JPH06206899A - 生物学的活性ブタソマトトロピンポリペプチド及びその使用法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ブタソマトトロピンのエピトープに対応する
単離ポリペプチド、ならびに組成物中のこのポリペプチ
ドを動物に投与することにより動物の成長を促進する方
法が本発明により提供される。 【効果】 動物の成長を促進するポリペプチドを大量に
製造することができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の背景】本出願を通じ、本発明が関連する技術の
現状をより十分に記載するために種々の出版物が括弧内
で及び本明細書内で引用されている。これによりこれら
の出版物の記載事項は引用することにより本明細書の記
載内容とする。

【０００２】ソマトトロピンは温血動物中の下垂体前葉
により分泌されるポリペプチドであり、主に肝臓にある
特異的細胞表面レセプターを通じて作用する（Ｈｕｇｈ
ｅｓ，Ｊ．Ｐ． ａｎｄ Ｆｒｉｅｓｅｎ．Ｈ．Ｇ．，
Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，４７，４６９−４
８２（１９８５））。ソマトトロピン（すなわち成長ホ
ルモン）は中でもウシ（牛）、ブタ（豚、“ｐＳ
Ｔ”）、ヤギ（山羊）、トリ（鶏、七面鳥、がちょうな
ど）及びウサギなどの動物の成長の促進に有用である。
ソマトトロピンは魚などの他の脊椎動物の成長の促進に
も有用である。

【０００３】特に成長ホルモンＰＳＴは本来豚のもので
あり、成長速度及び脂肪に対する赤身の比率の向上を含
む動物の成熟を担う。ｐＳＴは１９１アミノ酸の一本鎖
ポリペプチドであり、２個のシスチン架橋が残基５３−
１６４及び１８１−１８９をそれぞれ結合させているこ
とが見いだされた（Ａｂｄｅｌ−Ｍｅｇｕｉｄ，Ｓ．
Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．，８４ ６４３４−６４３７（１９８７））。

【０００４】ｐＳＴの内因的量は少ないので、大規模農
業において用いるための外因的ｐＳＴの製造が努力され
てきた。又努力は、ｐＳＴ分子の小部分の同定、これら
の部分に対する抗体の生成、及びこれらの抗体をｐＳＴ
と共に投与して成長を促進することに向けられてきた。
（例えば欧州特許出願公開第２８４，４０６号明細書を
参照）。この明細書はｐＳＴ分子のフラグメントを投与
して成長を促進することを目的としている。

【０００５】

【発明の概略】本発明によりｐＳＴのエピトープに対応
する単離ポリペプチド及びこのポリペプチドを含む組成
物が提供される。この本発明はこのポリペプチドを動物
に投与することによる、動物の成長の促進法も提供す
る。

【０００６】

【発明の具体的な記述】本発明はブタソマトトロピン
（ｐＳＴ）のエピトープに対応する単離ポリペプチドを
提供する。さらに特定するとこのエピトープはモノクロ
ーナル抗体ＰＳ−７．６と反応性の結合領域である。モ
ノクローナル抗体ＰＳ−７．６はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔ
ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴ
ＣＣ），１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ，
Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ ２０８５２
Ｕ．Ｓ．Ａ．に、特許手続上の微生物の寄託の国際的承
認に関するブタペスト条約に従って寄託され、ＡＴＣＣ
ＨＢ１０４１６として寄託されている。ここで用いら
れる“ポリペプチド”という用語は天然に存在するその
いずれの対立遺伝子変異体ならびに人工の組み替え形
態、すなわち天然のポリペプチドと十分に同一で類似の
生物学的活性を保有することができる非天然の形態のポ
リペプチド、例えば誘導体及び類似体も含む。これらの
ポリペプチドはいずれもこれらのポリペプチドを製造す
るように造られた組み替え系又はベクターにより、なら
びに化学的合成により作られる。

【０００７】当該技術における熟練者に既知の通りエピ
トープは、抗原分子、この場合はブタソマトトロピンポ
リペプチドの、それが相補的である抗原−抗体結合部位
における抗原の特異性を担う部分である。本発明の具体
化の１つにおいて、単離ソマトトロピンポリペプチド
は、図５に示すアミノ酸番号５０近辺からアミノ酸番号
１０５までのアミノ酸配列を有する。しかし好ましい具
体化の場合単離ソマトトロピンポリペプチドは図５に示
すアミノ酸番号５４近辺からアミノ酸番号９５近辺まで
のアミノ酸配列を有する。最も好ましい具体化の場合、
ポリペプチドは図５に示すアミノ酸８０近辺からアミノ
酸９０近辺のアミノ酸配列を有する。

【０００８】十分に同一のポリペプチドには、ポリペプ
チドの一次構造を変化させる小さい核酸変化を除いて実
質的に本来のＰＳＴと同一であるアミノ酸配列を有する
ポリペプチドが含まれる。これらのポリペプチドをコー
ドする核酸は、本来のｐＳＴをコードする核酸に中から
高緊縮度の条件下でハイブリッド形成することができ
る。ハイブリッド形成の方法は当該技術における熟練者
に周知である。得られたポリペプチドは変化しているが
依然として抗体ＰＳ−７．６に結合するこができる。

【０００９】この単離ソマトトロピンポリペプチドはブ
タ（豚）から単離される。

【００１０】本発明は、上記のポリペプチドをコードす
る核酸分子も含む。本文で用いる“核酸”という用語は
ＲＮＡ、ならびに一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ及びｃＤＮＡ
も含む。そのような核酸の例は、図５に示すアミノ酸番
号５４からアミノ酸番号１０５の配列を有するポリペプ
チドをコードする核酸である。上記で定義した分子とは
異なるが同一の生物学的効果を与えるポリペプチドをコ
ードする核酸分子は本発明に含まれる。又本発明は上文
で記載した核酸分子と比較した場合に、製造されるポリ
ペプチドの表現型を変えない非−コード領域の変化を特
徴とする核酸分子も含む。これらの核酸は天然源又は化
学合成から単離される。

【００１１】これらの核酸分子はポリペプチドの製造の
ための発現ベクターに生合成により挿入される。適した
ベクターにはプラスミド、ウィルス又はコスミドベクタ
ーが含まれるがこれらに限られるわけではない。これら
のベクターはＲＮＡ転写のプロモーターに作用的に結合
させた本発明の核酸、ならびに他の調節配列を含む。本
文で用いる“作用的に結合させた”という用語は、プロ
モーターがＲＮＡの転写を核酸分子から離れる方向に向
けるように位置させることを意味する。そのようなプロ
モーターの例はＳＰ６、Ｔ４及びＴ７である。プロモー
ター及びそのプロモーターに核酸の挿入片が作用的に結
合されたクローニング部位の両方を含むベクターは当該
技術において周知である。これらのベクターは生体内及
び試験管内でＲＮＡを転写できるのが好ましい。これら
のベクターはポリペプチドの製造のために宿主細胞に挿
入される。本発明の目的の場合適した宿主は真核細胞、
例えば哺乳類又は酵母細胞、あるいはバクロウィルス発
現のための昆虫細胞、又は原核細胞、例えば大腸菌
（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞であるがこれらに限ら
れるわけではない。宿主細胞を挿入された核酸分子が発
現し易い条件下で成育すると生合成によりポリペプチド
が製造され、当該技術において周知の方法により単離さ
れる。本発明はこれらのポリペプチドも含む。

【００１２】本発明の単離ソマトトロピンポリペプチド
及び製薬学的に許容し得る担体を含む組成物が本発明に
より提供される。本文で用いる“製薬学的に許容し得
る”担体という用語は、リン酸塩緩衝食塩水、水、乳
液、例えば油／水乳液及び種々の湿潤剤などのいずれの
標準の製薬学的担体も含む。本発明の好ましい組成物は
ブタソマトトロピンポリペプチドを含む。

【００１３】これらの組成物は動物における成長ホルモ
ンの生物学的活性の増強に特に有用である。組成物は生
物学的増強有効量で動物に投与され、正確な量は処置さ
れる動物の大きさに依存する。量の決定法は当該技術に
おける熟練者に周知である。

【００１４】これらの組成物は又、免疫化有効量のこれ
らの組成物を動物に投与することにより抗−成長ホルモ
ン抗体を動物中で誘起するのにも有用である。上記の通
り正確な量は処置される動物の大きさ及び種に依存する
が、量の決定法は当該技術における熟練者に周知であ
る。これらの量は、例えば約１μｇ−約１０ｍｇのｐＳ
Ｔの範囲である。しかし本発明の好ましい具体化の場
合、量は約３μｇ−約５ｍｇのｐＳＴの範囲である。

【００１５】又、成長促進有効量のこれらの組成物を動
物に投与することにより動物の成長が促進される。この
場合も正確な投与量は、周知の方法で当該技術における
熟練者により決定される。これらの量は例えば約１μｇ
−約１０ｍｇの範囲である。しかし本発明の好ましい具
体化の場合、量は約３μｇ−約５ｍｇの組成物の範囲で
ある。

【００１６】上記の方法で処置する動物には牛、豚、山
羊、鶏、七面鳥、がちょう、うさぎ及び魚などの脊椎動
物が含まれるがこれらに限られるわけではない。本発明
の目的の場合、投与は経口的、静脈内又は腹腔内投与を
意味する。

【００１７】本発明のいくつかの具体化を下記に詳細に
示す。しかし本発明の境界及び限界は以下の実施例によ
り制限されてはならない。

【００１８】

【実施例】

実施例１動物及びペプチド合成 ２１日令及び体重５０−６４ｇの下垂体摘出された雌の
Ｓｐｒａｇｕｅ−ＤａｗｌｅｙラットをＴａｃｏｎｉｃ
Ｆａｒｍ，Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹから入手し、
成長ホルモン（ＧＨ）の分析に用いる。３−５月令及び
体重３０−５０ｋｇの雌の雑種形成された豚（Ｄｕｒｏ
ｃ ｘ Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ ｘ Ｈａｍｐｓｈｉｒ
ｅ）をＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ Ｃｏ．，
Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪの飼育コロニーから入手し、
抗体の製造に用いる。

【００１９】Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ
−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−
Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ａ
ｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｈ
ｅ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ
−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−
Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇの配列を有す
るペプチドを、カップリング剤としてのベンゾトリアゾ
ール−１−イルオキシトリ（ジメチルアミノ）−ホスホ
ニウムヘキサフルオロホスフェート（“ＢＯＰ”）、１
−ヒドロキシベンゾトリアゾール（“ＨＯＢＴ”）、及
び担体としての４−ヒドロキシメチル−フェノキシ−樹
脂と共に９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
（“Ｆｍｏｃ”）−アミノ酸を用い、自動ペプチド合成
機、Ｍｉｌｌｉｎｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅｒｃｈ ９６００
Ａｕｔｏｍａｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｚｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍ
Ａ）により合成する。側鎖の保護のために以下のＦｍｏ
ｃアミノ酸誘導体を用いる：Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（Ｔ−Ｂ
ｕ）、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔ−Ｂｕ）、Ｆｍｏｃ−Ａｒ
ｇ（Ｐｍｃ）、Ｆｍｃｏ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ
−Ｇｌｎ−ｏＰｆｐ及びＦｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏ−ｔ−Ｂ
ｕ）。固相ペプチド合成の後、９５％ＴＦＡ、２．５％
アニソール及び２．５％エタンジチオールで処理するこ
とによりペプチドを樹脂から遊離させ、その後冷エーテ
ル溶液から沈澱させる。その後粗ペプチドを流量２２ｍ
ｌ／分にて２５分で水−アセトニトリル勾配（３０−８
０％）を用いた分取ＨＰＬＣ Ｃ１８カラム（Ｒａｉｎ
ｉｎ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）により精製する。このペプ
チドの純度は標準的アミノ酸分析及びＦＡＢ質量分析に
より決定することができる（図６を参照）。

【００２０】実施例２ペプチドの担体との複合 上記で同定されたペプチドを室温（約２５℃）で２％の
グルタルデヒドを用い、オボアルブミンに複合させ、そ
の後ＮａＢＨ₄を用いて還元する。過剰のＮａｂＨ₄を酢
酸によりクエンチし、複合体をサイジングカラムクロマ
トグラフィーにより精製する。それを凍結乾燥し、使用
するまで−２０℃で保存する。

【００２１】実施例３ペプチドに対する抗体の製造 ペプチド−オボアルブミン複合体を完全フロイントアジ
ュバントと乳化し、豚の耳の後ろの首領域に皮下注射す
る。すべての動物に４週間毎に同一抗原で少なくとも２
回追加免疫し、最後の追加免疫後７−１４日で血液試料
を採取する。血液凝固後に血清を得、タンパク質高速液
体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）系（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）上で分取タンパク質ＡセファロースＨＲ１６／５
カラムにより、又は硫酸アンモニウム沈澱により免疫グ
ロブリン（Ｉｇ）を精製する。抗体は使用するまで−８
０℃にてアリコートとして保存する。

【００２２】実施例４ 固相酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）及
び ｐＳＴの類似体の決定法 例えば抗原をリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で調製
し、１００μｌ中の１μｇを９６−ウェル平底ポリスチ
レンプレートの各ウェルに加える。１時間インキュベー
トした後、プレートを自動プレート洗浄機（Ｄｙｎａｔ
ｅｃｈ ＷａｓｈＩＩ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ，
Ｕ．Ｓ．Ａ．）により０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅ
ｎ−２０を含むＰＢＳを用いて３回洗浄し、各ウェルに
２％（ｗ／ｖ）の牛血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ）２０
０μｌを懸濁する。プレートを再度さらに１時間インキ
ュベートする。血清試料を加える。これらをウェル中５
％の最終濃度で調べる。プレートを３０分間インキュベ
ートし、ＰＢＳで６回洗浄し、１００μｌのアルカリホ
スファターゼ−複合ヒツジ抗−ウサギＩｇＧ Ｆ（ａ
ｂ’）₂（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓ
ｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ，Ｕ．
Ｓ．Ａ．）を加える。３０分間インキュベートした後、
プレートを再度洗浄し、０．１Ｍジエタノールアミン
（ｐＨ１０．３）中の１００μｌのｐ−ニトロフェニル
ホスフェート（Ｓｉｇｍａ）を発色基質として加える。
最後に比色応答を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーにより
４０５ｎｍの波長にて光学濃度（ＯＤ）として記録す
る。インキュベーション法は常に３７℃で行う。

【００２３】この方法を用いて図５に示す本来のｐＳＴ
の類似体を検出する。この方法を用い、ポリペプチドの
試料をＰＢＳ中に調製し、９６−ウェルプレート上に分
ける。本来のｐＳＴ（５４−９５）を標準として用い
る。

【００２４】実施例５成長−促進活性に関する生物学的分析 下垂体摘出したラットを無作為に８グループに割り当て
る。室温で５μｇのｐＳＴと１時間混合した抗体を実験
用ラットの首領域に皮下から投与する。すべての動物を
毎日種々の時間で処置し、その成長を正味の体重増加と
して記録する。統計分析系の一般直線モデル法（Ｇｅｎ
ｅｒａｌ Ｌｉｎｅａｒ Ｍｏｄｅｌｓｐｒｏｃｅｄｕ
ｒｅ）を用い、ランダム化デザイン（ｒａｎｄｏｍｉｚ
ｅｄｄｅｓｉｇｎ）に関する偏差の最少二乗分析を用い
てｐＳＴ処理のみと比較することにより統計的評価を行
う。

【００２５】実施例６ｐＳＴペプチドに対する抗体の製造 ペプチドｐＧＨ（５４−９５）（これも配列Ｉ．Ｄ．Ｎ
ｏ．１）を化学的にオボアルブミンと複合させる。複合
体をフロイントアジュバントと混合し、２匹の豚に注射
する。２回の抗原追加の後これらの豚から血清を得、Ｅ
ＬＩＳＡにて抗体力価を調べる。図１に示す通りこれら
の豚からの血清はｐＳＴと免疫反応可能な抗体を含む。
プールされた正常な豚の血清は非反応性であることが見
いだされる。これらのすべての血清試料を同様にｐＳＴ
（５４−９５）ペプチドを標的として調べ、免疫化され
た豚の両方が抗−ペプチド抗体を生成するが、未処理の
正常な豚は、もしあっても非常に低い力価を示すことが
見いだされる（図２）。

【００２６】実施例７ｐＳＴ（５４−９５）に対する抗体の生物学的活性 これらの抗体の成長促進効果を下垂体摘出ラットで評価
する。下垂体摘出ラットに抗体を含む、又は含まないｐ
ＳＴ（５μｇ）を連続５日間（０日−４日）皮下注射す
る。正味の体重増加を記録する。ｐＳＴ（５４−９５）
で免疫化した２匹の豚から２つの異なる供給源の実験用
抗体を調製し、非−免疫化の豚のプールされた血清から
標準抗体を調製する。図３の結果は２ｍｇの投薬量で非
−免疫抗体を含むすべての抗体が、下垂体摘出ラットの
成長の促進におけるｐＳＴの活性を増強することを示
す。しかし非−免疫抗体の効果は短命であるが２匹の豚
において抗体は明らかに長い効果を示す。

【００２７】より低い抗体投薬量及び長い期間で第２の
実験を行う。動物を０日から４日まで、及び再度７日か
ら１０日まで５μｇ／日のｐＳＴで処理し、未処理ラッ
トと比較して顕著な成長を示す（図４）。これらの２匹
の豚からの免疫抗体（０．５ｍｇ／日）を加えるとｐＳ
Ｔの効果を有意に増強するが、プールされた正常な豚の
血清は無効である。これらのデータは、ｐＳＴ（５４−
９５）により豚がｐＳＴ活性を増強できる抗体を製造で
きるようになることを示す。

【００２８】実施例８ｐＳＴポリペプチドをコードする核酸の発現ベクターへ
の挿入 ｐＳＴポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を適
した発現ベクター、すなわち挿入されたタンパク質−コ
ード配列の転写及び翻訳に必要な要素を含むベクターに
挿入する。コード配列は５’又は３’末端のいずれか
で、あるいは両末端で伸長し、エピトープを保持したま
ま生合成によりポリペプチドを伸長することができる。
伸長により、例えば標識のための結合用のアームを担体
又は表面に与えることができる。

【００２９】ｐＳＴ配列の発現のために多様な宿主−ベ
クター系が用いられる。これらには、チャイニーズハム
スター卵巣細胞宿主培養物（ＣＨＯ）などの哺乳類培養
細胞；ウィルス（例えばワクシニアウィルス、アデノウ
ィルス）に感染した哺乳類系；ウィルス（例えばバクロ
ウィルス）に感染した昆虫細胞系；酵母ベクターを含む
酵母又はバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ
あるいはコスミドＤＮＡを用いて形質転換した細菌など
の微生物が含まれるが、これらに限られるわけではな
い。哺乳類細胞系にクローニングする場合、哺乳類細胞
のゲノムから単離したプロモーター（マウス メタロチ
オニン プロモーター）又はこれらの細胞中で成長した
ウィルスから単離したプロモーター（ワクシニア ウィ
ルス ７．５Ｋ プロモーター）を用いる。本発明のあ
る具体化の場合、プロモーターは組み替えＤＮＡ又は合
成法により製造し、挿入配列の転写に備える。

【００３０】挿入ヌクレオチドの有効な翻訳のために特
異的開始シグナルを備える。これらのシグナルはＡＴＧ
開始コドン及び隣接配列を含み、確実に挿入物全体を翻
訳するためにｐＳＴ配列の読み取り枠と同一の相で挿入
される。これらの外因的翻訳制御シグナル及び開始コド
ンは天然及び合成の多様な起源を有する。ｐＳＴヌクレ
オチドは試験管内組み替え法により、及び生体内組み替
えによりベクター中に挿入される。

【００３１】ｐＳＴ配列を含む発現ベクターは、例えば
３つの一般的方法：１）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形
成、２）マーカー遺伝子機能の存在又は不在、３）挿入
ｐＳＴ配列の発現により同定される。第１の方法の場
合、発現ベクター中の挿入ｐＳＴ配列の存在を、ｐＳＴ
ヌクレオチドと相同である配列を含むプローブを用いた
ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド形成により検出する。第２
の方法では、ベクター中への異種遺伝子の挿入によって
起こるある種の“マーカー”遺伝子機能（例えばチミジ
ンキナーゼ活性、抗生物質に対する抵抗性、形質転換表
現型）の存在又は不在に基づいて組み替えベクター／宿
主系を同定する。第３の方法の場合、組み替え体により
発現される異種遺伝子生成物の分析により、例えばヌク
レオチド生成物の抗体ＰＳ−７．６との反応性の分析に
より組み替え発現ベクターを同定する。

【００３２】さらに挿入ｐＳＴ配列の発現が調節される
宿主細胞株を選ぶことができる。ある種のプロモーター
からの発現はある種のインデューサー（例えばメタロチ
オニン プロモーターの場合の亜鉛及びカドミウムシオ
ン）の存在下で高められる。

【００３３】特定の組み替えＤＮＡ分子が同定され、単
離された後、そのような組み替え体が自己−複製単位
（レプリコン）を構成するかどうかに依存していくつか
の方法を用い、それを増殖する。自己−複製単位、プラ
スミド、ウィルス、細胞は適した細胞環境及び成長条件
において自己を増殖することができる。自己−複製単位
の欠乏した組み替え体はそのような単位を有する分子中
に組み込み、増殖できるようにする。例えばある種のプ
ラスミド発現ベクターは宿主細胞中に挿入した後、組み
替え遺伝子の増殖及び安定した発現の保証のために細胞
染色体中に組み込む必要がある。適した宿主系及び成長
条件が確立した後、組み替え発現ベクターを増殖し、大
量に製造される。

【００３４】実施例９発現ベクターとしての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） 多くの大腸菌プラスミドが既知であり、異種遺伝子の発
現に用いられてきた。経済的な理由から、高い発現度を
得られるのが非常に好ましい。与えられた遺伝子生成物
を大量に得る１つの方法は、細菌細胞内で非常に高い複
製数を有するプラスミド上に遺伝子をクローニングする
ことである。特定の遺伝子の複製の数を増すことによ
り、通常ｍＲＮＡの量も増加し、それが今度は所望のタ
ンパク質の製造を増加させる。

【００３５】実施例１０発現ベクターとしてのワクシニアウィルス クローニング及び発現ベクターとしてワクシニアウィル
スを用いることができる。ウィルスは約１８７ｋｂ対の
線状２本鎖ＤＮＡゲノムを含み、感染細胞の細胞質内で
複製される。これらのウィルスはウィルスコア内に完全
転写酵素系（キャッピング、メチル化及びポリアデニル
化酵素を含む）を含む。ワクシニアウィルス転写調節配
列（プロモーター）は、細胞ＲＮＡポリメラーゼではな
くワクシニアＲＮＡポリメラーゼにより転写を開始させ
るので、この系はウィルス感染力に必要である。

【００３６】組み替えウィルスにおける異種ＤＮＡの発
現には、異種ヌクレオチドのポリペプチドコード配列へ
のワクシニアプロモーターの融合が必要である。挿入ベ
クターとも呼ばれるプラスミドベクターは、ワクシニア
ウィルスへのキメラ遺伝子の挿入に用いられる。挿入ベ
クターの１つの種類は：１）転写開始部位を含むワクシ
ニアウィルスプロモーター；２）異種ＤＮＡフラグメン
トの挿入のための、転写開始部位の下流のいくつかの独
特の制限エンドヌクレアーゼクローニング部位；３）プ
ロモーター及びクローニング部位の側面にならび、ウィ
ルスゲノムの相同非必須領域へのキメラウィルスの挿入
を方向づける非必須ワクシニアウィルスＤＮＡ（例えば
チミジンキナーゼ遺伝子）；及び４）大腸菌における複
製及び選択のための、細菌起源の複製による抗生物質抵
抗性マーカーを含む。

【００３７】組み替えウィルスは、異種遺伝子を含む組
み替え細菌挿入ベクターの、ワクシニアウィルスに感染
した細胞中へのトランスフェクションにより製造され
る。感染細胞内で相同的組み替えが起こり、ウィルスゲ
ノム中に異種遺伝子が挿入される。例えばその内容を本
開示中に参照として挿入する米国特許第４，６０３，１
１２号を参照せよ。例えば免疫学的方法、ＤＮＡプラー
クハイブリッド形成又は遺伝的選択を用いて所望の組み
替えウィルスを同定し、単離する。これらのワクシニア
ウィルスは感染力に必須の機能を保持し、最高約３５ｄ
ｂの異種ＤＮＡを収容して構築することができる。

【００３８】実施例１１発現ベクターとしてのバクロウィルス オートグラフィカ カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐ
ｈｉｃａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウィル
ス（ＡｃＮＰＶ）などのバクロウィルスはクローニング
又は発現ベクターとして用いられる。ＡｃＮＰＶの感染
形態は通常ウィルス性閉塞（ｖｉｒａｌ ｏｃｃｌｕｓ
ｉｏｎ）中に見られる。この構造は大部分が多角体ポリ
ペプチドから成り、その中にウィルス粒子が埋め込まれ
ている。多角体遺伝子発現は感染サイクル中の非常に後
期に、成熟ウィルス粒子が形成されてから起こる。従っ
て多角体遺伝子発現は必ずしも必要でない機能であり、
すなわち多角体遺伝子発現の不在下で製造された非−閉
塞ウィルス粒子が十分活性であり、培養物中の細胞に感
染することができる。例示のみを目的として２段階で組
み替えバクロウィルスを製造することができる。第１に
バクロウィルスＤＮＡを切断して多角体遺伝子又はその
一部を含むフラグメントを製造し、それをその後クロー
ニングビークル中に挿入する。発現されるべき遺伝子も
クローニングビークル中に挿入し、それは多角体プロモ
ーターの制御下となるように挿入される。この組み替え
分子は組み替えトランスファーベクターと称することが
できる。通常組み替えトランスファーベクターは適した
宿主細胞中で増幅される。組み替えトランスファーベク
ターをバクロウィルウヘルパーＤＮＡと混合し、培養物
中の昆虫細胞のトランスフェクションに用い、バクロウ
ィルスゲノムの多角体遺伝子座においてクローニングさ
れた遺伝子の組み替え及び挿入を行う。得られた組み替
えバクロウィルスを用いて感受性の強い昆虫又は培養昆
虫細胞に感染させる。

【００３９】本発明の主たる特徴及び態様は以下の通り
である。

【００４０】１．ブタソマトトロピン（ｐＳＴ）のエピ
トープに対応する単離ポリペプチド。

【００４１】２．ポリペプチドが図５に示すアミノ酸番
号５０近辺からアミノ酸番号１０５近辺のアミノ酸配列
を有する、第１項に記載の単離ポリペプチド。

【００４２】３．ポリペプチドが図５に示すアミノ酸番
号５４近辺からアミノ酸番号９５近辺のアミノ酸配列を
有する、第２項に記載の単離ポリペプチド。

【００４３】４．ポリペプチドが図５（配列Ｉ．Ｄ．Ｎ
ｏ．１）に示すアミノ酸番号８０近辺からアミノ酸番号
９０近辺のアミノ酸配列を有する、第３項に記載の単離
ポリペプチド。

【００４４】５．第１項に記載のポリペプチドをコード
する核酸分子。

【００４５】６．核酸がＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡで
ある、第５項に記載の核酸分子。

【００４６】７．第５項に記載の核酸分子にハイブリッ
ド形成する核酸分子。

【００４７】８．第７項に記載の核酸分子によりコード
される単離ポリペプチド。

【００４８】９．第１項に記載の単離ポリペプチド及び
製薬学的に許容し得る担体を含む組成物。

【００４９】１０．生物学的増強有効量の第９項に記載
の組成物を動物に投与することを含む、動物における成
長ホルモンの生物学的活性を増強する方法。

【００５０】１１．組成物中のｐＳＴの量が製薬学的に
許容し得る担体中で約１μｇ−１０ｍｇのｐＳＴであ
る、第１０項に記載の方法。

【００５１】１２．組成物中のｐＳＴの量が製薬学的に
許容し得る担体中で約３μｇ−５ｍｇのｐＳＴである、
第１１項に記載の方法。

【００５２】１３．免疫化有効量の第９項に記載の組成
物を動物に投与することを含む、動物において抗−成長
ホルモン抗体を誘起する方法。

【００５３】１４．組成物中のｐＳＴの量が製薬学的に
許容し得る担体中で約１μｇ−１０ｍｇのｐＳＴであ
る、第１３項に記載の方法。

【００５４】１５．組成物中のｐＳＴの量が製薬学的に
許容し得る担体中で約３μｇ−５ｍｇのｐＳＴである、
第１４項に記載の方法。

【００５５】１６．成長−促進有効量の第９項に記載の
組成物を動物に投与することを含む、動物の成長を促進
する方法。

【００５６】１７．組成物中のｐＳＴの量が製薬学的に
許容し得る担体中で約１μｇ−１０ｍｇのｐＳＴであ
る、第１６項に記載の方法。

【００５７】１８．組成物中のｐＳＴの量が製薬学的に
許容し得る担体中で約３μｇ−５ｍｇのｐＳＴである、
第１７項に記載の方法。

【００５８】１９．動物が豚（ブタ）である第１０、１
３又は１６項に記載の方法。

【００５９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１９１ 配列の型：アミノ酸 鎖の数：１本 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：サス スクロファ（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ） 配列の特徴： 名称／キー：結合部位 存在位置：５４．．．９５ 出版物情報： （Ａ）著者：Ａｂｄｅｌ−Ｍｅｇｕｉｄ，Ｓ．Ｓ． Ｓｈｉｅｈ，Ｈ． Ｓｍｉｔｈ，Ｗ．Ｗ． Ｄａｙｒｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ｅ． Ｖｉｏｌａｎｄ，Ｂ．Ｎ． Ｂｅｎｔｌｅ，Ｌ．Ａ． （Ｂ）標題：ブタ成長ホルモンの遺伝的操作変異体の三
次元構造 （Ｃ）雑誌：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
Ｕ．Ｓ．Ａ． （Ｄ）巻：８４ （Ｆ）頁：６４３４−６４３７ （Ｇ）日にち：１９８７年９月１日 （Ｋ）配列ＩＤ ＮＯ：１中の関連残基：１から１９１ 配列

【００６０】

【化１】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は以下のＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。Ｅ
ＬＩＳＡプレートにｐＳＴ及び２匹の豚からの血清試料
を塗布し、両方共ｐＳＴ（５４−９５）で免疫化し、プ
レートに加え、抗体−ｐＳＴ抗体力価を決定する。プー
ルされた未処理の正常な豚からの血清を標準として同様
に処理する。

【図２】図２は以下のＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。Ｅ
ＬＩＳＡプレートにペプチドｐＳＴ（５４−９５）及び
２匹の豚から血清試料を塗布し、両方共ｐＳＴ（５４−
９５）で免疫化し、プレートに加えて抗体−ｐＳＴ抗体
力価を決定する。プールされた未処理の正常な豚からの
血清を標準として同様に試験する。

【図３】図３はｐＳＴ（５４−９５）に対する抗体の生
物学的活性を示す。下垂体摘出ラットに抗体（２ｍｇ／
日）を含む、又は含まないｐＳＴ（５μｇ／日）を連続
５日間皮下注射し、正味の体重増加を記録する。免疫抗
体はｐＳＴ（５４−９５）で免疫した２匹の豚から調製
し、標準抗体は非−免疫化の豚のプールされた血清から
調製する。＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１。

【図４】図４はｐＳＴ（５４−９５）に対する抗体の生
物学的活性を示す。図３に示す研究と類似の研究におい
て、抗体を０．５ｍｇ／日の投薬量でより長い期間注射
する。＊，ｐ＜０．０５；＊＊，ｐ＜０．０１；＊＊
＊，ｐ＜０．００１。

【図５】図５はブタソマトトロピンのアミノ酸配列を示
す。配列Ｉ．Ｄ．Ｎｏ．１としても示す。

【図６】図６は精製ｐＳＴの質量分析である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/16 ＺＮＡ 15/62 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ホング−ミング・シー アメリカ合衆国ペンシルベニア州19047ロ ングホーン・パイングレンロード35 (72)発明者 マーテイン・ジヨン・コーベツト アメリカ合衆国ニユージヤージイ州08060 マウントホリー・ユニオンストリート112

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ブタソマトトロピン（ｐＳＴ）のエピト
   ープに対応する単離ポリペプチド。
2. 【請求項２】 請求項１に記載のポリペプチドをコード
   する核酸分子。
3. 【請求項３】 請求項２に記載の核酸分子にハイブリッ
   ド形成する核酸分子。
4. 【請求項４】 請求項３に記載の核酸分子によりコード
   される単離ポリペプチド。
5. 【請求項５】 請求項１に記載の単離ポリペプチド及び
   製薬学的に許容し得る担体を含む組成物。
6. 【請求項６】 生物学的増強有効量の請求項５に記載の
   組成物を動物に投与することを含む、動物における成長
   ホルモンの生物学的活性を増強する方法。
7. 【請求項７】 免疫化有効量の請求項５に記載の組成物
   を動物に投与することを含む、動物において抗−成長ホ
   ルモン抗体を誘起する方法。
8. 【請求項８】 成長−促進有効量の請求項５に記載の組
   成物を動物に投与することを含む、動物の成長を促進す
   る方法。