことを許容するに必要なよりも小さい孔をも有していても、それはチャンバーの 作動を妨害しないであろう。そのような小さい孔は避ける必要がない。収容され る生物学的材料は、ホスト内に埋め込まれるべきいかなる細胞、細胞の組合せ、 オルガノイド、器官又は組織であってもよい。該生物学的材料は、好ましくはホ ストと免疫学的に適合性である。該チャンバーは、ホスト内に安全に埋め込むこ とのできる、ホストと生物学的適合性のいかなる材料であってもよい。例えば、 本発明において使用するに適した安定な又は半安定過去においては、ホストの血 管系を利用しつつ装置内の組織をホストに埋め込もうとする他の試みは、栄養素 が細胞に十分な速度で利用できなかったために、乏しい細胞生存力を示した。５ ｃｈａｒｐ、　Ｄ。

Ｗ、　ｅｔ　ａｌ、、　”１ｓｌｅｔ　Ｉｍｍｕｎｏ−ｉｓｏｌａｔｉｏｎ：　 Ｔｈｅ　Ｕｓｅ　ｏｆ　Ｈｙｂｒｉｄ　Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　Ｏｒｇａｎｓ　 ｔｏ　Ｐｒｅｖｅｎｔ　ｌ５ｌｅｔ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ＝、　 Ｗｏｒｌｄ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｓｕｒｇｅｒｙ、　Ｖｏｌ、８．ｐｌ）、 ２２１−２２９　（１９８４）を参照。本発明によれば、埋め込み後適当な速度 での栄養素の供給を許容するに十分迅速に十分の毛細血管が形成されるから、孔 のサイズ及び数は早期のそして一貫した細胞の生存力を支えるのに十分である。

本チャンバーは、疾患状態の矯正において組織又は細胞の置換のために使用でき る。疾患状態を矯正するための細胞オルガネラ又は遊離の細胞の同種移植片埋め 込み物は、現在量も一般的には、該細胞が肝臓内に留まることを許容するために 門脈循環中への注入によって実施されている。本発明は、容易にアクセスできる 代わりの埋め込み部位を利用することを許容し、そして必要なときは、該チャン バーは内容物と共に除去されることができる。該チャンバーは、疾患状態を矯正 するために、埋め込まれた組織に対して十分な栄養的支持をホストが供給するこ とを許容する。従って、該チャンバーは、ヒト組織の同種移植のために使用する ことができる。

それはまた、治療的生成物を産生ずるよう遺伝子的に変更された患者自身の細胞 を埋め込むためにも使用することができる。一旦細胞が遺伝子を表現し治療的生 成物を分泌するよう形質転換されたなら、それらの細胞には取り外しつる容器が 望ましい。

このチャンバーはまた、混成の生物人工器官を構成するのに使用することもでき る。該チャンバーは、器官に栄養素が供給され、代謝老廃物が除去されそして該 器官によって作られた治療的生成物がホストへと供給されるよう、ホストが該生 物人工器官に緊密な血管系を供給するのを許容する。

該チャンバーは内側の無傷の細胞保護膜を封入するために使用することができる 。血管要素はチャンバーに貫入しそして封入された細胞が生存し且つ糖尿病動物 を矯正するために機能するよう、十分な栄養素と老廃物の交換を提供する。

該チャンバーはまた、埋め込まれるべきマイクロカプセル化された細胞又はオル ガネラを収容するために使用することもできる。チャンバー内のカプセル化され た組織を埋め込むことによって、迅速な血管化が促進され、該カプセルは、必要 が生じたときの容易な除去のために所定の空間内に収容されるであろう。

本発明の−の具体例においては、次の構成要素が用いられた：有孔膜、膜を保持 するためのハウジング；組織空間を提供するための０−リング；及び生物学的組 織（図１）。該構造的ハウジングは膜を支持し一体性を提供する。好ましい具体 例においては、それはチタンで作られている。しかしながら、テフロン、ポリス チレン及びポリプロピレンのハウジングもまた作られており、ハウジングは代わ りの生物学的適合性の材料からも作られることができる。例えば、約１０乃至２ ５０μｍのような適当な厚みを有する０−リングは、細胞又は組織のための空間 を提供する。典型的には、該０−リングは、シリコンで作られる。尤も、他の生 物学的適合性の材料も使用することができる。

公称ポアサイズ約３μｍを有する膜は、チャンバー内への迅速な血管応答を誘導 することができなかった（図１４）。血管要素は、これらの３μｍ孔膜装置にお いては、埋め込みの３乃至９週後において検出されたが、血管は栓塞しており埋 め込み組織への血流は不十分であった。これは、糖尿病動物を矯正することので きなかった３μｍ孔膜装置中の埋め込まれた島によって示された（ｌ１１２ｂ、 ４．６、及び８）。従って、十分な血管応答を誘導するための公称ポアサイズの 下限は、約３μｍより大きい。５乃至１５μｍの公称ポアサイズを有する膜は、 迅速な血管応答を誘導した（図９及び１０）。９０Ｘ１７０μｍまでの孔が応答 を誘導した（図７．１１．１２、及び１３）。

代わりのチャンバー形態もまた可能である。これらには、チャンバー内に細胞付 着用の足場を含めること；チャンバー内に細胞要素を封入した無傷の免疫防護膜 を備えること；装置内のマイクロカプセル化された組織を使用すること；膜を一 緒にシールして／Ｎウジングの必要をなくす材料で０−リングを作ること；埋め 込まれた組織に追加の空間を提供するための重ねられた膜の束：装置を中空繊維 の形とすること；又は超音波溶接のような技術によってハウジングを要しないよ う膜をシールすることが含まれるが、これらに限定さ該チャンバーの糖尿病を矯 正する能力をモニターするために、糖尿病Ｌｅｗｉｓラットに、単離された同系 の島を収容した大孔膜又は無傷の膜装置を埋め込んだ。埋め込まれた動物は、ジ ャム手術された対照動物及び糖尿病対照動物と比較された。

膜の製造及び装置の記述 試験膜（ポリエステル繊維の裏打ちを備えたテフロン膜、有効公称ポアサイズ３ ．０　μｍ５Ｇｏｒｅ０３μｍテフロン＃Ｌ１０９５６）のディスクを、順次Ｆ ｒｅｏｎ−ＴＥ３５で３０乃至６０分間洗浄し、エタノールを数回交換し、次い でエタノール中に４５分間浸漬した。滅菌食塩水（０．９％ＮａＣ１）で洗浄し てエタノールを除去した。膜を培養培地（ＲＰＭ［１６４０＋１０％胎仔牛血清 （ＦＢＳ））ニ移し、３７°ｃのｃＯｚインキコベーター中に置いた。膜の半数 を無傷で残しく３μｍ孔）、半数を３０Ｇの無菌針で２４回穿孔した（大孔膜、 ポアサイズ７０×１１０μｍ）。島を保持するための装置は、１２０μｍ厚の０ −リングによって分離された２枚の試験膜ディスクに密着した摩擦蓋を有するチ タンチャンバーよりなった（図１）。チタンチャンバー及びシリコン０−リング はエタノールに浸漬することにより滅菌され、使用前に滅菌食塩水で濯がれた。

糖尿病の惹起 糖尿病は、９０％の膵切除（Ｐｘ）に続き、膵切除後３乃至１０日に尾静脈より ６０ｍｇ／ｋｇ体重のストレプトシトシン（Ｓｔｚ）を静脈注射することによっ て惹起した。

成体ラットの島の単離 同系Ｌｅｗｉｓラットからの島が埋め込みに使用された。屠殺後、無菌的条件下 に、総胆管にカニユーレを入れ膵臓を１０ｍｊ７のＨａｎｋ’　ｓ平衡塩類溶液 （ＨＢＳＳ）で膨らませた。膨らんだ膵臓を除去し、清浄化しそして細切した。

細切された組織を、膵臓当たり１０ｍｇのコラゲナーゼ（Ｖ型、Ｓｉｇｍａ）で ３９℃の水浴中にて消化した。水冷ＨＢＳＳで消化を停止させ、内容物をＨＢＳ Ｓで３回洗浄した。２９％、２６％、２３％、及び２０％の牛血清アルブミン（ ＢＳＡ）段階勾配中における遠心によって、島を腺傍細胞及び大部分の導管組織 から分離した。１０％胎仔牛血清を含んだＲＰＭ［１６４０培地で島を洗浄し、 空気１５％ＣＯを中３７°Ｃにて埋め込み前３乃至７日間培養を行った。

装置の埋め込み 装置に負荷するために島を培養プレートから手で摘んだ。１０μ！の高懸濁液（ 島約２０００個）を各試験装置に負荷した。各動物は２個の装置を埋め込まれた （島計４０００個）。動物をキシラジン（ｘｙｌａｚｉｎｅ）　（５ｍ　ｇ　／ 　ｋ　ｇ　）及びケタミン（６５ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、その副毫丸脂肪褥を小 さい下腹部切開を通じて単離した。

各脂肪褥に１個の装置を置き、脂肪褥で覆った。装置は、Ｎｅｘａｂａｎｄ（Ｃ ＲＸ　Ｍｅｄｉｃａｌ、　ｔｎｃ、）組織接着剤でその位置に保持した。腹筋は 縫合（４−０ガツト）によって、皮膚はステンレススチールの傷クリップ動物の 機能状態を次のパラメーターをモニターすることにより評価した：体重の変化、 非絶食時血糖、腹腔白糖耐性、及び屠殺時における埋め込み物及び膵臓残遺物の 組織学。定期的な非絶食時血糖レベルは、尾静脈穿刺により得られた血液中にて ＥｘａｃＴｅｃｈ”　ＢｌｏｏｄＧｌｕｃｏｓｅ　Ｍｅｔｅｒ　（Ｍｅｄｉｓｅ ｎｓｅ）によって評価した。ＥｘａｃＴｅｃｈ”　ＢｌｏｏｄＧｌｕｃｏｓｅ　 Ｍｅｔｅｒの検出上限は４５０ｍｇ／ｄＩ！である。４５０ｍｇ／ｄｉとして報 告した値は、正確な血糖濃度の最低予測である。腹腔白糖耐性試験（ＩＰ　ＧＴ Ｔ）は、終夜絶食、グルコース（２０％グルコース溶液からの２ｇ／ｋｇ体重） の腹腔内注射及び、０（注射前）、１０．３０．５０、及び９０分における血糖 測定よりなる。体重は、試験を通してモニターした。

装置の除去 装置は、埋め込みの４．７及び９週後に取り出された。取り出しは、副曇丸脂肪 褥の単離、絹の縫合糸による結紮及び装置の取り出しよりなった。装置は、組織 学用に、一つはグルタルアルデヒドで、他はＢｏｕｉｎ’　ｓ固定液で固定した 。取り出し後、矯正を示していた動物における糖尿病状態への反転を評価するた めに、非絶食時血糖レベル、絶食時［Ｐ　ＧＴＴ及び体重をモニターした。反転 が確立された後、動物を層殺し、膵臓残遺物を除去して組織学的検索のためにＢ Ｏｕｉｎ’ｓで固定した。

４群（群当たりＮ＝３）の動物をモニターした。すなわち、ジャム手術対照、糖 尿病対照、大孔膜チャンバー塩め込み（７０Ｘ１１０μｍ孔）及び無傷膜チャン バー塩め込み（３μｍ孔）である。

体重変化 大孔膜チャンバーを埋め込まれた３匹の動物はいずれも、埋め込みの期間中、ジ ャム対照と同等又はそれ以上の速度の体重増加をみた（図２Ａ）。対照的に、無 傷膜チャンバーを埋め込まれた３匹の動物のうち１匹のみが対照ラットと同等の 体重の増加をみた（図２Ｂ）。糖尿病対照動物は、体重を増加することができな かった。

非絶食時血糖 大孔チャンバー埋め込み物は、３匹の動物全てにおいて非絶食時血糖レベルを対 照レベルまで低下させた（図３）。３匹の動物全てにおいて、装置の取り出し後 、血糖は急速に糖尿病レベルへと上昇した。無傷膜チャンバーを埋め込まれた動 物は、埋め込み後非絶食時血糖において僅かな且つ不規則な低下を示したに過ぎ ない（図４）。どの例においてもジャム値までへの低下はなかった。実際、血糖 は糖尿病レベルに留まっていた。

腹腔白糖耐性試験（ｒＰＧＴＴ） 大孔埋め込み物中の島は、糖負荷に対するそれらの急速な応答によって示される ように（図５）、機能的に無傷であった。動物内の大孔埋め込み物によって、そ れらのＩＰ　ＧＴＴ曲線は、ジャム対照曲線と同一であった。しかしながら、埋 め込み前及び取り出し後においては、それらの［Ｐ　ＧＴＴ曲線は糖尿病曲線と 区別がつかなかった。対照的に、無傷膜埋め込み物は、限定的な機能を示したに 過ぎない（大孔チャンバーは、多数の良好に血管化された島を含んでいた（図７ ）。毛細血管が島自身の内部に検出された。無傷膜埋め込み物もまた、チャンバ ーの内側及び外側の双方で良好に血管化されていたが、装置内に大きい血液の島 が形成されており、これは自由に流れる血液の欠乏を示している。加えて、チャ ンバー内には少数の島しか見出されなかった（図８）。糖尿病動物内の残りの膵 臓は、疎らな、ひどく損傷を受けた島残遺物を含んでいる過ぎなかった。

体重変化、非絶食時血糖レベル、ｒＰ　ＧＴＴ及び組織学は、大孔埋め込み物が これら３匹の動物の糖尿病を矯正したことを実証している。同じパラメーターは 、無傷膜埋め込み物が、限定された機能のみを有し、無傷埋め込み物を有する３ 匹の動物の糖尿病状態を矯正しなかったことを示している。チャンバーがチャン バーの大孔を通して島の血管化を許容することから、大孔チャンバーにおいては 島は機能的状態に維持された。

実施例２ ポリエステルの裏打ちを有するＧｏｒｅ＠　５μｍテフロン（＃Ｘ１２０３９） 膜及びＧｏｒｅ＠　１０乃至１５μｍテフロン（＃Ｘ１２２９９）膜中における 胎仔肺組織の埋め込み。

妊娠１４４日目肺組織を単離し、約１ｍｍ’の切片に細切し、ＤＭＥＭ、２０％ ＦＢＳで洗浄しそしてチタンチャンバー内に置いた。この実験のために用いた膜 は、５又は１０乃至１５μｍの公称ポアサイズを育するテフロンであった。装置 は副棗丸脂肪褥内に置かれ、動物内に２１日間残され次いで取り出された。組織 は２．５％グルタルアルデヒドで固定し、組織学的検索のために処理された。

５μｍ公称ポアサイズを有する膜は、胎仔肺組織が分化し成熟するのを許容し、 収容されている組織への有意な血管化応答が明らかであった（図９）。無傷５μ ｍ孔膜によって組織が装置内部に収容されており孔から外へは成長しなかったこ とに注意。

１０乃至１５μｍの公称ボアを有する膜もまた、埋め込まれた組織の完全な分化 及び成熟を許容した（図１０）。ここでもまた、組織はチャンバー内部に収容さ れており良好に血管化されていた。

実施例３ 胎仔膵臓芽（ｐａｎｃｒｅａｔｉｅ　ｂｕｄｓ）並びに胎仔間葉と成体の管上皮 との組織組み換え体の埋め込み。

胃間葉組織及び膵臓原基痕跡は妊娠１４日のＬｅｗｉｓラットより単離し、大膵 管上皮は成体しｅ＊ｉｓラットより単離した。組換え体は、単離された管上皮を 組織チャンバー装置内において胎仔間葉の切片上に注意深くピペットすることに よって形成した。これらの実験に用いた膜は、上側膜に大孔（９０Ｘ１７０μｍ ）を形成するために２６ゲージ針で２４回刺通した０、４５μｍ孔テフロン（Ｍ ｉｌｌｉｐｏｒｅ、　ＣＭ）であった。下側膜は無傷で残した。

該組織チャンバー装置を、成体雄性１ｅｗｉｓラットの副畢丸脂肪褥に埋め込ん だ。副塞丸脂肪褥を陰茎の直ぐ前の中程度の切開を通して引き、食塩水で濡らし た無菌のガーゼ上に置いた。チャンバーを脂肪褥上に置き、組織接着剤によりチ タンリングを脂肪褥に接着した。

組換え体（Ｎ＝１０）及び膵臓原基痕跡（Ｎ＝　６　）を８日間又は６乃至１２ 週間埋め込んだ。Ｌｅｗｉｓラットからチャンバーを取り出しＢｏｕｉｎ’　ｓ で固定した。処理の後、切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色しそして適切 な場合にはインシュリン及びグルカゴンのために免疫細胞化学的に染色を行った 。

組換え組織は、無傷の膵臓のものに近似した小管の形成によって明らかなように 、有意な組織発生を示した。インシュリン及びグルカゴンに対して免疫陽性の細 胞が、埋め込み８日後に検出され（図１１）、分化が起こったことを示している 。６乃至１２週後に取り出された組織においても、類似の形態生成が明らかであ った。内分泌組織もまた、埋め込み８日後にインシュリン及びグルカゴンに対す る免疫染色によって明らかにされたように、膵臓原基痕跡において分化した（図 １２）。金側において、埋め込まれた組織は良好に血管化されていた。従って、 大孔チャンバーは、実質的なホストの血管化のために、胎仔組織の成長、形態生 成及び分化を支持する二人孔チャンバー（７０Ｘ１１０μｍ孔）における単離さ れた島の迅速な血管化。

この実験に使用した膜は、無傷のままか又は７０Ｘ１１０μｍ孔をあけた３μｍ 公称ボアのテフロン膜（Ｇｏｒｅ■３μｍテフロン＃Ｌ１０９５６）であった。

正常成体Ｌｅｗｉｓラットより単離された約５００個の膵臓島を、各形態のチャ ンバー内に置いた（各群Ｎ＝２）。チャンバーを正常Ｌｅｗｉｓラットの副栗丸 脂肪褥内に埋め込み、３日後に取り出して組織学的に検索した。

大孔膜チャンバーの埋め込み後３日目に、血管がチャンバー内部を通って埋め込 まれた島の周りに侵入していることが検出された（図１３）。対照的に、３μｍ 孔チャンバー内に埋め込まれた島は、埋め込み後３日目の時点では血管化される ことができなかった（図１４）。

ここに記述した目下好ましい具体例に対する種々の変更及び修正が当業者に明ら かであろうということは理解されなければならない。そのような変更及び修正は 、本発明の精神及び範囲から外れることなく且つ伴う利益を減することなく行う ことができる。従って、そのような変更及び修正は、添付の請求の範囲に包含さ れることが意図されている。

’　ＦＩＧ、　２Ａ 日 日 日 日 ＦＩＧ、　５ ＦＩＧ、　６ 分 ＦＩＧ、　７ ＦＩＧ、　８ ＦＩＧ、　９ ＦＩＧ、　１０ ＦＩＧ、　ＩＩＡ ＦＩＧ、ＩＩＢ ＦＩＧ、　１２Ａ ＦＩＧ、　１２８ ＦＩＧ、　１３ ＦＩＧ、　１４ 国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　ブローカー、ジェイムス、エイチアメリカ合衆国６００３３イ リノイ、バーバード、マレンゴロード　３０７

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．生体適合性の材料で作られたチャンバーであって、（ａ）ホスト内に埋め込 まれるのに適合し、（ｂ）ホストと免疫学的に適合性の生物学的材料を実質的に 収容するに適合し、 （ｃ）壁を有し、 （ｄ）最も狭い点においても機能的なホストの毛細血管が壁の厚みを横切るのを 許容するに十分大きい内径を有するものである、該壁を横切る孔を有し、そして （ｅ）ここに前記孔が、収容された生物学的材料の生存力を前記ホストの毛細血 管が支持するのを許容するに十分多数あるものであるチャンバー。
2. ２．最も狭い点における内径が約３μｍより大きいものである、請求項１に記載 のチャンバー。
3. ３．最も狭い点における内径が、ホストに埋め込まれたとき生物学的材料が実質 的にチャンバー内に収容されるに十分小さいものである、請求項１に記載のチャ ンバー。
4. ４．該生体適合性の材料がテフロンである、請求項１に記載のチャンバー。
5. ５．中空繊維の形態である、請求項１に記載のチャンバー。
6. ６．生きた細胞を収容した、請求項１に記載のチャンバー。
7. ７．該生きた細胞が治療的生成物を分泌することのできるものである、請求項６ に記載のチャンバー。
8. ８．該生きた細胞が、脳下垂体細胞、膵臓島細胞、膵臓β細胞、甲状腺細胞、上 皮小体細胞、又は副腎髄質細胞である、請求項６に記載のチャンバー。
9. ９．該生きた細胞が成長ホルモン分泌細胞、第ＶＩＩＩ因子分泌細胞又は第ＩＸ 因子分泌細胞である、請求項７に記載のチャンバー。
10. １０．該チャンバーの内容物にアクセスするためのインプット及びアウトプット ポートを有するものである、請求項１に記載のチャンバー。
11. １１．該生きた細胞がマイクロカプセル化されているものである、請求項６に記 載のチャンバー。
12. １２．細胞がその上に接着して成長するものであるマトリクスを収容した、請求 項１に記載のチャンバー。
13. １３．該ホストと免疫学的に適合性である該生物学的材料が免疫隔離性の膜内に 収容された同種移植片又は異種移植片である、請求項１に記載のチャンバー。
14. １４．請求項６のチャンバーをホストに埋め込むことよりなる方法。
15. １５．請求項７のチャンバーをホストに埋め込むことよりなる方法。
16. １６．請求項１３のチャンバーをホストに埋め込むことよりなる方法。