JPH0630800A - 生殖器マイコプラズマ検出用核酸プローブ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 生殖器領域由来のマイコプラズマ、すなわち
マイコプラズマ・ホミニス、マイコプラズマ・ジェニタ
リウム及びウレアプラズマ・ウレアリティクムによる非
淋菌性尿道炎、骨盤内炎症性疾患、卵管炎及びその他の
感染症のマイコプラズマ病因学的作用因子のｒＲＮＡ及
びｒＤＮＡに対してハイブリッド形成することができ
る、約１０から２５０ヌクレオチドを有する核酸。 【効果】 生殖器マイコプラズマに関連する疾病の臨床
的治療に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、非淋菌性尿道炎、骨盤
内炎症性疾患、敗血性流産、及び他の組織のかなりの種
類の疾患の原因であると思われている、生殖器及び尿路
に関連するマイコプラズマに関する。より特定的には、
本発明の実施態様は、核酸プローブ及び組成物、臨床及
び他の試料中のマイコプラズマ・ホミニス、ウレアプラ
ズマ・ウレアリティクム、及びマイコプラズマ・ジェニ
タリウムの特異的検出もしくは同定に関するそれらの使
用、及びキットとしての使用に適する包装された成分を
提供する。

【０００２】

【従来技術並びに発明が解決しようとする課題】マイコ
プラズマは微小な無壁細菌であり、元来ヒトを含む動物
源から単離される。７０種類を越えるマイコプラズマ
（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）属及び、やはり微小な無壁細
菌として特徴づけられる数々の関連属が存在しており、
それらは、スピロプラズマ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍ
ａ）、アコレプラズマ（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ）、
ウレアプラズマ（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）、アネロプラ
ズマ（Ａｎａｅｒｏｐｌａｓｍａ）、及びアステロレプ
ラズマ（Ａｓｔｅｒｏｌｅｐｌａｓｍａ）である。これ
らの属のうちのほんの一握りの種のみがヒトに関連して
発見されており、幾種かのものは「正常の常在菌叢」で
あろうと思われ、他のものは時折病原性を示すことがあ
り、更に他のものは常時臨床的に重要であると思われて
いる。病原性であるとして知られているマイコプラズマ
の中では、マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍｙｃｏｐ
ｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）が歴史的に最も良
く研究されており、原発性異型肺炎の主要感染作用因子
である。マイコプラズマ・ニューモニエ及び別のマイコ
プラズマ性病原体であるマイコプラズマ・フェルメンタ
ンス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ）
の検出のための核酸組成物及び方法は、「マイコプラズ
マ・ニューモニエの検出用の核酸プローブ」及び「マイ
コプラズマ・フェルメンタンスもしくはエイズ関連ウィ
ルス様感染性作因の検出用核酸プローブ」と題する２つ
の同時に提出された特許出願である米国特許６７３，６
８６及び米国特許６７３，６８７の主題である。これら
全ての出願及び本出願については、少なくとも一人の発
明者が共通している。

【０００３】ヒトの生殖器及び尿路から単離することが
できる他の３種類のマイコプラズマ種であるマイコプラ
ズマ・ホミニス、マイコプラズマ・ジェニタリウム、及
びウレアプラズマ・ウレアリティクムは、ヒトの体内に
おけるこれらの生物の検出の臨床的関連性において幾分
より不可解である。例えば、ウレアプラズマ・ウレアリ
ティクムは、重要かつ重大なヒトの罹患率及び死亡率に
関連してはいるものの、同様に無症候性の「健常」人に
おいても発見され得る。この３種のマイコプラズマ・ホ
ミニス、マイコプラズマ・ジェニタリウム、及びウレア
プラズマ・ウレアリティクムは、本明細書中においては
生殖器マイコプラズマとして述べられる。

【０００４】マイコプラズマ・ジェニタリウムは、最初
に非淋病性の尿道炎に罹った２人の男性の尿道から単離
された（Ｔｕｌｌｙ他、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｓｙｓｔ．Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ．３３巻、１９８３年）。続いてマイコプ
ラズマ・ジェニタリウムがマイコプラズマ・ニューモニ
エとの共同培養内でヒトの気道から単離された（Ｂａｓ
ｅｍａｎ他、Ｊ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏ．２６
巻、１９８８年）。しかしながら、マイコプラズマ・ジ
ェニタリウムが、特に同性愛の男性における急性尿道炎
のケースの少なくとも幾つかにおいて重要な役割を演じ
ていることが研究により明らかにされている（例えば、
Ｈｏｏｔｏｎ他、Ｌａｎｃｅｔ、１９８８年）。マイコ
プラズマ・ジェニタリウム検出のための特異的なプロー
ブの設計及び製造に関する方法を記載することは本発明
の一つの側面である。進化的に近い類縁関係にあるマイ
コプラズマ・ジェニタリウムとマイコプラズマ・ニュー
モニエの両方を認識する核酸プローブについては、同時
に提出した特許出願中に記載されている。

【０００５】マイコプラズマ・ホミニスは、卵管炎、羊
膜炎、非特異的腟炎、及び産褥敗血症熱を引き起こす作
用因子として関与している。マイコプラズマ・ホミニス
はかなりの数の無症状の女性から単離することができ
る。マイコプラズマ・ホミニス検出のための特異的なプ
ローブの設計及び製造に関する方法を記載することは本
発明の一つの側面である。

【０００６】ウレアプラズマ・ウレアリティクムは、非
淋菌性尿道炎、絨毛性羊膜炎、早産、及び分娩時の罹患
率及び死亡率に関与している。幾人かの臨床研究者は、
ウレアプラズマ・ウレアリティクムによる非淋菌性尿道
炎（ＮＧＵ）の病因学的作用因子をクラミジア・トラコ
マティス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉ
ｓ）のものと同じレベルまで追及することが可能であろ
うと評定している。約４０％もの急性ＮＧＵが、ウレア
プラズマにより引き起こされているものと思われる（Ｂ
ｏｗｉｅ、Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｌｉｎｉｃｓ ｏ
ｆ ＮｏｒｔｈＡｍｅｒｉｃａ、１１巻、１９８４
年）。このことは、合衆国における年間約３−４００万
事例を意味する。マイコプラズマ・ホミニス同様、ウレ
アプラズマ・ウレアリティクムはかなりの数の無症状の
男性及び女性の両方から単離することができる。少なく
とも１５種類のウレアプラズマ・ウレアリティクム血清
型が存在する。血清型、罹患率値、及びウレアプラズマ
の病原学に寄与する他の因子の組み合わせは現在のとこ
ろ全く知られていない。ウレアプラズマ・ウレアリティ
クム検出のための特異的なプローブの設計及び製造に関
する方法を記載することは本発明の一つの側面である。

【０００７】上述したようなもののマイコプラズマは栄
養条件のめんどうな生物であり、ペプトン、イースト抽
出物、高価な動物血清、及びステロールを含有する複雑
な培養培地を必要とする。増殖は比較的緩慢であり、大
多数の細菌に比べて低い細胞密度にしか達しない。更
に、細胞増殖用の大気条件として二酸化炭素の添加を必
用とする。これらの理由から、多くの臨床研究室ではマ
イコプラズマの培養物の単離を行うことができず、その
ためこれらの重要な病原性細菌の存在を真に診断するこ
とができないままとなっている。マイコプラズマが細胞
壁を欠損しているため、細胞壁を標的とするペニシリン
等の抗生物質は抗マイコプラズマ活性を有さない。その
結果、医師にとって、特に臨床的兆候が前兆となる場合
には、これらの細菌の１種類以上のものの存在の診断を
下すこと、そして適切な抗生物質を処方することが重要
である。

【０００８】リボソームは全ての生物にとって非常に重
要である。リボソームは、遺伝子情報を、生命の主要な
構造的かつ触媒的要素である細胞内蛋白質へと翻訳する
唯一の既知の手段として働く。全ての細胞がリボゾーム
を有していることが観察されるということがこの重要性
の明確な証拠である。

【０００９】細菌のリボソームは３つの特有なＲＮＡ分
子を含んでおり、少なくとも大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ）においては、それらは５Ｓ、１６
Ｓ、及び２３Ｓ ｒＲＮＡとして引用される。真核生物
内では、４つの特有なｒＲＮＡ種が存在し、一般的には
５Ｓ、１８Ｓ、２８Ｓ、及び５．８Ｓとして引用され
る。これらの名称は、歴史的にはそれらの沈降係数によ
り決定されたＲＮＡ分子の大きさに関連している。しか
し、実際にはリボソームＲＮＡは生物間で大きさがかな
り異なっている。それにもかかわらず、マイコプラズマ
を含む任意の細菌内の相同なＲＮＡ分子に対する一般的
名称として５Ｓ、１６Ｓ、及び２３Ｓ ｒＲＮＡが通例
として用いられており、この慣習を本明細書中において
も継続させている。本発明のプローブは、生殖器マイコ
プラズマの１６Ｓ及び２３Ｓ ｒＲＮＡ分子を標的とす
る。

【００１０】ハイブリッド形成は、核酸の塩基は互いに
対を成すことができるということに関与する明白な法則
に従い、適切な反応条件下において、２つの部分的もし
くは完全に相補的な核酸の鎖を逆平行方向（一つは５’
から３’方向に向かい、他のものは３’から５’に向か
う）において結合させ、特異的かつ安定な水素結合を有
する二重鎖の核酸を形成させる過程である。

【００１１】本明細書中で使用されるように、プローブ
とは、ハイブリッド形成条件下特異的かつ優先的に標的
核酸配列とハイブリッド形成をするのを可能にするよう
な特異的な核酸配列を、設計もしくは選択により含んで
いる、合成もしくは生物学的に産生される核酸（ＤＮＡ
もしくはＲＮＡ）を示す。用語「優先的に」というのは
相対的な意味で用いられており、同一条件下であるハイ
ブリッド形成反応産物が他のものよりも安定である。い
くつかの条件下では、１つのハイブリッド形成反応生成
物がある標的に関して作成されるだろうが、他の結合可
能な相手に関しては作成されないだろう。それらのハイ
ブリッド形成特性に加え、プローブはまた、特別なアッ
セイ条件下においてそれらの適切または至適な機能に関
連するある種の構成要素を含んでいても良い。例えば、
プローブは、修正を加えて、ヌクレアーゼ消化に対する
それらの耐性を改良し（例えば、末端修飾により）、検
出リガンド（例えば、蛍光物質、ビオチン等）を付加
し、検出を容易にし（例えば、化学ルミネセンス用蛍光
性物質及び放射性物質）、あるいは、固体の支持体上へ
のそれらの捕捉を容易にしても良い（例えば、ホモポリ
マーでできた「尾部」を用いて）。このような修正は、
ハイブリッド形成アッセイ中の標的及び非標的生物間を
有用に区別する能力であるその基本的なプローブ機能を
基に入念に作り上げられる。

【００１２】統計学的には最低１０ヌクレオチドが、特
異性を獲得し、かつ安定なハイブリッド形成産物を形成
させるためには必要である。最高２５０ヌクレオチドと
は、反応パラメーターを不適合な組み合わせの配列及び
優先的的なハイブリッド形成を決定するために調整する
ことができる配列の上限を意味する。

【００１３】ハイブリッド形成条件は、プローブ／標的
二本鎖（ｄｕｐｌｅｘ）の塩基組成並びに２種類の核酸
間の不適合な組み合わせのレベル及びジオメトリーによ
り限定される。１０から２５０塩基の核酸のための標準
的なハイブリッド形成条件は、１．０８Ｍ塩化ナトリウ
ム、６０ｍＭリン酸ナトリウム、及び６ｍＭエチレンジ
アミン四酢酸（ｐＨ７．４）の存在下において温度約６
０℃である。

【００１４】通常調整される反応パラメーターは、ハイ
ブリッド形成溶液中に存在するイオン種の濃度及び種
類、存在する変性剤の種類及び濃度、及びハイブリッド
形成の温度を含む。一般的には、安定なハイブリッドを
形成する目的であれば、ハイブリッド形成条件がより緊
縮的になればなるほどより長いプローブが望ましい。当
然の結果として、ハイブリッド形成が行われる条件の緊
縮度（例えば、行われるアッセイの種類に基づく）によ
り、使用されるべき望ましいプローブのある特性が定め
られる。そのような関係は、当業者にとってよく理解で
き、また容易に操作することができる。

【００１５】Ｋｏｈｎｅ他（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ
Ｊｏｕｒｎａｌ ８巻、１１０４ー１１１８、１９６８
年）は、ｒＲＮＡ配列に対するプローブの調製方法につ
いて論じている。しかしながらＫｏｈｎｅ他は、３種類
の生殖器マイコプラズマ検出のためのプローブ作成に必
要な技術を提供していない。

【００１６】Ｐａｃｅ及びＣａｍｐｂｅｌｌ（Ｊｏｕｒ
ｎａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ １０７巻、
５４３ー５４７、１９７１年）は、異なるバクテリア種
由来のリボソームのリボ核酸の相同性、及びそのような
相同性のレベルを定量化するためのハイブリッド形成法
について論じている。同様に、Ｓｏｇｉｎ、Ｓｏｇｉｎ
及びＷｏｅｓｅ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕ
ｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ １巻、１７３ー１８４、
１９７２年）は、系統発生的な関連性を評価するため
に、様々なリボソームＲＮＡ分子の一次構造決定法を用
いることの理論的及び実際的な見地を論じている。Ｆｏ
ｘ、Ｐｅｃｈｍａｎ及びＷｏｅｓｅ（Ｉｎｔｅｒｎａｔ
ｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔ
ｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ ２７巻、４４−５
７、１９７７年）は、原核生物の分類に対する手掛かり
として１６ＳのリボソームＲＮＡの系統発生的な比較目
録作成について論じている。個別に、あるいは共同で、
Ｋｏｈｎｅ他、Ｐａｃｅ及びＣａｍｐｂｅｌｌ、Ｓｏｇ
ｉｎ、Ｓｏｇｉｎ及びＷｏｅｓｅ、及びＦｏｘ、Ｐｅｃ
ｈｍａｎ及びＷｏｅｓｅは、生殖器マイコプラズマの存
在及び量を検出するアッセイにおいて有効な特異的プロ
ーブを提供していない。

【００１７】Ｈｏｇａｎ他（国際特許出願、公開番号
ＷＯ ８８／０３９５７）は、マイコプラズマ・ニュー
モニエの特異的検出用の５種類のプローブについて記載
している。しかしながら、Ｈｏｇａｎ他は、特異的な３
種類の生殖器マイコプラズマ種に対するプローブについ
ては記載していない。

【００１８】Ｗｏｅｓｅ、Ｍａｎｉｌｏｆｆ、Ｚａｂｌ
ｅｎ（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ７７巻、１９８０年）は、選択したマイコプ
ラズマの１６Ｓ ｒＲＮＡの部分配列を調査し、マイコ
プラズマ配列の「記号」の概念を定めている。しかしな
がら、Ｗｏｅｓｅ他は、プローブの設計技法を教示して
いない。Ｗｏｅｓｅ他は、マイコプラズマ・ジェニタリ
ウム、マイコプラズマ・ホミニスまたはウレアプラズマ
・ウレアリティクムについて論じていない。

【００１９】Ｒｏｇｅｒｓ他（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８２巻、１９８５
年）は、５Ｓ ｒＲＮＡの配列について論じている。し
かしＲｏｇｅｒｓ他は、プローブ設計の技法について教
示していない。Ｒｏｇｅｒｓ他は、マイコプラズマ・ジ
ェニタリウムもしくはマイコプラズマ・ホミニスについ
て記載していない。

【００２０】Ｗｅｉｓｂｕｒｇ他（Ｊｎｌ． Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌｏｇｙ、１７１巻、１９８９年）は、ウレア
プラズマ・ウレアリティクム及びマイコプラズマ・ホミ
ニスの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列について論じている。しか
しＷｅｉｓｂｕｒｇ他は、マイコプラズマプローブの設
計について論じていないし、また教示していない。

【００２１】Ｈｙｍａｎ他（Ｈｙｍａｎ他、Ｊｎｌ．
Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏ．、２５巻、１９８７年）及び
Ｊｅｎｓｅｎ他（Ｊｅｎｓｅｎ他、Ｊｎｌ． Ｃｌｉ
ｎ．Ｍｉｃｒｏ．、２９巻、１９９１年）は、ポリメラ
ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を利用するマイコプラズマ・ジ
ェニタリウムの検出について論じている。両方の論文と
も、マイコプラズマｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡの配列の
利用に関する非ＰＣＲ的アッセイについて教示していな
い。

【００２２】

【課題を解決するための手段】本発明は、核酸組成物及
び組成物のセット、及びマイコプラズマ・ホミニス、ウ
レアプラズマ・ウレアリティクム、及びマイコプラズマ
・ジェニタリウムの特異的な検出もしくは同定のための
それらの使用に関する方法を特徴とする。本発明の一つ
の実施態様は、ヒトにおける非マイコプラズマ性細菌の
ｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡに対してよりもヒトの尿管及
び生殖器領域に関与する病原性マイコプラズマ細菌のｒ
ＲＮＡもしくはｒＤＮＡに対して優先的にハイブリッド
形成することができる約１０から２５０のヌクレオチド
を有する、組成物としての核酸を特徴とする。この核酸
組成物は、マイコプラズマ・ホミニス、ウレアプラズマ
・ウレアリティクム及びマイコプラズマ・ジェニタリウ
ムを検出するために有効である。

【００２３】この核酸組成物は、マイコプラズマ・ホミ
ニスの１６Ｓｒ ＲＮＡの位置５０から１００、４２５
から４８５、もしくは１１００から１１５０、ウレアプ
ラズマ・ウレアリティクムの１６Ｓ ｒＲＮＡの位置５
０から１００、１５０から２５０、４２５から４８５、
８００から８５０、１０９０から１１６０、及び１２２
０から１２６０、マイコプラズマ・ジェニタリウムの１
６Ｓ ｒＲＮＡの位置１１１０から１１６０、マイコプ
ラズマ・ジェニタリウムの２３Ｓ ｒＲＮＡの位置２６
０から３３０、１５９０から１６３０、及び１８５０か
ら１９００から成る領域の群から選択されるｒＲＮＡも
しくはｒＤＮＡ領域に対して、相補的若しくは相同であ
る。かかる番号表示はＲＮＡ分子の５’末端から数えた
ヌクレオチドの位置であり、当業者には慣用的に知られ
ている。

【００２４】この核酸組成物が、プローブ２２６２、２
２５６、２２４６、２２１８、２２７１、２２２０、２
２５９、２２２７、２３３５、２３３７、２３３４、２
３３６、２１９１、２２２８及び２２６０から成る群か
ら選択される核酸配列内の任意の連続する１０ヌクレオ
チドを含む配列の少なくとも９０％に対して相補的であ
ることが望ましい。

【００２５】本発明の他の実施態様は、プローブ２２６
２、２２５６、２２４６、２２１８、２２７１、２２２
０、２２５９、２２２７、２３３５、２３３７、２３３
４、２３３６、２１９１、２２２８及び２２６０から成
る群から選択される配列内の任意の連続する１０ヌクレ
オチド含む配列の少なくとも９０％と相同である核酸を
含む。

【００２６】本発明の一つの実施態様は、製造物品とし
ての、少なくとも２種類の核酸組成物のセットを特徴と
する。各核酸組成物は約１０から２５０ヌクレオチドを
有し、マイコプラズマ・ホミニス、ウレアプラズマ・ウ
レアリティクム及びマイコプラズマ・ジェニタリウムの
ｒＲＮＡもしくはｒＤＭＡに対して優先的にハイブリッ
ド形成することができる。各核酸は、２２６２、２２５
６、２２４６、２２１８、２２７１、２２２０、２２５
９、２２２７、２３３５、２３３７、２３３４、２３３
６、２１９１、２２２８及び２２６０から成るプローブ
により定義される群から選択される配列内の任意の連続
する１０ヌクレオチドを含む配列の少なくとも９０％に
対して相補的若しくは相同である。

【００２７】ウレアプラズマ・ウレアリティクムの検出
に適するプローブセットは、プローブ２２６２とプロー
ブ２２５６；プローブ２２４６とプローブ２２１８；プ
ローブ２２５９とプローブ２２７１；プローブ２２７１
とプローブ２２２０；及びそれらの相補体を含有する。

【００２８】マイコプラズマ・ホミニスの検出に適する
プローブセットは、プローブ２１９１とプローブ２２２
８；プローブ２２２８とプローブ２２６０；プローブ２
１９１とプローブ２２６０；及びそれらの相補体を含有
する。

【００２９】マイコプラズマ・ジェニタリウムの検出に
適するプローブセットは、プローブ２２２７とプローブ
２２１９；プローブ２３３５とプローブ２３３７；プロ
ーブ２３３５とプローブ２３３４；プローブ２３３４と
プローブ２３３６；及びそれらの相補体を含有する。プ
ローブ２２２７及びプローブ２２１９は、１６Ｓのリボ
ソームサブユニットのｒＲＮＡとハイブリッド形成する
ことができる。プローブ２３３５とプローブ２３３７；
プローブ２３３５とプローブ２３３４；プローブ２３３
４とプローブ２３３６のプローブセットは、２３Ｓのリ
ボソームサブユニットとハイブリッド形成することがで
きる。

【００３０】本発明の実施態様はまた、マイコプラズマ
・ホミニス、ウレアプラズマ・ウレアリティクム及びマ
イコプラズマ・ジェニタリウムの検出に関する方法に関
する。この方法は、マイコプラズマを含むと考えられる
試料を、マイコプラズマ・ホミニス、ウレアプラズマ・
ウレアリティクム及びマイコプラズマ・ジェニタリウム
のｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡに対して優先的にハイブリ
ッド形成することができる１０から２５０ヌクレオチド
を有する核酸組成物の少なくとも１種類のものに接触さ
せることを含む。これらの塩基配列は、核酸組成物をハ
イブリッド形成させる条件下において、マイコプラズマ
生物のｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡに対して優先的にハイ
ブリッド形成する。試料に対してハイブリッド形成条件
を賦課すると、標的存在下ではハイブリッド形成産物が
形成される。ハイブリッド形成産物の検出は、マイコプ
ラズマが存在することを示す。

【００３１】本発明の方法は、２２１９、２２６２、２
２５６、２２４６、２２１８、２２７１、２２２０、２
２５９、２２２７、２３３５、２３３７、２３３４、２
３３６、２１９１、２２２８及び２２６０から成るプロ
ーブにより定義される群から選択される配列内の１０ヌ
クレオチド配列の少なくとも９０％と相補的若しくは相
同である核酸組成物を特徴とする。

【００３２】本発明の実施態様はまた、第１の核酸組成
物及び第２の核酸組成物を用いる方法を特徴とする。異
なる配列の各組成物であって、そして各々は、２２１
９、２２６２、２２５６、２２４６、２２１８、２２７
１、２２２０、２２５９、２２２７、２３３５、２３３
７、２３３４、２３３６、２１９１、２２２８及び２２
６０から成るプローブにより定義される配列の群のなか
の１０個の核酸の少なくとも９０％に対して相補的若し
くは相同である。各セットの配列は、プローブ２２６２
とプローブ２２５６；プローブ２２４６とプローブ２２
１８；プローブ２２５９とプローブ２２７１；プロ−ブ
２２７１とプローブ２２２０；プローブ２１９１とプロ
ーブ２２２８；プローブ２２２８とプローブ２２６０；
プロ−ブ２１９１とプローブ２２６０；プロ−ブ２２２
７とプローブ２２１９；プローブ２３３５とプローブ２
３３７；プローブ２３３５とプローブ２３３４；及びプ
ローブ２３３４とプローブ２３３６、であることが好ま
しい。

【００３３】当業者は、本発明のプローブ組成物は、生
物マイコプラズマ・ホミニス、ウレアプラズマ・ウレア
リティクム及びマイコプラズマ・ジェニタリウムのうち
の１種類以上の存在を検出するためのキットとしてのそ
れらの使用のための適切な指導書と一緒に包装すること
ができるということを認識するであろう。

【００３４】核酸組成物及び本発明の方法は、綿棒で採
取した生殖器の分泌液（ｇｅｎｉｔａｌ ｓｗａｂ
ｓ）、生殖器の洗浄液、喀痰、綿棒で採取した咽喉の分
泌液（ｔｈｒｏａｔ ｓｗａｂｓ）、血液、尿、脳脊髄
液、皮膚、生検、唾液、滑液、気管支洗浄液、気管支洗
浄液等の臨床的試料、あるいは、ヒト患者もしくは獣医
学的実験材料由来の他の組織もしくは液体試料における
非淋菌性尿道炎、敗血性流産、骨盤内炎症性疾患、産褥
敗血症熱の３種類の仮説的な原因学的作用因子の特異的
検出のための核酸ハイブリッド形成アッセイのための基
礎を提供する。本発明の核酸組成物はまた、液体もしく
は半固体のインビトロ培養物中の生殖器マイコプラズマ
の存在の検証のための基礎を形成する。

【００３５】本発明の実施態様は、ｒＲＮＡに対してハ
イブリッド形成することができる核酸を特徴とする。リ
ボソームＲＮＡは細胞質容量の重要な成分を構成する。
細胞質リボソームの成分の概算量は異なるものの、活発
に増殖している細菌細胞は、細胞当たり最高で１０，０
００のリボソームを含有している可能性があり、そのた
めリボソーム内では１：１：１の化学量論的な比率で各
ｒＲＮＡの１０，０００コピーが存在する。それと比較
すると、遺伝子ないしはそのＲＮＡ転写物等、他の種類
の細胞質標的分子としての可能性があるものは、存在量
が非常に少ないという理由からあまり理想的ではない。
しかしながら、マイコプラズマ種と識別したいと願う多
数の生物が非常に近似しているために、マイコプラズマ
・ホミニス、ウレアプラズマ・ウレアリティクム及びマ
イコプアズマ・ジェニタリウムのｒＲＮＡ及びｒＤＮＡ
に対して優先的にハイブリッド形成する核酸組成物を実
際に作ることができるかどうかについて確証はない。

【００３６】生殖器マイコプラズマ単離物の検出に関す
る本発明のプローブの驚くべき包括的かつ排他的特性を
用いることによって、これらの種間あるいは他の細菌分
類群（記載したもの以外）に対しての交差反応を必ずし
も引き起こさないようなプローブを作成することができ
たという発見は、予想外であり推測外のことであった。

【００３７】本発明の原理及び態様は、後掲の表および
図を参照することにより、より深く理解されるであろ
う：なお、表１はプローブの物理的構造を記載してお
り、表２、３、４及び５は表項目にある臨床面及び環境
面で代表的なマイコプラズマ種に対するプローブのハイ
ブリッド形成反応性を示し、表６はマイコプラズマ・ホ
ミニス、ウレアプラズマ・ウレアリティクム及びマイコ
プラズマ・ジェニタリウムの１６Ｓ ｒＲＮＡ配列並び
にマイコプラズマ・ジェニタリウムの１６Ｓ ｒＲＮＡ
配列を説明する。また、図１は二重プローブ捕捉／検出
アッセイを図式的に表したものである。

【００３８】発明の詳細な説明及びベスト・モード 本発明の好ましい実施態様は、マイコプラズマ・ホミニ
ス、ウレアプラズマ・ウレアリティクム及びマイコプラ
ズマ・ジェニタリウムに対するプローブとして特有な有
用性を有する核酸組成物に関してじられる。詳細な論議
によって、プローブの作成法、ドットブロット分析、サ
ンドウィッチハイブリッド形成アッセイ、機器的ハイブ
リッド形成及び増幅化が特徴づけられるだろう。

【００３９】I．プロ−ブ作成法 本発明のプローブ作成において採られた最初の工程は、
所望の感度を有する特異的核酸プローブのために標的部
位として働くことができる１６Ｓ ｒＲＮＡ及び２３Ｓ
ｒＲＮＡの領域の同定を含んだ。所望の感度を得るた
めに、マイコプラズマ・ホミニス、ウレアプラズマ・ウ
レアリティクム及びマイコプラズマ・ジェニタリウムに
対して特有なプローブ標的の探索を始めた。

【００４０】マイコプラズマの１６Ｓ及び２３ＳｒＲＮ
Ａ配列の正確な配列線（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）が展開
（ｄｅｖｅｌｏｐ）された。マイコプラズマ・ジェニタ
リウム由来の本質的に完全な１６Ｓ ｒＲＮＡ及び２３
Ｓ ｒＲＮＡ配列が決定された。ウレアプラズマ・ウレ
アリティクム及びマイコプラズマ・ホミニス由来の１６
Ｓｒ ＲＮＡ配列は、Ｗｅｉｓｂｕｒｇ他（Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｂａｃｔｒｅｉｏｌｏｂｙ、１７１巻、１
９８９年）及びＧＥＮＢＡＮＫ受託番号Ｍ２３９３５及
びＭ２４４７３を通じて入手可能である。

【００４１】マイコプラズマ・ジェニタリウム由来のヌ
クレオチド配列は、プローブ設計に関する当業者には良
く知られている標準的な研究室用の方法により決定され
た。実施例により、１６ＳｒＤＮＡ及び２３ＳｒＤＮＡ
由来のポリメラーゼ連鎖反応生産物を制限酵素消化した
プラスミドベクター内につなぎ入れることにより作成し
たプラスミドクローンから、その配列を決定することが
できる。

【００４２】マイコプラズマの配列を、興味ある変化の
領域を同定するために、他のマイコプラズマ及び非マイ
コプラズマのリボソームＲＮＡ配列の相同な配列と一緒
に直線にして並べた。興味ある変化が現れている領域
が、表１の各プローブの配列図で同定される。

【００４３】

【表１】 マイコプラズマ・ホミニス、マイコプラズマ・ジェニタ
リウム及びウレアプラズマ・ウレアリティクムの標的配
列を考慮することに加え、他のマイコプラズマ及び生殖
器に関連する他の病原性生物をハブリッド形成から排除
することも考慮した。プローブ領域を、以下に示す生物
（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号は、Ｗｅｉｓｂｕｒｇ他、Ｊ
ｕｌ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｂｙ、１７１巻、１９８
９年、に示されている）の１６Ｓ ｒＲＮＡ配列と比較
した：マイコプラズマ・アガラクティエ（Ｍ．ａｇａｌ
ａｃｔｉａｅ）、マイコプラズマ・アルギニーニ（Ｍ．
ａｒｇｉｎｉｎｉ）、マイコプラズマ・アルスリティデ
ィス（Ｍ．ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）、マイコプラズマ
・ボビゲニタリウム（Ｍ．ｂｏｖｉｇｅｎｉｔａｌｉｕ
ｍ）、マイコプラズマ・カリフォルニクム（Ｍ．ｃａｌ
ｉｆｏｒｎｉｃｕｍ）、マイコプラズマ・カプリコルム
（Ｍ．ｃａｐｒｉｃｏｌｕｍ）、マイコプラズマ・エリ
クニエ（Ｍ．ｅｌｌｙｃｈｎｉａｅ）、マイコプラズマ
・メラロイクム（Ｍ．ｍｅｌａｌｅｕｃｕｍ）、マイコ
プラズマ・フェルメンタンス（Ｍ．ｆｅｒｍｅｎｔａｎ
ｓ）、マイコプラズマ・ガリセプティクム（Ｍ．ｇａｌ
ｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ）、マイコプラズマ・ヒヨニュー
モニエ（Ｍ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプ
ラズマ・ヒヨリニス（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）、マイ
コプラズマ・アイオエ（Ｍ．ｉｏｗａｅ）、マイコプラ
ズマ・リポフィラム（Ｍ．ｌｉｐｏｐｈｉｌｕｍ）、マ
イコプラズマ・モービレ（Ｍ．ｍｏｂｉｌｅ）、マイコ
プラズマ・ムーリス（Ｍ．ｍｕｒｉｓ）、マイコプラズ
マ・マイコイデス（Ｍ．ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、マイコプ
ラズマ・ノイロリティクム（Ｍ．ｎｅｕｒｏｌｙｔｉｃ
ｕｍ）、マイコプラズマ・オーラレ（Ｍ．ｏｒａｌ
ｅ）、マイコプラズマ・ピーラム（Ｍ．ｐｉｒｕｍ）、
マイコプラズマ・ニューモニエ（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉ
ａｅ）、マイコプラズマ・パルモニス（Ｍ．ｐｕｌｍｏ
ｎｉｓ）、マイコプラズマ・プトレファキエンス（Ｍ．
ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ）、マイコプラズマ・サリバ
リウム（Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）、マイコプラズマ
・スアルビ（Ｍ．ｓｕａｌｖｉ）、１０種類のスピロプ
ラズマ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ）種の配列、４種類の
アコレプラズマ（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ）種の配
列、４種類のアネロプラズマ（Ａｎａｅｒｏｐｌａｓｍ
ａ）種の配列、及び１種類のアステロレプラズマ（Ａｓ
ｔｅｒｏｌｅｐｌａｓｍａ）の配列。

【００４４】生殖器に関する病的状態の類似する型を引
き起こす可能性がある他の微生物を考慮するために、数
種のカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）イースト、ネイセリア
・ゴノローエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏ
ｅａｅ）、キラミジア・トラコマティス（Ｃｈｌａｍｙ
ｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、トレポネーマ・パ
リダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ）及び
かなりの数の他種に由来するｒＲＮＡ配列が利用された
が、これらの大多数はＧｅｎＢａｎｋ等の配列コンピレ
ーション（ｃｏｍｐｉｌａｔｉｏｎ）から入手可能であ
る。当業者は、プローブとしての該配列を、同様に他の
生物のものと比較することができるということを認識す
るだろう。

【００４５】設計され、合成され、テストされた１６種
類のプローブが表１に記載されている。あるプローブ、
すなわちプローブ２２１９は、「マイコプラズマ・ニュ
ーモニエに関する核酸プローブ」と題された同時に特許
出願中の米国特許Ｎｏ．６７３，６８６の標題物質であ
る。７種類のプローブがウレアプラズマ・ウレアリティ
クムの１６Ｓ ｒＲＮＡに対して興味ある特異性を示
す。３種類のプローブがマイコプラズマ・ホミニスの１
６ＳｒＲＮＡに対して興味ある特異性を示す。１種類の
プローブがマイコプラズマ・ジェニタリウムの１６Ｓ
ｒＲＮＡに対して興味ある特異性を示す。４種類のプロ
ーブがマイコプラズマ・ジェニタリウムの２３Ｓ ｒＲ
ＮＡに対して興味ある特異性を示す。マイコプラズマ・
ジェニタリウム及びマイコプラズマ・ニューモニエの両
方を認識するプローブについては、発明の権利者がＷｅ
ｉｓｂｕｒｇ及びＰｅｌｌｅｔｉｅｒで、本出願と同時
に提出された特許出願中に記載されている。

【００４６】プローブの説明 プローブ選択法により、臨床的あるいは他の試料におけ
る生殖器マイコプラズマに対するハイブリッド形成につ
いて有効な１６種類の核酸組成物が産生された。ある型
のプローブの特異的挙動は、表２、３、４及び５に記載
されている。

【００４７】

【表２】

【表３】

【表４】

【表５】 ここで当該表について言及すると、マイコプラズマ・ジ
ェニタリウムの３種類の代表的な株は、国立アレルギー
・感染性疾患研究所のマイコプラズ部門（Ｎａｔｉｏｎ
ａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａ
ｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ’ｓ Ｍ
ｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｓｅｃｔｉｏｎ）により選択され
たものを表す。５種類の代表的なマイコプラスマ・ホミ
ニス株及びウレアプラズマ・ウレアリティクムの１５種
総ての血清種は、バーミンガム（Ｂｅｒｍｉｎｇｈａ
ｍ）のアラバマ大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａ
ｌａｂａｍａ）のマイコプラズマ・コレクションからの
代表的な収集株である。バクテリアの追加的な株及び幾
種かの真菌類を、既知のバクテリア分類群の幅広さを表
すために表項目に加えた。

【００４８】種の特異的な株は、精製され変性されたＲ
ＮＡを膜へ移し、それにプローブハイブリッド形成を行
うことによってよって表わされる。当業者に良く知られ
ている標準的な方法及び化学的手段によりプローブを合
成し、³²Ｐラベルし、６０℃における標準的な条件下で
表項目に記載されている株に対してハイブリッド形成を
行い、オートラジオグラフィーで定量した。

【００４９】表２において、ハイブリッド形成は「＋」
または「−」のいずれかとして表示される。陽性のハイ
ブリッド形成は、３時間の露光の後のオートラジオグラ
フィーでのシグナルの検出に基づいて測定する。ウレア
プラズマ・ウレアリティクムの培養はミリリットルあた
り百万（細胞）以上の密度になることがほとんどないた
め、この表項目のプローブはこのような方法で測定し
た。ウレアプラズマ・ウレアリティクム標的に対するウ
レアプラズマのプローブのハイブリッド形成により生成
されたシグナルを標準化するために、ハイブリッド形成
シグナルを全てのバクテリア種に対してハイブリッド形
成するとして知られているプローブ（同時に特許出願中
の米国特許３５９，１５８；プローブ１６６０）のシグ
ナルと比較した。プローブ１６６０からのシグナルが非
常に弱い場合も、候補となっているウレアプラズマのプ
ローブのシグナルをそれに従って「標準化」した。対照
プローブであるプローブ１６６０に対して同等なシグナ
ルを得るために各株に対してスポットする核酸量を調整
してある場合には、ウレアプラズマ・ウレアリティクム
の「＋」表示の全ては、従って、「＋＋＋」もしくは
「＋＋＋＋」であるとみなされるだろう。

【００５０】表３、４及び５において、「＋＋＋＋」は
３時間の露光後の最強のハイブリッド形成シグナルを表
し、やや弱いシグナルを「＋＋＋」で表示し、「＋＋」
へと弱くなり、後に「＋」となり、「＋−」は事実上は
シグナル無しと同様であり、「−」は標的に対するプロ
ーブのハイブリッド形成が示されないことを表示する。

【００５１】前述のプローブの特異的挙動は、それらを
使用するアッセイ型に大いに依存する。逆に言えば、ア
ッセイ型により特定のプローブのある最適な特性が示さ
れる。本発明のプローブの「本質」は、選ばれたプロー
ブ中の特異的なヌクレオチド鎖に対して限定されるとし
て解釈されるものではない。例えば、これらの独自のオ
リゴヌクレオチドの長さは、ドット−ブロットアッセイ
及びサンドイッチアッセイ中での使用のために最適化さ
れた。プローブの最適な長さは、選択されたハイブリッ
ド形成条件の緊縮度の関数となり、そのため本明細書文
中に開示されているプローブの長さはそれに応じて変化
させても良いということは、当業者にとってよく知られ
ていることである。通常、安定性を確保し、充分な排他
性及び包括性を得るために、プローブ配列は少なくとも
１０個のヌクレオチドを含む。プローブ配列が２５０個
のヌクレオチドを越えることは殆ど無い。核酸が長くな
るほど、必要な排他性及び包括性を得るように制御する
ことが困難になる。

【００５２】１種類超のプローブを含むセットについて
考慮した場合、プローブを使用するどのような特定の型
式においても全てのプローブが矛盾なく挙動するのが望
ましい。そのため、特定のプローブの正確な長さは、そ
の特定の意図される使用をある程度反映するだろう。

【００５３】本発明の核酸は、オリゴヌクレオチドプロ
ーブとして使用され得る、または、リボ核酸もしくはデ
オキシリボ核酸のいずれかのものより長いポリヌクレオ
チド内に挿入可能であると思われる配列を制限する。本
明細書中に記載されているプローブ配列に対して相補的
な配列は、ｒＲＮＡ遺伝子に対するプローブとして使用
することが可能である。好ましいプローブ配列もしくは
それらの相補体を、ポリメラーゼ連鎖反応、配列決定あ
るいはその他の適用例に対する鎖伸長開始物質として用
いることができる。

【００５４】プローブの物理的説明は、組み込まれてい
る表１及び２を引用することによって確かめることがで
きる。ヌクレオチドに対する略称、Ｇ、Ａ、Ｃ及びＴ、
並びに５’及び３’により表示されるポラリティ（ｐｏ
ｌａｒｉｔｙ）は、当業者には良く知られた標準的な名
称である。

【００５５】好ましいプローブの実験的特異性は、実施
例１に記載するように、表２、３、４及び５に要約して
ある。特異性とは実験上のものであり、先に述べたよう
に、プローブを使用する型式に依存する。

【００５６】

【実施例】

実施例１． プローブのハイブリッド形成反応のドット
−ブロット分析 良く知られている方法によると、ドット・ブロット分析
は、この目的のために特に商業的に入手可能な、ニトロ
セルロース、ナイロンもしくは他の誘導化膜等のフィル
ター上への１種類の核酸もしくは核酸集団の固定を含
む。ＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかは、このようなフ
ィルター上に容易に固定することができ、その後、多数
の条件（例えば、緊縮度）下において、ヌクレオチド配
列もしくはかかるプローブでプローブ反応を行うか、あ
るいは、ハイブリッド形成に関するテストを行うことが
できる。緊縮条件下では、そのヌクレオチド配列が標的
に対してかなり高い相補性を有するプローブは、相補性
をあまり含まないプローブよりは高いレベルのハイブリ
ッド形成を示す。

【００５７】本発明の核酸配列を、ドット−ブロット型
式においてテストした。記載してあるように、ウレアプ
ラズマを除いては、フェノール抽出及びエタノール沈澱
により精製した１００ナノグラムのＲＮＡを変性させ、
ナイロン膜上にスポットした。プローブは、オリゴヌク
レオチドの５’端に対する³²Ｐ部分を添加して同位元素
ラベルした。プローブのハイブリッド形成は、６０℃に
おける、１．０８Ｍ塩化ナトリウム、６０ｍＭリン酸ナ
トリウム、及び６ｍＭエチレンジアミンの存在下におい
て反応を行った。ハイブリッド形成しなかったプローブ
を、ハイブリッド形成条件の１／３の塩濃度で洗浄して
除去した。フィルターをＸ線フィルムに対して露光し、
ハイブリッド形成シグナルの強度を３時間の露光の後測
定した。表２、３、４及び５では、本実施例で使用した
プローブの反応を要約し、かつ先に要約した特異性を示
す。

【００５８】実施例２． ２重プローブのハイブリッド
形成 本発明のある実施態様は、「サンドイッチ」ハイブリッ
ド形成機構におけるプローブの使用を含む。ここで図１
を見てみると、サンドイッチハイブリッド形成機構は、
捕捉プローブ１２と検出プローブ１３を使用している。
捕捉プローブ１２は、高い標的特異性を有するプローブ
配列に対してホモポリマーでできている３’末端部分を
付加することにより製造された２重機能性のポリヌクレ
オチドである。次にこの尾部が、ガラスビーズもしくは
フィルターディスクのような固体支持体１０上で相補的
ホモポリマー１１に対してハイブリッド形成する。捕捉
プローブ１２の、その標的１５、この場合にはマイコプ
ラズマｒＲＮＡである、に対するハイブリッド形成によ
り、固体支持体１０上で標的・プローブ複合体が形成さ
れる。検出プローブ１３はある程度の特異性を有して標
的に対して結合することができ、これが放射活性、蛍光
物質、ケミルミネッセンス、発色及びその類いのものに
依存する検出機構の一部を成す。検出プローブ１３は、
完全なハイブリッド形成複合体の存在を表示する検出部
分１４を有する。検出プローブ１３は、ＲＮＡ配列とし
て、Ｋｒａｍｅｒ及びＬｉｚａｒｄｉ（Ｎａｔｕｒｅ、
３３９巻、１９８９年）により記載されている増幅化が
可能なＱ−ベーター中間変異株内へ取り込ませることが
潜在的に可能であろう。

【００５９】実施例３． 生殖器マイコプラズマ感染の
臨床診断 綿棒で採取した分泌物、尿、または洗浄液のような臨床
試料に、全ての核酸含有物を遊離させるための処理を行
う。切断されたマイコプラズマを含有するその試料を、
グアニジニウム イソチオシアネートのようなカオトロ
ピックなバッファー中で、実施例２と同様に、捕捉プロ
ーブ、検出プローブ、及びオリゴ−チミジンでデリバタ
イズされている（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ）磁石粒ビー
ズの存在下でインキュベートする。

【００６０】標的分子、すなわちマイコプラズマ・ジェ
ニタリウムの１６Ｓもしくは２３ＳｒＲＮＡ、ウレアプ
ラズマ・ウレアリティクムの１６Ｓ ｒＲＮＡ、または
マイコプラズマ・ホミニスの１６Ｓ ｒＲＮＡが（どの
プローブセットを使用するかに依存する）存在する場合
には、ビーズ＋捕捉プローブ＋標的＋検出プローブのハ
イブリッド形成複合体が、図１に示されるように形成さ
れる。反応用試験管の底付近に磁石を存在させることに
より、ハイブリッド形成複合体を保有する磁性粒子を試
験管の側面に吸着させることができ、試料マトリック
ス、非結合のプローブ等を除去することができるだろ
う。ビーズ＋プローブ＋標的複合体の再水和及び変性を
繰り返すことにより、バックグラウンド値をかなり低減
することができるだろう（米国特許９２２，１５５、Ｃ
ｏｌｌｉｎｓ、１９８６年、に記載）。本実施例におい
て、最終検出は、ビーズを膜上にスポットし、そしてオ
ートラジオグラフィーによってアッセイしてもよい。あ
るいは、検出プローブは実施例２で記載したように増幅
可能な中間変異プローブであってもよい。

【００６１】この特別なアッセイのためには、以下の捕
捉及び検出プローブが好適な組の例である： （１） ウレアプラズマ・ウレアリティクム １６Ｓ ｒＲＮＡ プローブ２２６２＋プローブ２２５６ プローブ２２４６＋プローブ２２１８ プローブ２２５９＋プローブ２２７１ プローブ２２７１＋プローブ２２２０ （２） マイコプラズマ・ホミニス １６Ｓ ｒＲＮＡ プローブ２１９１＋プローブ２２２８ プローブ２２２８＋プローブ２２６０ プローブ２１９１＋プローブ２２６０ （３） マイコプラズマ・ジェニタリウム １６Ｓ ｒＲＮＡ プローブ２２２７＋プローブ２２１９ （４） マイコプラズマ・ジェニタリウム ２３Ｓ ｒＲＮＡ プロ−ブ２３３５＋プローブ２３３７ プローブ２３３５＋プローブ２３３４ プローブ２３３４＋プローブ２３３６ 実施例４． マイコプラズマｒＤＮＡのポリメラーゼ連
鎖反応増幅を用いるヒト試料からのマイコプラズマ・ホ
ミニス、マイコプラズマ・ジェニタリウム、またはウレ
アプラズマ・ウレアリティクム感染の臨床診断 試料処理法は、ＤＮＡを回収するように設計されてい
る。本明細書中に記載されているプローブのうちの一つ
を、本明細書中に記載されているプローブの一つに対し
て逆平行な相補体と結合させるのに用い、マイコプラズ
マのｒＲＮＡをコードするマイコプラズマ・ジェニタリ
ウム、マイコプラズマ・ホミニス、ウレアプラズマ・ウ
レアリティクムのセグメントを、ポリメラーゼ連鎖反応
において酵素を用いて増幅する。結果として得られる物
質を、その後、本明細書中に記載してあるプローブを用
いて「サンドイッチ」ハイブリッド形成法（実施例２）
でアッセイすることができる。ポリメラーゼ連鎖反応
は、それ自体、本明細書中に記載のプローブ／プライマ
ーを使用することによって非常に特異的なものとするこ
とができ、あるいは、同時に特許出願中の米国特許３５
９，１５８で記載したようなプローブを用いて、該反応
をよりより一般的なものとすることができ、そしてその
後、実施例２に記載したように生殖器マイコプラズマと
して増幅化した生産物を同定する。

【００６２】実施例５． 細胞学的染色としてのイン・
サイチュー（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリッド形成法 本発明のプローブは、細胞学的染色用試薬として用いて
も良い。例えば、綿棒で採取した生殖器の分泌液（ｇｅ
ｎｉｔａｌ ｓｗａｂ）を顕微鏡スライド上に載せる。
適当に固定化及び溶菌させた後、原位置（イン・サイチ
ュー）でプローブのハイブリッド形成を行う。本実施例
では、プローブ２２２７、２２６０及び２２７１を蛍光
物質でラベルすることにより標本中でマイコプラズマを
可視化することができ、そして蛍光顕微鏡を用いてスラ
イドを検査し、小さな蛍光性の物体を探す。

【００６３】実施例６． 培養を伴う仮定的マイコプラ
ズマ種同定の確認 マイコプラズマ・ホミニス、マイコプラズマ・ジェニタ
リウム、もしくはウレアプラズマ・ウレアリティクムの
ための標準的な培養段階に続いて、例えばＨ−アガロー
スプレート、ＳＰ−６ブイヨン、１０Ｂブイヨン、もし
くはＡ８アガロース上で、実施例２及び３で記載された
サンドイッチハイブリッド形成アッセイを用いて、生殖
器マイコプラズマのうちの１種類の存在のために、コロ
ニーまたは液体培養をテストする。純粋培養は必要でな
い。

【００６４】このように、本発明は、マイコプラズマ・
ホミニス、ウレアプラズマ・ウレアリティクム及びマイ
コプラズマ・ジェニタリウムの存在の検出に使用するの
に適した核酸配列を特徴とする。これらの生物のうちの
１種類のものの存在について試料をテストするために必
要なプローブ、試薬及び組成物は、適切な容器に詰めて
キットに仕立てることができるということを、当業者な
ら容易に認識するであろう。キットのこのようなプロー
ブ、試薬及び組成物を、先に特定した生物のうちの１種
類以上のものについて試料をテストするのに使用される
であろう。

【００６５】本発明の好ましい実施態様が説明され記載
されてきたが、本発明は変形及び修正することができ、
そのため、記載された正確な詳細に限定されるのではな
く、特許請求の範囲内に属するそのような変化及び修正
を含むべきであるということが理解される。

【図面の簡単な説明】

【図１】２重プローブ捕捉／検出アッセイを模式的に表
した図である。

【符号の説明】

１０ 固体支持体 １１ 相補的ホモポリマー １２ 捕捉プローブ １３ 検出プローブ １４ 検出部分 １５ 標的

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 非マイコプラズマ細菌及びヒトのｒＲＮ
   ＡもしくはｒＤＮＡに対してよりもヒト尿路及び生殖器
   領域に関連する病原性マイコプラズマ細菌のｒＲＮＡも
   しくはｒＤＮＡに対して優先的にハイブリッド形成する
   ことができる約１０から２５０のヌクレオチドを有す
   る、組成物としての核酸。
2. 【請求項２】 当該マイコプラズマ細菌が、マイコプラ
   ズマ・ホミニス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｈｏｍｉｎｉ
   ｓ）、ウレアプラズマ・ウレアリティクム（Ｕｒｅａｐ
   ｌａｓｍａ ｕｒｅａｌｙｔｉｃｕｍ）、及びマイコプ
   ラズマ・ジェニタリウム（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇｅ
   ｎｉｔａｌｉｕｍ）である、請求項１に記載の核酸。
3. 【請求項３】 核酸が、５０から１００、４２５から４
   ８５、１１００から１１５０から成る位置の群から選択
   されるマイコプラズマ・ホミニスの１６ＳｒＲＮＡもし
   くは１６Ｓ ｒＤＮＡの領域に対してハイブリッド形成
   することができる、請求項１に記載の核酸。
4. 【請求項４】 核酸が、５０から１００、１５０から２
   ５０、４２５から４８５、８００から８５０、１０９０
   から１１６０、及び１２２０から１２６０から成る位置
   の群から選択されるウレアプラズマ・ウレアリティクム
   の１６Ｓ ｒＲＮＡもしくは１６Ｓ ｒＤＮＡの領域に
   対してハイブリッド形成することができる、請求項１に
   記載の核酸。
5. 【請求項５】 核酸が、１１１０から１１６０から成る
   位置の群から選択されるマイコプラズマ・ジェニタリウ
   ムの１６Ｓ ｒＲＮＡもしくは１６Ｓ ｒＤＮＡの領域
   に対してハイブリッド形成することができる、請求項１
   に記載の核酸。
6. 【請求項６】 核酸が、２６０から３３０、１５９０か
   ら１６３０、及び、１８５０から１９００から成る位置
   の群から選択されるマイコプラズマ・ジェニタリウムの
   １６Ｓ ｒＲＮＡもしくは２３Ｓ ｒＤＮＡの領域に対
   してハイブリッド形成することができる、請求項１に記
   載の核酸。
7. 【請求項７】 当該核酸が、配列２２６２、２２５６、
   ２２４６、２２１８、２２７１、２２２０、２２５９、
   ２２２７、２３３５、２３３７、２３３４、２３３６、
   ２１９１、２２２８及び２２６０から成る群から選択さ
   れる核酸配列を有する任意の連続する１０ヌクレオチド
   を含む一つの配列の少なくとも９０％に対して相補的で
   ある、請求項１に記載の核酸。
8. 【請求項８】 当該核酸が、プローブ２２６２、２２５
   ６、２２４６、２２１８、２２７１、２２２０、２２５
   ９、２２２７、２３３５、２３３７、２３３４、２３３
   ６、２１９１、２２２８、及び２２６０から成るプロー
   ブにより定義される配列の群から選択される任意の連続
   する１０ヌクレオチドを含む一つの配列の少なくとも９
   ０％に対して相同である、請求項１に記載の核酸。
9. 【請求項９】 少なくとも２種類以上の核酸組成物のセ
   ットであって、各核酸組成物が、異なる配列組成物の約
   １０から２５０ヌクレオチドを有し、非マイコプラズマ
   性細菌またはヒトのｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡに対して
   よりもヒトの尿路及び生殖器領域に関与する病原性マイ
   コプラズマ細菌のｒＲＮＡもしくはｒＤＮＡに対して優
   先的にハイブリッド形成することができ、各核酸が、プ
   ローブ２２６２、２２５６、２２４６、２２１８、２２
   ７１、２２２０、２２５９、２２２７、２３３５、２３
   ３７、２３３４、２３３６、２１９１、２２２８及び２
   ２６０により定義される配列の群から選択される任意の
   連続する１０ヌクレオチドを含む一つの配列の少なくと
   も９０％に対して相補的であるかあるいは相同であり、
   かつ当該残存核酸が残存配列から選択される、製造物品
   としての上記核酸組成物のセット。
10. 【請求項１０】 当該セットが、以下のプローブ、 プローブ２２６２とプローブ２２５６； プローブ２２４６とプローブ２２１８； プロ−ブ２２５９とプローブ２２７１； プローブ２２７１とプローブ２２２０；及びそれらの相
    補物により定義される核酸組成物セットの群から選択さ
    れ、当該セットがウレアプラズマ・ウレアリティクムを
    検出するためのものである、請求項９に記載の製造物
    品。
11. 【請求項１１】 当該セットが、以下のプローブ、 プローブ２１９１とプローブ２２２８； プローブ２２２８とプローブ２２６０； プローブ２１９１とプローブ２２６０；及びそれらの相
    補物により定義される核酸組成物セットの群から選択さ
    れ、当該セットがマイコプラズマ・ホミニスを検出する
    ためのものである、請求項９に記載の製造物品。
12. 【請求項１２】 当該セットが、以下のプローブ、 プローブ２２２７とプローブ２２１９、及びそれらの相
    補物により定義される核酸組成物セットの群から選択さ
    れ、当該セットがマイコプラズマ・ジェニタリウムを検
    出するためのものである、請求項９に記載の製造物品。
13. 【請求項１３】 当該セットが、以下のプローブ、 プローブ２３３５とプローブ２３３７； プロ−ブ２３３５とプローブ２３３４； プロ−ブ２３３４とプローブ２３３６；及びそれらの相
    補物により定義される核酸組成物セットの群から選択さ
    れ、当該セットがマイコプラズマ・ジェニタリウムを検
    出するためのものである、請求項９に記載の製造物品。
14. 【請求項１４】 試料中のマイコプラズマ・ホミニス、
    ウレアプラズマ・ウレアリティクム、またはマイコプラ
    ズマ・ジェニタリウムを検出するための方法であって、 ａ） 当該核酸組成物をハイブリッド形成させる条件下
    で、当該試料を、該マイコプラズマ生物のｒＲＮＡまた
    はｒＤＮＡに対して優先的にハイブリッド形成する１０
    から２５０のヌクレオチドを有する核酸組成物の少なく
    とも１つと接触させ、 ｂ） 当該試料にハイブリッド形成条件を賦課し、標的
    物質の存在下でハイブリッド形成産物を形成させ、そし
    て、 ｃ） 当該マイコプラズマの存在の指標としての当該ハ
    イブリッド形成産物を検出する、ことを含む、上記方
    法。
15. 【請求項１５】 当該接触段階の当該核酸組成物が、２
    ２１９、２２６２、２２５６、２２４６、２２１８、２
    ２７１、２２２０、２２５９、２２２７、２３３５、２
    ３３７、２３３４、２３３６、２１９１、２２２８及び
    ２２６０から成るプローブにより定義される配列の群か
    ら選択される任意の連続する１０ヌクレオチドの少なく
    とも９０％に対して相補的もしくは相同である、請求項
    １４に記載の方法。
16. 【請求項１６】 当該接触段階で第一の核酸組成物と第
    二の核酸組成物を用い、各核酸が異なる配列を有し、か
    つ、２２１９、２２６２、２２５６、２２４６、２２１
    ８、２２７１、２２２０、２２５９、２２２７、２３３
    ５、２３３７、２３３４、２３３６、２１９１、２２２
    ８、及び２２６０から成るプローブにより定義される配
    列の群から選択される任意の連続する１０ヌクレオチド
    の少なくとも９０％に対して相補的もしくは相同であ
    る、請求項１４に記載の方法。
17. 【請求項１７】 当該第一の核酸組成物と当該第二の核
    酸組成物とが、 プローブ２２６２とプローブ２２５６； プローブ２２４６とプローブ２２１８； プローブ２２５９とプローブ２２７１； プローブ２２７１とプローブ２２２０； プローブ２１９１とプローブ２２２８； プロ−ブ２２２８とプローブ２２６０； プロ−ブ２１９１とプローブ２２６０； プローブ２２２７とプローブ２２１９； プローブ２３３５とプローブ２３３７； プローブ２３３５とプローブ２３３４；及び プローブ２３３４とプローブ２３３６、 から成るプローブにより定義されるセットの群から選択
    されるセットである、請求項１６に記載の方法。
18. 【請求項１８】 ヒト、真菌類、及び、下記の３種以外
    のマイコプラズマのｒＲＮＡ若しくはｒＤＮＡに対して
    よりも該下記の生物のｒＲＮＡ若しくはｒＤＮＡに対し
    て優先的にハイブリッド形成することができる１０から
    ２５０のヌクレオチド有する核酸を含む、マイコプラズ
    マ・ホミニス、ウレアプラズマ・ウレアリティクム及び
    マイコプラズマ・ジェニタリウムから成る生物の１種類
    以上の存在を検出するためのキット。