JPH06222059A - Fluorescence-labeled reagent and fluorescence immunoassay - Google Patents
Fluorescence-labeled reagent and fluorescence immunoassayInfo
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- JPH06222059A JPH06222059A JP3447593A JP3447593A JPH06222059A JP H06222059 A JPH06222059 A JP H06222059A JP 3447593 A JP3447593 A JP 3447593A JP 3447593 A JP3447593 A JP 3447593A JP H06222059 A JPH06222059 A JP H06222059A
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Abstract
Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、蛍光免疫測定法による
生理活性物質等の測定に用いる蛍光標識試薬、それを用
いた蛍光免疫測定法および蛍光免疫測定キットに関す
る。さらに詳しくは、半導体レーザを励起光源とした場
合の蛍光標識試薬と蛍光免疫測定法に関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a fluorescent labeling reagent used for measuring physiologically active substances and the like by a fluorescent immunoassay, a fluorescent immunoassay using the same, and a fluorescent immunoassay kit. More specifically, it relates to a fluorescent labeling reagent and a fluorescent immunoassay method using a semiconductor laser as an excitation light source.
【０００２】[0002]
【従来の技術・発明が解決しようとする課題】従来、抗
原、抗体の濃度の測定方法としてはラジオアイソトープ
や酵素で抗原抗体を標識する方法が用いられてきたが、
これらの方法は感度、安全性などの面で問題があり、こ
れらの方法に代わって蛍光色素で抗原抗体を標識し、こ
れを用いて抗原抗体の濃度を測定する方法が種々研究さ
れている。2. Description of the Related Art Conventionally, a method of labeling an antigen / antibody with a radioisotope or an enzyme has been used as a method for measuring the concentration of an antigen / antibody.
These methods have problems in terms of sensitivity and safety, and various methods for labeling the antigen antibody with a fluorescent dye and measuring the concentration of the antigen antibody by using this method have been studied instead of these methods.
【０００３】例えば、特開昭５９−５０１８７３号（米
国特許番号４８５２８０９号）などでは、光ファイバー
の側面に抗原、抗体を結合させ、蛍光色素で標識した抗
体、抗原をこの光ファイバー表面で免疫反応させるとと
もに、この光ファイバーに励起光を導波することによ
り、光ファイバー上の蛍光色素を励起させ、生ずる蛍光
を光ファイバーの出射端面で反射させ、光ファイバーの
入射端面から蛍光と残余の励起光を取り出し、これをビ
ームスプリッターを経由することにより分光させ、蛍光
のみを測定する方法が記載されている。For example, in Japanese Patent Laid-Open No. 59-501873 (US Pat. No. 4,852,809), an antigen and an antibody are bound to the side surface of an optical fiber, and an antibody and an antigen labeled with a fluorescent dye are immunoreacted on the surface of the optical fiber. , By guiding the excitation light to this optical fiber, the fluorescent dye on the optical fiber is excited, the generated fluorescence is reflected at the exit end face of the optical fiber, the fluorescence and the remaining excitation light are extracted from the entrance end face of the optical fiber, and this is beamed. A method is described in which only the fluorescence is measured by making a spectrum through a splitter.
【０００４】従来よりこのような蛍光免疫測定法におい
ては、標識物としてフルオレセインイソチオシアネー
ト、ローダミンイソチオシアネートなどの蛍光色素で修
飾された蛍光標識抗原や蛍光標識抗体が用いられてき
た。しかしながら、このような蛍光標識抗原や蛍光標識
抗体は、抗原又は抗体一つに結合する蛍光色素の量が一
つであるため，感度の改善が困難であった。また、ロー
ダミンやフルオレセイン等の蛍光色素は、励起波長が４
００ｎｍ付近であるため、励起光源が大型で、高価であ
るという欠点を持っていた。そのため、これらの蛍光色
素に代えて、６３０ｎｍ帯で励起するシアニン色素で修
飾されたアビジンをビオチン化抗原やビオチン化抗体で
標識することにより、Ｈｅ−Ｎｅレーザを光源として使
用可能な蛍光標識抗体が開発されている（ＷＯ９０／１
３０２９公報）。Conventionally, in such a fluorescent immunoassay, a fluorescently labeled antigen or a fluorescently labeled antibody modified with a fluorescent dye such as fluorescein isothiocyanate or rhodamine isothiocyanate has been used as a labeling substance. However, it is difficult to improve the sensitivity of such a fluorescently labeled antigen or fluorescently labeled antibody because the amount of the fluorescent dye bound to one antigen or antibody is one. In addition, fluorescent dyes such as rhodamine and fluorescein have an excitation wavelength of 4
Since it is around 00 nm, it has a drawback that the excitation light source is large and expensive. Therefore, in place of these fluorescent dyes, by labeling avidin modified with a cyanine dye that is excited in a 630 nm band with a biotinylated antigen or a biotinylated antibody, a fluorescent labeled antibody that can use a He-Ne laser as a light source is obtained. Being developed (WO90 / 1
3029 publication).
【０００５】しかし、Ｈｅ−Ｎｅレーザは、小型化を図
ると低出力になり、高出力化を図ると大型でかつ高価格
なものとなってしまうという問題がある。一方、Ｈｅ−
Ｎｅレーザより小型のレーザとして半導体レーザが市販
されているが、６３０ｎｍ帯では、実用的で安価で高出
力な半導体レーザは市販されていない。また、従来の蛍
光色素は、水溶媒系で溶けにくく、また溶解しても加水
分解を生じるなど大変不安定であるため、反応試薬の作
成が困難であった。そのため、水溶媒系での反応機会
（時間）を減らす必要があること、アビジンと蛍光色素
がともに溶けた状態で反応させることが困難であるこ
と、さらにアビジンと蛍光色素の結合体の水溶解性が低
いこと等の問題点が指摘されていた。However, the He-Ne laser has a problem that the output becomes low when the size is reduced and becomes large and expensive when the output is increased. On the other hand, He-
A semiconductor laser is commercially available as a laser smaller than the Ne laser, but no practical, inexpensive, and high-power semiconductor laser is commercially available in the 630 nm band. Further, conventional fluorescent dyes are difficult to dissolve in an aqueous solvent system, and even if they are dissolved, they are very unstable such as causing hydrolysis, so that it is difficult to prepare a reaction reagent. Therefore, it is necessary to reduce the reaction opportunity (time) in an aqueous solvent system, it is difficult to react in the state where both avidin and the fluorescent dye are dissolved, and the water solubility of the avidin-fluorescent dye conjugate It was pointed out that there were problems such as low cost.
【０００６】[0006]
【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、前
記の課題を解決するために鋭意検討した。その結果、小
型、低価格、高出力の光源として実用化されている、赤
外域の半導体レーザにより励起でき、しかも水溶媒系で
溶けやすくかつ安定であるため取り扱いの容易な蛍光色
素を見いだし、これをアビジン等の親水性多官能基高分
子に結合させて測定試薬とすることにより、さらに高感
度で低価格な免疫測定を実現でき、また、測定装置の小
型化、低価格化が可能となることを見いだし、本発明を
完成するに至った。SUMMARY OF THE INVENTION Therefore, the present inventors have made extensive studies to solve the above-mentioned problems. As a result, we have found a fluorescent dye that is easy to handle because it can be excited by a semiconductor laser in the infrared region and is easily soluble and stable in a water solvent system, which has been put into practical use as a small-sized, low-cost, high-output light source. By linking to a hydrophilic polyfunctional polymer such as avidin as a measuring reagent, it is possible to realize a more sensitive and low-cost immunoassay, and it is possible to reduce the size and cost of the measuring device. As a result, they have completed the present invention.
【０００７】即ち、本発明の要旨は、 （１）一般式（１）により表されるシアニン色素により
標識された親水性多官能基高分子よりなる蛍光標識試
薬、That is, the gist of the present invention is (1) a fluorescent labeling reagent comprising a hydrophilic polyfunctional polymer labeled with a cyanine dye represented by the general formula (1),
【化４】 （式中、Ｒは水素原子又はハロゲン原子を、ＸはＳ又は
Ｃ（ＣＨ3 ）2 を表し、ｎは０〜５、ｍは０〜４、ｋは
０〜６の整数を示す。） （２）蛍光免疫測定において、前記（１）に記載の蛍光
標識試薬を用い、７５０〜８５０ｎｍの半導体レーザを
励起光源とすることを特徴とする蛍光免疫測定法、 （３）蛍光色素により標識された親水性多官能基高分子
と、該親水性多官能基高分子と直接的または間接的に結
合する生理活性物質よりなる蛍光免疫測定キットにおい
て、該蛍光色素が一般式（１）により表されるシアニン
色素であることを特徴とする蛍光免疫測定キット、並び
に （４）一般式（１）により表される蛍光色素により直接
的またはアミノグリカン及び／又はポリペプチドを介し
て間接的に標識されたアビジン及び／又はプロテインＡ
よりなる結合体、およびビオチン及び／又は免疫グロブ
リンが直接的またはアミノグリカン及び／又はポリペプ
チドを介して間接的に生理活性物質に結合した結合体よ
り構成されることを特徴とする蛍光免疫測定キットに関
する。[Chemical 4] (Wherein, R represents a hydrogen atom or a halogen atom, X represents S or C (CH 3) 2, n is 0 to 5, m is 0 to 4, k is an integer of 0 to 6.) ( 2) In a fluorescent immunoassay, the fluorescent labeling reagent according to (1) above is used, and a semiconductor laser of 750 to 850 nm is used as an excitation light source. (3) Labeled with a fluorescent dye In a fluorescent immunoassay kit comprising a hydrophilic polyfunctional polymer and a physiologically active substance that directly or indirectly binds to the hydrophilic polyfunctional polymer, the fluorescent dye is represented by the general formula (1). A fluorescent immunoassay kit, which is a cyanine dye, and (4) avidin directly or indirectly labeled with an aminoglycan and / or polypeptide by a fluorescent dye represented by the general formula (1) And / or Prote Down A
And a bioimmunoglobulin composed of a biotin and / or an immunoglobulin directly or indirectly bound to a physiologically active substance via an aminoglycan and / or a polypeptide. Regarding
【０００８】本発明の蛍光標識試薬は、一般式（１）に
より表されるシアニン色素により標識された親水性多官
能基高分子よりなるものである。シアニン色素として
は、一般式（１）に示されるものであれば特に限定され
るものではなく、例えば下記構造式（２）を有する色素
ＮＫ３６８２（日本感光色素研究所製）等が挙げられ
る。本発明で用いるこれらのシアニン色素は、赤外域を
吸収する蛍光色素であるため、小型で高出力かつ低価格
な半導体レーザを光源として使用することができる。従
って、装置全体としても小型化、低価格化を実現するこ
とができる。本発明におけるシアニン色素は水溶性が高
く、水溶媒系で親水性多官能基高分子と容易に反応させ
ることができ、また溶解液中で加水分解はみられず安定
である。The fluorescent labeling reagent of the present invention comprises a hydrophilic polyfunctional polymer labeled with a cyanine dye represented by the general formula (1). The cyanine dye is not particularly limited as long as it is represented by the general formula (1), and examples thereof include dye NK3682 (manufactured by Japan Photosensitive Dye Research Institute) having the following structural formula (2). Since these cyanine dyes used in the present invention are fluorescent dyes that absorb in the infrared region, a compact, high-power and low-cost semiconductor laser can be used as a light source. Therefore, downsizing and cost reduction of the entire device can be realized. The cyanine dye in the present invention has high water solubility, can be easily reacted with a hydrophilic polyfunctional polymer in a water solvent system, and is stable in the solution without hydrolysis.
【０００９】[0009]
【化５】 [Chemical 5]
【００１０】本発明の蛍光標識試薬においてシアニン色
素により標識される親水性多官能基高分子としては、特
に限定されるものではなく、例えばアビジン、プロテイ
ンＡ、アミノグリカン、またはポリペプチド等が好適に
使用される。アミノグリカンとしては、例えばキトサ
ン、ポリガラクトサミン、ポリノイラミン酸等が例示さ
れ、ポリペプチドとしては、ポリリジン等が挙げられ
る。The hydrophilic polyfunctional polymer to be labeled with a cyanine dye in the fluorescent labeling reagent of the present invention is not particularly limited, and for example, avidin, protein A, aminoglycan, polypeptide or the like is preferable. used. Examples of the aminoglycan include chitosan, polygalactosamine, polyneuraminic acid and the like, and examples of the polypeptide include polylysine and the like.
【００１１】シアニン色素により親水性多官能基高分子
を標識するには、公知の方法により容易に行われるが、
本発明におけるシアニン色素はカルボキシル基のほかに
強電解性のスルホン酸基を有するため水溶性が高く、水
溶媒系においてアビジン等の親水性多官能基高分子と反
応させることができる。即ち、本発明におけるシアニン
色素と親水性多官能基高分子の結合は、シアニン色素の
カルボキシル基と親水性多官能基高分子のアミノ基とを
トリエチルアミン塩酸緩衝液、トリエタノールアミン塩
酸緩衝液等の水溶媒系中で、縮合剤を用いて、常法によ
り縮合させてアミド結合させることができる。シアニン
色素と親水性多官能基高分子との反応終了後、未反応物
は除去することが好ましく、例えば透析法、遠心分離
法、ゲル濾過法又は限外濾過法などによって除くことが
できる。ここで、縮合剤としては１−エチル−３−
（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド、ジ
−ｐ−トレオイルカルボジイミド、ジシクロヘキシルカ
ルボジイミド、Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モル
フォリノエチル）カルボジイミド メト−ｐ−トルエン
スルホン酸塩（ＣＨＭＣ）のようなカルボジイミド類
や、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ブロモスクシ
ンイミド等が使用される。Labeling of the hydrophilic polyfunctional polymer with a cyanine dye is easily carried out by a known method.
The cyanine dye in the present invention has a strong electrolytic sulfonic acid group in addition to the carboxyl group, and thus has high water solubility and can be reacted with a hydrophilic polyfunctional polymer such as avidin in an aqueous solvent system. That is, the bond between the cyanine dye and the hydrophilic polyfunctional group polymer in the present invention is obtained by combining the carboxyl group of the cyanine dye and the amino group of the hydrophilic polyfunctional group polymer with triethylamine hydrochloric acid buffer solution, triethanolamine hydrochloric acid buffer solution, etc. In a water solvent system, a condensing agent can be used to condense and form an amide bond by a conventional method. After the reaction between the cyanine dye and the hydrophilic polyfunctional polymer is completed, it is preferable to remove unreacted substances, for example, dialysis method, centrifugation method, gel filtration method or ultrafiltration method. Here, as the condensing agent, 1-ethyl-3-
Such as (3′-dimethylaminopropyl) carbodiimide, di-p-toreoylcarbodiimide, dicyclohexylcarbodiimide, N-cyclohexyl-N ′-(2-morpholinoethyl) carbodiimide meth-p-toluenesulfonate (CHMC). Carbodiimides, N-hydroxysuccinimide, N-bromosuccinimide, etc. are used.
【００１２】例えば、親水性多官能基高分子としてアビ
ジンを使用する場合について、さらに具体的な態様を例
示すると、通常４．０×１０-6〜５．０×１０-3Ｍのシ
アニン色素をトリエチルアミン塩酸緩衝液に懸濁し、そ
の懸濁液１０ｍｌに０．５〜２．０ｍｇのアビジンを加
え、前記のような縮合剤をシアニン色素に対してモル比
で等倍〜１００倍量加え、室温で一晩放置する。一晩放
置後、反応液を限外濾過し、未反応色素を除去した後、
限外濾過膜上の残留物を弱アルカリ性の緩衝液を用いて
分取し、乾燥したものをシアニン色素修飾アビジンとす
る。乾燥方法としては種々あるが、好ましくは凍結乾燥
法である。この場合、１分子のアビジンの表面に結合す
るシアニン色素の数が多い程効率が良いが、通常のシア
ニン色素では結合数が多くなると使用時の水溶解性が問
題となるため４分子程度に抑えざるを得ないが、本発明
におけるシアニン色素は水溶性が高いため１５分子程度
結合しても使用に支障がない。For example, in the case of using avidin as the hydrophilic polyfunctional polymer, a more specific embodiment will be described. Generally, a cyanine dye of 4.0 × 10 −6 to 5.0 × 10 −3 M is used. Suspended in triethylamine-hydrochloric acid buffer solution, added 0.5-2.0 mg of avidin to 10 ml of the suspension, and added the condensing agent as described above in an equimolar amount to 100-fold amount with respect to the cyanine dye at room temperature. Leave it overnight. After standing overnight, the reaction solution was ultrafiltered to remove unreacted dye,
The residue on the ultrafiltration membrane is separated using a weakly alkaline buffer solution and dried to obtain cyanine dye-modified avidin. Although there are various drying methods, the freeze-drying method is preferable. In this case, the greater the number of cyanine dyes bonded to the surface of one molecule of avidin, the better the efficiency. However, in the case of ordinary cyanine dyes, when the number of bonded cyanine dyes increases, the water solubility at the time of use becomes a problem. Inevitably, since the cyanine dye of the present invention has high water solubility, it can be used even if about 15 molecules are bound.
【００１３】次に、本発明の蛍光標識試薬を用いて蛍光
免疫測定を行う方法について、本発明のシアニン色素修
飾アビジンを使用する態様を例示して説明する。 工程Ａ：まず、生理活性物質（例えば、測定物質である
抗原）に対する抗体を光ファイバーのコア表面に固定す
る。次いで、該抗体の結合した光ファイバーと生理活性
物質（抗原）を特異的に反応させて、光ファイバーのコ
ア表面上に抗体と生理活性物質（抗原）の結合した免疫
複合体（光ファイバーのコア表面−抗体−生理活性物
質）を形成する。Next, a method for performing a fluorescent immunoassay using the fluorescent labeling reagent of the present invention will be described by exemplifying an embodiment using the cyanine dye-modified avidin of the present invention. Step A: First, an antibody against a physiologically active substance (for example, an antigen as a measurement substance) is immobilized on the core surface of the optical fiber. Then, the optical fiber to which the antibody is bound specifically reacts with the physiologically active substance (antigen), and an immune complex in which the antibody and the physiologically active substance (antigen) are bound to the core surface of the optical fiber (core surface of optical fiber-antibody). A physiologically active substance).
【００１４】工程Ｂ：前記の生理活性物質（抗原）に対
して特異的な結合能を有する抗体の結合したビオチン化
アミノグリカン（抗体−アミノグリカン−ビオチン）と
本発明のシアニン色素修飾アビジン（アビジン−シアニ
ン色素）を反応させて、ビオチン−アビジンの結合を介
したシアニン色素標識抗体を調製する（抗体−アミノグ
リカン−ビオチン−アビジン−シアニン色素）。Step B: Biotinylated aminoglycan (antibody-aminoglycan-biotin) to which an antibody having a specific binding ability to the physiologically active substance (antigen) is bound and the cyanine dye-modified avidin (avidin) of the present invention. -Cyanine dye) to prepare a cyanine dye-labeled antibody through the biotin-avidin bond (antibody-aminoglycan-biotin-avidin-cyanine dye).
【００１５】工程Ｃ：工程Ａで調製した免疫複合体と工
程Ｂで調製したシアニン色素標識抗体を特異的に反応さ
せて、光ファイバーのコア表面−抗体−生理活性物質
（測定物質）−抗体−アミノグリカン−ビオチン−アビ
ジン−シアニン色素の免疫複合体を形成し、７５０〜８
５０ｎｍの半導体レーザを励起光源とする蛍光測定装置
を用いて光ファイバーのコア表面に固定されたシアニン
色素の蛍光を測定する。Step C: The immune complex prepared in Step A and the cyanine dye-labeled antibody prepared in Step B are specifically reacted to form a core surface of the optical fiber-antibody-physiologically active substance (measurement substance) -antibody-amino acid. An immune complex of glycan-biotin-avidin-cyanine dye is formed, and 750 to 8
The fluorescence of the cyanine dye fixed on the core surface of the optical fiber is measured by using a fluorescence measuring device using a semiconductor laser of 50 nm as an excitation light source.
【００１６】前記の説明においては、親水性多官能基高
分子としてアビジンを例としたものであるが、本発明に
おける親水性多官能基高分子は前記のようにアビジン以
外にもプロテインＡ、アミノグリカン、またはポリペプ
チド等が使用される。光ファイバーのコア表面にシアニ
ン色素を固定するために介在する化合物として、アビジ
ンの場合にはビオチンが使用されるように、使用する親
水性多官能基高分子と特異的に結合する化合物が選択さ
れる。具体的には、アビジンとビオチン、プロテインＡ
と抗体などが好ましく、特にアビジンとビオチンの組み
合わせが最適である。In the above description, avidin was taken as an example of the hydrophilic polyfunctional polymer, but the hydrophilic polyfunctional polymer in the present invention is not limited to avidin, but the protein A and amino are used as described above. Glycan, polypeptide or the like is used. As an intervening compound for fixing the cyanine dye on the core surface of the optical fiber, a compound that specifically binds to the hydrophilic polyfunctional polymer to be used is selected, as in the case of avidin, biotin is used. . Specifically, avidin, biotin, protein A
And an antibody are preferable, and a combination of avidin and biotin is particularly preferable.
【００１７】尚、本発明の測定方法における別の態様と
して、シアニン色素修飾アビジンを免疫反応後に反応さ
せて免疫複合体に結合させてもよい。即ち、予め光ファ
イバーのコア表面−抗体−生理活性物質−抗体−アミノ
グリカン−ビオチンからなる免疫複合体を形成させ、こ
れにシアニン色素修飾アビジンを反応させることによ
り、前記と同様に光ファイバーのコア表面にシアニン色
素を固定することができ、前記と同様にして蛍光を測定
する。As another aspect of the measuring method of the present invention, cyanine dye-modified avidin may be reacted after the immune reaction to bind to the immune complex. That is, an immune complex consisting of the core surface of the optical fiber-antibody-physiologically active substance-antibody-aminoglycan-biotin is formed in advance, and by reacting this with a cyanine dye-modified avidin, the core surface of the optical fiber is formed as described above. A cyanine dye can be immobilized and fluorescence is measured as described above.
【００１８】本発明の免疫測定方法は、前記のように蛍
光免疫測定において、本発明の蛍光標識試薬を用い、７
５０〜８５０ｎｍの半導体レーザを励起光源とすること
に特徴を有するものであって、免疫測定の各手順は特に
限定されるものではなく、公知の方法をそのまま適用す
ることができる。また、前記の説明では光ファイバーの
コア表面上に生理活性物質を抗体でサンドイッチ状に結
合させてシアニン色素を固定する態様を示したが、測定
試料である生理活性物質と本発明の蛍光標識試薬とを競
合させて、光ファイバー表面に結合した抗原あるいは抗
体と結合させて光ファイバーのコア表面上にシアニン色
素を固定する方法であってもよい。The immunoassay method of the present invention uses the fluorescent labeling reagent of the present invention in the fluorescent immunoassay as described above,
The method is characterized by using a semiconductor laser of 50 to 850 nm as an excitation light source, and each procedure of immunoassay is not particularly limited, and a known method can be applied as it is. Further, in the above description, a mode was shown in which a cyanine dye is immobilized by binding a physiologically active substance with an antibody on the core surface of an optical fiber in a sandwich form, but the physiologically active substance as a measurement sample and the fluorescent labeling reagent of the present invention are used. Alternatively, a cyanine dye may be immobilized on the core surface of the optical fiber by allowing the antibody to bind to the antigen or antibody bound to the surface of the optical fiber.
【００１９】本発明の蛍光免疫測定キットには、次のよ
うな２つの態様がある。 （１）第１の態様 本発明の蛍光免疫測定キットの第１の態様としては、前
記のようなシアニン色素により標識された親水性多官能
基高分子と、該親水性多官能基高分子と直接的または間
接的に結合する生理活性物質よりなるものである。ここ
でいう生理活性物質とは、測定対象としての生理活性物
質ではなく、測定対象となる抗原、抗体等に対して特異
的に結合する抗体、抗原等を意味する。即ち、シアニン
色素により標識された親水性多官能基高分子としては、
前記のような例えばシアニン色素修飾アビジン（アビジ
ン−シアニン色素）やシアニン色素により修飾されたプ
ロテインＡ、シアニン色素により修飾されたアミノグリ
カン、またはシアニン色素により修飾されたポリペプチ
ド等が挙げられる。The fluorescent immunoassay kit of the present invention has the following two modes. (1) First Aspect As a first aspect of the fluorescent immunoassay kit of the present invention, a hydrophilic polyfunctional group polymer labeled with a cyanine dye as described above, and the hydrophilic polyfunctional group polymer are provided. It is composed of a physiologically active substance that is directly or indirectly bound. The term “physiologically active substance” as used herein means an antibody, an antigen, or the like that specifically binds to an antigen, an antibody, or the like to be measured, not a physiologically active substance as a measurement target. That is, as a hydrophilic polyfunctional polymer labeled with a cyanine dye,
Examples thereof include cyanine dye-modified avidin (avidin-cyanine dye), protein A modified with a cyanine dye, aminoglycan modified with a cyanine dye, and a polypeptide modified with a cyanine dye.
【００２０】一方、親水性多官能基高分子と直接的また
は間接的に結合する生理活性物質としては、例えば測定
対象となる抗原に対して特異的な結合能を有する生理活
性物質（例えば、抗体）の結合したビオチン化アミノグ
リカン（抗体−アミノグリカン−ビオチン）が親水性多
官能基高分子に間接的に結合する場合として例示され
る。この場合、生理活性物質である抗体は、親水性多官
能基高分子であるアビジンとアミノグリカン−ビオチン
を介して間接的に結合する。また、親水性多官能基高分
子に直接的に結合する場合としては、例えばシアニン色
素修飾アミノグリカン（アミノグリカン−シアニン色
素）、またはシアニン色素修飾ポリペプチド（ポリペプ
チド−シアニン色素）等が測定対象となる抗原や抗体に
対して特異的な結合能を有する生理活性物質（例えば、
抗体や抗原）と直接的に結合する態様が挙げられる。On the other hand, examples of the physiologically active substance that directly or indirectly binds to the hydrophilic polyfunctional polymer include, for example, a physiologically active substance having specific binding ability to the antigen to be measured (eg, antibody). ) Bound biotinylated aminoglycan (antibody-aminoglycan-biotin) is indirectly bound to a hydrophilic polyfunctional polymer. In this case, the antibody, which is a physiologically active substance, is indirectly bound to avidin, which is a hydrophilic polyfunctional polymer, via aminoglycan-biotin. When directly binding to a hydrophilic polyfunctional polymer, for example, a cyanine dye-modified aminoglycan (aminoglycan-cyanine dye), a cyanine dye-modified polypeptide (polypeptide-cyanine dye), or the like is a measurement target. Physiologically active substance having specific binding ability to the antigen or antibody (for example,
(Antibody and antigen).
【００２１】（２）第２の態様 本発明の蛍光免疫測定キットの第２の態様としては、前
記のようなシアニン色素により直接的またはアミノグリ
カン及び／又はポリペプチドを介して間接的に標識され
たアビジン及び／又はプロテインＡよりなる結合体（結
合体ａ）、およびビオチン及び／又は免疫グロブリンが
直接的またはアミノグリカン及び／又はポリペプチドを
介して間接的に生理活性物質に結合した結合体（結合体
ｂ）より構成されるものである。例えば、結合体ａとし
ては、アビジン−シアニン色素、プロテインＡ−シアニ
ン色素、アビジン−アミノグリカン−シアニン色素、プ
ロテインＡ−アミノグリカン−シアニン色素等の種々の
例が挙げられる。また、結合体ｂとしてはビオチン−生
理活性物質、免疫グロブリン−生理活性物質、ビオチン
−アミノグリカン−生理活性物質、免疫グロブリン−ア
ミノグリカン−生理活性物質等の種々の例が挙げられ
る。(2) Second Aspect As a second aspect of the fluorescence immunoassay kit of the present invention, the above-mentioned cyanine dye is directly or indirectly labeled via an aminoglycan and / or a polypeptide. A conjugate comprising avidin and / or protein A (conjugate a), and a conjugate in which biotin and / or immunoglobulin is directly or indirectly bound to a physiologically active substance via an aminoglycan and / or a polypeptide ( It is composed of the conjugate b). For example, examples of the conjugate a include avidin-cyanine dye, protein A-cyanine dye, avidin-aminoglycan-cyanine dye, protein A-aminoglycan-cyanine dye, and the like. Examples of the conjugate b include biotin-bioactive substance, immunoglobulin-bioactive substance, biotin-aminoglycan-bioactive substance, immunoglobulin-aminoglycan-bioactive substance and the like.
【００２２】なお、本発明において用いる光ファイバー
は、樹脂製光ファイバーが用いられる。樹脂製光ファイ
バーを構成する樹脂としては、特に限定されるものでは
ないが、免疫物質を吸着しない材質で透光性のよいもの
であることが必要であり、例えば、ポリスチレン、ポリ
アクリル酸エステル、ポリエステル、ポリアクリルアミ
ド、ポリビニルアルコール、ポリエチレンテレフタレー
ト、ポリカーボネート、あるいはこれらの共重合体等が
挙げられる。なかでもポリアクリル酸エステルが好まし
い。ポリアクリル酸エステルは、アクリル樹脂のうちエ
ステル構造を有するものであって、例えば、アクリル
酸、メタクリル酸などのエステル誘導体の重合体からな
る合成樹脂であり、具体的にはアクリル酸メチル、アク
リル酸エチル、メタクリル酸メチルなどの重合体が挙げ
られる。これらのポリアクリル酸エステルのうち、本発
明において特に好適に用いられるものは、ポリメタクリ
ル酸メチルである。これはポリメタクリル酸メチルが他
の樹脂に比べ、特に透光性がよいからである。また、本
発明において用いられる樹脂製光ファイバーは、例え
ば、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、メタクリル
酸メチルなどのモノマーとスチレンなどのモノマーとの
共重合体であってもよい。The optical fiber used in the present invention is a resin optical fiber. The resin constituting the resin-made optical fiber is not particularly limited, but it is necessary that it is a material that does not adsorb an immunological substance and that has a good light-transmitting property. For example, polystyrene, polyacrylic ester, polyester , Polyacrylamide, polyvinyl alcohol, polyethylene terephthalate, polycarbonate, and copolymers thereof. Among them, polyacrylic acid ester is preferable. Polyacrylic acid ester is one having an ester structure among acrylic resins, and is, for example, a synthetic resin composed of a polymer of an ester derivative such as acrylic acid and methacrylic acid, and specifically, methyl acrylate and acrylic acid. Examples thereof include polymers such as ethyl and methyl methacrylate. Of these polyacrylic acid esters, polymethyl methacrylate is particularly preferably used in the present invention. This is because polymethylmethacrylate has particularly good translucency as compared with other resins. The resin optical fiber used in the present invention may be, for example, a copolymer of a monomer such as methyl acrylate, ethyl acrylate, or methyl methacrylate and a monomer such as styrene.
【００２３】[0023]
【実施例】以下、実施例および比較例により本発明をさ
らに詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例等によ
りなんら限定されるものではない。まず実験にはいる前
に本発明において使用されるシアニン色素の水系溶媒に
対する溶解性を従来使用されてきたシアニン色素の水系
溶媒に対する溶解性と比較した。以下の実験には実施例
に使用されるシアニン色素の例としてＮＫ３６８２を、
比較例においては従来使用されてきたシアニン色素の例
として下記構造式（３）を有するＮＫ１１６０（日本感
光色素研究所製）を用いた。EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to Examples and Comparative Examples, but the present invention is not limited to these Examples. First, before entering the experiment, the solubility of the cyanine dye used in the present invention in an aqueous solvent was compared with the solubility of a conventionally used cyanine dye in an aqueous solvent. In the following experiments, NK3682 was used as an example of the cyanine dye used in the examples.
In the comparative example, NK1160 (manufactured by Japan Photosensitive Dye Research Institute) having the following structural formula (3) was used as an example of a cyanine dye that has been conventionally used.
【００２４】[0024]
【化６】 [Chemical 6]
【００２５】実験方法としては、ＮＫ３６８２又はＮＫ
１１６０を０．０１Ｍトリエチルアミン塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）の５ｍｌに十分量添加し、遮光下に室温で一
晩撹拌した。ついで、１７００ｒｐｍで１５分間遠心分
離することにより、未溶解色素を沈降除去した。得られ
た上清の最大吸収波長における吸光度を測定し、それぞ
れのシアニン色素の濃度を算出した。その結果、ＮＫ３
６８２の濃度は５１．０μＭすなわち３６．０μｇ／ｍ
ｌであり、ＮＫ１１６０の濃度は０．５３μＭすなわち
０．２６μｇ／ｍｌであった。この結果はＮＫ３６８２
の水系溶媒に対する溶解性がＮＫ１１６０の水に対する
溶解性の、モル比で約９６倍、重量比で約１３８倍であ
ることを意味する。As an experimental method, NK3682 or NK
1160 was added to 0.01 M triethylamine hydrochloride buffer solution (p
H8.0) was sufficiently added to 5 ml, and the mixture was stirred overnight at room temperature in the dark. Then, the undissolved dye was precipitated and removed by centrifugation at 1700 rpm for 15 minutes. The absorbance at the maximum absorption wavelength of the obtained supernatant was measured, and the concentration of each cyanine dye was calculated. As a result, NK3
The concentration of 682 is 51.0 μM or 36.0 μg / m
1 and the concentration of NK1160 was 0.53 μM or 0.26 μg / ml. The result is NK3682
It means that the solubility of NK1160 in an aqueous solvent is about 96 times the solubility of NK1160 in water in a molar ratio and about 138 times in a weight ratio.
【００２６】実施例１ （１）大過剰の２．５ｍｇのＮＫ３６８２を０．０１Ｍ
トリエチルアミン塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍｌに
懸濁した。（実際に溶けている量は３６０μｇ／１０ｍ
ｌである。） （２）アビジン１ｍｇを５００μｌの水に溶かして、前
記（１）の懸濁液に加え、攪拌し、さらにＮ−シクロヘ
キシル−Ｎ’−（２−モルフォリノエチル）カルボジイ
ミド メト−ｐ−トルエンスルホン酸塩（ＣＨＭＣ）
０．１ｇを加えて、一晩放置した。Example 1 (1) A large excess of 2.5 mg of NK3682 was added to 0.01M
It was suspended in 10 ml of triethylamine hydrochloric acid buffer solution (pH 8.0). (The amount actually melted is 360 μg / 10 m
It is l. (2) 1 mg of avidin was dissolved in 500 μl of water, added to the suspension of (1), stirred, and further N-cyclohexyl-N ′-(2-morpholinoethyl) carbodiimide meth-p-toluenesulfone. Acid salt (CHMC)
0.1 g was added and left overnight.
【００２７】（３）前記（２）の溶液を限外濾過を用い
て、エタノールで３〜４回洗浄して未反応色素を除去し
た。 （４）得た沈殿をｐＨ８．０に調整したＫＯＨ溶液に懸
濁し、「ＮＫ３６８２修飾アビジン液」（以下、Ｆ1 ア
ビジンと略す。）とした。(3) The solution of (2) above was washed 3 to 4 times with ethanol using ultrafiltration to remove unreacted dye. (4) The obtained precipitate was suspended in a KOH solution adjusted to pH 8.0 to give a “NK3682 modified avidin solution” (hereinafter abbreviated as F 1 avidin).
【００２８】（５）別途、ウサギ由来抗ヒト膵アミラー
ゼ抗体（以下、ＲＨＡＡｂと略す）を光ファイバーに固
定し、これとヒト膵アミラーゼ（以下、ＨＡと略す）を
特異的に反応させて、「ウサギ由来抗ヒト膵アミラーゼ
抗体＋ヒト膵アミラーゼ」（以下、ＲＨＡＡｂ−ＨＡと
略す）とした。 （６）また多数のアミノ基をビオチン化したキトサン
（以下、Ｂ−Ｃと略す）に、ヒツジ由来抗ヒト膵アミラ
ーゼ抗体（以下、ＳＨＡＡｂと略す）を結合させ、「ビ
オチン化キトサン＋ヒツジ由来抗ヒト膵アミラーゼ抗
体」（以下、Ｂ−Ｃ−ＳＨＡＡｂと略す）とした。(5) Separately, a rabbit-derived anti-human pancreatic amylase antibody (hereinafter abbreviated as RHAAb) is immobilized on an optical fiber, and this is specifically reacted with human pancreatic amylase (hereinafter abbreviated as HA) to give “rabbit. Derived anti-human pancreatic amylase antibody + human pancreatic amylase ”(hereinafter, abbreviated as RHAAb-HA). (6) Furthermore, sheep-derived anti-human pancreatic amylase antibody (hereinafter, abbreviated as SHAAb) is bound to chitosan (hereinafter, abbreviated as BC) in which a large number of amino groups are biotinylated, and a “biotinylated chitosan + sheep-derived antibody is bound. Human pancreatic amylase antibody "(hereinafter abbreviated as B-C-SHAAb).
【００２９】（７）さらに前記（４）のＦ1 アビジンと
前記（６）のＢ−Ｃ−ＳＨＡＡｂを反応させて、「ＮＫ
３６８２修飾アビジン＋ビオチン化キトサン＋ヒツジ由
来抗ヒト膵アミラーゼ抗体」（以下、Ｆ1 アビジン−Ｂ
−Ｃ−ＳＨＡＡｂと略す）とした。 （８）前記（５）のＲＨＡＡｂ−ＨＡと前記（７）のＦ
1 アビジン−Ｂ−Ｃ−ＳＨＡＡｂを特異的に反応させ、
「ウサギ由来抗ヒト膵アミラーゼ抗体＋ヒト膵アミラー
ゼ＋ヒツジ由来抗ヒト膵アミラーゼ抗体＋ビオチン化キ
トサン＋ＮＫ３６８２修飾アビジン」として、それを７
８０ｎｍＬＤ（３０ｍＷ）で励起させ、その蛍光を測定
した結果、ヒト膵アミラーゼは１．２×１０-4ｍｇ／ｍ
ｌで検出でき、７８０ｎｍＬＤの素子は１０φ×１０
で、低価格になり、装置としても小型化低価格化が実現
できた。(7) Further, the F 1 avidin of the above (4) is reacted with the BC-SHAAb of the above (6) to obtain "NK
3682 modified avidin + biotinylated chitosan + sheep-derived anti-human pancreatic amylase antibody "(hereinafter, F 1 avidin-B
-C-SHAAb). (8) RHAAb-HA of the above (5) and F of the above (7)
1 specifically reacting avidin-BC-SHAAb,
As a “rabbit-derived anti-human pancreatic amylase antibody + human pancreatic amylase + sheep-derived anti-human pancreatic amylase antibody + biotinylated chitosan + NK3682 modified avidin”,
It was excited with 80 nm LD (30 mW), and its fluorescence was measured. As a result, human pancreatic amylase was found to be 1.2 × 10 −4 mg / m 2.
can be detected by 1 and the element of 780 nm LD is 10φ × 10
Therefore, the price was low, and the device was downsized and the price was low.
【００３０】比較例１ （１）大過剰の２．５ｍｇのＮＫ１１６０を０．０１Ｍ
トリエチルアミン塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍｌに
懸濁した。（実際の溶解量は２．６μｇ／１０ｍｌであ
る。）Comparative Example 1 (1) 0.01M of a large excess of 2.5 mg of NK1160
It was suspended in 10 ml of triethylamine hydrochloric acid buffer solution (pH 8.0). (The actual amount of dissolution is 2.6 μg / 10 ml.)
【００３１】（２）実施例１の（２）〜（３）と同様の
方法により得た沈澱をｐＨ８．０に調整したＫＯＨ溶液
に懸濁したところ、明らかに紫外、可視領域の吸収スペ
クトルに変化が見られ、有機溶媒を用いた場合のよう
に、標識試薬として用いることができる色素修飾アビジ
ンを得ることができなかった。(2) When the precipitate obtained by the same method as (2) to (3) in Example 1 was suspended in a KOH solution adjusted to pH 8.0, the absorption spectra in the ultraviolet and visible regions were clearly observed. A change was seen and it was not possible to obtain a dye-modified avidin that could be used as a labeling reagent as when using an organic solvent.
【００３２】比較例２ （１）２．０ｍｇのＮＫ１１６０をエタノール：トリエ
チルアミン＝４：１混合液１ｍｌに溶かした。Comparative Example 2 (1) 2.0 mg of NK1160 was dissolved in 1 ml of a mixture of ethanol: triethylamine = 4: 1.
【００３３】（２）実施例１の（２）〜（４）において
縮合剤としてＣＨＭＣに代えてジシクロヘキシルカルボ
ジイミドを使用すること以外は、同様の操作を行い、
「ＮＫ１１６０修飾アビジン」（以下Ｆ, アビジンと略
す）を作った。(2) The same operation as in (2) to (4) of Example 1 was repeated except that dicyclohexylcarbodiimide was used as the condensing agent instead of CHMC.
"NK1160 modified avidin" (hereinafter , abbreviated as F , avidin) was prepared.
【００３４】（３）実施例１の（５）〜（６）と同様に
反応させ、さらに前記（２）のＦ, アビジンと実施例１
のＢ−Ｃ−ＳＨＡＡｂとを反応させ、「ＮＫ１１６０修
飾アビジン＋ビオチン化キトサン＋ヒツジ由来抗ヒト膵
アミラーゼ抗体」（以下、Ｆ,アビジン−Ｂ−Ｃ−ＳＨ
ＡＡｂと略す）とした。 （４）実施例１のＲＨＡＡｂ−ＨＡと前記（３）のＦ,
アビジン−Ｂ−Ｃ−ＳＨＡＡｂを特異的に反応させて、
「ウサギ由来抗ヒト膵アミラーゼ抗体＋ヒト膵アミラー
ゼ＋ヒツジ由来抗ヒト膵アミラーゼ抗体＋ビオチン化キ
トサン＋Ｆ, アビジン」とし、これをＨｅ−Ｎｅレーザ
（６３３ｎｍ）で励起させ、その蛍光を測定したとこ
ろ、ヒト膵アミラーゼは１．９×１０-4ｍｇ／ｍｌで検
出できたが、Ｈｅ−Ｎｅレーザは３０ｍＷのもので長さ
約１ｍで、高価格であるため、装置は大型で高価なもの
となってしまった。(3) The reaction was carried out in the same manner as in (5) to (6) of Example 1, and the reaction was carried out with F and avidin of (2) above.
Of NK1160-modified avidin + biotinylated chitosan + sheep-derived anti-human pancreatic amylase antibody (hereinafter, F , avidin-BC-SH).
(Abbreviated as AAb). (4) RHAAb-HA of Example 1 and F of the above (3) ,
By specifically reacting avidin-BC-SHAAb,
"Rabbit-derived anti-human pancreatic amylase antibody + human pancreatic amylase + sheep-derived anti-human pancreatic amylase antibody + biotinylated chitosan + F , avidin" was excited with a He-Ne laser (633 nm), and its fluorescence was measured. Human pancreatic amylase could be detected at 1.9 × 10 -4 mg / ml, but the He-Ne laser was 30 mW and the length was about 1 m, and it was expensive. Therefore, the device was large and expensive. I got it.
【００３５】実施例２ （１）大過剰の２．５ｍｇのＮＫ３６８２を０．０１Ｍ
トリエチルアミン塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍｌに
懸濁した。（実際に溶けた量は３６０μｇ／１０ｍｌで
ある。） （２）実施例１の（２）〜（４）と同様の操作を行い、
Ｆ1 アビジンを得た。Example 2 (1) A large excess of 2.5 mg of NK3682 was added to 0.01 M
It was suspended in 10 ml of triethylamine hydrochloric acid buffer solution (pH 8.0). (The amount actually dissolved is 360 μg / 10 ml.) (2) The same operations as (2) to (4) of Example 1 were performed,
F 1 avidin was obtained.
【００３６】（３）ヒト絨毛性腺刺激ホルモン（以下、
ｈＣＧと略す）と光ファイバーに固定したウサギ由来抗
ｈＣＧ抗体（以下、ＲｈＣＧＡｂと略す）を特異的に反
応させ、「ウサギ由来抗ｈＣＧ抗体＋ｈＣＧ」（以下、
ＲｈＣＧＡｂ−ｈＣＧと略す）とした。 （４）また多数のアミノ基をビオチン化したポリガラク
トサミン（以下、Ｂ−ｐＧと略す）に、ヤギ由来抗ｈＣ
Ｇ抗体（以下、ＧｈＣＧＡｂと略す）を結合させ、「ビ
オチン化ポリガラクトサミン＋ヤギ由来抗ｈＣＧ抗体」
（以下、Ｂ−ｐＧ−ＧｈＣＧＡｂと略す）とした。(3) Human chorionic gonadotropin (hereinafter,
(abbreviated as hCG) and a rabbit-derived anti-hCG antibody immobilized on an optical fiber (hereinafter, abbreviated as RhCGAb) are specifically reacted, and “rabbit-derived anti-hCG antibody + hCG” (hereinafter,
RhCGAb-hCG). (4) Polygalactosamine (hereinafter abbreviated as B-pG) in which a large number of amino groups have been biotinylated, and goat-derived anti-hC
G-antibody (hereinafter abbreviated as GhCGAb) is bound, and "biotinylated polygalactosamine + goat-derived anti-hCG antibody"
(Hereinafter, abbreviated as B-pG-GhCGAb).
【００３７】（５）さらに前記（２）のＦ1 アビジンと
前記（４）のＢ−ｐＧ−ＧｈＣＧＡｂを反応させて、
「ＮＫ３６８２修飾アビジン＋ビオチン化ポリガラクト
サミン＋ヤギ由来抗ｈＣＧ抗体」（以下、Ｆ1 アビジン
＋Ｂ−ｐＧ−ＧｈＣＧＡｂと略す）とした。 （６）前記（３）のＲｈＣＧＡｂ−ｈＣＧと前記（５）
のＦ1 アビジン＋Ｂ−ｐＧ−ＧｈＣＧＡｂを特異的に反
応させ、「ウサギ由来抗ｈＣＧ抗体＋ｈＣＧ＋ヤギ由来
抗ｈＣＧ抗体＋ビオチン化ポリガラクトサミン＋ＮＫ３
６８２修飾アビジン」とした。これを７８０ｎｍＬＤで
励起させ、その蛍光を測定した結果、ｈＣＧは２．０×
１０-4ｍｇ／ｍｌで検出でき、７８０ｎｍＬＤ素子は１
０φ×１０で低価格となり、小型化低価格化が実現でき
た。(5) Further, by reacting the F 1 avidin of (2) with the B-pG-GhCGAb of (4),
"NK3682 modified avidin + biotinylated polygalactosamine + goat-derived anti-hCG antibody" (hereinafter, abbreviated as F 1 avidin + B-pG-GhCGAb). (6) The RhCGAb-hCG of the above (3) and the above (5)
Specifically react with F 1 avidin + B-pG-GhCGAb to produce “rabbit-derived anti-hCG antibody + hCG + goat-derived anti-hCG antibody + biotinylated polygalactosamine + NK3.
682 modified avidin ”. This was excited with a 780 nm LD, and the fluorescence was measured. As a result, hCG was 2.0 ×.
Detectable at 10 -4 mg / ml, 780 nm LD element is 1
The price was 0φ × 10 and the price was low.
【００３８】実施例３ （１）大過剰である３．０ｍｇのＮＫ３６８２を０．０
１Ｍトリエチルアミン塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍ
ｌに懸濁した。（実際に溶けている量は３６０μｇ／１
０ｍｌである。） （２）アビジン２ｍｇを５００μｌの水に溶かして、前
記（１）の懸濁液に加え、さらにＣＨＭＣ０．１ｇを加
えて、一晩放置した。 （３）実施例１の（４）まで同様の操作を行い、「ＮＫ
３６８２修飾アビジン液」（Ｆ1 アビジン）を作成し
た。Example 3 (1) A large excess of 3.0 mg of NK3682 was added to 0.0
1M triethylamine hydrochloric acid buffer solution (pH 8.0) 10 m
suspended in 1 l. (The amount actually melted is 360 μg / 1
It is 0 ml. (2) 2 mg of avidin was dissolved in 500 μl of water, added to the suspension of (1) above, 0.1 g of CHMC was further added, and left overnight. (3) Perform the same operation up to (4) of Example 1, and perform “NK
3682 modified avidin solution "(F 1 avidin) was prepared.
【００３９】（４）ヤギ由来抗ヒトカルシトニン抗体
（以下、ＧＨＣＡｂと略す）を光ファイバーに固定し、
これとヒトカルシトニン（以下、ＨＣと略す）を特異的
に反応させて、「ヤギ由来抗ヒトカルシトニン抗体＋ヒ
トカルシトニン」（以下、ＧＨＣＡｂ−ＨＣと略す）と
した。 （５）また多数のアミノ基をビオチン化したポリノイラ
ミン酸（以下、Ｂ−ｐＮと略す）に、ウサギ由来抗ヒト
カルシトニン抗体を結合させ、「ウサギ由来抗ヒトカル
シトニン抗体＋ビオチン化ポリノイラミン酸」（以下、
ＲＨＣＡｂ−Ｂ−ｐＮと略す）とし、前記（４）のＧＨ
ＣＡｂ−ＨＣを特異的に反応させ、「ヤギ由来抗ヒトカ
ルシトニン抗体＋ヒトカルシトニン＋ウサギ由来抗ヒト
カルシトニン抗体＋ビオチン化ポリノイラミン酸」（以
下、ＧＨＣＡｂ−ＨＣ−ＲＨＣＡｂ−Ｂ−ｐＮと略す）
とした。(4) Immobilizing goat-derived anti-human calcitonin antibody (hereinafter abbreviated as GHCAb) on an optical fiber,
This was specifically reacted with human calcitonin (hereinafter abbreviated as HC) to obtain “goat-derived anti-human calcitonin antibody + human calcitonin” (hereinafter abbreviated as GHCAb-HC). (5) In addition, a rabbit-derived anti-human calcitonin antibody was bound to polyneuraminic acid (hereinafter, abbreviated as B-pN) in which a large number of amino groups were biotinylated, and a “rabbit-derived anti-human calcitonin antibody + biotinylated polyneuraminic acid” (hereinafter ,
(Abbreviated as RHCAb-B-pN), and GH of the above (4)
CAb-HC specifically reacts, "goat-derived anti-human calcitonin antibody + human calcitonin + rabbit-derived anti-human calcitonin antibody + biotinylated polyneuraminic acid" (hereinafter abbreviated as GHCAb-HC-RHCAb-B-pN)
And
【００４０】（６）さらに前記（３）のＦ1 アビジンと
前記（５）のＧＨＣＡｂ−ＨＣ−ＲＨＣＡｂ−Ｂ−ｐＮ
を反応させ、「ヤギ由来抗ヒトカルシトニン抗体＋ヒト
カルシトニン＋ウサギ由来抗ヒトカルシトニン抗体＋ビ
オチン化ポリノイラミン酸＋ＮＫ３６８２修飾アビジ
ン」とし、これを７８０ｎｍＬＤで励起させ、その蛍光
を測定したところ、ヒトカルシトニンは、４．３×１０
-4ｍｇ／ｍｌで検出でき、７８０ｎｍＬＤ素子は１０φ
×１０で低価格となり、小型化低価格化が実現できた。(6) Further, the F 1 avidin of the above (3) and the GHCAb-HC-RHCAb-B-pN of the above (5).
Was reacted to give “goat-derived anti-human calcitonin antibody + human calcitonin + rabbit-derived anti-human calcitonin antibody + biotinylated polyneuraminic acid + NK3682 modified avidin”, which was excited with 780 nm LD and its fluorescence was measured. 4.3 x 10
-Detectable at -4 mg / ml, 780 nm LD element is 10φ
The price was low at × 10, and it was possible to realize downsizing and cost reduction.
【００４１】実施例４ （１）実施例１の（１）〜（４）と同様の操作を行い、
「ＮＫ３６８２修飾アビジン液」（Ｆ1 アビジン）を作
成した。 （２）ヒト卵胞刺激ホルモン（ｈＦＳＨ）と光ファイバ
ーに固定したヤギ由来抗ｈＦＳＨ抗体（以下、ＧｈＦＳ
ＨＡｂと略す）を特異的に反応させ、「ヤギ由来抗ｈＦ
ＳＨ抗体＋ｈＦＳＨ」（以下、ＧｈＦＳＨＡｂ−ｈＦＳ
Ｈと略す）とした。Example 4 (1) Operations similar to (1) to (4) of Example 1 were carried out,
A “NK3682 modified avidin solution” (F 1 avidin) was prepared. (2) Human follicle stimulating hormone (hFSH) and goat-derived anti-hFSH antibody immobilized on an optical fiber (hereinafter referred to as GhFS
(Abbreviated as HAb) specifically reacts with “goat-derived anti-hF
SH antibody + hFSH ”(hereinafter, GhFSHAb-hFS
(Abbreviated as H).
【００４２】（３）また多数のアミノ基をビオチン化し
たキトサン（Ｂ−Ｃ）にウサギ由来抗ｈＦＳＨ抗体（以
下、ＲｈＦＳＨＡｂと略す）を結合させ、「ビオチン化
キトサン＋ウサギ由来抗ｈＦＳＨ抗体」（以下、Ｂ−Ｃ
−ＲｈＦＳＨＡｂと略す）とした。 （４）さらに前記（１）のＦ1 アビジンと前記（３）の
Ｂ−Ｃ−ＲｈＦＳＨＡｂを反応させて、「修飾アビジン
＋ビオチン化キトサン＋ウサギ由来抗ｈＦＳＨ抗体」
（以下、ＲｈＦＳＨＡｂ−Ｂ−Ｃ−Ｆ1 アビジンと略
す）とした。(3) Further, a rabbit-derived anti-hFSH antibody (hereinafter, abbreviated as RhFSHAb) was bound to chitosan (BC) in which a large number of amino groups were biotinylated, and "biotinylated chitosan + rabbit-derived anti-hFSH antibody" ( Below, B-C
-RhFSHAb). (4) Further, F 1 avidin of (1) above is reacted with B-C-RhFSHAb of (3) above to give “modified avidin + biotinylated chitosan + anti-hFSH antibody derived from rabbit”.
(Hereinafter, abbreviated as RhFSHAb-B-C-F 1 avidin).
【００４３】（５）前記（２）のＧｈＦＳＨＡｂ−ｈＦ
ＳＨと前記（４）のＲｈＦＳＨＡｂ−Ｂ−Ｃ−Ｆ1 アビ
ジンを特異的に反応させて、「ヤギ由来抗ｈＦＳＨ抗体
＋ｈＦＳＨ＋ウサギ由来抗ｈＦＳＨ抗体＋ビオチン化キ
トサン＋ＮＫ３６８２修飾アビジン」とし、これを７８
０ｎｍＬＤで励起させ、その蛍光を測定した結果、ｈＦ
ＳＨは５．２×１０-4ｍｇ／ｍｌで検出でき、７８０ｎ
ｍＬＤは１０φ×１０で低価格となり、小型化低価格化
が実現できた。(5) GhFSHAb-hF of the above (2)
SH was specifically reacted with RhFSHAb-B-C-F 1 avidin of the above (4) to obtain “goat-derived anti-hFSH antibody + hFSH + rabbit-derived anti-hFSH antibody + biotinylated chitosan + NK3682 modified avidin”, which was 78
When excited with 0 nm LD and measured the fluorescence, hF
SH can be detected at 5.2 × 10 -4 mg / ml, 780n
The price of the mLD was 10φ × 10, which was low, and it was possible to reduce the size and cost.
【００４４】実施例５ （１）大過剰の２．５ｍｇのＮＫ３６８２を０．０１Ｍ
トリエチルアミン塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１０ｍｌに
懸濁した。 （２）キトサン１ｍｇを０．５ｍｌの水に溶解し、前記
（１）の懸濁液に加え、攪拌し、さらにＣＨＭＣ０．１
ｇを加えて、一晩放置した。 （３）前記（２）の溶液を限外濾過を用いて、メタノー
ルで３〜４回洗浄し、未反応色素を除去し、ＮＫ３６８
２が結合したキトサン（以下、３６８２キトサンと略
す。）を得た。Example 5 (1) A large excess of 2.5 mg of NK3682 was added to 0.01 M
It was suspended in 10 ml of triethylamine hydrochloric acid buffer solution (pH 8.0). (2) 1 mg of chitosan was dissolved in 0.5 ml of water, added to the suspension of (1) above, stirred, and further added with CHMC 0.1.
g, and left overnight. (3) The solution of (2) above is washed with methanol 3 to 4 times using ultrafiltration to remove unreacted dye, and NK368
A chitosan having 2 bound thereto (hereinafter abbreviated as 3682 chitosan) was obtained.
【００４５】（４）得た３６８２キトサンを０．０１Ｍ
トリエチルアミン塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１ｍｌに懸
濁し、０．５ｍｌのプロテインＡ水溶液（濃度２ｍｇ／
ｍｌ）と混合、さらにＣＨＭＣ０．１ｇを加えて、攪拌
しながら一晩放置した。 （５）前記（４）の溶液を限外濾過を用いて、リン酸緩
衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ８．０で３〜４回洗浄し、
未反応プロテインＡを除去し、プロテインＡと３６８２
キトサンの結合体（以下、ＰｒＡ−３６８２キトサンと
略す。）を得た。(4) 0.013 M of the obtained 3682 chitosan
Suspended in 1 ml of triethylamine hydrochloric acid buffer solution (pH 8.0), 0.5 ml of protein A aqueous solution (concentration 2 mg /
ml), CHMC (0.1 g) was further added, and the mixture was left overnight with stirring. (5) The solution of (4) above is washed 3 to 4 times with phosphate buffered saline (PBS) pH 8.0 using ultrafiltration,
Unreacted protein A is removed, and protein A and 3682 are removed.
A conjugate of chitosan (hereinafter abbreviated as PrA-3682 chitosan) was obtained.
【００４６】（６）得たＰｒＡ−３６８２キトサンをＰ
ＢＳ１ｍｌに懸濁し、１ｍｌのウサギ由来のＣ反応性タ
ンパク質（以下、ＣＲＰと略す。）に対する免疫グロブ
リンＧ（以下、ウサギ由来抗ＣＲＰＩｇＧと略す。）水
溶液（濃度５ｍｇ／ｍｌ）と混合、攪拌しながら、一晩
放置した。 （７）前記（６）の溶液を限外濾過を用いて、ＰＢＳで
３〜４回洗浄し、未反応ウサギ由来抗ＣＲＰＩｇＧを除
去し、ウサギ由来抗ＣＲＰＩｇＧをＰｒＡ−３６８２キ
トサンの結合体（以下、抗ＣＲＰＩｇＧ−ＰｒＡ−３６
８２キトサンと略す。）を得、ＰＢＳに懸濁、溶解する
ことにより、抗ＣＲＰＩｇＧ−ＰｒＡ−３６８２キトサ
ン溶液とした。(6) The obtained PrA-3682 chitosan was added to P
Suspended in 1 ml of BS, mixed with 1 ml of an aqueous solution of immunoglobulin G (hereinafter, abbreviated as rabbit anti-CRP IgG) against C-reactive protein (hereinafter, abbreviated as CRP) derived from rabbit (concentration 5 mg / ml), and stirred. , Left overnight. (7) The solution of (6) above is washed 3 to 4 times with PBS using ultrafiltration to remove unreacted rabbit-derived anti-CRP IgG, and rabbit-derived anti-CRP IgG to PrA-3682 chitosan conjugate (hereinafter , Anti-CRP IgG-PrA-36
82 Abbreviated as chitosan. Was obtained, and suspended and dissolved in PBS to give an anti-CRP IgG-PrA-3682 chitosan solution.
【００４７】（８）別途、マウス由来抗ＣＲＰモノクロ
ーナル抗体を光ファイバーに固定し、これとＣＲＰを特
異的に反応させて、光ファイバー上にマウス由来抗ＣＲ
Ｐモノクローナル抗体−ＣＲＰの複合体（以下、抗ＣＲ
Ｐ−ＣＲＰ複合体と略す。）を形成した。 （９）前記（８）の抗ＣＲＰ−ＣＲＰ複合体を固定化し
た光ファイバーを前記（７）の抗ＣＲＰＩｇＧ−ＰｒＡ
−３６８２キトサン溶液に浸漬、特異的に反応させ、光
ファイバー上に、抗ＣＲＰ−ＣＲＰ複合体と抗ＣＲＰＩ
ｇＧ−ＰｒＡ−３６８２キトサンの結合体を形成し、こ
れを７８０ｎｍＬＤで励起させ、その蛍光を測定した結
果、ＣＲＰは、２．５×１０-4ｍｇ／ｍｌで検出でき、
７８０ｎｍＬＤ素子は１０φ×１０で低価格となり、小
型化低価格化が実現できた。(8) Separately, a mouse-derived anti-CRP monoclonal antibody was immobilized on an optical fiber, and this was allowed to specifically react with CRP to form a mouse-derived anti-CR on the optical fiber.
P monoclonal antibody-CRP complex (hereinafter referred to as anti-CR
Abbreviated as P-CRP complex. ) Was formed. (9) The optical fiber having the anti-CRP-CRP complex of (8) immobilized thereon is used as the anti-CRP IgG-PrA of (7).
-3682 Chitosan solution soaked and reacted specifically to form anti-CRP-CRP complex and anti-CRPI on the optical fiber.
As a result of forming a conjugate of gG-PrA-3682 chitosan, exciting it with 780 nm LD, and measuring the fluorescence thereof, CRP can be detected at 2.5 × 10 −4 mg / ml,
The 780 nm LD element has a low price of 10φ × 10, and it has been possible to realize downsizing and cost reduction.
【００４８】[0048]
【発明の効果】本発明によれば、特定のシアニン色素に
より標識された蛍光標識試薬を用いることにより、蛍光
免疫測定において赤外域の半導体レーザを励起光源とし
て用いることができる。また、本発明で用いるシアニン
色素は水溶媒系での溶解性に優れたものであるから、シ
アニン色素を用いた標識試薬の作成が容易である。ま
た、本発明により高感度で、低価格の免疫測定が可能と
なり、測定装置の小型化、低価格化が実現できる。According to the present invention, a semiconductor laser in the infrared region can be used as an excitation light source in fluorescence immunoassay by using a fluorescent labeling reagent labeled with a specific cyanine dye. Further, since the cyanine dye used in the present invention has excellent solubility in an aqueous solvent system, it is easy to prepare a labeling reagent using the cyanine dye. Further, according to the present invention, highly sensitive and low-cost immunoassay can be performed, and the downsizing and cost of the measuring device can be realized.
Claims (5)
素により標識された親水性多官能基高分子よりなる蛍光
標識試薬。 【化１】 （式中、Ｒは水素原子又はハロゲン原子を、ＸはＳ又は
Ｃ（ＣＨ3 ）2 を表し、ｎは０〜５、ｍは０〜４、ｋは
０〜６の整数を示す。）1. A fluorescent labeling reagent comprising a hydrophilic polyfunctional polymer labeled with a cyanine dye represented by the general formula (1). [Chemical 1] (Wherein, R represents a hydrogen atom or a halogen atom, X represents S or C (CH 3) 2, n is 0 to 5, m is 0 to 4, k is an integer of 0-6.)
テインＡ、アミノグリカン、またはポリペプチドである
請求項１記載の蛍光標識試薬。2. The fluorescent labeling reagent according to claim 1, wherein the hydrophilic polyfunctional polymer is avidin, protein A, aminoglycan, or polypeptide.
２記載の蛍光標識試薬を用い、７５０〜８５０ｎｍの半
導体レーザを励起光源とすることを特徴とする蛍光免疫
測定法。3. A fluorescent immunoassay method, which uses the fluorescent labeling reagent according to claim 1 or 2 in a fluorescent immunoassay and uses a semiconductor laser of 750 to 850 nm as an excitation light source.
基高分子と、該親水性多官能基高分子と直接的または間
接的に結合する生理活性物質よりなる蛍光免疫測定キッ
トにおいて、該蛍光色素が一般式（１）により表される
シアニン色素であることを特徴とする蛍光免疫測定キッ
ト。 【化２】 （式中、Ｒは水素原子又はハロゲン原子を、ＸはＳ又は
Ｃ（ＣＨ3 ）2 を表し、ｎは０〜５、ｍは０〜４、ｋは
０〜６の整数を示す。）4. A fluorescent immunoassay kit comprising a hydrophilic polyfunctional macromolecule labeled with a fluorescent dye and a physiologically active substance that directly or indirectly binds to the hydrophilic polyfunctional macromolecule. A fluorescent immunoassay kit, wherein the dye is a cyanine dye represented by the general formula (1). [Chemical 2] (Wherein, R represents a hydrogen atom or a halogen atom, X represents S or C (CH 3) 2, n is 0 to 5, m is 0 to 4, k is an integer of 0-6.)
より直接的またはアミノグリカン及び／又はポリペプチ
ドを介して間接的に標識されたアビジン及び／又はプロ
テインＡよりなる結合体、およびビオチン及び／又は免
疫グロブリンが直接的またはアミノグリカン及び／又は
ポリペプチドを介して間接的に生理活性物質に結合した
結合体より構成されることを特徴とする蛍光免疫測定キ
ット。 【化３】 （式中、Ｒは水素原子又はハロゲン原子を、ＸはＳ又は
Ｃ（ＣＨ3 ）2 を表し、ｎは０〜５、ｍは０〜４、ｋは
０〜６の整数を示す。）5. A conjugate comprising avidin and / or protein A labeled directly with a fluorescent dye represented by the general formula (1) or indirectly via an aminoglycan and / or a polypeptide, and biotin and A fluorescent immunoassay kit characterized in that / or an immunoglobulin is composed of a conjugate bound to a physiologically active substance directly or indirectly via an aminoglycan and / or a polypeptide. [Chemical 3] (Wherein, R represents a hydrogen atom or a halogen atom, X represents S or C (CH 3) 2, n is 0 to 5, m is 0 to 4, k is an integer of 0-6.)
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