JPH0638765A - Dna fragment capable of coding non-a, non-b hepatitis virus structural protein - Google Patents

Dna fragment capable of coding non-a, non-b hepatitis virus structural protein

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JPH0638765A
JPH0638765A JP2413844A JP41384490A JPH0638765A JP H0638765 A JPH0638765 A JP H0638765A JP 2413844 A JP2413844 A JP 2413844A JP 41384490 A JP41384490 A JP 41384490A JP H0638765 A JPH0638765 A JP H0638765A
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Abstract

PURPOSE:To provide the subject new DNA fragment coding a polypeptide useful for diagnosis of non-A, non-B hepatitis excellent in accuracy of judgment. CONSTITUTION:This invention is a DNA fragment obtained by collecting non-A, non-B hepatitis virus RNA directly from the plasma of a non-A, non-B hepatitis patient and modifying the collected RNA according to the genetic engineering method, containing a base sequence capable of coding a polypeptide constituting non-A, non-B hepatitis virus structural protein and having an amino acid sequence of, e.g. the formula. From the fresh plasma of a Japanese chronic non-A, non-B hepatitis patient infected only with group II, all the RNAs including non-A, non-B hepatitis virus RNA are collected using ELISA method and PCR method and cDNA is synthesized according to random primer method. The resultant cDNA is introduced in lambda phage so as to construct a cDNA library. The obtained cDNA library is subjected to immunoscreening using the above- mentioned plasma of the hepatitis patient and cDNA library constructed from plural patient plasmas is screened by using the resultant DNA fragment as a probe, thus affording the objective cDNA specific to the above-mentioned hepatitis.

Description

【発明の詳細な説明】Detailed Description of the Invention

【産業上の利用分野】本発明は、非A非B型肝炎ウイル
ス構造蛋白質の構成ポリペプチドをコードする新規なD
NA断片、該DNA断片を含む発現ベクター、該発現ベ
クターによって形質転換された形質転換体、並びに該形
質転換体を培養して得られる発現ポリペプチド及びその
製造方法に関する。
The present invention relates to a novel D encoding a constituent polypeptide of a non-A non-B hepatitis virus structural protein.
The present invention relates to an NA fragment, an expression vector containing the DNA fragment, a transformant transformed with the expression vector, an expression polypeptide obtained by culturing the transformant, and a method for producing the same.

【従来の技術】非A非B型肝炎は、ウイルス性の伝染性
肝炎と考えられており、慢性化しやすく、肝硬変、肝癌
へ移行する率が高いことから、社会的に問題となってい
る。しかしながら患者あるいは健康キャリアー体内での
ウイルス発現量が少ないこと、また感染性ウイルスが同
定されておらず、原因ウイルスが1種なのかあるいは2
種以上存在するのかも分かっていないことなどからその
確定診断は、非常に困難である。現在まで非A非B型肝
炎の診断は、臨床的には、血清中のアラニンアミノトラ
ンスフェラーゼとアスパラギン酸アミノトランスフェラ
ーゼのレベルの上昇を確認し、その上でA型肝炎、B型
肝炎およびD型肝炎、さらには肝障害を引き起こす既知
のウイルス、CMV、EBV等による肝炎か否かの診断
を行い、これらの疾病に該当しない場合に非A非B型肝
炎と診断する、いわゆる除外診断によって行われてい
た。しかし、非A非B型肝炎の臨床像は他のウイルス性
肝炎のものと似通っており、上記のような除外診断法で
は、他のウイルス性の肝炎との鑑別診断は難しい。ま
た、ALT値に異常のみられない健康キャリアーを同定
するのはさらに困難である。このため、健康キャリアー
からの輸血による感染を防止することは困難で、輸血後
肝炎の90%以上をこの肝炎が占めており、患者数は年間
100万人にのぼるといわれている。かかる状況を改善す
るため、多くの研究者が非A非B型肝炎の診断用材料の
開発を行ってきたが、信頼性が低いものが多かった。こ
れらの診断用材料で最も信頼性の高いものは、カイロン
社のM.Houghtonら(特表平2-500880号公報)によって開
発されたものだと考えられている。カイロン社では、患
者血漿をチンパンジーに接種して非A非B型肝炎を起こ
させ、その中で高い感染価の血漿を有する個体から血漿
を分離し、これよりRNAを回収して蛋白質発現ベクタ
ーであるλgt11を用いて患者血清でスクリーニングし
ている。カイロン社では得られた遺伝子を用いさらに遺
伝子のクローニングを行い、C型肝炎ウイルス(HCV
=カイロン社命名)のほぼ全遺伝子をクローニングし、
一部遺伝子を発現して得られた抗原蛋白質を用いて診断
用のキット化を行っている。その後、日本でもイムノス
クリーニングにより、非A非B型肝炎に特異的な遺伝子
が分離されてきている。ところが、槙らの特許(特願平
2-180889号)によると、分離された遺伝子は、カイロン
社の分離したHCVに核酸、アミノ酸レベルでの相同性
の高いHCV・グループIと、ホモロジーが低く、HC
V・グループIとは異なるウイルスと考えてよい程度の
ホモロジーしか示さないグループIIに分類できることが
示された。またこのグループIとグループIIの遺伝子の
発現産物を用いたELISAの系で、グループIに感染
している患者とグループIIに感染している患者を分類で
きることも示されている。
Non-A, non-B hepatitis is considered to be a viral infectious hepatitis, is prone to chronicity, and has a high rate of conversion to liver cirrhosis and liver cancer, which is a social problem. However, the virus expression level in patients or healthy carriers is low, and no infectious virus has been identified.
It is very difficult to make a definitive diagnosis because it is not known that more than one species exist. To date, the diagnosis of non-A non-B hepatitis has clinically confirmed elevated levels of alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase in the serum, and then hepatitis A, hepatitis B and hepatitis D. Furthermore, it is carried out by a so-called exclusion diagnosis, in which it is diagnosed whether hepatitis is caused by a known virus that causes liver damage, CMV, EBV, etc., and when it does not correspond to these diseases, non-A non-B hepatitis is diagnosed. It was However, the clinical picture of non-A non-B hepatitis is similar to that of other viral hepatitis, and differential diagnosis with other viral hepatitis is difficult by the above-mentioned exclusion diagnosis method. Further, it is more difficult to identify a healthy carrier having no abnormal ALT value. For this reason, it is difficult to prevent infection by transfusion from healthy carriers, and this hepatitis accounts for over 90% of posttransfusion hepatitis.
It is said to reach one million. Many researchers have developed non-A non-B hepatitis diagnostic materials in order to improve such a situation, but many of them have low reliability. The most reliable of these diagnostic materials is believed to have been developed by M. Houghton et al. (Kohron 2-500880) of Chiron. At Chiron, chimpanzees are inoculated with patient plasma to cause non-A non-B hepatitis, and plasma is separated from an individual having high infectious titer plasma, and RNA is recovered from the isolated plasma using a protein expression vector. Screened with patient sera using a λgt11. At Chiron, using the obtained gene, the gene was further cloned, and the hepatitis C virus (HCV
(= Chiron company name)
An antigenic protein obtained by expressing a part of a gene is used to make a kit for diagnosis. Thereafter, in Japan, non-A non-B hepatitis-specific genes have been isolated by immunoscreening. However, the patent of Maki et al.
According to 2-180889), the isolated gene has a low homology with HCV isolated by Chiron, which has high homology with HCV group I which has high homology at the nucleic acid and amino acid level.
It was shown that the virus can be classified into group II, which shows only a homology that can be considered as a virus different from V. group I. It has also been shown that patients infected with group I and patients infected with group II can be classified by an ELISA system using the expression products of the group I and group II genes.

【発明が解決しようとする課題】カイロン社により非A
非B型肝炎の原因ウイルスの1つと考えられるHCVが
発見され、除外診断法に代わる診断が可能となった。し
かしながら、この診断材料を使用した患者血清スクリー
ニング結果は決して満足できるものではなく、カイロン
社のキットは特に日本人の非A非B型肝炎患者血清とで
は50〜70%程度の反応しか示さない。即ち、臨床的には
非A非B型肝炎と診断されている患者血清、あるいは遺
伝子増幅(PCR)によってHCVの遺伝子の存在が確
認されている患者血清と反応しない例が認められる。こ
の原因としては、1つには、カイロン社の分離したウイ
ルス遺伝子がHCVのグループIに属するウイルス遺伝
子であるため、その発現産物も、グループI特異的であ
ると考えられる。そのため、グループIIのウイルスに感
染している患者血清は、カイロン社のキットでは、検出
できない可能性が考えられる。またグループI、グルー
プII以外にその中間に位置するようなウイルスやそのど
ちらにも属さない例えばグループIII に相当するような
ウイスルあるいは、全くHCVに相同性のないウイルス
の存在する可能性も否定できない。これらの課題を解決
するためには、グループIIに感染している日本人患者血
漿からグループII特異的なウイルス遺伝子を得る必要が
ある。さらにHCVグループIあるいはグループIIに対
して相同性の低いウイルスを得るためにはより多くの日
本人患者から、日本人由来の非A非B型肝炎ウイルス遺
伝子を多数得て、可能な限り多くの患者血清と反応する
抗原を得る必要がある。本発明は上記課題を解決するた
めの、非A非B型肝炎ウイルス構造蛋白質の構成ポリペ
プチドをコードする新規なDNA断片、該DNA断片を
含む発現ベクター、該発現ベクターによって形質転換さ
れた形質転換体、並びに該形質転換体を培養して得られ
る発現ポリペプチド及びその製造方法を提供することを
目的としている。
[Problems to be Solved by the Invention]
HCV, which is considered to be one of the causative viruses of non-hepatitis B, was discovered, and it became possible to make an alternative to the exclusion diagnostic method. However, the patient serum screening results using this diagnostic material are not satisfactory at all, and the kit of Chiron shows only about 50 to 70% reaction particularly with Japanese non-A non-B hepatitis patient serum. That is, there are cases in which it does not react with the serum of a patient who is clinically diagnosed with non-A non-B hepatitis or with the serum of a patient whose presence of the HCV gene has been confirmed by gene amplification (PCR). One reason for this is that the isolated viral gene of Chiron is a viral gene belonging to HCV group I, and therefore its expression product is also considered to be group I-specific. Therefore, the sera of patients infected with Group II viruses may not be detected by the kit of Chiron. In addition to group I and group II, there is a possibility that there are viruses located in the middle of them, viruses that do not belong to either of them, such as group III, or viruses that have no homology to HCV at all. . In order to solve these problems, it is necessary to obtain a group II-specific viral gene from plasma of Japanese patients infected with group II. Furthermore, in order to obtain a virus with low homology to HCV group I or group II, many non-A non-B hepatitis virus genes derived from Japanese were obtained from more Japanese patients, and as many as possible were obtained. It is necessary to obtain an antigen that reacts with patient serum. MEANS TO SOLVE THE PROBLEM This invention solves the said subject, the novel DNA fragment which codes the constituent polypeptide of non-A non-B hepatitis virus structural protein, the expression vector containing this DNA fragment, and the transformation transformed by this expression vector. It is an object of the present invention to provide a body, an expressed polypeptide obtained by culturing the transformant, and a method for producing the same.

【課題を解決するための手段】本発明者らは、かかる目
的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、HCV・グルー
プIIのみに感染している日本人非A非B型肝炎患者の血
漿から非A非B型肝炎の原因ウイルスと考えられる病因
ウイルス遺伝子を精製・単離し、さらにその遺伝子を用
いて複数の日本人非A非B型肝炎患者の血漿からウイル
ス遺伝子を得、該遺伝子から誘導されたDNAを含む発
現ベクターを構築し、および該発現ベクターにより形質
転換された形質転換体を得ることによって、本発明を完
成するに至った。本発明は、非A非B型肝炎患者血漿か
ら直接取得された非A非B型肝炎ウイルスRNAから遺
伝子工学的に誘導して得られた、非A非B型肝炎ウイル
ス構造蛋白質の構成ポリペプチドをコードする塩基配列
を含むDNA断片を提供する。このDNA断片の調製に
あたっての重要な特徴は、ELISA法及びPCR法を
用いてグループIIのみに感染している慢性期の日本人非
A非B型肝炎患者の新鮮血漿を出発材料として用いた点
が挙げられる。本発明者らは、この血漿プールから直接
非A非B型肝炎ウイスルRNAを含む全RNAを取り出
し、ランダムプライマー法によりcDNAを合成した。
このcDNAをλファージに入れcDNAライブラリー
を作製した。さらにこのcDNAライブラリーをグルー
プIIのみに感染している非A非B型肝炎患者血清を用い
てイムノスクリーニングし、グループIIに特異的なDN
A断片を得た。この得られたDNA断片をプローブとし
て用い、複数の慢性期非A非B型肝炎患者血漿より得ら
れたcDNAライブラリーをハイブリダイゼーションア
ッセイによりスクリーニングし、相同性の異なる日本人
非A非B型肝炎患者に特異的なcDNAを単離した。こ
のように、グループIIに感染している非A非B型肝炎患
者血漿からグループII特異的な非A非B型肝炎ウイルス
RNAを単離する手法を採用したこと、及びさらに得ら
れたDNA断片を用い、多数の非A非B型肝炎患者血漿
からスクリーニングを行ったことは、いくつかのグルー
プがあり且つ変異しやすいと考えられている非A非B型
肝炎ウイルス関連の患者の診断および該肝炎ウイルスを
有する非A非B型肝炎ウイルスキャリアーの輸血用血液
の検出確度を上げるうえで非常に有効な抗原を提供する
ものである。以下に本発明のcDNAライブラリーの調
製方法、DNA断片の単離、配列の決定、ポリペプチド
の発現、精製単離、及び酵素抗体法の詳細な説明を行
う。先ず、グループIIにのみ感染している非A非B型肝
炎患者の新鮮血漿から細胞破砕物を分離し、その遠心上
清を更に遠心によりペレット化する。このペレットから
セシウムトリフルオロアセテートを用いる平衡密度勾配
遠心法によって全RNAを沈澱として分離し、フェノー
ル/クロロホルム抽出、エタノール沈澱を行い全RNA
を精製する。得られたRNA画分から、GublerとHoffma
n の方法により、ランダムプライマーを用いcDNAを
合成する。これをDNAメチラーゼ(例えば、EcoRI メ
チラーゼ)で処理してメチル化した後に、DNAリンカ
ー(例えば、EcoRI リンカー)又はDNAアダプター
(例えばEcoRI アダプター)を連結し、このものをλフ
ァージ(例えば、λgt10,λgt11)等のクローニン
グベクターにクローニングし、cDNAライブラリーを
構築した。これをcDNAライブラリーAとする。また
同様の方法で、複数の非A非B型肝炎患者の新鮮血漿か
らもcDNAライブラリーを構築した。これをcDNA
ライブラリーBとする。次に、λファージcDNAライ
ブラリーAを大腸菌に感染させ、例えば寒天プレート上
で培養してプラークを形成させる。プラークをニトロセ
ルロースフイルターに移し取り、グループIIにのみ感染
している非A非B型肝炎血清を用いるイムノスクリーニ
ングにより陽性クローンを検出する。このスクリーニン
グにより1個のクローンC11−C21が得られた。スクリ
ーニングの効率化を計るため、及びびより多くの人から
非A非B型肝炎の原因ウイルス遺伝子を得るため、得ら
れた陽性クローンをプラスミド等のクローニングベクタ
ーにクローニングし、フラグメントを切り出し、ランダ
ムプライマー法により32Pで標識し、DNAプローブを
作製し、該プローブを用いるハイブリダイゼーションア
ッセイによりスクリーニングし、cDNAライブラリー
Bから陽性プラークを検出する。このようにして得られ
たクローンを用いさらにスクリーニングを行った。この
一連のスクリーニングによりさらに、4種のクローンが
得られた。本発明者らはこれらのクローンをC10−E1
2,C10−E13,C10−E24,C10−E15と命名した。
これらの合計5つのクローン、即ちC11−C21,C10−
E12,C10−E13,C10−E24及びC10−E15はいずれ
も大腸菌JM109 株に移入され、形質転換株と成して夫
々微工研菌寄第 11892号,同第 11894号,同第 11895
号,同第 11896号及び同第 11897号として平成2年12月
11日付けで寄託されている。得られた5クローンのλフ
ァージDNAから常法に従ってcDNAを取得し、これ
を適切な制限酵素(例えば、EcoRI, BamHI)で切断し、
各cDNA断片をアガロースゲル電気泳動で精製した
後、pUC119 あるいはM13ファージに組み込み、Sang
erらのジデオキシ鎖終止法[Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA, 74, 5463(1977)]を用いて各cDNA断片の塩基配
列を決定した。このようにして決定された上記クローン
C11−C12,C10−E12,C10−E13,C10−E24及び
C10−E15の塩基配列及びそれから推定されるアミノ酸
配列を夫々配列番号1,2,3,4及び5に示した。こ
れらは夫々369 BP,932 BP,559 BP,276 BP及び742 BP
から成る核酸配列を有するDNA断片である。従って、
本発明の実施態様により、本発明は、非A非B型肝炎ウ
イルス構造蛋白質を構成するポリペプチドが配列番号
1,2,3,4又は5によって示される読み取り枠に従
ってコードされるアミノ酸配列の全部又は一部で表わさ
れることを特徴とする、該ポリペプチドをコードする塩
基配列を含むDNA断片を提供する。もちろん、これら
の塩基配列において、各アミノ酸に対応する他のコドン
から成る他のいかなる塩基配列も本発明に包含される。
5クローンは全て連続的なオープンリーディングフレー
ム(読み取り枠)が開き、終止コドンはもっていなかっ
た。HCVはゲノムRNAの解析により日本脳炎ウイル
スなどのフラビウルスと類似したウイルスであることが
知られており(蛋白質・核酸・酵素35(12),2117-2127
(1990))、この公知のフラビウイスルの遺伝子及びポリ
ペプチドに対する相同性に基づいて、本発明DNA断片
がHCV構造蛋白質をコードしているものと認められ
た。特に、クローンC11−C12はHCVのcoreをコード
する遺伝子であり、またクローンC10−E12,C10−E
13,C10−E24及びC10−E15はいずれもHCVのcore
の後半からenv 又はenv から下流の領域をコードする遺
伝子であると認められる。C11−C21クローンに関する
配列番号1によって示される核酸配列369 BPとオープン
リーディングフレームに沿って翻訳したアミノ酸配列12
3 アミノ酸をHoughtonら[特表平2-11089 号公報]の報
告したHCVとオーバーラップした部分の相同性を比較
すると核酸レベルで81.8%、アミノ酸レベルで87%の相
同性を示した。また岡本ら(Japan J.Exp.Med.,60,3,p.
167-177,1990)の発表した日本人より得られたHCVク
ローンHC−J1およびHC−J4との比較でも核酸レ
ベルで82.1%および82.7%、アミノ酸レベルで87.8%お
よび89.4%の相同性を示した。HoughtonらのHCVおよ
びHC−J1、HC−J4の3つのクローン間での同じ
領域での相同性は、核酸レベルで92.1%〜97.6%、アミ
ノ酸レベルで95.5%〜96.7%とよく保存されており、我
々の得たクローンC11−C21は、これら3つのクローン
とは、相同性において一定の距離があり、グループの異
なるウイルスの遺伝子だと考えられる。残りの4つのク
ローンのうち3クローン、C10−E12、C10−E13、C
10−E15は、HCV、HC−J1、HC−J4と核酸レ
ベルで83〜93%、アミノ酸レベルで82〜95%の相同性を
示している。またC10−E24は核酸レベルで63%前後、
アミノ酸レベルで60%前後の相同性を示した。このよう
に本発明DNA断片は、従来公知のDNA断片とは異な
るもので新規のDNAである。HCVは、グループIお
よびグループIIの2つのグループに分けられるが、宿主
内で変異を受けやすいウイルスである可能性が高く、グ
ループI、グループIIの中間のタイプのものや、他のグ
ループに分けられるウイルスが存在する可能性もある。
そのため、一種のDNA断片からつくられる抗原蛋白だ
けでは、すべての非A非B型肝炎患者を診断することは
困難である。この問題を解決するためには、DNA等の
調製方法を設定し、より多くのクローンを得ることが重
要である。この得られたクローンをいくつか組み合わせ
て診断に用いることにより、診断の効率を高めることが
可能である。本発明はまた、上述のようにして得られた
DNA断片を、プロモーターの下流に存在するベクター
内のクローニング部位に、導入して得られる発現を提供
する。ベクターとしては、プラスミド、ファージ等の慣
用のベクターが用いられる。発現ベクターは、当該技術
分野で公知の技術を用いて構築される。図1は発現プラ
スミドの構築例を示すものであるが、以下にその構築方
法を説明する。先ず、前記C11−C21クローンをpUC
119 に組み込んで得られたプラスミドpUC・C11−C
21DNA から2つのプライマー(5′−TTACGAATTCATGGGC
ACGAATCCT −3′、5′−TTAATCGATGACCTTACCCACATTGC
G −3′)を用いた遺伝子増幅法(PCR)により3′
末端にストップコドンの入ったDNA断片を得る。この
DNA断片をSmaIで消化したpUC118 に連結し、
プラスミドpUC118 ・C11−C21・Smaを得る。こ
のプラスミドをEcoRIおよびBamHIで消化し、
DNA断片をアガロースゲル電気泳動により分離し、グ
ラスパウダー法により精製する。一方、発現ベクターで
あるTrp・TrpE DNA(特願平2-180889号)を
BamHI,EcoRI消化およびバクテリアアルカリ
性ホスファターゼ(BAP)処理した後、フェノール抽
出、エタノール沈澱を行い処理ベクターDNAを得る。
このベクターDNAと前述のC11−C21 DNA断片と
をライゲーション緩衝液中でT4 DNAリガーゼによ
り連結することによって、非A非B型肝炎ウイルス構造
蛋白質の構成ポリペプチドをコードするDNAを転写制
御できる位置にプロモーターをもつ発現プラスミドTr
p・TrpE C11−C21を得た。他のクローンについ
ても適当な制限酵素を用いて処理し、発現ベクターに組
込むことにより、対応する発現プラスミドを得ることが
できる。プロモーターとしては、大腸菌、ファージ等由
来のものが挙げられる。例えば、トリプトファン合成酵
素オペロン(trp)、ラクトースオペロン(la
c)、ラムダファージPL ,PR などがある。また、転
写終結因子は必ずしも必要ないが、発現ベクター内に存
在させるのが好ましい。本発明は更に、宿主を、本発明
発現ベクターで形質転換して得られる形質転換体を提供
する。宿主としては、大腸菌,枯草菌,酵母などのこの
分野で慣用される微生物が用いられる。形質転換は発現
ベクターを宿主細胞に移入するための慣用的方法によっ
て実施される。宿主として細菌(例えば大腸菌)を用い
る場合には、塩化カルシウムを用いる直接取込み法[Ma
ndel,M. とHiga,A.,J.Mol.Bio.53,159-162(1970)]が使
用できる。さらに、発現ベクターを含む大腸菌等の宿主
を例えばアンピシリン含有2YT培地に接種し、培養
し、更にアンピシリン含有リン酸培地中で継代培養する
ことによって発現菌体を増殖し、目的ポリペプチドを産
生させることができる。宿主からの目的物の精製方法と
しては、宿主細胞を例えば超音波破砕した後に遠心分離
を行って非A非B型肝炎ウイルスcDNAでコードされ
るポリペプチド又は該ポリペプチドを含む融合ポリペプ
チドを含有する不溶性画分を得、このポリペプチドを尿
素含有バッファで可溶化抽出し、イオン交換カラムクロ
マトグラフィー(例えば、S-Sepharose)に掛けて精製す
ることができる。従って、本発明はまた、配列番号1,
2,3,4又は5のDNA断片を構成する塩基配列によ
ってコードされるアミノ酸配列の全部又は一部を含む組
換ポリペプチドの製造方法を提供する。即ち、本発明方
法は、該DNA断片を適当な宿主細胞内で発現させ得る
複製可能な発現ベクターを構築する工程、該発現ベクタ
ーを宿主細胞内に移入して形質転換体を得る工程、該D
NA断片を発現させ得る条件下で該形質転換体を培養し
て該組換えポリペプチドを産生する工程、該組換えポリ
ペプチドを回収する工程を含む。本発明はまた、このよ
うにして得られる、配列番号1,2,3,4又は5によ
って示される非A非B型肝炎ウイルス構造蛋白質の構成
ポリペプチドを含む組換えポリペプチドも提供する。本
明細書中、「組換えポリペプチド」とは、ベクター内の
非A非B型肝炎ウイルス構造蛋白質を構成するポリペプ
チドをコードするDNAを発現させて得られるポリペプ
チド自体又は該ポリペプチドとtrpEなどの他のペプ
チドとの融合ポリペプチドを意味する。本発明の発現ポ
リペプチドをSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
に掛けた後、ウェスタンブロット法により正常人血清又
は非A非B型肝炎患者血清各2検体と抗原抗体反応させ
た結果、図3に示すように患者血清とのみ強く反応する
ことから、この発現ポリペプチドは非A非B型肝炎ウイ
ルス特異抗原として作用することが確認された。また酵
素抗体法により、本発明の発現ポリペプチドTrpE・
C11−C21、槙らの特許[特願平2-180889号]で得られ
たグループIの遺伝子より発現させたポリペプチドTr
pE・C11−7、およびカイロン社のキット(オーソH
CV Ab ELISAキット)を用いて、臨床的に非
A非B型肝炎と判断された患者の血清と反応させ陽性率
を検討した。カイロン社キットは33例中、23例が陽性で
69.7%、グループIであるTrpE・C11−7は26例が
陽性で、78.8%の陽性率を示した。一方、本発明の発現
ポリペプチドTrpE・C11−C21の場合28例が陽性で
84.8%の陽性率を示し、カイロン社のキットより高い陽
性率を得た。さらに、グループIの発現ポリペプチドで
あるTrpE・C11−7と、グループIIであると考えら
れるTrpE・C11−C21とを組み合わせることにより
31例中、30例が陽性となり、陽性率は93.9%と上昇す
る。(表1、図2参照) 以下の実施例により、本発明を更に詳細に説明するが、
本発明は本発明の要旨を変えない限りこれらの実施例に
限定されるものではない。
[Means for Solving the Problems] As a result of intensive studies to achieve such an object, the present inventors have found that the plasma of Japanese non-A non-B hepatitis patients infected only with HCV / group II. A pathogenic viral gene that is considered to be the causative virus of non-A non-B hepatitis is purified and isolated, and the gene is used to obtain the viral gene from plasma of a plurality of Japanese non-A non-B hepatitis patients, and the gene is derived from the gene. The present invention was completed by constructing an expression vector containing the selected DNA and obtaining a transformant transformed with the expression vector. The present invention provides a constituent polypeptide of a non-A non-B hepatitis virus structural protein obtained by genetically inducing a non-A non-B hepatitis virus RNA obtained directly from plasma of a non-A non-B hepatitis patient. Provided is a DNA fragment containing a nucleotide sequence encoding An important feature in the preparation of this DNA fragment is that fresh plasma from a chronic non-Japanese non-A non-B hepatitis patient who is infected only with group II using the ELISA method and the PCR method is used as a starting material. Is mentioned. The present inventors directly extracted total RNA including non-A non-B hepatitis virus RNA from this plasma pool and synthesized cDNA by the random primer method.
This cDNA was put into λ phage to prepare a cDNA library. Furthermore, this cDNA library was immunoscreened using sera of non-A non-B hepatitis patients infected only with group II, and a group II-specific DN
A fragment was obtained. Using the obtained DNA fragment as a probe, a cDNA library obtained from a plurality of chronic stage non-A non-B hepatitis patient plasmas was screened by a hybridization assay, and Japanese non-A non-B hepatitis having different homologies. A patient-specific cDNA was isolated. Thus, the method for isolating group II-specific non-A non-B hepatitis virus RNA from the plasma of non-A non-B hepatitis patients infected with group II was adopted, and the obtained DNA fragment Was used to screen a large number of non-A non-B hepatitis patient plasmas. The present invention provides an extremely effective antigen for increasing the detection accuracy of blood for transfusion of a non-A non-B hepatitis virus carrier having hepatitis virus. The cDNA library preparation method of the present invention, DNA fragment isolation, sequence determination, polypeptide expression, purification and isolation, and enzyme antibody method are described in detail below. First, a cell lysate is separated from fresh plasma of a non-A non-B hepatitis patient infected only with group II, and the centrifugation supernatant is further pelletized by centrifugation. From this pellet, total RNA was separated as a precipitate by equilibrium density gradient centrifugation using cesium trifluoroacetate, and phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation were carried out.
To purify. From the obtained RNA fraction, Gubler and Hoffma
According to the method of n, cDNA is synthesized using random primers. This is treated with a DNA methylase (for example, EcoRI methylase) to be methylated, and then a DNA linker (for example, EcoRI linker) or a DNA adapter (for example, EcoRI adapter) is ligated, and this is subjected to λ phage (for example, λgt10, λgt11). ) And other cloning vectors to construct a cDNA library. This is designated as cDNA library A. In the same manner, a cDNA library was constructed from fresh plasma of a plurality of non-A non-B hepatitis patients. This is cDNA
This is library B. Next, E. coli is infected with the λ phage cDNA library A and cultured on an agar plate to form plaques. Plaques are transferred to nitrocellulose filters and positive clones are detected by immunoscreening with non-A non-B hepatitis sera that are only infected with group II. From this screening, one clone C11-C21 was obtained. In order to improve the efficiency of screening and to obtain non-A non-B hepatitis-causing virus genes from more people, the obtained positive clones were cloned into a cloning vector such as a plasmid, the fragments were excised, and the random primer method was used. Is labeled with 32 P to prepare a DNA probe, which is then screened by a hybridization assay using the probe to detect a positive plaque from the cDNA library B. Further screening was carried out using the clones thus obtained. This series of screens yielded four additional clones. We have cloned these clones into C10-E1.
2, C10-E13, C10-E24, C10-E15.
These total 5 clones, namely C11-C21, C10-
All of E12, C10-E13, C10-E24 and C10-E15 were transferred into Escherichia coli JM109 strain and formed into transformant strains, respectively, and were produced by Microtechnical Research Institutes, Microbial Research Institute Nos. 11892, 11894 and 11895.
, No. 11896 and No. 11897, December 1990
It has been deposited on the 11th. From the obtained 5 clones of λ phage DNA, a cDNA was obtained by a conventional method and cleaved with an appropriate restriction enzyme (for example, EcoRI, BamHI),
After each cDNA fragment was purified by agarose gel electrophoresis, it was incorporated into pUC119 or M13 phage and Sang
er et al.'s dideoxy chain termination method [Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA, 74, 5463 (1977)] was used to determine the nucleotide sequence of each cDNA fragment. The nucleotide sequences of the clones C11-C12, C10-E12, C10-E13, C10-E24 and C10-E15 thus determined and the amino acid sequences deduced therefrom are shown in SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 and 5 shows. These are 369 BP, 932 BP, 559 BP, 276 BP and 742 BP, respectively.
A DNA fragment having a nucleic acid sequence consisting of Therefore,
According to an embodiment of the present invention, the invention provides a complete amino acid sequence in which the polypeptide constituting the non-A non-B hepatitis virus structural protein is encoded according to the open reading frame represented by SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 5. Or a part thereof is provided, which provides a DNA fragment containing a nucleotide sequence encoding the polypeptide. Of course, in these base sequences, any other base sequence consisting of other codons corresponding to each amino acid is included in the present invention.
All 5 clones had open open reading frames and had no stop codons. HCV is known to be a virus similar to flaviurus such as Japanese encephalitis virus by analysis of genomic RNA (protein / nucleic acid / enzyme 35 (12), 2117-2127).
(1990)), it was recognized that the DNA fragment of the present invention encodes an HCV structural protein based on the homology to the known flavivirus gene and polypeptide. In particular, clone C11-C12 is a gene encoding the core of HCV, and clones C10-E12 and C10-E.
13, C10-E24 and C10-E15 are all HCV core
It is recognized that it is a gene encoding env or a region downstream from env from the latter half of the. Nucleic acid sequence 369 BP represented by SEQ ID NO: 1 for the C11-C21 clone and the amino acid sequence translated in open reading frame
Comparing the homology of 3 amino acids with HCV reported by Houghton et al. [Japanese Patent Publication No. 2-11089], the homology was 81.8% at the nucleic acid level and 87% at the amino acid level. Also Okamoto et al. (Japan J. Exp.Med., 60,3, p.
167-177, 1990) also showed homology of 82.1% and 82.7% at the nucleic acid level and 87.8% and 89.4% at the amino acid level, as compared with HCV clones HC-J1 and HC-J4 obtained from Japanese. It was Houghton et al.'S homology in the same region among three clones of HCV and HC-J1 and HC-J4 is well conserved at 92.1% to 97.6% at the nucleic acid level and 95.5% to 96.7% at the amino acid level. , The clones C11-C21 obtained by us have a certain distance in homology from these three clones, and are considered to be genes of different virus groups. 3 of the remaining 4 clones, C10-E12, C10-E13, C
10-E15 shows 83-93% homology at the nucleic acid level and 82-95% homology at the amino acid level with HCV, HC-J1 and HC-J4. C10-E24 is around 63% at the nucleic acid level,
The homology was around 60% at the amino acid level. Thus, the DNA fragment of the present invention is a novel DNA, which is different from the conventionally known DNA fragment. HCV is divided into two groups, group I and group II, but it is highly likely that it is a virus that is susceptible to mutation in the host, and it is divided into groups of intermediate types between group I and group II and other groups. It is possible that some viruses are present.
Therefore, it is difficult to diagnose all non-A non-B hepatitis patients with only an antigen protein made from one kind of DNA fragment. In order to solve this problem, it is important to set a method for preparing DNA and the like to obtain more clones. It is possible to improve the efficiency of diagnosis by using several of the obtained clones in combination for diagnosis. The present invention also provides expression obtained by introducing the DNA fragment obtained as described above into a cloning site in a vector existing downstream of a promoter. As the vector, a commonly used vector such as a plasmid or a phage is used. Expression vectors are constructed using techniques known in the art. FIG. 1 shows an example of construction of an expression plasmid. The construction method will be described below. First, the C11-C21 clone was cloned into pUC
Plasmid pUC.C11-C obtained by incorporating into 119
2 primers from 21 DNA (5'-TTACGAATTCATGGGC
ACGAATCCT -3 ', 5'-TTAATCGATGACCTTACCCACATTGC
3'by the gene amplification method (PCR) using G-3 ')
A DNA fragment having a stop codon at the end is obtained. This DNA fragment was ligated to pUC118 digested with SmaI,
The plasmid pUC118.C11-C21.Sma is obtained. This plasmid was digested with EcoRI and BamHI,
The DNA fragments are separated by agarose gel electrophoresis and purified by the glass powder method. On the other hand, the expression vector Trp.TrpE DNA (Japanese Patent Application No. 2-180889) is digested with BamHI and EcoRI and treated with bacterial alkaline phosphatase (BAP), followed by phenol extraction and ethanol precipitation to obtain a treated vector DNA.
By ligating this vector DNA and the above-mentioned C11-C21 DNA fragment with T4 DNA ligase in a ligation buffer, the DNA encoding the constituent polypeptide of the non-A non-B hepatitis virus structural protein is placed at a position where transcription can be controlled. Expression plasmid Tr with promoter
p.TrpE C11-C21 was obtained. Other clones can be treated with an appropriate restriction enzyme and integrated into an expression vector to obtain a corresponding expression plasmid. Examples of the promoter include those derived from Escherichia coli, phage and the like. For example, tryptophan synthase operon (trp), lactose operon (la)
c), lambda phage P L , P R, etc. Further, the transcription termination factor is not always necessary, but it is preferable to make it exist in the expression vector. The present invention further provides a transformant obtained by transforming a host with the expression vector of the present invention. As the host, microorganisms commonly used in this field such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, and yeast are used. Transformation is carried out by conventional methods for transferring expression vectors into host cells. When bacteria (eg E. coli) are used as the host, direct uptake method using calcium chloride [Ma
ndel, M. and Higa, A., J. Mol. Bio. 53, 159-162 (1970)] can be used. Further, a host such as Escherichia coli containing the expression vector is inoculated into, for example, ampicillin-containing 2YT medium, cultivated, and subcultured in ampicillin-containing phosphate medium to proliferate the expressed bacterial cells and produce the desired polypeptide. be able to. As a method for purifying a target product from a host, for example, a host cell is disrupted by ultrasonic waves and then centrifuged to contain a polypeptide encoded by a non-A non-B hepatitis virus cDNA or a fusion polypeptide containing the polypeptide. The insoluble fraction can be obtained, and the polypeptide can be solubilized and extracted with a buffer containing urea and subjected to ion exchange column chromatography (for example, S-Sepharose) for purification. Therefore, the present invention also includes SEQ ID NO: 1,
Provided is a method for producing a recombinant polypeptide containing all or part of an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence constituting a 2, 3, 4 or 5 DNA fragment. That is, the method of the present invention comprises the steps of constructing a replicable expression vector capable of expressing the DNA fragment in an appropriate host cell, transferring the expression vector into the host cell to obtain a transformant,
The step of culturing the transformant under conditions capable of expressing the NA fragment to produce the recombinant polypeptide, and the step of recovering the recombinant polypeptide are included. The present invention also provides a recombinant polypeptide thus obtained, which comprises the constituent polypeptide of the non-A non-B hepatitis virus structural protein represented by SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4 or 5. In the present specification, the term “recombinant polypeptide” means the polypeptide itself obtained by expressing the DNA encoding the polypeptide constituting the non-A non-B hepatitis virus structural protein in the vector, or the polypeptide and trpE. It means a fusion polypeptide with other peptides such as. The expressed polypeptide of the present invention was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, and then subjected to antigen-antibody reaction with two samples of normal human serum or non-A non-B hepatitis patient serum by Western blotting. The results are shown in FIG. Thus, it was confirmed that this expressed polypeptide acts as a non-A non-B hepatitis virus-specific antigen because it strongly reacts only with patient serum. In addition, the expressed polypeptide of the present invention TrpE.
C11-C21, a polypeptide Tr expressed from a group I gene obtained in the patent of Maki et al. [Japanese Patent Application No. 2-180889]
pE • C11-7, and kit from Chiron (Ortho H
CV Ab ELISA kit) was used to examine the positive rate by reacting with the serum of a patient clinically judged to be non-A non-B hepatitis. Chiron kit was positive in 23 of 33 cases
69.7%, TrpE.C11-7 in Group I was positive in 26 cases, showing a positive rate of 78.8%. On the other hand, in the case of the expressed polypeptide TrpE.C11-C21 of the present invention, 28 cases were positive.
The positive rate was 84.8%, which was higher than that of the Chiron kit. Furthermore, by combining the expressed polypeptide of group I, TrpE • C11-7, with TrpE • C11-C21, which is considered to be group II,
Out of 31 cases, 30 cases became positive, and the positive rate increased to 93.9%. (See Table 1 and FIG. 2) The present invention will be described in more detail with reference to the following examples.
The present invention is not limited to these examples unless the gist of the present invention is changed.

【実施例】【Example】

実施例1非A非B型肝炎患者血漿からのcDMAライブラリーの
調製 慢性期にある日本人非A非B型肝炎患者の新鮮血漿を、
槙らがクローニングした、グループIのcDNAクロー
ンC11-7の発現産物及びグループIIのcDNAクローン
C10-14 の発現産物を用いたELISAの系でスクリー
ニングし、C10-14 のみに反応してくる患者血漿を得
た。この患者血漿をさらに、グループIでよく保存され
ている領域のプライマー(5′−CACATTTGAT
CCCACGATGG−3′,5′−CTGGGAGA
GCGTCTTCACAG−3′)及びグループIIでよ
く保存されている領域のプライマー(5′−GATGC
CCACTTCCTCTCCCA−3′,5′−GTC
AGGGTAACCTCGTTGGT−3′)を用いた
遺伝子増幅法(PCR法)を行なった。PCR法はGene
AmpTM(DNA Amplification Reagent Kit, Perkin Elme
r Cetus)を用い、DNA変性95℃、 1.5分、アニーリン
グ55℃、2分、DNA合成70℃、3分の条件で行った。
この条件でグループIIのプライマーでのみ、遺伝子が増
幅してくる患者血漿をプールして用いた。この患者の新
鮮血漿から以下に述べる手順でRNA画分を調製後、λ
gt10、λgt11ファージを用いてcDNAライブリラ
ーを作製した。まず、血漿1lを等量の50m M Tri
s−HCl(pH8.0)、1m M EDTAで希釈後、細胞
破砕物等を3500gで20分間遠心することにより除去す
る。この上清をさらに4500rpm (約100000g)、4℃で
4時間遠心することによりペレットを得た。このペレッ
トを常法に従い蛋白変性剤である6Mグアニジウムチオ
シアネートを用いて溶解後、セシウムトリフルオロアセ
テート液の上に重層し、ベックマンSW50ローターで33
000rpm、20℃で18時間遠心してペレットを得た。このペ
レットを10m M Tris−HCl(pH7.5)、1m M
EDTA溶液に溶かし、フェノール:クロロホルム
(1:1)混合液で2回の抽出操作の後、上清をとり5
M NaClを10分の1量およびエタノールを 2.5倍量
加えて−20℃に2時間放置した。2時間放置後 15000g
で20分間遠心し得られたペレットをジエチルピロカーボ
ネート処理水に溶解しRNA試料とした。得られたRN
A試料を用いて、Gubler & Hoffmanの方法に従い、市販
キット(Amersham社あるいは BRL社)を用いランダムプ
ライマー法によりcDNAを合成した。合成されたcD
NAをEcoRIメチラーゼで処理した後にEcoRI
リンカーあるいはEcoRIアダプターを連結し、λg
t11ファージのEcoRI部位にクローニングした。作
製したcDNAライブラリーは、平均106 −107 PFU
の組み換え体ファージを含んでいた。このcDNAライ
ブラリーをcDNAライブラリーAとする。またELI
SA PCR法でのスクリーニングを行っていない複数
の非A非B型肝炎患者の新鮮血漿5lを出発材料とし、
同様の方法でλgt10ファージを用いたcDNAライブ
ラリーBを構築した。cDNAライブラリーBも平均10
6 −107 PFUの組み換え体ファージを含んでいた。 実施例2非A非B型肝炎特異的cDNAの単離 実施例1で作製したcDNAライブラリーAから非A非
B型肝炎に特異的なcDNAをイムノスクリーニングに
よりクローニングした。イムノスクリーニングに使用す
る血清は、ELISAおよびPCR法でグループIIのみ
に感染していることを確認した非A非B型肝炎患者血清
でHBc抗体およびHBs抗体陰性のもの2サンプルを
プールして用いた。まず、大腸菌Y1090株にλgt11フ
ァージを37℃で15分間感染させ、これを適当な密度で寒
天プレートにまき、43℃、3時間インキュベートしプラ
ークを形成させる。このプレートの寒天上に、10m M
IPTGを染み込ませたHybond-Nニトロセルロースフィ
ルターをのせ37℃で3時間培養し融合蛋白の発現を誘発
する。発現蛋白の吸着したニトロセルロースフィルター
を3%ゼラチン溶液でブロッキングした後、非A非B型
肝炎(NANBHと略称する)患者血清と4℃で一晩反
応させる。TBST溶液で3回洗浄後、ペルオキシダー
ゼ標識抗ヒトIgG(ヤギ抗体)と室温で 1.5時間反応
させる。このフィルターを再びTBST溶液で3回洗浄
し、基質であるジアミノベンチジンとH2 2 との混合
液と反応させ陽性プラークを得た。得られたクローンC
11−C21はHBc抗体、HBs抗体とは陽性の反応は認
められなかった。次にスクリーニングの効率化をはかる
ため、及びグループII以外のウイルス遺伝子をスクリー
ニングするため得られたC11−C21クローンをpUC11
9 にリクローニングしたものを、制限酵素で消化し、ラ
ンダムプライマーラベリング法で32P標識しプローブと
して用い、ハイブリダイゼーションアッセイによりcD
NAライブラリーBのスクリーニングを行った。スクリ
ーニングは、C600 hfl(−)大腸菌に、 5×104
FUの組み換え体ファージを37℃、15分間で感染させ、
150mm Lプレートにまく。37℃で一晩インキュベート
し、プラークが出現したら4℃に1時間放置する。この
プレートの寒天にHybond-Nフィルターをかぶせ30秒間放
置する。次に、変性溶液(0.5M NaOH, 1.5M N
aCl)で湿らせた濾紙の上にこのフィルターをのせ、
2分間放置後、中和溶液(0.5M Tris−HCl pH
7.0 , 1.5M NaCl)に5分間浸し、更に、 2×S
SC中で洗浄後、風乾させる。乾燥したフィルターは 3
04nmUVを2分間照射し、UV−クロスリンキングし
た。このフィルターをNANBH患者血清とのイムノス
クリーニングにより得られたC11−C21クローンの32
標識DNAプローブとハイブリダイズさせ、スクリーニ
ングした。DNAプローブをハイブリダイゼーションバ
ッファーで希釈し、ハイブリダイゼーションバッファ中
で55℃、一晩インキュベートし反応させる。その後、バ
ックグラウンドをおとすため、1×SSC55℃で10分間
ずつ、2回洗浄する。このフィルターを−70℃でオート
ラジオグラフィーを行い、陽性ブラークを検出する。フ
ィルムとL−プレートをあわせて、L−プレートから陽
性プラークをSMバッファにかきとる。このスクリーニ
ングにより得られたクローンをプローブとして用い、さ
らにcDNAライブラリーBのスクリーニングを行っ
た。この一連のスクリーニングにより4クローンが得ら
れ、それぞれC10−E12,C10−E13,C10−E24,C
10−E15と命名した。 実施例3非A非B型肝炎特異的cDNAの配列決定 得られた5クローンのλgt11あるいはλgt10のファ
ージを大腸菌に感染させ、大量のファージを回収する。
このファージから、常法に従い、アルカリ法によりDN
Aを抽出する。このDNAを制限酵素EcoRI、Ba
mHIあるいはKpnIで消化しアガロースゲル電気泳
動により精製する。一方、シークエンス用ベクターであ
るM13ファージのmp18およびmp19(Messing, J., Me
thod inEnzymology, 101, 20-78) あるいはpUC118
およびpUC119 (Vieira, J. とMessing, J., Methods
in Enzymology, 153, 3-11)を制限酵素EcoRI、B
amHIあるいはKpnIで消化し、線状化した。前記
のcDNA断片とベクターDNAを緩衝液中でT4リガ
ーゼにより連結し、この反応物を用い、大腸菌JM109
株に形質導入あるいは形質転換した。これらの大腸菌を
培養し、アルカリ法によりDNAを回収しSangerらのジ
デオキシ鎖終止法を用い塩基配列を決定した。クローン
C10−C21,C10−E12,C10−E13,C10−E24及び
C10−E15の塩基配列及びそれから推定されるアミノ酸
配列は、夫々配列番号1,2,3,4及び5に示される
とおりであった。 実施例4非A非B型肝炎ウイルスcDNAでコードされるポリペ
ブチドの発現および精製 (i) 発現プラスミドの構築 得られたクローンの1つであるC11−C21を大腸菌(E.
coli) 内でプロモーターの下流にtrpEとの融合ポリ
ペプチドとして発現させた。まず、C11−C21クローン
をpUC119 に組み込んで得られたプラスミドpUC・
C11−C21 DNA1ngを、2つのプライマー(5′−
TTACGAATTCATGGGCACGAATCCT
−3′,5′−TTAATCGATGACCTTACC
CACATTGCG−3′)を用いPCR法を行う。P
CRはGene AmpTM(DNA Amplification Reagent Kit, Pe
rkin Elmer Cetus) のキットを用い、DNA変性95℃、
1.5分、アニーリング50℃、2分、DNA合成70℃3分
の条件で行い、得られたDNA断片を 0.8%アガロース
電気泳動により分解し、グラスパウダー法で精製した。
一方、pUC118 を制限酵素SmaIで消化し、PCR
法によって得られたDNA断片と緩衝液中でT4リガー
ゼにより連結し、プラスミドpUC118 ・C11−C21・
Smaを得た。このプラスミドDNA1μgを制限酵素
反応液20μl[150mM NaCl,6mM Tris−H
Cl(pH7.9),6mM MgCl2 、15単位のEcoRI
酵素および15単位のBamHI酵素]中で37℃1時間消
化反応を行い、その後 0.8%アガロース電気泳動を行っ
て約 380bpのEcoRI−BamHI断片を分離し、こ
れをグラスパウダー法(Gene Clean TM,Bio−101
社)により精製した。次に、発現ベクターであるTrp
・TrpEのDNA1μgを反応液20ml[150mM Na
Cl,6mM Tris−HCl(pH7.5),6mM MgC
2 ,15単位のEcoRI酵素および15単位のBamH
I酵素]中37℃で1時間消化し、その反応液に水39μl
を加え、70℃で5分間熱処理した後にバクテリアアルカ
リ性ホスファターゼ(BAP)1μl(250単位/μl)
を加えて37℃で1時間保温した。この反応液にフェノー
ルを加えてフェノール抽出を行い、得られた水層をエタ
ノール沈澱し、沈澱物を乾燥した。得られたEcoRI
−BamHI処理ベクターDNA1μgと上述のC11−
C21DNA断片を10×リガーゼ用バッファ[660mM T
ris−HCl(pH7.5) 66mM MgCl2 ,100mMジ
チオスレイトール,1mM ATP]5μl,T4リガー
ゼ1μl(350単位/μl)に水を加えて50μlとし、16
℃で一晩保温し、連結反応を行った。この反応液の10μ
lを用いて大腸菌HB101 株を形質転換した。形質転換
に用いる感受性大腸菌株は、塩化カルシウム法[Mande
l, M.とHiga, A., J. Mol. Biol. 53, 159-162 (197
0)]により作られる。形質転換大腸菌を25μg/mlのア
ンピシリンを含むLB−プレート(1%トリプトン,
0.5%酵母エキス, 0.5%NaCl, 1.5%寒天)上に
塗布し、37℃に一晩保温した。プレート上に生じた菌の
コロニーを一白金耳取り、25μg/mlアンピシリンを含
むLB培地に移し、一晩37℃で培養した。 1.5mlの菌培
養液を遠心して集菌し、プラスミドDNAのミニプレパ
レーションをアルカリ法(Maniatis ら Molecular Cloni
ng: A Laboratory Manual, 1982)により行った。得られ
たプラスミドDNA1μgを反応液20μl[150mM N
aCl,6mM Tris−Hcl(pH7.5),6mM Mg
Cl,15単位のEcoRIおよびBamHI酵素]中で
37℃、1時間消化し、アガロース電気泳動を行って、約
380bのEcoRI−BamHI断片が生じるTrp・
TrpE C11−C21発現プラスミドを選別した。この
プラスミドは大腸菌101株に移入され、形質転換体と成
して微工研菌寄第 11893号として平成2年12月11月付で
寄託されている。 (ii) クローンC11−C21でコードされるポリペプチ
ドの発現および精製 発現プラスミドTrp・TrpE C11−C21をもつ大
腸菌HB101 株を50μg/mlのアンピシリンを含む3ml
の2YT培地(1.6%トリプトン,1%酵母エキス, 0.5
%NaCl)に接種し、37℃で9時間培養する。この培
養液1mlを50μg/mlのアンピシリンを含む 100mlのM
9−CA培地(0.6% Na2 HPO4 ,0.5% KH2
PO4 , 0.5% NaCl, 0.1% NH4 Cl,0.1m
M CaCl2 ,2mM MgSO4 , 0.5% カザミノ
酸, 0.2% グルコース)に植え継ぎ、37℃で21時間培
養した。更に、本培養液18mlを 1.2lのM9−CA培地
に植え継ぎ、37℃で培養した。OD600 = 0.3のときに
終濃度40mg/lになるようにインドールアクリル酸を加
え、さらに16時間培養した。この培養液を遠心分離して
菌体を集めた。菌体に20mlのバッファA(50mA Tri
s−HCl(pH8.0),1mM EDTA, 30mM NaC
l)を加えて懸濁し、再び遠心分離を行って発現菌体
2.6gを得た。得られた菌体をバッファA10ml中に懸濁
し、超音破砕により大腸菌膜を破砕した後に遠心分離を
行い、非A非B型肝炎ウイルスcDNAでコードされる
ポリペプチドとtrpEの融合ポリペプチドを含む不溶
性画分を得た。その画分に10mlの6M尿素を含むバッフ
ァAを加えて融合ポリペプチドを可溶化抽出した。可溶
化した抽出物をS-Sepharose を用いたイオン交換カラム
クロマトグラフィーに掛けてNaClの0Mから 0.5M
までの濃度勾配により融合ポリペプチドの精製を行っ
た。 実施例5非A非B型肝炎患者血清中のHCV抗体の測定 (i) ウェスタンブロット法による測定 実施例4により精製された発現産物をSDS−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動[Laemmli, Nature 277, 680
(1970)]を行った後、常法に従ってニトロセルロースフ
ィルター(Bio-rad,Trans-blot) にブロッティングを行
った。このフィルターを3%ゼラチン溶液でブロッキン
グ後、正常人血清および非A非B型肝炎患者血清を4℃
で反応させる。洗浄後、ペルオキシダーゼ標識ヒトIg
G(ヤギ抗体)を反応させた。再びフィルターを洗浄
し、基質であるジアミノベンチジン溶液に浸し、発色を
確認した。図2に示したように正常人血清に対しては全
く反応していないが、患者血清に対しては強く反応し特
異的なバンドがみられた。 (ii) 酵素抗体測定法(ELISA法)による測定 ウエスタンブロット法より大量の血清を診断する手段の
1つとしてELISA法が使用できる。方法は常法を用
いて行い、精製抗原をPBS(−)で5μg/mlの濃度
に希釈し、4℃あるいは室温でマイクロプレートに固定
する。洗浄液で数回洗浄後、希釈被検血清を加え、37℃
あるいは室温で1時間インキュベートする。洗浄後、ペ
ルオキシダーゼ標識抗ヒトIgG(ヤギ抗体)を加え37
℃あるいは室温で反応させる。更に数回洗浄し、ジアミ
ノベンチジン溶液を50μl加え、37℃で発色させる。 2
M H2 SO4 で発色を停止させ、比色計で測定を行っ
た。表1に示したように、現在上市されているカイロン
社のキット(オーソHCVAb ELISAテスト)と
陽性率を比較したところ、カイロン社のものは69.7%で
あるのに対し、本発明による発現抗原を用いたものは8
4.8%の陽性率であった(表1)。
 Example 1Of cDMA library from non-A non-B hepatitis patient plasma
Preparation Fresh plasma of Japanese non-A non-B hepatitis patients in the chronic stage,
Group I cDNA clone cloned by Maki et al.
C11-7 expression product and Group II cDNA clone
Screen by ELISA system using C10-14 expression product
To obtain patient plasma that responded only to C10-14
It was This patient plasma is also well preserved in Group I
Region primer (5'-CACATTTGAT
CCCACGATGG-3 ', 5'-CTGGGAGA
GCGTCTTCACAG-3 ') and Group II
Well-conserved region primer (5'-GATGC
CCACTTCCTCTCCCA-3 ', 5'-GTC
AGGGTAACCTCCGTTGGT-3 ') was used.
The gene amplification method (PCR method) was performed. PCR method is Gene
 AmpTM(DNA Amplification Reagent Kit, Perkin Elme
r Cetus), DNA denaturation 95 ° C, 1.5 minutes, annealing
The conditions were 55 ° C., 2 minutes, DNA synthesis 70 ° C., 3 minutes.
Under this condition, the gene was increased only with the Group II primers.
The pooled patient plasma was used. New for this patient
After preparing the RNA fraction from fresh plasma by the procedure described below,
cDNA library using gt10 and λgt11 phages
Was prepared. First, 1 liter of plasma is equivalent to 50 mM Tri
Cells diluted with s-HCl (pH 8.0) and 1 mM EDTA
Remove the crushed material by centrifuging at 3500g for 20 minutes.
It This supernatant is further added at 4500 rpm (about 100000g) at 4 ℃.
A pellet was obtained by centrifugation for 4 hours. This perez
6M guanidinium thiol which is a protein denaturant according to the conventional method
After dissolution with cyanate, cesium trifluoroacetate
Layered on top of the Tate solution, 33 with a Beckman SW50 rotor
The pellet was obtained by centrifugation at 000 rpm and 20 ° C. for 18 hours. This
Let 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 1 mM
Dissolve in EDTA solution, phenol: chloroform
After extracting twice with the (1: 1) mixture, collect the supernatant and
1/10 volume of M NaCl and 2.5 volumes of ethanol
In addition, it was left to stand at -20 ° C for 2 hours. 15000g after left for 2 hours
Centrifuge for 20 minutes at room temperature and pellet the resulting pellet with diethyl pyrocarbo.
An RNA sample was prepared by dissolving in nate-treated water. RN obtained
Commercially available using the A sample according to the method of Gubler & Hoffman
Use a kit (Amersham or BRL) to randomize
CDNA was synthesized by the Limer method. Synthesized cD
After treating NA with EcoRI methylase, EcoRI
Linker or EcoRI adapter, λg
It was cloned into the EcoRI site of t11 phage. Product
The average number of cDNA libraries produced is 106−107PFU
Of recombinant phages. This cDNA library
The library is designated as cDNA library A. Also ELI
Multiples not screened by SA PCR method
Starting from 5 l of fresh plasma from a non-A non-B hepatitis patient,
CDNA live using λgt10 phage in the same manner
Rally B was constructed. cDNA library B also averages 10
6−107It contained PFU recombinant phage. Example 2Isolation of non-A non-B hepatitis-specific cDNA From the cDNA library A prepared in Example 1,
CDNA specific for hepatitis B for immunoscreening
More cloned. Used for immunoscreening
The only sera that can be group II by ELISA and PCR
Non-A non-B hepatitis patient serum confirmed to be infected with
2 samples negative for HBc antibody and HBs antibody
It was used as a pool. First, the E. coli Y1090 strain was added to λgt11
Infection at 37 ° C for 15 minutes, and incubate it at an appropriate density.
Spread on a heaven plate and incubate at 43 ℃ for 3 hours.
To form a ark. On the agar of this plate, 10 mM
Hybond-N nitrocellulose powder impregnated with IPTG
Incubate for 3 hours at 37 ℃ with Luther and induce expression of fusion protein
To do. Nitrocellulose filter with adsorbed expressed protein
Non-A non-B type after blocking with 3% gelatin solution
Hepatitis (abbreviated as NANBH) patient serum and reacted overnight at 4 ° C
To respond. After washing 3 times with TBST solution, peroxidizer
React with ze-labeled anti-human IgG (goat antibody) for 1.5 hours at room temperature
Let Wash this filter 3 times with TBST solution again
And the substrates diaminobenzidine and H2O2Mixed with
A positive plaque was obtained by reacting with the liquid. The obtained clone C
11-C21 is positive for HBc antibody and HBs antibody
It did not fit. Next, we will streamline screening
And screen viral genes other than group II
The resulting C11-C21 clone was cloned into pUC11
The product recloned in 9 was digested with restriction enzymes and
By the random primer labeling method32With P-labeled probe
Used by the hybridization assay
The NA library B was screened. Screen
For the C600 hfl (-) E. coli, 5 × 10FourP
Infect the recombinant phage of FU at 37 ° C for 15 minutes,
Spread on a 150mm L plate. Incubate at 37 ° C overnight
When plaque appears, leave at 4 ° C for 1 hour. this
Cover the agar plate with Hybond-N filter and let stand for 30 seconds.
Place. Next, a denaturing solution (0.5M NaOH, 1.5M N
Place this filter on a filter paper moistened with aCl),
After standing for 2 minutes, neutralization solution (0.5M Tris-HCl pH
7.0, 1.5M NaCl) for 5 minutes, then 2 × S
After washing in SC, air dry. 3 dry filters
Irradiate with 04nm UV for 2 minutes and UV-crosslink
It was This filter was used as an immunos with NANBH patient serum.
Of the C11-C21 clone obtained by cleaning32P
Hybridize with labeled DNA probe and
I ran DNA probe
Dilute with buffer and in hybridization buffer
Incubate at 55 ° C overnight to react. After that,
For 10 minutes at 1 x SSC 55 ° C to reduce background
Wash 2 times each. Auto this filter at -70 ℃
Perform radiography to detect positive brakes. F
Put the film and L-plate together, and
Scrape sex plaques into SM buffer. This screenini
Clones obtained by
Screen cDNA library B
It was 4 clones were obtained by this series of screening
C10-E12, C10-E13, C10-E24, C
It was named 10-E15. Example 3Sequencing of non-A non-B hepatitis-specific cDNA The obtained 5 clones of λgt11 or λgt10
Escherichia coli is infected with E. coli and a large amount of phage is recovered.
From this phage, according to the conventional method, DN was applied by the alkaline method.
Extract A. Use this DNA as a restriction enzyme EcoRI, Ba
Digestion with mHI or KpnI and agarose gel electrophoresis
Purify by motion. On the other hand, it is a sequence vector
M13 phage mp18 and mp19 (Messing, J., Me
thod in Enzymology, 101, 20-78) or pUC118
And pUC119 (Vieira, J. and Messing, J., Methods
 in Enzymology, 153, 3-11) with restriction enzymes EcoRI, B
It was linearized by digesting with amHI or KpnI. The above
CDNA fragment and vector DNA of T4
Ligation with E.coli JM109
The strain was transduced or transformed. These E. coli
After culturing, the DNA was recovered by the alkaline method, and the DNA of Sanger et al.
The nucleotide sequence was determined using the deoxy chain termination method. clone
C10-C21, C10-E12, C10-E13, C10-E24 and
C10-E15 nucleotide sequence and amino acid deduced therefrom
The sequences are shown in SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4 and 5, respectively.
It was as it was. Example 4Polype encoded by non-A non-B hepatitis virus cDNA
Expression and purification of butido (I) Construction of expression plasmid One of the obtained clones, C11-C21, was transformed into E. coli (E.
fusion protein with trpE downstream of the promoter in E. coli.
Expressed as a peptide. First, C11-C21 clone
To pUC119 to obtain a plasmid pUC.
1 ng of C11-C21 DNA was added to two primers (5'-
TTACGAATTTCATGGGGCACGAATCCT
-3 ', 5'-TTAATCGATGACCTTACC
The PCR method is performed using CACATTGCG-3 '). P
CR is Gene AmpTM(DNA Amplification Reagent Kit, Pe
rkin Elmer Cetus) kit, DNA denaturation 95 ℃,
 1.5 minutes, annealing 50 ℃, 2 minutes, DNA synthesis 70 ℃ 3 minutes
The DNA fragment obtained was subjected to 0.8% agarose
It was decomposed by electrophoresis and purified by the glass powder method.
On the other hand, pUC118 was digested with the restriction enzyme SmaI and PCR was performed.
DNA fragment obtained by the method and T4 liger in buffer
Ligated with the plasmid pUC118.C11-C21.
Sma was obtained. 1 μg of this plasmid DNA is a restriction enzyme
Reaction solution 20 μl [150 mM NaCl, 6 mM Tris-H
Cl (pH7.9), 6 mM MgCl2, 15 units of EcoRI
Enzyme and 15 units of BamHI enzyme] at 37 ° C for 1 hour
Reaction, followed by 0.8% agarose electrophoresis
The EcoRI-BamHI fragment of approximately 380 bp.
This is the glass powder method (Gene Clean TM, Bio-101
Company). Next, the expression vector Trp
・ 1 μg of TrpE DNA was added to 20 ml of reaction solution [150 mM Na
Cl, 6 mM Tris-HCl (pH 7.5), 6 mM MgC
l2, 15 units of EcoRI enzyme and 15 units of BamH
I enzyme] at 37 ° C for 1 hour and 39 μl of water in the reaction mixture.
And heat treated at 70 ℃ for 5 minutes, then
Reactive phosphatase (BAP) 1 μl (250 units / μl)
Was added and the mixture was kept warm at 37 ° C for 1 hour. Phenol into this reaction
Phenol to extract the resulting aqueous layer.
Knoll was precipitated and the precipitate was dried. The obtained EcoRI
-1 μg of BamHI-treated vector DNA and the above-mentioned C11-
C21 DNA fragment was added to 10x ligase buffer [660 mM T
ris-HCl (pH7.5) 66 mM MgCl2, 100 mM
Thiosthreitol, 1 mM ATP] 5 μl, T4 liger
Add water to 1 μl (350 units / μl) to make 50 μl, and
The ligation reaction was carried out by keeping the temperature overnight at ℃. 10μ of this reaction solution
1 was used to transform E. coli HB101 strain. Transformation
The sensitive E. coli strain used for
l, M. and Higa, A., J. Mol. Biol. 53, 159-162 (197
0)]. Transformed E. coli with 25 μg / ml
LB-plates containing ampicillin (1% tryptone,
0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, 1.5% agar)
It was applied and kept at 37 ° C overnight. Of the germs on the plate
Take one platinum loop of the colony and add 25 μg / ml ampicillin.
LB medium and cultured overnight at 37 ° C. 1.5 ml bacterial culture
The nutrient solution is centrifuged to collect the cells, and the plasmid DNA minipreparation is performed.
The alkaline method (Maniatis et al. Molecular Cloni
ng: A Laboratory Manual, 1982). Obtained
20 μl of reaction solution [150 mM N
aCl, 6 mM Tris-Hcl (pH 7.5), 6 mM Mg
Cl, 15 units of EcoRI and BamHI enzyme]
Digest at 37 ° C for 1 hour and perform agarose gel electrophoresis.
 380b EcoRI-BamHI fragment resulting in Trp
The TrpE C11-C21 expression plasmid was selected. this
The plasmid was transferred to E. coli strain 101 and transformed into a transformant.
And, as of December 11, 1990
Has been deposited. (Ii) Polypeptide encoded by clone C11-C21
Expression and purification of the large plasmid containing the expression plasmid Trp / TrpE C11-C21
3 ml of enterobacteria HB101 strain containing 50 μg / ml of ampicillin
2YT medium (1.6% tryptone, 1% yeast extract, 0.5%
% NaCl) and incubate at 37 ° C. for 9 hours. This culture
1 ml of nutrient solution contains 100 μM of M containing 50 μg / ml of ampicillin
9-CA medium (0.6% Na2HPOFour, 0.5% KH2
POFour, 0.5% NaCl, 0.1% NHFourCl, 0.1m
M CaCl2, 2 mM MgSOFour, 0.5% Casamino
Acid, 0.2% glucose) and culture at 37 ℃ for 21 hours.
I nourished. Furthermore, 18 ml of the main culture solution was added to 1.2 l of M9-CA medium.
The cells were subcultured in and cultured at 37 ° C. OD600When = 0.3
Add indole acrylic acid to a final concentration of 40 mg / l.
Then, it was further cultured for 16 hours. Centrifuge this culture
The cells were collected. 20 ml of buffer A (50 mA Tri
s-HCl (pH8.0), 1 mM EDTA, 30 mM NaC
l) was added to suspend the cells, and the cells were centrifuged again to express cells.
2.6 g was obtained. Suspend the cells obtained in 10 ml of buffer A
And crush the E. coli membrane by sonication and then centrifuge.
Performed and encoded by a non-A non-B hepatitis virus cDNA
Insoluble containing fusion polypeptide of polypeptide and trpE
A sex fraction was obtained. A buffer containing 10 ml of 6M urea in the fraction
A was added to solubilize and extract the fusion polypeptide. soluble
Ionized column using S-Sepharose
Chromatography NaCl 0M to 0.5M
The fusion polypeptide by a concentration gradient up to
It was Example 5Measurement of HCV antibody in serum of non-A non-B hepatitis patients (I) Measurement by Western blotting The expression product purified in Example 4 was treated with SDS-polyac
Rylamide gel electrophoresis [Laemmli, Nature 277, 680
(1970)], and then perform nitrocellulose
Filter (Bio-rad, Trans-blot)
It was. Blockin this filter with 3% gelatin solution.
After that, normal human serum and non-A non-B hepatitis patient serum were treated at
React with. After washing, peroxidase-labeled human Ig
G (goat antibody) was reacted. Wash the filter again
Then, soak it in the substrate diaminobenzidine solution to develop the color.
confirmed. As shown in FIG.
Although it did not react well, it responded strongly to the patient's serum and
A strange band was seen. (Ii) Measurement by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA method) A means for diagnosing a large amount of serum by Western blotting
The ELISA method can be used as one. The method is the usual method
The purified antigen with PBS (-) at a concentration of 5 μg / ml.
And fix to microplate at 4 ℃ or room temperature
To do. After washing several times with the wash solution, add diluted test serum and incubate at 37 ℃.
Alternatively, incubate at room temperature for 1 hour. After cleaning,
Add luoxidase-labeled anti-human IgG (goat antibody) 37
React at ℃ or room temperature. Wash several more times and
Add 50 μl of Noventidine solution and develop color at 37 ° C. 2
MH2SOFourStop the color development and measure with a colorimeter
It was As shown in Table 1, Chiron currently on the market
With company kit (Ortho HCVAb ELISA test)
When comparing the positive rate, 69.7% was that of Chiron.
In contrast, 8 using the expressed antigen according to the present invention
The positive rate was 4.8% (Table 1).

【表1】 [Table 1]

【発明の効果】本発明によって得られたcDNA配列
は、非A非B型肝炎に特異的であり、これらの遺伝子を
微生物、例えば大腸菌等を利用した蛋白質発現系に組み
込むことによって産生されたポリペプチドは、多数の非
A非B型肝炎患者の血清と反応するため、極めて感度の
よい且つ判定確度の高い診断キットを作製することがで
きる。また、これらを直接プローブとして用いたり、こ
れらの配列に基づいて特異性の高いプローブを合成した
りして、診断することも可能である。更に遺伝子増幅法
(PCR)と組み合わせることによって診断や、非A非
B型肝炎に特異的な遺伝子を得ることもできる。また、
これらのポリペプチドは、非A非B型肝炎ウイルス抗原
としての機能を有するため、ワクチンとしてこのポリペ
プチドを免疫することにより非A非B型肝炎ウイルスの
感染を防御できることも期待できる。更にまた、これら
のポリリペプチドをウサギ等に免疫することにより、患
者体内のウイルス検出、分離に有用な抗体を得ることが
できる。
INDUSTRIAL APPLICABILITY The cDNA sequence obtained by the present invention is specific to non-A non-B hepatitis, and is produced by incorporating these genes into a protein expression system utilizing microorganisms such as Escherichia coli. Since the peptide reacts with the sera of many non-A non-B hepatitis patients, a diagnostic kit with extremely high sensitivity and high determination accuracy can be prepared. It is also possible to directly diagnose these by using these as probes or by synthesizing highly specific probes based on these sequences. Furthermore, by combining with a gene amplification method (PCR), it is possible to obtain a diagnosis and obtain a gene specific to non-A non-B hepatitis. Also,
Since these polypeptides have a function as a non-A non-B hepatitis virus antigen, it can be expected that immunization with this polypeptide as a vaccine can protect the non-A non-B hepatitis virus infection. Furthermore, by immunizing rabbits and the like with these polypolypeptides, an antibody useful for detecting and isolating the virus in the patient's body can be obtained.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

【図1】発現プラスミドTrp・TrpE C11−C21
の構築方法を示す。
FIG. 1 Expression plasmid Trp / TrpE C11-C21
The construction method of is shown.

【図2】発現産物と正常人血清または非A非B型肝炎患
者血清との免疫反応性をウエスタンブロット法により調
べた結果を示す写真である。
FIG. 2 is a photograph showing the results of examining the immunoreactivity of the expression product with normal human serum or non-A non-B hepatitis patient serum by Western blotting.

【図3】表1のELISAの陽性数を図に書き換えたも
のである。
FIG. 3 is a diagram in which the number of positive ELISAs in Table 1 is rewritten in the figure.

【配列表】 配列番号:1 配列の長さ:369 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to genomic RNA 配列 ATG GGC ACG AAT CCT AAA CCT CAA AGA AAA ACC AAA AGA AAC ACT AAC 48 Met Gly Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 CGT CGC CCA CAA GAC GTT AAG TTT CCG GGC GGC GGC CAG ATC GTT GGC 96 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 GGA GTA TAC TTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGA TTG GGT GTG CGC GCG 144 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 ACA AGG AAG ACT TCG AAG CGG TCC CAG CCA CGT GGG GGG CGC CGG CCC 192 Thr Arg Lys Thr Ser Lys Arg Ser Gln Pro Arg Gly Gly Arg Arg Pro 50 55 60 ATC CCT AAA GAT CGG CGC TCC ACT GGC AAG TCC TGG GGG AAA CCA GGA 240 Ile Pro Lys Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp Gly Lys Pro Gly 65 70 75 80 TAC CCC TGG CCC CTA TAT GGG AAT GAG GGA CTC GGC TGG GCA GGG TGG 288 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 CTT CTG TCC CCC CGA GGT TCC CGT CCC TCT TGG GGC CCC ACT GAC CCC 336 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro 100 105 110 CGG CAT AGG TCG CGC AAT GTG GGT AAG GTC ATC 369 Arg His Arg Ser Arg Asn Val Gly Lys Val Ile 115 120 配列番号:2 配列の長さ:932 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to genomic RNA 配列 CG CGC AAC TTG GGT AAG GTC ATC GAT ACC CTC ACA TGC GGC TTC GCC 47 Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala 1 5 10 15 GAC CTC ATG GGG TAC ATT CCG CTT GTC GGC GCC CCC CTA GGG GGT GCT 95 Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala 20 25 30 GCC AGG GCC CTG GCA CAT GGT GTC CGG GTT CTG GAG GAC GGC GTG AAC 143 Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn 35 40 45 TAT GCA ACA GGG AAT TTG CCC GGT TGC TCT TTC TCT ATC TTC CTC TTG 191 Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu 50 55 60 GCT TTG CTG TCC TGT TTG ACC ATC CCA GCT TCC GCT TAT GAG GTG CGC 239 Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg 65 70 75 AAC GTA TCC GGG ATA TAC CAT GTC ACG AAC GAC TGC TCC AAC TCA AGT 287 Asn Val Ser Gly Ile Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser 80 85 90 95 ATT GTG TAT GAG GCA GCG GAC ATG ATC ATG CAT ACC CCC GGG TGC GTG 335 Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val 100 105 110 CCC TGC GTT CGG GAG AAC AAC TCC TCC CGT TGC TGG GCA GCG CTC ACT 383 Pro Cys Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Ala Ala Leu Thr 115 120 125 CCC ACG TTA GCG GCC AGG AAC ACC AGC GTC CCC ACT ACG ACA ATA CGA 431 Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Thr Ser Val Pro Thr Thr Thr Ile Arg 130 135 140 CGG CAT GTC GAT TTG CTC GTT GGG GCG GCT GCT TTC TGC TCC GCT ATG 479 Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met 145 150 155 TAC GTG GGG GAT CTC TGT GGA TCT GTC TTC CTC GTT TCC CAG CTG TTC 527 Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe 160 165 170 175 ACT TTC TCA CCT CGT CGG CAT GAG ACA GTA CAG GAC TGC AAC TGC TCA 575 Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser 180 185 190 ATC TAT CCC GGC CAC TTG ACA GGT CAT CGC ATG GCT TGG GAT ATG ATG 623 Ile Tyr Pro Gly His Leu Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met 195 200 205 ATG AAC TGG TCA CCT ACA ACA GCC CTA GTG GTG TCG CAT CTA CTC CGG 671 Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser His Leu Leu Arg 210 215 220 ATC CCA CAA GCT GTC ATG GAC ATG GTG GCG GGG GCT CAC TGG GGA GTC 719 Ile Pro Gln Ala Val Met Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val 225 230 235 CTA GCG GGC CTC GCC TAC TAT TCC ATG GTG GGG AAC TGG GCT AAG GTT 767 Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val 240 245 250 255 TTG ATT GTG ATG CTA CTC TTC GCC GGC GTT GAC GGG ACC ACC TAT GTG 815 Leu Ile Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly Thr Thr Tyr Val 260 265 270 ACA GGG GGG ACG ACA GGC CGC ACC ACC AGC TCG TTC GCA TCC CTC TTT 863 Thr Gly Gly Thr Thr Gly Arg Thr Thr Ser Ser Phe Ala Ser Leu Phe 275 280 285 ACA CTT GGG TCG CAT CAG AAG GTC CAG CTT ATA AAT ACC AAT GGC AGC 911 Thr Leu Gly Ser His Gln Lys Val Gln Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser 290 295 300 TGG CAC ATC AAC AGG ACC GCC 932 Trp His Ile Asn Arg Thr Ala 305 310 配列番号:3 配列の長さ:559 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to genomic RNA 配列 CGC CGG TAT GAG ACG GCG CAA GAC TGC AAT TGC TCA CTC TAT CCC GGT 48 Arg Arg Tyr Glu Thr Ala Gln Asp Cys Asn Cys Ser Leu Tyr Pro Gly 1 5 10 15 CAC GTA TCT GGT CAC CGC ATG GCT TGG GAT ATG ATG ATG AAC TGG TCA 96 His Val Ser Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser 20 25 30 CCT ACA ACG GCC CTA GTG GTA TCG CAG CTA CTC CGG ATC CCA CAA GCC 144 Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala 35 40 45 GTC GTG GAC ATG GTG GCG GGG GCC CAC TGG GGA GTC CTA GCG GGC CTT 192 Val Val Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val Ile Ala Gly Leu 50 55 60 GCC TAC TAT TCC ATG GTG GCG AAC TGG GCT AAG GTC TTG GTT GTG ATG 240 Ala Tyr Tyr Ser Met Val Ala Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Met 65 70 75 80 CTA CTC TTT GCC GGC GTT GAC GAC GGG AAG ACC ACC GTG ACG GGG GGG 288 Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Asp Gly Lys Thr Thr Val Thr Gly Gly 85 90 95 AGC GCA GCC TTC CAG TCC AGG AAG TTA GTG TCC TTC TTC TCA CCA GGG 336 Ser Ala Ala Phe Gln Ser Arg Lys Leu Val Ser Phe Phe Ser Pro Gly 100 105 110 CCG AAA CAA AAT ATC CAG CTT GAT AAC ACC AAC GGC AGC TGG CAC ATC 384 Pro Lys Gln Asn Ile Gln Leu Asp Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile 115 120 125 AAC AGG ACT GCC CTG AAT TGC AAT GAC TCC CTC CAA ACT GGG TTC ATC 432 Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gln Thr Gly Phe Ile 130 135 140 GCT GCG CTG TTC TAC GCG CAC AAG TTC AAT TCG TCC GGA TGC CTA GAG 480 Ala Ala Leu Phe Tyr Ala His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Leu Glu 145 150 155 160 CGC ATG GCC AGC TGC CGC CCC ATT GAC AAG TTC GCG CAG GGG TGG GGT 528 Arg Met Ala Ser Cys Arg Pro Ile Asp Lys Phe Ala Gln Gly Trp Gly 165 170 175 CCC ATC ACT CAC GAT ACG CCT AAG ATC CCG G 559 Pro Ile Thr His Asp Thr Pro Lys Ile Pro 180 185 配列番号:4 配列の長さ:276 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to genomic RNA 配列 GA CAC CGT ATG GCA TGG GAC ATG ATG ATG AAC TGG TCG CCC ACG GCT 47 His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala 1 5 10 15 ACC ATG ATT CTG GCG TAT GTG ATG CGC ATC CCC GAG GTC GTC ATG GAC 95 Thr Met Ile Leu Ala Tyr Val Met Arg Ile Pro Glu Val Val Met Asp 20 25 30 ATC ATT GGC GGG GCT CAC TGG GGC GTC ATG TTC GGC TTG GGC TAT TTT 143 Ile Ile Gly Gly Ala His Trp Gly Val Met Phe Gly Leu Gly Tyr Phe 35 40 45 TCT ATG CAG GGG GCT TGG GCA AAA GTC GTT GTC ATC CTT CTG CTG GCC 191 Ser Met Gln Gly Ala Trp Ala Lys Val Val Val Ile Leu Leu Leu Ala 50 55 60 GCT GGG GTG GAT GCG ACT ACC CTC AGC GTT GGG GGC TCT GCC GCG CAC 239 Ala Gly Val Asp Ala Thr Thr Leu Ser Val Gly Gly Ser Ala Ala His 65 70 75 ACC ACC GGC GGC CTT GTC GGC TTG TTC AAG CCT GGC G 276 Thr Thr Gly Gly Leu Val Gly Leu Phe Lys Pro Gly 80 85 90 配列番号:5 配列の長さ:742 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to genomic RNA 配列 CG CTT GTC GGC GCC CCC CTA GGG GGT GCT GCC AGG GCC CTG GCA CAT 47 Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His 1 5 10 15 GGT GTC CGG GTT CTG GAG GAC GGC GTG AAC TAT GCA ACA GGG AAT TTG 95 Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu 20 25 30 CCC GGT TGC TCT TTC TCT ATC TTC CTC TTG GCT TTG CTG TCC TGT TTG 143 Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu 35 40 45 ACC ATC CCA GCT TCC GCT TAT GAG GTG CGC AAC GTA TCC GGG ATA TAC 191 Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Ile Tyr 50 55 60 CAT GTC ACG AAC GAC TGC TCC AAC TCA AGT ATT GTG TAT GAG GCA GCG 239 His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala 65 70 75 GAC ATG ATC ATG CAT ACC CCC GGG TGC GTG CCC TGC GTT CGG GAG AAC 277 Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Asn 80 85 90 95 AAC TCC TCC CGT TGC TGG GCA GCG CTC ACT CCC ACG TTA GCG GCC AGG 335 Asn Ser Ser Arg Cys Trp Ala Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg 100 105 110 AAC ACC AGC GTC CCC ACT ACG ACA ATA CGA CGG CAT GTC GAT TTG CTC 383 Asn Thr Ser Val Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu 115 120 125 GTT GGG GCG GCT GCT TTC TGC TCC GCT ATG TAC GTG GGG GAT CTC TGT 431 Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys 130 135 140 GGA TCT GTC TTC CTC GTT TCC CAG CTG TTC ACT TTC TCA CCT CGT CGG 479 Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg 145 150 155 CAT GAG ACA GTA CAG GAC TGC AAC TGC TCA ATC TAT CCC GGC CAC TTG 527 His Glu Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Leu 160 165 170 175 ACA GGT CAT CGC ATG GCT TGG GAT ATG ATG ATG AAC TGG TCA CCT ACA 575 Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr 180 185 190 ACA GCC CTA GTG GTG TCG CAT CTA CTC CGG ATC CCA CAA GCT GTC ATG 623 Thr Ala Leu Val Val Ser His Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val Met 195 200 205 GAC ATG GTG GCG GGG GCC CAC TGG GGA GTC CTA GCG GGC CTT GCC TAC 671 Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr 210 215 220 TAT TCC ATG GTG GGG AAC TGG GCT AAG GTT TTG ATT GTG ATG CTA CTC 719 Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Ile Val Met Leu Leu 225 230 235 TTC GCC GGC GTT GAC GGG ACC AC 742 Phe Ala Gly Val Asp Gly Thr 240 245[Sequence Listing] SEQ ID NO: 1 Sequence length: 369 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double-stranded topology: Linear Sequence type: cDNA to genomic RNA Sequence ATG GGC ACG AAT CCT AAA CCT CAA AGA AAA ACC AAA AGA AAC ACT AAC 48 Met Gly Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn 1 5 10 15 CGT CGC CCA CAA GAC GTT AAG TTT CCG GGC GGC GGC CAG ATC GTT GGC 96 Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly 20 25 30 GGA GTA TAC TTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGA TTG GGT GTG CGC GCG 144 Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala 35 40 45 ACA AGG AAG ACT TCG AAG CGG TCC CAG CCA CGT GGG GGG CGC CGG CCC 192 Thr Arg Lys Thr Ser Lys Arg Ser Gln Pro Arg Gly Gly Arg Arg Pro 50 55 60 ATC CCT AAA GAT CGG CGC TCC ACT GGC AAG TCC TGG GGG AAA CCA GGA 240 Ile Pro Lys Asp Arg Arg Ser Thr Gly Lys Ser Trp Gly Lys Pro Gly 65 70 75 80 TAC CCC TGG CCC CTA TAT GGG AAT GAG GGA CTC GGC TGG GCA GGG TGG 288 Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu G ly Trp Ala Gly Trp 85 90 95 CTT CTG TCC CCC CGA GGT TCC CGT CCC TCT TGG GGC CCC ACT GAC CCC 336 Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro 100 105 110 CGG CAT AGG TCG CGC AAT GTG GGT AAG GTC ATC 369 Arg His Arg Ser Arg Asn Val Gly Lys Val Ile 115 120 SEQ ID NO: 2 Sequence length: 932 Sequence type: Nucleic acid Topology: Linear Sequence type: cDNA to genomic RNA sequence CG CGC AAC TTG GGT AAG GTC ATC GAT ACC CTC ACA TGC GGC TTC GCC 47 Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala 1 5 10 15 GAC CTC ATG GGG TAC ATT CCG CTT GTC GGC GCC CCC CTA GGG GGT GCT 95 Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala 20 25 30 GCC AGG GCC CTG GCA CAT GGT GTC CGG GTT CTG GAG GAC GGC GTG AAC 143 Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn 35 40 45 TAT GCA ACA GGG AAT TTG CCC GGT TGC TCT TTC TCT ATC TTC CTC TTG 191 Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu 50 55 60 GCT TTG CTG TCC TGT TTG ACC ATC CCA GCT TCC GCT TAT GAG GTG CGC 239 Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg 65 70 75 AAC GTA TCC GGG ATA TAC CAT GTC ACG AAC GAC TGC TCC AAC TCA AGT 287 Asn Val Ser Gly Ile Tyr His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser 80 85 90 95 ATT GTG TAT GAG GCA GCG GAC ATG ATC ATG CAT ACC CCC GGG TGC GTG 335 Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val 100 105 110 CCC TGC GTT CGG GAG AAC AAC TCC TCC CGT TGC TGG GCA GCG CTC ACT 383 Pro Cys Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys Trp Ala Ala Leu Thr 115 120 125 CCC ACG TTA GCG GCC AGG AAC ACC AGC GTC CCC ACT ACG ACA ATA CGA 431 Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Thr Ser Val Pro Thr Thr Thr Ile Arg 130 135 140 CGG CAT GTC GAT TTG CTC GTT GGG GCG GCT GCT TTC TGC TCC GCT ATG 479 Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met 145 150 155 TAC GTG GGG GAT CTC TGT GGA TCT GTC TTC CTC GTT TCC CAG CTG TTC 527 Tyr Val Gly Asp Leu Cys Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe 160 165 170 175 ACT TTC TCA CCT C GT CGG CAT GAG ACA GTA CAG GAC TGC AAC TGC TCA 575 Thr Phe Ser Pro Arg Arg His Glu Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser 180 185 190 ATC TAT CCC GGC CAC TTG ACA GGT CAT CGC ATG GCT TGG GAT ATG ATG 623 Ile Tyr Pro Gly His Leu Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met 195 200 205 ATG AAC TGG TCA CCT ACA ACA GCC CTA GTG GTG TCG CAT CTA CTC CGG 671 Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser His Leu Leu Arg 210 215 220 ATC CCA CAA GCT GTC ATG GAC ATG GTG GCG GGG GCT CAC TGG GGA GTC 719 Ile Pro Gln Ala Val Met Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val 225 230 235 CTA GCG GGC CTC GCC TAC TAT TCC ATG GTG GGG AAC TGG GCT AAG GTT 767 Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val 240 245 250 255 TTG ATT GTG ATG CTA CTC TTC GCC GGC GTT GAC GGG ACC ACC TAT GTG 815 Leu Ile Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Gly Thr Thr Tyr Val 260 265 270 ACA GGG GGG ACG ACA GGC CGC ACC ACC AGC TCG TTC GCA TCC CTC TTT 863 Thr Gly Gly Thr Thr Gly Arg Thr Thr Ser Ser Phe Ala Ser Leu Phe 275 280 285 ACA C TT GGG TCG CAT CAG AAG GTC CAG CTT ATA AAT ACC AAT GGC AGC 911 Thr Leu Gly Ser His Gln Lys Val Gln Leu Ile Asn Thr Asn Gly Ser 290 295 300 TGG CAC ATC AAC AGG ACC GCC 932 Trp His Ile Asn Arg Thr Ala 305 310 SEQ ID NO: 3 Sequence length: 559 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double-stranded topology: Linear Sequence type: cDNA to genomic RNA sequence CGC CGG TAT GAG ACG GCG CAA GAC TGC AAT TGC TCA CTC TAT CCC GGT 48 Arg Arg Tyr Glu Thr Ala Gln Asp Cys Asn Cys Ser Leu Tyr Pro Gly 1 5 10 15 CAC GTA TCT GGT CAC CGC ATG GCT TGG GAT ATG ATG ATG AAC TGG TCA 96 His Val Ser Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser 20 25 30 CCT ACA ACG GCC CTA GTG GTA TCG CAG CTA CTC CGG ATC CCA CAA GCC 144 Pro Thr Thr Ala Leu Val Val Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala 35 40 45 GTC GTG GAC ATG GTG GCG GGG GCC CAC TGG GGA GTC CTA GCG GGC CTT 192 Val Val Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val Ile Ala Gly Leu 50 55 60 GCC TAC TAT TCC ATG GTG GCG AAC TGG GCT AAG GTC TTG GTT GTG ATG 2 40 Ala Tyr Tyr Ser Met Val Ala Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Met 65 70 75 80 CTA CTC TTT GCC GGC GTT GAC GAC GGG AAG ACC ACC GTG ACG GGG GGG 288 Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp Asp Gly Lys Thr Thr Val Thr Gly Gly 85 90 95 AGC GCA GCC TTC CAG TCC AGG AAG TTA GTG TCC TTC TTC TCA CCA GGG 336 Ser Ala Ala Phe Gln Ser Arg Lys Leu Val Ser Phe Phe Ser Pro Gly 100 105 110 CCG AAA CAA AAT ATC CAG CTT GAT AAC ACC AAC GGC AGC TGG CAC ATC 384 Pro Lys Gln Asn Ile Gln Leu Asp Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile 115 120 125 AAC AGG ACT GCC CTG AAT TGC AAT GAC TCC CTC CAA ACT GGG TTC ATC 432 Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn Asp Ser Leu Gln Thr Gly Phe Ile 130 135 140 GCT GCG CTG TTC TAC GCG CAC AAG TTC AAT TCG TCC GGA TGC CTA GAG 480 Ala Ala Leu Phe Tyr Ala His Lys Phe Asn Ser Ser Gly Cys Leu Glu 145 150 155 160 CGC ATG GCC AGC TGC CGC CCC ATT GAC AAG TTC GCG CAG GGG TGG GGT 528 Arg Met Ala Ser Cys Arg Pro Ile Asp Lys Phe Ala Gln Gly Trp Gly 165 170 175 CCC ATC ACT CAC GAT ACG CCT AAG ATC CCG G 559 Pro Ile Th r His Asp Thr Pro Lys Ile Pro 180 185 SEQ ID NO: 4 Sequence length: 276 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double stranded Topology: Linear Sequence type: cDNA to genomic RNA Sequence GA CAC CGT ATG GCA TGG GAC ATG ATG ATG AAC TGG TCG CCC ACG GCT 47 His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr Ala 1 5 10 15 ACC ATG ATT CTG GCG TAT GTG ATG CGC ATC CCC GAG GTC GTC ATG GAC 95 Thr Met Ile Leu Ala Tyr Val Met Arg Ile Pro Glu Val Val Met Asp 20 25 30 ATC ATT GGC GGG GCT CAC TGG GGC GTC ATG TTC GGC TTG GGC TAT TTT 143 Ile Ile Gly Gly Ala His Trp Gly Val Met Phe Gly Leu Gly Tyr Phe 35 40 45 TCT ATG CAG GGG GCT TGG GCA AAA GTC GTT GTC ATC CTT CTG CTG GCC 191 Ser Met Gln Gly Ala Trp Ala Lys Val Val Val Ile Leu Leu Leu Ala 50 55 60 GCT GGG GTG GAT GCG ACT ACC CTC AGC GTT GGG GGC TCT GCC GCG CAC 239 Ala Gly Val Asp Ala Thr Thr Leu Ser Val Gly Gly Ser Ala Ala His 65 70 75 ACC ACC GGC GGC CTT GTC GGC TTG TTC AAG CCT GGC G 276 Thr Thr Gly Gly Leu Val Gly Leu Phe Lys Pro Gly 80 85 90 SEQ ID NO: 5 Sequence length: 742 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double-stranded topology: Linear Sequence type: cDNA to genomic RNA Sequence CG CTT GTC GGC GCC CCC CTA GGG GGT GCT GCC AGG GCC CTG GCA CAT 47 Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His 1 5 10 15 GGT GTC CGG GTT CTG GAG GAC GGC GTG AAC TAT GCA ACA GGG AAT TTG 95 Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu 20 25 30 CCC GGT TGC TCT TTC TCT ATC TTC CTC TTG GCT TTG CTG TCC TGT TTG 143 Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu 35 40 45 ACC ATC CCA GCT TCC GCT TAT GAG GTG CGC AAC GTA TCC GGG ATA TAC 191 Thr Ile Pro Ala Ser Ala Tyr Glu Val Arg Asn Val Ser Gly Ile Tyr 50 55 60 CAT GTC ACG AAC GAC TGC TCC AAC TCA AGT ATT GTG TAT GAG GCA GCG 239 His Val Thr Asn Asp Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala 65 70 75 GAC ATG ATC ATG CAT ACC CCC GGG TGC GTG CCC TGC GTT CGG GAG AAC 277 Asp Met Ile Met His Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Asn 80 85 90 95 AAC TCC TCC CGT TGC TGG GCA GCG CTC ACT CCC ACG TTA GCG GCC AGG 335 Asn Ser Ser Arg Cys Trp Ala Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg 100 105 110 AAC ACC AGC GTC CCC ACT ACG ACA ATA CGA CGG CAT GTC GAT TTG CTC 383 Asn Thr Ser Val Pro Thr Thr Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu 115 120 125 GTT GGG GCG GCT GCT TTC TGC TCC GCT ATG TAC GTG GGG GAT CTC TGT 431 Val Gly Ala Ala Ala Phe Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Leu Cys 130 135 140 GGA TCT GTC TTC CTC GTT TCC CAG CTG TTC ACT TTC TCA CCT CGT CGG 479 Gly Ser Val Phe Leu Val Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg 145 150 155 CAT GAG ACA GTA CAG GAC TGC AAC TGC TCA ATC TAT CCC GGC CAC TTG 527 His Glu Thr Val Gln Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Leu 160 165 170 175 ACA GGT CAT CGC ATG GCT TGG GAT ATG ATG ATG AAC TGG TCA CCT ACA 575 Thr Gly His Arg Met Ala Trp Asp Met Met Met Asn Trp Ser Pro Thr 180 185 190 ACA GCC CTA GTG GTG TCG CAT CTA CTC CGG ATC CCA CAA GCT GTC ATG 623 Thr Ala Leu Val Val Ser His Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val Met 195 200 205 GAC ATG GTG GCG GGG GCC CAC TGG GGA GTC CTA GCG GGC CTT GCC TAC 671 Asp Met Val Ala Gly Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr 210 215 220 TAT TCC ATG GTG GGG AAC TGG GCT AAG GTT TTG ATT GTG ATG CTA CTC 719 Tyr Ser Met Val Gly Asn Trp Ala Lys Val Leu Ile Val Met Leu Leu 225 230 235 TTC GCC GGC GTT GAC GGG ACC AC 742 Phe Ala Gly Val Asp Gly Thr 240 245

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 G01N 33/53 D 8310−2J 33/576 Z 9015−2J //(C12N 1/21 C12R 1:19) (72)発明者 小原 道法 埼玉県入間郡大井町西鶴ケ岡1−3−1 東燃株式会社総合研究所内─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 5 Identification code Internal reference number FI Technical display location G01N 33/53 D 8310-2J 33/576 Z 9015-2J // (C12N 1/21 C12R 1: 19) (72) Inventor Michiho Ohara 1-3-1 Nishitsurugaoka, Oi-cho, Iruma-gun, Saitama Tonen Research Institute

Claims (12)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項1】 非A非B型肝炎患者血漿から直接取得さ
れた非A非B型肝炎ウイルスRNAから遺伝子工学的に
誘導して得られた、非A非B型肝炎ウイルス構造蛋白質
の構成ポリペプチドをコードする塩基配列を含むDNA
断片。
1. A non-A non-B hepatitis virus structural protein constituent protein obtained by genetically engineering from a non-A non-B hepatitis virus RNA obtained directly from plasma of a non-A non-B hepatitis patient. DNA containing a nucleotide sequence encoding a peptide
fragment.
【請求項2】 前記ポリペプチドが、配列番号1によっ
て示される読み取り枠に従ってコードされるアミノ酸配
列の全部又は一部で表わされることを特徴とする請求項
1記載のDNA断片。
2. The DNA fragment according to claim 1, wherein the polypeptide is represented by all or part of an amino acid sequence encoded according to the open reading frame represented by SEQ ID NO: 1.
【請求項3】 前記ポリペプチドが、配列番号2によっ
て示される読み取り枠に従ってコードされるアミノ酸配
列の全部又は一部で表わされることを特徴とする請求項
1記載のDNA断片。
3. The DNA fragment according to claim 1, wherein the polypeptide is represented by all or part of an amino acid sequence encoded according to the open reading frame represented by SEQ ID NO: 2.
【請求項4】 前記ポリペプチドが、配列番号3によっ
て示される読み取り枠に従ってコードされるアミノ酸配
列の全部又は一部で表わされることを特徴とする請求項
1記載のDNA断片。
4. The DNA fragment according to claim 1, wherein the polypeptide is represented by all or part of an amino acid sequence encoded according to the open reading frame represented by SEQ ID NO: 3.
【請求項5】 前記ポリペプチドが、配列番号4によっ
て示される読み取り枠に従ってコードされるアミノ酸配
列の全部又は一部で表わされることを特徴とする請求項
1記載のDNA断片。
5. The DNA fragment according to claim 1, wherein the polypeptide is represented by all or part of an amino acid sequence encoded according to the open reading frame represented by SEQ ID NO: 4.
【請求項6】 前記ポリペプチドが、配列番号5によっ
て示される読み取り枠に従ってコードされるアミノ酸配
列の全部又は一部で表わされることを特徴とする請求項
1記載のDNA断片。
6. The DNA fragment according to claim 1, wherein the polypeptide is represented by all or part of the amino acid sequence encoded according to the open reading frame represented by SEQ ID NO: 5.
【請求項7】 請求項1〜6のいずれか一項に記載のD
NA断片を、プロモーターの下流に存在するベクター内
のクローニング部位に導入して得られる発現ベクター。
7. D according to any one of claims 1 to 6.
An expression vector obtained by introducing an NA fragment into a cloning site in a vector existing downstream of a promoter.
【請求項8】 ベクターがプラスミドである請求項7記
載の発現ベクター。
8. The expression vector according to claim 7, wherein the vector is a plasmid.
【請求項9】 宿主を、請求項7又は8に記載の発現ベ
クターで形質転換して得られる形質転換体。
9. A transformant obtained by transforming a host with the expression vector according to claim 7 or 8.
【請求項10】 宿主が大腸菌である請求項9記載の形
質転換体。
10. The transformant according to claim 9, wherein the host is Escherichia coli.
【請求項11】 請求項1〜6のいずれか一項に記載の
DNA断片を構成する塩基配列によってコードされるア
ミノ酸配列の全部又は一部を含む組換えポリペプチドの
製造方法であって、 前記DNA断片を適当な宿主細胞内で発現させ得る複製
可能な発現ベクターを構築する工程、 前記発現ベクターを宿主細胞内に移入して形質転換体を
得る工程、 前記DNA断片を発現させ得る条件下で前記形質転換体
を培養して前記組換えポリペプチドを産生させる工程、 前記組換えポリペプチドを回収する工程、を含む方法。
11. A method for producing a recombinant polypeptide containing all or part of an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence constituting the DNA fragment according to any one of claims 1 to 6, comprising: Constructing a replicable expression vector capable of expressing the DNA fragment in a suitable host cell, transferring the expression vector into the host cell to obtain a transformant, under conditions capable of expressing the DNA fragment A method comprising culturing the transformant to produce the recombinant polypeptide, and recovering the recombinant polypeptide.
【請求項12】 請求項11に記載の方法によって得られ
る、非A非B型肝炎ウイルス構造蛋白質の構成ポリペプ
チドを含む組換えポリペプチド。
12. A recombinant polypeptide comprising a constituent polypeptide of a non-A non-B hepatitis virus structural protein, obtained by the method according to claim 11.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6623921B2 (en) 1998-07-30 2003-09-23 Advanced Life Science Institute, Inc. Method for measurement of hepatitis C virus
US7316905B1 (en) 1998-07-30 2008-01-08 Advanced Life Science Institute, Inc. Method for measurement of hepatitis C virus

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