JPH0643137A

JPH0643137A - キャピラリ電気泳動用カラム

Info

Publication number: JPH0643137A
Application number: JP4196739A
Authority: JP
Inventors: Masako Mizuno; 昌子水野; Kenji Tochigi; 憲治栃木
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1992-07-23
Filing date: 1992-07-23
Publication date: 1994-02-18

Abstract

(57)【要約】【目的】蛋白などが吸着しにくく、高分離かつ高信頼性
分析が可能な電気泳動用キャピラリカラムを提供する。【構成】フューズドシリカチューブの内壁面に一定の厚
さを有する親水性ポリマから成る固定相を形成させたキ
ャピラリ電気泳動カラムにおいて、固定相の厚さを１０
〜１００ｎｍ、架橋剤の濃度を５〜１０％にコントロー
ルすることにより、蛋白などが吸着しにくいキャピラリ
カラムを得る。【効果】高分離でかつ再現性の良い分析が可能になる。
キャピラリの長寿命化を図れる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はキャピラリ電気泳動装置
の分離管として用いられるキャピラリ電気泳動用カラム
に関する。

【０００２】

【従来の技術】キャピラリ電気泳動用カラムは、たとえ
ばフューズドシリカからなる内径２０〜１００μｍ程度
のチューブが用いられている。内壁面にコーティングを
していないフューズドシリカチューブから成るカラムで
は、蛋白などがキャピラリの内壁面に吸着しやすいとい
う問題があった。キャピラリの内壁面に蛋白が吸着する
と、分離能が低下する、ピークの対称性が悪くなる、泳
動時間の再現性が悪くなるなどの問題があった。また、
一度、蛋白が吸着すると、洗浄しても簡単には脱離せ
ず、結果的にキャピラリカラムが使用不可能になるとい
う問題があった。

【０００３】内壁をコーティングしたキャピラリカラム
として、メチルシリコンやアルキルシラン化合物をコー
ティングしたキャピラリカラムが報告されている（各々
特開昭63−210766号及び特開昭63−210767号公報）。し
かし、このような疎水性物質をコーティングしたキャピ
ラリカラムは、界面動電クロマトグラフィー用キャピラ
リカラムとしては使用できるが、疎水性の強い蛋白の分
析には使用できないという問題があった。

【０００４】また、G.J.M.Bruin らはフューズドシリカ
キャピラリの内壁を水酸化カリウム(ＫＯＨ)で処理して
シラノール基(−ＳｉＯＨ)を出した後、シリル化剤であ
るγ−グリシドキシプロピルトリメトキシシランを作用
させた後、ポリエチレングリコールを作用させてコーテ
ッドキャピラリを作製している（J. of Chromatogr.,４
７１，４２９（１９８９））。このようにシリル化剤を
介してポリエチレングリコールをコーティングした場
合、完全にはシラノール基がカバーされていなかった
り、加水分解により、シラノール基とシリル化剤との結
合が切れやすいという問題があった。また、ポリエチレ
ングリコール分子を架橋していないので、耐溶媒性の点
で問題があった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記従来技術は分離
能，測定値の再現性，キャピラリの寿命などの点で問題
があった。

【０００６】本発明の目的は、内壁面にタンパクなどが
吸着しにくくて、分離能に優れ、測定値の再現性が良い
キャピラリカラムを提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
の本発明の特徴は、固定相の厚さが１０〜１００μｍ、
架橋剤の添加濃度が固定相形成剤の５〜１０％になるよ
うに親水性ポリマからなる固定相を形成させたキャピラ
リ電気泳動用カラムを用いることにある。

【０００８】また、固定相の厚さが１０〜１００μｍ、
架橋度（溶媒洗浄前のキャピラリ電気泳動カラムを用い
てガスクロマトグラフィで測定した特定成分のキャパシ
ティファクタをｋ₁とし、溶媒洗浄後のキャピラリ電気
泳動カラムを用いてガスクロマトグラフィで測定した特
定成分のキャパシティファクタをｋ₂とし、ｋ₂／ｋ₁×
１００と架橋度と定義する）が５０〜８０％になるよう
に固定相を形成させたキャピラリ電気泳動用カラムを用
いることにある。

【０００９】さらに、固定相が分子量５０００〜２００
００のポリエチレングリコール、架橋剤が過酸化物であ
るキャピラリ電気泳動用カラムを用いることにある。

【００１０】

【作用】本発明では、キャピラリの内壁に形成させる固
定相の厚さや架橋剤の濃度、架橋度などをコントロール
することにより、蛋白のキャピラリ内壁への吸着を防
ぎ、蛋白を高分離でかつ再現性良くキャピラリ電気泳動
分析することを可能にした。

【００１１】

【実施例】以下、本発明の実施例を図面を用いて説明す
る。

【００１２】本発明のキャピラリは、外側にポリイミド
やアクリル系の樹脂がコーティングされた、内径１０〜
１００μｍのフューズドシリカ製キャピラリチューブが
用いられる。

【００１３】固定相形成用物質は、ポリエチレングリコ
ールなどの親水性ポリマが用いられる。架橋剤は、過酸
化ジクミル，過酸化ベンゾイルなどの過酸化物が用いら
れる。固定相形成用物質及び架橋剤を溶解させるための
溶媒は、塩化メチレン，ｎ−ペンタン，ジエチルエーテ
ル，メタノール，クロロホルムおよびこれらの混合溶媒
が用いられる。

【００１４】キャピラリの内壁への高分子膜の形成は以
下のように行った。溶媒に溶かした固定相形成用ポリマ
及び架橋剤を含む溶液をガス圧でキャピラリ内に充填
後、キャピラリの片端を封じ、キャピラリを一定温度の
恒温槽に送りこみ、恒温槽内でキャピラリを巻き取る。
この操作の間に、溶媒のみが揮発し、キャピラリの内壁
に固定相と架橋剤が残る。次に、キャピラリを恒温槽内
で、キャピラリ内にＨｅガスを流しながら、徐々に温度
を上げながら加熱し、ある一定温度で一定時間加熱し、
架橋反応を行わせる。その後、さらに温度を上げて加熱
し、未反応の架橋剤や副生成物を除去する。その後、恒
温槽のヒータを切り、恒温槽が室温になるまでキャピラ
リ内にＨｅガスを流す。

【００１５】このような方法でキャピラリの内壁に固定
相を形成させる場合、固定相の厚さは固定相形成用ポリ
マ溶液の濃度を変化させることにより、コントロールで
き、コーティングされる固定相の厚さは次式で示され
る。

【００１６】

【数１】

【００１７】ここで、ｄ：高分子膜の厚さ（μｍ）、
ａ：キャピラリの半径（μｍ）、ｃ：固定相形成用ポリ
マ溶液の濃度（ｗ／ｖ％）、ρ：固定相形成用ポリマの
比重（ｇ／ｍｌ）である。

【００１８】架橋度は以下のようにして求めた。まず、
先に述べた方法で固定相を形成させたキャピラリを用い
て、ガスクロマトグラフィによりクロマトグラムを測定
し、特定成分のキャパシティファクタｋ₁を求める。次
に、キャピラリを塩化メチレンなどの溶媒で洗浄し、乾
燥させたキャピラリを用いて、同様にクロマトグラムを
測定し、特定成分のキャパシティファクタｋ₂を求め
る。これらの値を用い、次式により、架橋度を求める。

【００１９】

【数２】

【００２０】ここで、ｋ₁：溶媒による洗浄前のキャパ
シティファクタ、ｋ₂：溶媒による洗浄後のキャパシテ
ィファクタである。また、キャパシティファクタｋは次
式より求めた。

【００２１】

【数３】

【００２２】ここで、ｔは特定成分の保持時間、ｔ₀は
溶媒ピークの溶出する時間である。〈実施例１〉キャピラリには、内径５０μｍ、外形３７
５μｍのフューズドシリカ製のキャピラリチューブを用
いた。まず、５ｍの長さのキャピラリに上述した方法で
内壁に固定相を形成させ、ガスクロマトグラフにより、
架橋度を測定した。その後、キャピラリを６０cmずつに
切り、キャピラリ電気泳動にて性能を評価した。固定相
には平均分子量二万のポリエチレングリコール（ＰＥ
Ｇ）を、架橋剤には過酸化ジクミル（ＤＣＰ）を用い
た。ＰＥＧ及びＤＣＰを溶解させる溶媒には塩化メチレ
ンを用いた。

【００２３】まず、固定相の厚さが一定で、架橋度が異
なるキャピラリを作製するため、架橋剤の濃度を変化さ
せて固定相を形成させた。なお、固定相の厚さは５０ｎ
ｍになるように、ＰＥＧ０.３８４ｇを塩化メチレン８
０ｍｌに溶解させた。ＤＣＰはＰＥＧの濃度の０〜２５
％になるように添加して、固定相を形成させ、ＤＣＰの
添加量と架橋度との関係について調べた。なお、ガスク
ロマトグラフによる架橋度測定の条件は以下のとおりで
ある。温度：１２０℃、流速：２０cm／ｓ、試料：５０
００ppm ２，６−ジメチルアニリン（溶媒：塩化メチレ
ン）。

【００２４】図１にＤＣＰの濃度と架橋度との関係を示
す。ＤＣＰの添加量が多いほど、架橋度の値が大きい
が、両者は直線関係にはなかった。架橋度は固定相形成
用ポリマの分子量，置換基の種類や量，固定相形成時の
測定条件などにより変化するので、固定相形成用ポリマ
と架橋剤の混合比と、実際に架橋した割合の両方でモニ
タするのが望ましい。

【００２５】次に、これらのキャピラリの性能をキャピ
ラリ電気泳動にて評価した。図２に用いた装置の構成を
示す。

【００２６】キャピラリ３の片端をバッファ１に、もう
一方の端をＵＶ検出器５を経て、バッファ２に浸し、キ
ャピラリ内をバッファで満たす。バッファ１及び２に各
々電極８及び９を浸し、高圧電源４を用いてキャピラリ
の両端に電圧を印加する。キャピラリの片端（バッファ
１側、ここではプラス極）より、落差法にて試料を注入
した後、高圧電源４によりキャピラリの両端に電圧を印
加する。電圧を印加すると、試料中の各成分はその電荷
に応じてキャピラリ内をマイナス極側（バッファ２側）
に移動する（電荷の大きさにより、移動速度が異な
る）。検出器５は液体クロマトグラフィ用のＵＶ検出器
のセルの部分を改良したものを用いた。キャピラリの一
部分のポリイミド層を紫外線が吸収されるように剥離
し、オンラインで検出した。検出部６に重水素ランプか
らの光を入射させて吸光度を測定し、データプロセッサ
７でモニタした。なお、測定毎にバッファでキャピラリ
内を洗浄した。

【００２７】架橋度を変化させて作成したキャピラリの
性能を図２のキャピラリ電気泳動装置にて評価した。以
下に示すような条件にてエレクトロフェログラムを測定
し、ピークの理論段数（ピークのシャープさの指標，値
が大きい程ピークがシャープで分離が良いことを示す）
を比較した。

【００２８】キャピラリの長さ：６０cm（試料注入部〜
検出部：３０cm）印加電圧：１５ｋＶ検出波長：２１０ｎｍ測定温度：２５℃ バッファ：３０ｍＭＫＨ₂ＰＯ₄，ｐＨ３.８試料：０.５ｍｇ／ｍｌチトクロームＣ，リゾチーム
（標準蛋白）図３に、ＤＣＰ濃度と理論段数との関係を示した。ＤＣ
Ｐ濃度が５〜１０％のときに最もよいＮが得られた。Ｄ
ＣＰ濃度１５％以上ではＮがわずかではあるが低下し
た。

【００２９】図４に、ＤＣＰ濃度とピークの非対称性の
指標であるアスシンメトリファクタとの関係を示し
た。ＤＣＰ濃度１５％以上ではピークのテーリングがみ
られ、ピークの非対称性が大きくなった。

【００３０】図３及び図４より、ＤＣＰ濃度としては、
Ｎ及びピークの対称性が良い５〜１０％が適していると
考えられる。ＤＣＰ濃度５〜１０％は図１より架橋度５
０〜８０％に相当する。ＤＣＰの添加濃度が変化すると
（それに伴い架橋度が変化する）、Ｎやピークの対称性
が変化するのは、ポリマ分子の網目の大きさが変わり、
試料の拡散速度が変わるためと考えられる。

【００３１】図５に、ＤＣＰ濃度と測定回数との関係を
示した。ＤＣＰ濃度５〜１０％では繰り返し１５０回以
上測定することができた。しかし、それ以外の領域では
ピークがブロードになってＮが低下したり、泳動時間が
徐々に長くなったりした。これはキャピラリ内壁に設け
た固定相に蛋白が吸着したり、固定相が徐々に溶け出し
たりしたためである。

【００３２】〈実施例２〉キャピラリ，固定相剤及び架
橋剤は実施例１と同じものを用い、架橋度が一定で、固
定相の厚さを変化させてコーテッドキャピラリを作製し
た。ＰＥＧの濃度は、固定相の厚さが２ｎｍ〜２００ｎ
ｍになるように調製した。ＤＣＰ濃度はＰＥＧの５％と
した。この場合、架橋度は約５０％になった。実施例１
と同様の方法でキャピラリの内壁に固定相を形成させた
後、キャピラリ電気泳動装置（図２）にてキャピラリの
性能を評価した。

【００３３】図６に、固定相の厚さと理論段数との関係
を示した。測定条件は実施例１に従った。固定相の厚さ
が１０ｎｍより小さい場合には、理論段数が減少した。
その理由としては、シラノール基が完全にはカバーされ
ておらず、試料がシラノール基に吸着するためと考えら
れる。また、固定相の厚さが１００ｎｍよりも大きい場
合には、理論段数の低下がみられた。その理由として、
固定相が厚く、試料が固定相と相互作用を行うためと考
えられる。また、固定相の厚さ２００ｎｍ以上のキャピ
ラリでは気泡が発生しやすく、安定性の点でも問題があ
った。

【００３４】〈実施例３〉図７に本発明のキャピラリを
用いて、標準タンパクの混合物（チトクロームＣ，リゾ
チーム）を分析したエレクトロフェログラムの一例を示
した。測定条件は以下のとおりである。

【００３５】キャピラリ：内径；５０μｍ、外径；３７
５μｍ長さ；６０cm（試料注入部〜検出部：３０cm）固定相；ＰＥＧ架橋剤；ＤＣＰＤＣＰ濃度；ＰＥＧの５％（架橋度；約５０％）固定相の厚さ；５０ｎｍ印加電圧：１５ｋＶ検出波長：２１０ｎｍ測定温度：２５℃ バッファ：３０ｍＭりん酸カリウム緩衝液，ｐＨ３.
８試料：標準タンパク２成分の混合物、各々０.５ｍｇ／
ｍｌチトクロームＣ（分子量；１２，４００、等電点；１
０.７）リゾチーム（分子量；１４，１００、等電点；１
１.１）また、図８に比較例として、ノンコーテッドキャピラリ
を用いて標準タンパクの混合物（チトクロームＣ，リゾ
チーム）を分析したエレクトロフェログラムの一例を示
した。キャピラリのサイズや測定条件は図７の場合と同
じである。

【００３６】図７及び図８において、ピーク１０はチト
クロームＣ，ピーク１１はリゾチームを示す。図７に示
したように、本発明のキャピラリカラムでは、チトクロ
ームＣとリゾチームとを良好に分離することができた。
また、不純物ピークもきちんと分離されていた。一方、
ノンコーテッドのキャピラリカラムでは、ピークがブロ
ードであり、ピークの対称性もあまり良くなかった（図
８）。

【００３７】本実施例のキャピラリカラムでは、蛋白の
吸着を防止できるので、蛋白のようにノンコーテッドキ
ャピラリでは吸着しやすい成分も、良好に分離すること
ができる。また、再現性や安定性（寿命）の点でも優れ
ている。

【００３８】

【発明の効果】本発明によれば、内壁面に蛋白などが吸
着しにくくて、寿命が長く、高分離で、かつ再現性良く
蛋白などを分析できるキャピラリーカラムを提供でき
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】ジクミルパーオキサイド（架橋剤）の濃度と架
橋度との関係を示す特性図。

【図２】キャピラリ電気泳動の装置の構成を示すブロッ
ク図。

【図３】ジクミルパーオキサイド（架橋剤）の濃度と分
離能（理論段数）との関係を示す特性図。

【図４】ジクミルパーオキサイド（架橋剤）の濃度とピ
ークの非対称性との関係を示す特性図。

【図５】ジクミルパーオキサイド（架橋剤）の濃度と測
定回数との関係を示す特性図。

【図６】固定相の厚さと分離能（理論段数）との関係を
示す特性図。

【図７】本発明のキャピラリにより得られたエレクトロ
フェログラムの一例の説明図。

【図８】比較例のノンコーテッドキャピラリにより得ら
れたエレクトロフェログラムの一例の説明図。

【符号の説明】

１，２…バッファ、３…キャピラリカラム、４…高圧電
源、５…ＵＶ検出器。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】フューズドシリカチューブの内壁面に一定
の厚さを有する親水性ポリマからなる固定相を形成させ
たキャピラリ電気泳動用カラムにおいて、前記固定相の
厚さが１０〜１００μｍ、架橋剤の添加濃度が固定相形
成剤の５〜１０％であることを特徴とするキャピラリ電
気泳動用カラム。
【請求項２】フューズドシリカチューブの内壁面に一定
の厚さを有する親水性ポリマからなる固定相を形成させ
たキャピラリ電気用カラムにおいて、固定相の厚さが１
０〜１００μｍ、架橋度が５０〜８０％であることを特
徴とするキャピラリ電気泳動用カラム。
【請求項３】請求項１または請求項２において、親水性
ポリマがポリエチレングリコールであるキャピラリ電気
泳動用カラム。
【請求項４】請求項３において、ポリエチレングリコー
ルの分子量が５０００〜２００００であるキャピラリ電
気泳動用カラム。
【請求項５】請求項１または請求項２において、架橋剤
が過酸化物であるキャピラリ電気泳動用カラム。