JPH06181760A - アルカリプロテアーゼｋ−１６ｈ - Google Patents
アルカリプロテアーゼｋ−１６ｈInfo
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- JPH06181760A JPH06181760A JP35656292A JP35656292A JPH06181760A JP H06181760 A JPH06181760 A JP H06181760A JP 35656292 A JP35656292 A JP 35656292A JP 35656292 A JP35656292 A JP 35656292A JP H06181760 A JPH06181760 A JP H06181760A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】界面活性剤に対して優れた安定性を有し、洗浄
剤配合酵素として有用なアルカリプロテアーゼＫ−１６
Ｈを提供する。 【構成】アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈは、例えばバ
チルス属に属するバチルス・エスピーＫＳＭ−Ｋ１６
（微工研条寄第３３７６号）を適当な培地に接種し、常
法に従って培養を行なった後、その培養上清液を適当な
分離、精製処理に付すことにより得ることができる。
剤配合酵素として有用なアルカリプロテアーゼＫ−１６
Ｈを提供する。 【構成】アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈは、例えばバ
チルス属に属するバチルス・エスピーＫＳＭ−Ｋ１６
（微工研条寄第３３７６号）を適当な培地に接種し、常
法に従って培養を行なった後、その培養上清液を適当な
分離、精製処理に付すことにより得ることができる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はアルカリプロテアーゼＫ
−１６Ｈに関し、更に詳細には界面活性剤に対して優れ
た安定性を有し、洗浄剤配合酵素として有用なアルカリ
プロテアーゼＫ−１６Ｈに関する。
−１６Ｈに関し、更に詳細には界面活性剤に対して優れ
た安定性を有し、洗浄剤配合酵素として有用なアルカリ
プロテアーゼＫ−１６Ｈに関する。
【０００２】
【従来の技術】従来よりプロテアーゼは、食品・水産加
工工業、皮革工業、繊維工業、醸造工業、洗剤工業など
に広く用いられている酵素であるが、このプロテアーゼ
の洗浄剤への配合も古くから行われており、現在多くの
アルカリプロテアーゼが洗浄剤用酵素として用いられて
いる。さらに近年、特に衣料用洗剤は、環境問題の面か
らの無リン化が進められているが、この結果低下する洗
浄力を強化するためにアルカリプロテアーゼの配合が行
われており、ますますアルカリプロテアーゼの需要が高
まっている。
工工業、皮革工業、繊維工業、醸造工業、洗剤工業など
に広く用いられている酵素であるが、このプロテアーゼ
の洗浄剤への配合も古くから行われており、現在多くの
アルカリプロテアーゼが洗浄剤用酵素として用いられて
いる。さらに近年、特に衣料用洗剤は、環境問題の面か
らの無リン化が進められているが、この結果低下する洗
浄力を強化するためにアルカリプロテアーゼの配合が行
われており、ますますアルカリプロテアーゼの需要が高
まっている。
【０００３】ところで、プロテアーゼが洗浄中に有効に
配合されるためには、単にアルカリ性条件下において作
用するというだけでは不十分であり、洗剤に配合される
界面活性剤中で安定であること、および衣類の汚れを分
解しうる能力、すなわち洗浄力を有することが要求され
る。
配合されるためには、単にアルカリ性条件下において作
用するというだけでは不十分であり、洗剤に配合される
界面活性剤中で安定であること、および衣類の汚れを分
解しうる能力、すなわち洗浄力を有することが要求され
る。
【０００４】しかしながら、このような洗剤に配合され
るプロテアーゼに要求される、界面活性剤に対する安定
性および優れた洗浄力の両特性を同時に満足させるアル
カリプロテアーゼは未だ提供されていないのが実情であ
る。
るプロテアーゼに要求される、界面活性剤に対する安定
性および優れた洗浄力の両特性を同時に満足させるアル
カリプロテアーゼは未だ提供されていないのが実情であ
る。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】上記実情を鑑み、本発
明者らは先に、新たなアルカリプロテアーゼ生産菌を取
得すべく、日本全国の土壌を採取し探索した。 そして
その結果、栃木県芳賀郡の土壌より分離されたバチルス
属の一菌株が、洗浄剤配合系において優れた洗浄力を有
し、しかも界面活性剤中で極めて高い安定性を有するア
ルカリプロテアーゼを生産することを見出し、特許出願
を行った（特願平３−３３１１６号及び特願平３−３３
１１７号）。
明者らは先に、新たなアルカリプロテアーゼ生産菌を取
得すべく、日本全国の土壌を採取し探索した。 そして
その結果、栃木県芳賀郡の土壌より分離されたバチルス
属の一菌株が、洗浄剤配合系において優れた洗浄力を有
し、しかも界面活性剤中で極めて高い安定性を有するア
ルカリプロテアーゼを生産することを見出し、特許出願
を行った（特願平３−３３１１６号及び特願平３−３３
１１７号）。
【０００６】上記微生物の産生するアルカリプロテアー
ゼＫ−１６は、それ自身、実際の使用に十分な安定性と
洗浄力を有する優れたものであるが、更に、より優れた
界面活性剤中での安定性と、より優れた洗浄剤配合酵素
としての機能を有するアルカリプロテアーゼを探求する
ことは極めて意義のあることである。
ゼＫ−１６は、それ自身、実際の使用に十分な安定性と
洗浄力を有する優れたものであるが、更に、より優れた
界面活性剤中での安定性と、より優れた洗浄剤配合酵素
としての機能を有するアルカリプロテアーゼを探求する
ことは極めて意義のあることである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記アル
カリプロテアーゼＫ−１６について種々研究を行った結
果、当該酵素は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に
より、アルカリプロテアーゼ活性を有する少なくとも３
成分から構成されていることを見出した。そして、これ
らの成分を分離、精製すべく、検討を重ねた結果、種々
のカラムクロマトグラフィーを用いることにより、電気
泳動的に均一な成分としてアルカリプロテアーゼＫ−１
６Ｈを取得することに成功し、本発明を完成するに至っ
た。
カリプロテアーゼＫ−１６について種々研究を行った結
果、当該酵素は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法に
より、アルカリプロテアーゼ活性を有する少なくとも３
成分から構成されていることを見出した。そして、これ
らの成分を分離、精製すべく、検討を重ねた結果、種々
のカラムクロマトグラフィーを用いることにより、電気
泳動的に均一な成分としてアルカリプロテアーゼＫ−１
６Ｈを取得することに成功し、本発明を完成するに至っ
た。
【０００８】すなわち本発明は、下記の特性を有する新
規なアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈを提供するもので
ある。
規なアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈを提供するもので
ある。
【０００９】（１）作用 単純蛋白質及び複合蛋白質を加水分解し、オリゴペプチ
ド又はアミノ酸を生成する。 （２）基質特異性 カゼイン、ヘモグロビン等の水可溶性蛋白質ならびにケ
ラチン、エラスチン等の水不溶性蛋白質に対して良好な
活性を有する。 （３）至適ｐＨ カゼインを基質とし、種々の緩衝液中で４０℃、１０分
間反応を行った場合、至適ｐＨは９.０〜１１.０であ
る。さらにｐＨ６.０〜１３.０で最大活性の５０％以上
の活性を有する。
ド又はアミノ酸を生成する。 （２）基質特異性 カゼイン、ヘモグロビン等の水可溶性蛋白質ならびにケ
ラチン、エラスチン等の水不溶性蛋白質に対して良好な
活性を有する。 （３）至適ｐＨ カゼインを基質とし、種々の緩衝液中で４０℃、１０分
間反応を行った場合、至適ｐＨは９.０〜１１.０であ
る。さらにｐＨ６.０〜１３.０で最大活性の５０％以上
の活性を有する。
【００１０】（４）ｐＨ安定性 種々の緩衝液中にＣａ2+を加え、５５℃、１０分間処理
した場合、ｐＨ５.０〜１２.０の範囲で極めて安定であ
る。 （５）至適温度 カゼインを基質とし、ｐＨ１０.０で反応を行った場
合、至適温度は５５℃である。 （６）耐熱性 ｐＨ９.０、５０℃にて１０分間処理した場合、または
Ｃａ2+を加え６０℃にて１０分間処理した場合、９０％
以上の残存活性を有する。
した場合、ｐＨ５.０〜１２.０の範囲で極めて安定であ
る。 （５）至適温度 カゼインを基質とし、ｐＨ１０.０で反応を行った場
合、至適温度は５５℃である。 （６）耐熱性 ｐＨ９.０、５０℃にて１０分間処理した場合、または
Ｃａ2+を加え６０℃にて１０分間処理した場合、９０％
以上の残存活性を有する。
【００１１】（７）分子量 ２８,０００±１,０００（ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による）。 （８）金属イオンの影響 カゼインを基質とした場合、Ｈｇ2+で活性が阻害され
る。また、Ｃａ2+で熱安定性及びｐＨ安定性が増大す
る。 （９）阻害剤の影響 エチレンジアミン四酢酸、ｐ−クロロマーキュリー安息
香酸、アンチパインで活性が阻害されない。フェニルメ
タンスルホニルフルオリド、キモスタチンによって活性
が阻害される。 （１０）界面活性剤の影響 ポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム、α−オレ
フィンスルホン酸ナトリウム、アルカンスルホン酸ナト
リウム、α−スルホ脂肪酸エステル等の界面活性剤が高
濃度に存在しても、極めて安定である。
ＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による）。 （８）金属イオンの影響 カゼインを基質とした場合、Ｈｇ2+で活性が阻害され
る。また、Ｃａ2+で熱安定性及びｐＨ安定性が増大す
る。 （９）阻害剤の影響 エチレンジアミン四酢酸、ｐ−クロロマーキュリー安息
香酸、アンチパインで活性が阻害されない。フェニルメ
タンスルホニルフルオリド、キモスタチンによって活性
が阻害される。 （１０）界面活性剤の影響 ポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム、α−オレ
フィンスルホン酸ナトリウム、アルカンスルホン酸ナト
リウム、α−スルホ脂肪酸エステル等の界面活性剤が高
濃度に存在しても、極めて安定である。
【００１２】本発明のアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈ
は、例えばバチルス属に属するバチルス・エスピーＫＳ
Ｍ−Ｋ１６（Bacillus ｓｐ.ＫＳＭ−Ｋ１６；微工研条
寄第３３７６号）を適当な培地に接種し、常法に従って
培養を行った後、その培養上清液を適当な分離、精製処
理に付すことにより得ることができる。 なお、このバ
チルス・エスピーＫＳＭ−Ｋ１６の菌学的性質およびそ
の取得方法は、特願平３−３３１１６号、同３−３３１
１７号等に記載されている。
は、例えばバチルス属に属するバチルス・エスピーＫＳ
Ｍ−Ｋ１６（Bacillus ｓｐ.ＫＳＭ−Ｋ１６；微工研条
寄第３３７６号）を適当な培地に接種し、常法に従って
培養を行った後、その培養上清液を適当な分離、精製処
理に付すことにより得ることができる。 なお、このバ
チルス・エスピーＫＳＭ−Ｋ１６の菌学的性質およびそ
の取得方法は、特願平３−３３１１６号、同３−３３１
１７号等に記載されている。
【００１３】培養に使用される培地としては、通常の微
生物の培養に用いられ、本菌株に利用可能なものであれ
ば何れをも使用することができるが、該培地中には資化
しうる炭素源及び窒素源を適当量含有せしめておくこと
が好ましい。
生物の培養に用いられ、本菌株に利用可能なものであれ
ば何れをも使用することができるが、該培地中には資化
しうる炭素源及び窒素源を適当量含有せしめておくこと
が好ましい。
【００１４】培地中に含有せしめる炭素源及び窒素源に
ついては特に制限はないが、窒素源の好ましい例として
は、コーングルテンミール、大豆粉、コーンスチープリ
カー、カザミノ酸、酵母エキス、ファーマメディア、イ
ワシミール、肉エキス、ペプトン、ハイプロ、アジパワ
ー、コーンミール、ソイビーンミール、コーヒー粕、綿
実油粕、カルチベーター、アミフレックス及びアジプロ
ン、ゼスト等が挙げられる。
ついては特に制限はないが、窒素源の好ましい例として
は、コーングルテンミール、大豆粉、コーンスチープリ
カー、カザミノ酸、酵母エキス、ファーマメディア、イ
ワシミール、肉エキス、ペプトン、ハイプロ、アジパワ
ー、コーンミール、ソイビーンミール、コーヒー粕、綿
実油粕、カルチベーター、アミフレックス及びアジプロ
ン、ゼスト等が挙げられる。
【００１５】また、炭素源としては、資化しうる炭素
源、例えばアラビノース、キシロース、グルコース、マ
ンノース、フラクトース、ガラクトース、蔗糖、麦芽
糖、乳糖、ソルビトール、マンニトール、イノシトー
ル、グリセリン、可溶性澱粉や廉価な廃糖蜜、転化糖
等、また資化しうる有機酸、例えば酢酸等が挙げられ
る。 更に、その他、リン酸、Ｍｇ2+、Ｃａ2+、Ｍ
ｎ2+、Ｚｎ2+、Ｃｏ2+、Ｎａ+、Ｋ+等の無機塩や、必要
であれば無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加する
こともできる。
源、例えばアラビノース、キシロース、グルコース、マ
ンノース、フラクトース、ガラクトース、蔗糖、麦芽
糖、乳糖、ソルビトール、マンニトール、イノシトー
ル、グリセリン、可溶性澱粉や廉価な廃糖蜜、転化糖
等、また資化しうる有機酸、例えば酢酸等が挙げられ
る。 更に、その他、リン酸、Ｍｇ2+、Ｃａ2+、Ｍ
ｎ2+、Ｚｎ2+、Ｃｏ2+、Ｎａ+、Ｋ+等の無機塩や、必要
であれば無機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加する
こともできる。
【００１６】斯して得られた培養物中からの目的物質で
あるアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈの採取及び精製
は、一般の酵素の採取及び精製の手段に準じて行うこと
ができる。
あるアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈの採取及び精製
は、一般の酵素の採取及び精製の手段に準じて行うこと
ができる。
【００１７】すなわち、培養物を遠心分離または濾過等
することによって菌体を分離し、その菌体及び培養濾過
液から通常の分離手段、例えば、塩析法、等電点沈澱
法、溶媒沈澱法（メタノール、エタノール、インプロピ
ルアルコール、アセトン等）によって蛋白質を沈澱させ
たり、また、限外濾過（例えばダイアフローメンブレン
フィルター；アミコン社製）により濃縮させたり、ある
いは、セファデックスＧ−２５、ポリビニルピロリドン
等により濃縮して、粗酵素としてアルカリプロテアーゼ
Ｋ−１６を得ることができる。
することによって菌体を分離し、その菌体及び培養濾過
液から通常の分離手段、例えば、塩析法、等電点沈澱
法、溶媒沈澱法（メタノール、エタノール、インプロピ
ルアルコール、アセトン等）によって蛋白質を沈澱させ
たり、また、限外濾過（例えばダイアフローメンブレン
フィルター；アミコン社製）により濃縮させたり、ある
いは、セファデックスＧ−２５、ポリビニルピロリドン
等により濃縮して、粗酵素としてアルカリプロテアーゼ
Ｋ−１６を得ることができる。
【００１８】上記分離手段のうち、塩析法では例えば硫
安（３０−７０％飽和画分）中で、沈澱法では、例えば
７５％エタノール中でアルカリプロテアーゼＫ−１６を
沈澱させた後、濾過あるいは遠心分離、脱塩することに
よってこれを凍結乾燥粉末とすることも可能である。こ
こで採用しうる脱塩の方法としては、透析または、セフ
ァデックスＧ−２５等を用いるゲル濾過法等の一般的方
法が用いられる。
安（３０−７０％飽和画分）中で、沈澱法では、例えば
７５％エタノール中でアルカリプロテアーゼＫ−１６を
沈澱させた後、濾過あるいは遠心分離、脱塩することに
よってこれを凍結乾燥粉末とすることも可能である。こ
こで採用しうる脱塩の方法としては、透析または、セフ
ァデックスＧ−２５等を用いるゲル濾過法等の一般的方
法が用いられる。
【００１９】さらに、粗酵素であるアルカリプロテアー
ゼＫ−１６からアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈを精
製、採取するには、例えば、ヒドロキシアパタイトクロ
マトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ
−セファデックス、ＤＥＡＥ−セルロース、ＣＭ−セル
ロースやＣＭ−バイオゲル等のイオン交換クロマトグラ
フー及びセファデックスやバイオゲルのような分子篩ゲ
ルクロマトグラフィーを適宜組み合わせて分別精製すれ
ばよい。 望ましくは、ＤＥＡＥ−バイオゲル、ＣＭ−
バイオゲル等のイオン交換クロマトグラフィー及びヒド
ロキシアパタイト等の吸着クロマトグラフィーを適宜組
合せて精製することにより良好な結果を得ることができ
る。
ゼＫ−１６からアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈを精
製、採取するには、例えば、ヒドロキシアパタイトクロ
マトグラフィー等の吸着クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ
−セファデックス、ＤＥＡＥ−セルロース、ＣＭ−セル
ロースやＣＭ−バイオゲル等のイオン交換クロマトグラ
フー及びセファデックスやバイオゲルのような分子篩ゲ
ルクロマトグラフィーを適宜組み合わせて分別精製すれ
ばよい。 望ましくは、ＤＥＡＥ−バイオゲル、ＣＭ−
バイオゲル等のイオン交換クロマトグラフィー及びヒド
ロキシアパタイト等の吸着クロマトグラフィーを適宜組
合せて精製することにより良好な結果を得ることができ
る。
【００２０】斯して得られた本発明のアルカリプロテア
ーゼＫ−１６Ｈは、以下に示すような酵素学的性質を有
する。 尚、以下において、酵素活性の測定は次の如く
して行った。
ーゼＫ−１６Ｈは、以下に示すような酵素学的性質を有
する。 尚、以下において、酵素活性の測定は次の如く
して行った。
【００２１】（酵素活性測定法）カゼイン（HAMMARSTE
N；メルク社製）１％（W/V）を含む５０ｍＭ ホウ酸−
ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０.０）１ｍｌを４０℃で５分
間保温した後、０.１ｍｌの酵素液を加え、反応を開始
した。 ４０℃で１０分間反応させた後、反応停止液
（０.１２３Ｍ トリクロロ酢酸−０.２４６Ｍ 酢酸ナト
リウム−０.３６９Ｍ酢酸）２ｍｌを加え、室温にて約
２０分間放置した。 生成した沈澱物を濾紙（Ｎｏ.２濾
紙；ワットマン社製）により除去し、濾液中の酸可溶性
蛋白分解物をフォーリン・ローリー法により比色定量し
た。尚、酵素１単位（Ｕ）は、上記反応条件下におい
て、１分間に１μｍｏｌのチロシンに相当する酸可溶性
蛋白分解物を遊離する酵素量とした。
N；メルク社製）１％（W/V）を含む５０ｍＭ ホウ酸−
ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０.０）１ｍｌを４０℃で５分
間保温した後、０.１ｍｌの酵素液を加え、反応を開始
した。 ４０℃で１０分間反応させた後、反応停止液
（０.１２３Ｍ トリクロロ酢酸−０.２４６Ｍ 酢酸ナト
リウム−０.３６９Ｍ酢酸）２ｍｌを加え、室温にて約
２０分間放置した。 生成した沈澱物を濾紙（Ｎｏ.２濾
紙；ワットマン社製）により除去し、濾液中の酸可溶性
蛋白分解物をフォーリン・ローリー法により比色定量し
た。尚、酵素１単位（Ｕ）は、上記反応条件下におい
て、１分間に１μｍｏｌのチロシンに相当する酸可溶性
蛋白分解物を遊離する酵素量とした。
【００２２】（１）作用 単純蛋白質及び複合蛋白質を加水分解し、オリゴペプチ
ド又はアミノ酸を生成する。
ド又はアミノ酸を生成する。
【００２３】（２）基質特異性 アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈの各種基質に対する特
異性を、他の市販プロテアーゼと比較した。 用いた基
質は、カゼイン、ヘモグロビン、獣毛ケラチン、エラス
チン、卵黄およびヒト由来α−ケラチンで、これらに対
する分解活性を測定した。すなわち、５０ｍＭ ホウ酸
−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０.０）に各基質を１％（α
−ケラチンは、０.１％）加え、各酵素液０.０４〜０.
０４３Ｕ（エラスチンの場合は、０.２００〜０.２１５
Ｕ）を添加し、４０℃で１０分間反応を行った。 各酵
素のカゼインに対する活性を１００とし、それぞれの基
質に対する相対活性を表１に示した。
異性を、他の市販プロテアーゼと比較した。 用いた基
質は、カゼイン、ヘモグロビン、獣毛ケラチン、エラス
チン、卵黄およびヒト由来α−ケラチンで、これらに対
する分解活性を測定した。すなわち、５０ｍＭ ホウ酸
−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０.０）に各基質を１％（α
−ケラチンは、０.１％）加え、各酵素液０.０４〜０.
０４３Ｕ（エラスチンの場合は、０.２００〜０.２１５
Ｕ）を添加し、４０℃で１０分間反応を行った。 各酵
素のカゼインに対する活性を１００とし、それぞれの基
質に対する相対活性を表１に示した。
【００２４】
【００２５】この結果、アルカリプロテアーゼＫ−１６
Ｈは、代表的なバチルス属のアルカリプロテアーゼに比
べ、特に、難溶性蛋白（獣毛ケチラン、α−ケラチン、
エラスチン）に対し、優れた分解作用を示した。
Ｈは、代表的なバチルス属のアルカリプロテアーゼに比
べ、特に、難溶性蛋白（獣毛ケチラン、α−ケラチン、
エラスチン）に対し、優れた分解作用を示した。
【００２６】（３）至適ｐＨ １％のカゼインを含む５０ｍＭの各種ｐＨ緩衝液１ｍｌ
にアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈを０.０４１Ｕ加
え、反応を行った。図１に示すように、最適ｐＨでの活
性を１００とした各ｐＨでの活性を相対値で表した。
この結果からアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈの至適ｐ
Ｈは、９.０〜１１.０であり、さらにｐＨ６.０以上か
らｐＨ１３.０までの広範囲に渡り、５０％以上の活性
を有するものであった。 尚、使用した各種緩衝液、及
びそのｐＨ範囲は次のとおりであった。
にアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈを０.０４１Ｕ加
え、反応を行った。図１に示すように、最適ｐＨでの活
性を１００とした各ｐＨでの活性を相対値で表した。
この結果からアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈの至適ｐ
Ｈは、９.０〜１１.０であり、さらにｐＨ６.０以上か
らｐＨ１３.０までの広範囲に渡り、５０％以上の活性
を有するものであった。 尚、使用した各種緩衝液、及
びそのｐＨ範囲は次のとおりであった。
【００２７】（ 使用緩衝液およびそのｐＨ範囲 ） 酢酸緩衝液 ｐＨ４.０〜５.９ リン酸緩衝液 ｐＨ６.０〜８.１ 炭酸緩衝液 ｐＨ９.３〜１１.２ リン酸−ＮａＯＨ緩衝液 ｐＨ１１.４〜１２.４ ＫＣ１−ＮａＯＨ緩衝液 ｐＨ１２.３〜１３.２
【００２８】（４）ｐＨ安定性 （３）で用いた各種緩衝液（２０ｍＭ）中に２ｍＭ Ｃ
ａＣｌ2を添加した系及び無添加の系をそれぞれ調製
し、これに１.７０ＵのアルカリプロテアーゼＫ−１６
Ｈを加え、５５℃で１０分間放置した。 この処理液を
５０ｍＭ ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０.０）で１
０倍に希釈し、酵素活性を測定した。 処理前の酵素活
性を１００とした各ｐＨの相対活性を図２に示した。
ａＣｌ2を添加した系及び無添加の系をそれぞれ調製
し、これに１.７０ＵのアルカリプロテアーゼＫ−１６
Ｈを加え、５５℃で１０分間放置した。 この処理液を
５０ｍＭ ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０.０）で１
０倍に希釈し、酵素活性を測定した。 処理前の酵素活
性を１００とした各ｐＨの相対活性を図２に示した。
【００２９】この結果、アルカリプロテアーゼＫ−１６
Ｈは、上記条件下で、ＣａＣｌ2無添加の場合、ｐＨ７
〜１１の間で、２ｍＭ ＣａＣｌ2添加の場合、ｐＨ５〜
１２の間で極めて安定であった。
Ｈは、上記条件下で、ＣａＣｌ2無添加の場合、ｐＨ７
〜１１の間で、２ｍＭ ＣａＣｌ2添加の場合、ｐＨ５〜
１２の間で極めて安定であった。
【００３０】（５）至適温度 ０.０２８ＵのアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈを用
い、３０℃〜８０℃の各温度において、５ｍＭ ＣａＣ
ｌ2を添加した系及び無添加の系を調製し、温度以外は
標準反応条件と同様に反応を行った。 標準反応条件に
おける活性を１００とした各温度での相対活性を図３に
示した。アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈの至適反応温
度は、ＣａＣｌ2無添加系の場合５５℃であり、５ｍＭ
ＣａＣｌ2添加系では６５℃であった。
い、３０℃〜８０℃の各温度において、５ｍＭ ＣａＣ
ｌ2を添加した系及び無添加の系を調製し、温度以外は
標準反応条件と同様に反応を行った。 標準反応条件に
おける活性を１００とした各温度での相対活性を図３に
示した。アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈの至適反応温
度は、ＣａＣｌ2無添加系の場合５５℃であり、５ｍＭ
ＣａＣｌ2添加系では６５℃であった。
【００３１】（６）耐熱性 ２０ｍＭ ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９.０）の中に
５ｍＭ ＣａＣｌ2を添加した系及び無添加の系を調製
し、３０〜７０℃の各温度で５分間保温した。次いで、
０.４１ＵのアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈを加え、
１０分間熱処理を行った。氷水中で急冷した後、５０ｍ
Ｍ ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０.０）で２倍に希
釈した酵素液を用いて残存活性を測定した。３０℃で処
理した酵素活性を１００とした各温度処理での相対活性
を図４に示した。
５ｍＭ ＣａＣｌ2を添加した系及び無添加の系を調製
し、３０〜７０℃の各温度で５分間保温した。次いで、
０.４１ＵのアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈを加え、
１０分間熱処理を行った。氷水中で急冷した後、５０ｍ
Ｍ ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０.０）で２倍に希
釈した酵素液を用いて残存活性を測定した。３０℃で処
理した酵素活性を１００とした各温度処理での相対活性
を図４に示した。
【００３２】アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈは、Ｃａ
Ｃｌ2無添加系では５０℃まで、また５ｍＭ ＣａＣｌ2
添加系では６０℃まで９０％以上の活性が維持された。
この結果、本酵素はＣａ2+により安定化することが判
った。
Ｃｌ2無添加系では５０℃まで、また５ｍＭ ＣａＣｌ2
添加系では６０℃まで９０％以上の活性が維持された。
この結果、本酵素はＣａ2+により安定化することが判
った。
【００３３】（７）分子量 アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈの分子量を１２.５％
アクリルアミドを用いたドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定し
た。 分子量マーカーには、エレクトロフォレシス・キ
ァリブレイションキット（Electrophoresis Calibratio
n kit) ［ホスホリラーゼｂ（分子量９４,０００）、牛
血清アルブミン（分子量６７,０００）、卵白アルブミ
ン（分子量４３,０００）、カルボニックアンヒドロラ
ーゼ（分子量３０,０００）、大豆トリプシンインヒビ
ター（分子量２０,１００）およびα−ラクトアルブミ
ン（分子量１４,４００）の混合試料；ファルマシア社
製］ を用いた。 この方法により、アルカリプロテアー
ゼＫ−１６Ｈの分子量は２８,０００±１,０００と決定
された。
アクリルアミドを用いたドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法により測定し
た。 分子量マーカーには、エレクトロフォレシス・キ
ァリブレイションキット（Electrophoresis Calibratio
n kit) ［ホスホリラーゼｂ（分子量９４,０００）、牛
血清アルブミン（分子量６７,０００）、卵白アルブミ
ン（分子量４３,０００）、カルボニックアンヒドロラ
ーゼ（分子量３０,０００）、大豆トリプシンインヒビ
ター（分子量２０,１００）およびα−ラクトアルブミ
ン（分子量１４,４００）の混合試料；ファルマシア社
製］ を用いた。 この方法により、アルカリプロテアー
ゼＫ−１６Ｈの分子量は２８,０００±１,０００と決定
された。
【００３４】（８）金属イオンの影響 各種金属イオンのアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈに及
ぼす影響を調べた。２０ｍＭ ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液
（ｐＨ９.０）に各種金属塩を１ｍＭとなるように添加
し、１.０Ｕの酵素を加えて３０℃で２０分間放置した
後、５０ｍＭ ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０.０）
で１０倍に希釈した酵素液を用いて活性を測定した。
金属塩無添加で同様に処理したもの（対照）の活性を１
００とし、各種金属塩を添加した場合の相対活性を表２
に示した。
ぼす影響を調べた。２０ｍＭ ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液
（ｐＨ９.０）に各種金属塩を１ｍＭとなるように添加
し、１.０Ｕの酵素を加えて３０℃で２０分間放置した
後、５０ｍＭ ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０.０）
で１０倍に希釈した酵素液を用いて活性を測定した。
金属塩無添加で同様に処理したもの（対照）の活性を１
００とし、各種金属塩を添加した場合の相対活性を表２
に示した。
【００３５】
【００３６】この結果、アルカリプロテアーゼＫ−１６
Ｈは、Ｈｇ2+により５０％程度阻害されることが判っ
た。また、その他の金属イオンに対しては、充分に安定
であった。
Ｈは、Ｈｇ2+により５０％程度阻害されることが判っ
た。また、その他の金属イオンに対しては、充分に安定
であった。
【００３７】（９）各種化合物の影響 各種化合物のアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈに及ぼす
影響を調べた。すなわち、２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７.０）に各種化合物を所定濃度になるように添加
し、１.０ＵのアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈを加え
た。 ３０℃で２０分間放置した後、５０ｍＭ ホウ酸−
ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０.０）で１０倍に希釈した酵
素液を用いて活性を測定した。 化合物無添加で同様に
処理したもの（対照）の活性を１００とし、各化合物を
添加した場合の相対活性を表３に示した。
影響を調べた。すなわち、２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７.０）に各種化合物を所定濃度になるように添加
し、１.０ＵのアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈを加え
た。 ３０℃で２０分間放置した後、５０ｍＭ ホウ酸−
ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０.０）で１０倍に希釈した酵
素液を用いて活性を測定した。 化合物無添加で同様に
処理したもの（対照）の活性を１００とし、各化合物を
添加した場合の相対活性を表３に示した。
【００３８】
【００３９】* 阻害剤略号 ＥＤＴＡ： エチレンジアミン四酢酸 Ｄ Ｔ Ｔ： ジチオスレイトール Ｎ Ｅ Ｍ： Ｎ−エチルマレイミド Ｈ Ｎ Ｂ： ２−ヒドロキシ−５−ニトロベンジルブロ
ミド ＤＴＮＢ： ５,５'−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸 ＰＣＮＢ： ｐ−クロロマーキュリー安息香酸 ＰＭＳＦ： フェニルメタンスルホニルフルオリド
ミド ＤＴＮＢ： ５,５'−ジチオビス−２−ニトロ安息香酸 ＰＣＮＢ： ｐ−クロロマーキュリー安息香酸 ＰＭＳＦ： フェニルメタンスルホニルフルオリド
【００４０】アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈは、フェ
ニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、キモス
タチンで阻害されることから、活性発現にセリンが関与
するアルカリプロテアーゼであることが判った。 ま
た、他の化合物に対しては、極めて安定であった。
ニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）、キモス
タチンで阻害されることから、活性発現にセリンが関与
するアルカリプロテアーゼであることが判った。 ま
た、他の化合物に対しては、極めて安定であった。
【００４１】（１０）界面活性剤の影響 各種界面活性剤のアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈに及
ぼす影響を調べた。すなわち、５％（W/V）の界面活性
剤及び１０％（V/V）エタノールを含む０.１Ｍ トリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ９.０）に２.０Ｕのアルカリプロテ
アーゼＫ−１６Ｈを加え、４０℃にて４時間放置した。
この処理液を５０ｍＭ ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ
１０.０）で１０倍に希釈し、酵素活性を測定した。 酵
素添加直後の活性を１００とし、残存活性をその相対値
として表４に示した。
ぼす影響を調べた。すなわち、５％（W/V）の界面活性
剤及び１０％（V/V）エタノールを含む０.１Ｍ トリス
−塩酸緩衝液（ｐＨ９.０）に２.０Ｕのアルカリプロテ
アーゼＫ−１６Ｈを加え、４０℃にて４時間放置した。
この処理液を５０ｍＭ ホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ
１０.０）で１０倍に希釈し、酵素活性を測定した。 酵
素添加直後の活性を１００とし、残存活性をその相対値
として表４に示した。
【００４２】
【００４３】なお、具体的な界面活性剤は次の通りであ
る。
る。
【化１】
【００４４】アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈは、各種
界面活性剤が高濃度（５％）存在しても高い安定性を示
すものであった。また、市販の洗剤用アルカリプロテア
ーゼの１.０％（W/V）各種界面活性剤に対する安定性と
比較しても、本酵素は界面活性剤中で非常に安定であっ
た。
界面活性剤が高濃度（５％）存在しても高い安定性を示
すものであった。また、市販の洗剤用アルカリプロテア
ーゼの１.０％（W/V）各種界面活性剤に対する安定性と
比較しても、本酵素は界面活性剤中で非常に安定であっ
た。
【００４５】
【実施例】次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明
するが、本発明はこれら実施例になんら制約されるもの
ではない。
するが、本発明はこれら実施例になんら制約されるもの
ではない。
【００４６】実 施 例 １ アルカリプロテアーゼＫ−１６の生産：バチルス・エス
ピーＫＳＭ−Ｋ１６（微工研条寄第３３７６号）株を、
下記の培地Ａに１白金耳接種し、３０℃で２４時間好気
的に振盪培養を行い、種培養液を得た。次に、得られた
種培養液を、下記の培地Ｂへ２％（V/V）接種し、３０
℃で４８時間好気的に振盪培養を行い、アルカリプロテ
アーゼＫ−１６を含む培養液１１を得た。
ピーＫＳＭ−Ｋ１６（微工研条寄第３３７６号）株を、
下記の培地Ａに１白金耳接種し、３０℃で２４時間好気
的に振盪培養を行い、種培養液を得た。次に、得られた
種培養液を、下記の培地Ｂへ２％（V/V）接種し、３０
℃で４８時間好気的に振盪培養を行い、アルカリプロテ
アーゼＫ−１６を含む培養液１１を得た。
【００４７】培 地 Ａ ： グルコース ２.０ ％（W/V） ポリペプトンＳ １.０ 〃 酵母エキス ０.０５ 〃 リン酸一カリウム ０.１ 〃 硫酸マグネシウム・７水塩 ０.０２ 〃 炭酸ナトリウム（別滅菌） １.０ 〃（ｐＨ無調整）
【００４８】培 地 Ｂ ： グルコース ２.０ ％（W/V） 魚肉エキス １.０ 〃 大豆粉 １.０ 〃 リン酸一カリウム ０.１ 〃 硫酸マグネシウム・７水塩 ０.０２ 〃 炭酸ナトリウム（別滅菌） １.０ 〃（ｐＨ１０.
０）
０）
【００４９】実 施 例 ２ アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈの精製： （１）実施例１で得た培養液１１を遠心分離（１０,０
００ｒｐｍ：５分間）して菌体を除去し、その上清液を
限外濾過膜（分画分子量５,０００）にて濃縮し、凍結
乾燥した。 得られた粉末１.５ｇをイオン交換水２０ｍ
ｌに溶解後、１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（２ｍＭ Ｃ
ａ2+を含む、ｐＨ８.０）に対し一昼夜透析を行った。
次にあらかじめ１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（２ｍＭ
Ｃａ2+を含む、ｐＨ８.０）にて平衡化しておいたＤＥ
ＡＥ Ｂｉｏ−ＧｅｌＡカラム（２.５×１６ｃｍ、バイ
オラッド社製）へ得られた透析内液を吸着させ、同緩衝
液にて洗浄溶出を行った。 洗浄溶出された非吸着蛋白
部分を集め（１５０ｍｌ）、限外濾過（ＹＭ−５メンブ
レン、アミコン社製）にて濃縮をおこなった。
００ｒｐｍ：５分間）して菌体を除去し、その上清液を
限外濾過膜（分画分子量５,０００）にて濃縮し、凍結
乾燥した。 得られた粉末１.５ｇをイオン交換水２０ｍ
ｌに溶解後、１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（２ｍＭ Ｃ
ａ2+を含む、ｐＨ８.０）に対し一昼夜透析を行った。
次にあらかじめ１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（２ｍＭ
Ｃａ2+を含む、ｐＨ８.０）にて平衡化しておいたＤＥ
ＡＥ Ｂｉｏ−ＧｅｌＡカラム（２.５×１６ｃｍ、バイ
オラッド社製）へ得られた透析内液を吸着させ、同緩衝
液にて洗浄溶出を行った。 洗浄溶出された非吸着蛋白
部分を集め（１５０ｍｌ）、限外濾過（ＹＭ−５メンブ
レン、アミコン社製）にて濃縮をおこなった。
【００５０】この濃縮液（２０ｍｌ）を、あらかじめ１
０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（２ｍＭ Ｃａ2+を含む、ｐ
Ｈ８.０）にて平衡化しておいたＣＭ Ｂｉｏ−ＧｅｌＡ
カラム（２.５×１６ｃｍ；バイオラッド社製）へ吸着
させ、２５０ｍｌの同緩衝液にて洗浄溶出後、３０ｍＭ
塩化カリウムを含む同緩衝液にて、０から３０ｍＭの
塩化カリウム濃度勾配溶出を行った（２２５ｍｌず
つ）。 さらに、同様に３０ｍＭから１００ｍＭの塩化
カリウム濃度勾配溶出を行った（２２５ｍｌずつ）。
２０ｍＭから３０ｍＭの塩化カリウム濃度にて溶出され
てくるアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈを含有する画分
を集め（１８０ｍｌ）、限外濾過にて濃縮を行った。
０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（２ｍＭ Ｃａ2+を含む、ｐ
Ｈ８.０）にて平衡化しておいたＣＭ Ｂｉｏ−ＧｅｌＡ
カラム（２.５×１６ｃｍ；バイオラッド社製）へ吸着
させ、２５０ｍｌの同緩衝液にて洗浄溶出後、３０ｍＭ
塩化カリウムを含む同緩衝液にて、０から３０ｍＭの
塩化カリウム濃度勾配溶出を行った（２２５ｍｌず
つ）。 さらに、同様に３０ｍＭから１００ｍＭの塩化
カリウム濃度勾配溶出を行った（２２５ｍｌずつ）。
２０ｍＭから３０ｍＭの塩化カリウム濃度にて溶出され
てくるアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈを含有する画分
を集め（１８０ｍｌ）、限外濾過にて濃縮を行った。
【００５１】濃縮液（７.２ｍｌ）をあらかじめ１０ｍ
Ｍ トリス−塩酸緩衝液（２ｍＭ Ｃａ2+を含む、ｐＨ
８.０）にて平衡化しておいたＣＭ Ｂｉｏ−ＧｅｌＡカ
ラム（１.６×１６ｃｍ；バイオラッド社製）へ吸着さ
せ、１５０ｍｌの同緩衝液にて洗浄溶出後、２５ｍＭ
塩化カリウムを含む同緩衝液にて、０から２５ｍＭの塩
化カリウム濃度勾配溶出を行った（１５０ｍｌずつ）。
各フラクションの電気泳動の結果から、アルカリプロ
テアーゼＫ−１６Ｈのみを含む画分を集め（１２.５ｍ
ｌ）、限外濾過にて濃縮し（１ｍｌ）、最終濃度が２０
％（V/V）となるようにグリセロールを添加し、使用時
まで−２０℃にて保存した。
Ｍ トリス−塩酸緩衝液（２ｍＭ Ｃａ2+を含む、ｐＨ
８.０）にて平衡化しておいたＣＭ Ｂｉｏ−ＧｅｌＡカ
ラム（１.６×１６ｃｍ；バイオラッド社製）へ吸着さ
せ、１５０ｍｌの同緩衝液にて洗浄溶出後、２５ｍＭ
塩化カリウムを含む同緩衝液にて、０から２５ｍＭの塩
化カリウム濃度勾配溶出を行った（１５０ｍｌずつ）。
各フラクションの電気泳動の結果から、アルカリプロ
テアーゼＫ−１６Ｈのみを含む画分を集め（１２.５ｍ
ｌ）、限外濾過にて濃縮し（１ｍｌ）、最終濃度が２０
％（V/V）となるようにグリセロールを添加し、使用時
まで−２０℃にて保存した。
【００５２】以上の操作により、粗酵素粉末１.５ｇ
（総括性、７９,５６０Ｕ；総蛋白、９１８ｍｇ；比活
性、８６.７Ｕ／ｍｇ）より、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動並びにＳＤＳ−ポリアルリルアミドゲル電気泳
動にて均一なアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈ（総活
性、４０８Ｕ；精製蛋白質、３.４ｍｇ；比活性、１２
０Ｕ／ｍｇ）を得ることができた。
（総括性、７９,５６０Ｕ；総蛋白、９１８ｍｇ；比活
性、８６.７Ｕ／ｍｇ）より、ポリアクリルアミドゲル
電気泳動並びにＳＤＳ−ポリアルリルアミドゲル電気泳
動にて均一なアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈ（総活
性、４０８Ｕ；精製蛋白質、３.４ｍｇ；比活性、１２
０Ｕ／ｍｇ）を得ることができた。
【００５３】
【発明の効果】上述の如く、粗酵素アルカリプロテアー
ゼＫ−１６から均一に精製された本発明のアルカリプロ
テアーゼＫ−１６Ｈは、各種の界面活性剤中で安定であ
る。従って、本発明酵素は洗浄剤配合用酵素として極め
て優れたものであり、洗剤等に有利に利用することがで
きるものとする。
ゼＫ−１６から均一に精製された本発明のアルカリプロ
テアーゼＫ−１６Ｈは、各種の界面活性剤中で安定であ
る。従って、本発明酵素は洗浄剤配合用酵素として極め
て優れたものであり、洗剤等に有利に利用することがで
きるものとする。
【図面の簡単な説明】
【図１】 アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈの至適ｐＨ
を示す図面。
を示す図面。
【図２】 アルカリプロテアーゼＫ−１６ＨのｐＨ安定
性試験の結果を示す図面。
性試験の結果を示す図面。
【図３】 アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈの至適温度
を示す図面。
を示す図面。
【図４】 アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈの熱安定性
試験の結果を示す図面。 以 上
試験の結果を示す図面。 以 上
【手続補正書】
【提出日】平成５年２月９日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２１】（酵素活性測定法）カゼイン（ＨＡＭＭＡ
ＲＳＴＥＮ；メルク社製）１％（ｗ／ｖ）を含む５０ｍ
Ｍホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）１ｍｌを４
０℃で５分間保温した後、０．１ｍｌの酵素液を加え、
反応を開始した。４０℃で１０分間反応させた後、反応
停止液（０．１２３Ｍ トリクロロ酢酸−０．２４６Ｍ
酢酸ナトリウム−０．３６９Ｍ酢酸）２ｍｌを加え、
室温にて約２０分間放置した。生成した沈澱物を濾紙
（Ｎｏ．２濾紙；ワットマン社製）により除去し、濾液
中の酸可溶性蛋白分解物をフォーリン・ローリー法によ
り比色定量した。尚、酵素１単位（Ｕ）は、上記反応条
件下において、１分間に１μｍｏｌのチロシンに相当す
る酸可溶性蛋白分解物を遊離する酵素量とした。
ＲＳＴＥＮ；メルク社製）１％（ｗ／ｖ）を含む５０ｍ
Ｍホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）１ｍｌを４
０℃で５分間保温した後、０．１ｍｌの酵素液を加え、
反応を開始した。４０℃で１０分間反応させた後、反応
停止液（０．１２３Ｍ トリクロロ酢酸−０．２４６Ｍ
酢酸ナトリウム−０．３６９Ｍ酢酸）２ｍｌを加え、
室温にて約２０分間放置した。生成した沈澱物を濾紙
（Ｎｏ．２濾紙；ワットマン社製）により除去し、濾液
中の酸可溶性蛋白分解物をフォーリン・ローリー法によ
り比色定量した。尚、酵素１単位（Ｕ）は、上記反応条
件下において、１分間に１μｍｏｌのチロシンに相当す
る酸可溶性蛋白分解物を遊離する酵素量とした。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４１】（１０）界面活性剤の影響 各種界面活性剤のアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈに及
ぼす影響を調べた。すなわち、５％（ｗ／ｖ）の界面活
性剤及び１０％（ｖ／ｖ）エタノールを含む０．１Ｍ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に２．０Ｕのアルカ
リプロテアーゼＫ−１６Ｈを加え、４０℃にて４時間放
置した。この処理液を５０ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液
（ｐＨ１０．０）で１０倍に希釈し、酵素活性を測定し
た。酵素添加直後の活性を１００とし、残存活性をその
相対値として表４に示した。
ぼす影響を調べた。すなわち、５％（ｗ／ｖ）の界面活
性剤及び１０％（ｖ／ｖ）エタノールを含む０．１Ｍ
トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９．０）に２．０Ｕのアルカ
リプロテアーゼＫ−１６Ｈを加え、４０℃にて４時間放
置した。この処理液を５０ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液
（ｐＨ１０．０）で１０倍に希釈し、酵素活性を測定し
た。酵素添加直後の活性を１００とし、残存活性をその
相対値として表４に示した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４２】
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４４】アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈは、各種
界面活性剤が高濃度（５％）存在しても高い安定性を示
すものであった。また、市販の洗剤用アルカリプロテア
ーゼの１．０％（ｗ／ｖ）各種界面活性剤に対する安定
性と比較しても、本酵素は界面活性剤中で非常に安定で
あった。
界面活性剤が高濃度（５％）存在しても高い安定性を示
すものであった。また、市販の洗剤用アルカリプロテア
ーゼの１．０％（ｗ／ｖ）各種界面活性剤に対する安定
性と比較しても、本酵素は界面活性剤中で非常に安定で
あった。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４６】実施例 １ アルカリプロテアーゼＫ−１６の生産：バチルス・エス
ピーＫＳＭ−Ｋ１６（微工研条寄第３３７６号）株を、
下記の培地Ａに１白金耳接種し、３０℃で２４時間好気
的に振盪培養を行い、種培養液を得た。次に、得られた
種培養液を、下記の培地Ｂへ２％（ｖ／ｖ）接種し、３
０℃で４８時間好気的に振盪培養を行い、アルカリプロ
テアーゼＫ−１６を含む培養液１リットルを得た。
ピーＫＳＭ−Ｋ１６（微工研条寄第３３７６号）株を、
下記の培地Ａに１白金耳接種し、３０℃で２４時間好気
的に振盪培養を行い、種培養液を得た。次に、得られた
種培養液を、下記の培地Ｂへ２％（ｖ／ｖ）接種し、３
０℃で４８時間好気的に振盪培養を行い、アルカリプロ
テアーゼＫ−１６を含む培養液１リットルを得た。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４７】培 地Ａ： グルコース ２．０％（ｗ／ｖ） ポリペプトンＳ １．０ 〃 酵母エキス ０．０５ 〃 リン酸一カリウム ０．１ 〃 硫酸マグネシウム・７水塩 ０．０２ 〃 炭酸ナトリウム（別滅菌） １．０ 〃 （ｐＨ無調整）
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４８】培 地Ｂ： グルコース ２．０％（ｗ／ｖ） 魚肉エキス １．０ 〃 大豆粉 １．０ 〃 リン酸−カリウム ０．１ 〃 硫酸マグネシウム・７水塩 ０．０２〃 炭酸ナトリウム（別滅菌） １．０ 〃 （ｐＨ１０．０）
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４９】実施例 ２ アルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈの精製： （１）実施例１で得た培養液１リットルを遠心分離（１
０，０００ｒｐｍ：５分間）して菌体を除去し、その上
清液を限外濾過膜（分画分子量５，０００）にて濃縮
し、凍結乾燥した。得られた粉末１．５ｇをイオン交換
水２０ｍｌに溶解後、１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液
（２ｍＭ Ｃａ２＋を含む、ｐＨ８．０）に対し一昼夜
透析を行った。次にあらかじめ１０ｍＭ トリス−塩酸
緩衝液（２ｍＭＣａ２＋を含む、ｐＨ８．０）にて平衡
化しておいたＤＥＡＥ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ａカラム
（２．５×１６ｃｍ、バイオラッド社製）へ得られた透
析内液を吸着させ、同緩衝液にて洗浄溶出を行った。
洗浄溶出された非吸着蛋白部分を集め（１５０ｍｌ）、
限外濾過（ＹＭ−５メンブレン、アミコン社製）にて濃
縮をおこなった。
０，０００ｒｐｍ：５分間）して菌体を除去し、その上
清液を限外濾過膜（分画分子量５，０００）にて濃縮
し、凍結乾燥した。得られた粉末１．５ｇをイオン交換
水２０ｍｌに溶解後、１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液
（２ｍＭ Ｃａ２＋を含む、ｐＨ８．０）に対し一昼夜
透析を行った。次にあらかじめ１０ｍＭ トリス−塩酸
緩衝液（２ｍＭＣａ２＋を含む、ｐＨ８．０）にて平衡
化しておいたＤＥＡＥ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ａカラム
（２．５×１６ｃｍ、バイオラッド社製）へ得られた透
析内液を吸着させ、同緩衝液にて洗浄溶出を行った。
洗浄溶出された非吸着蛋白部分を集め（１５０ｍｌ）、
限外濾過（ＹＭ−５メンブレン、アミコン社製）にて濃
縮をおこなった。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５０】この濃縮液（２０ｍｌ）を、あらかじめ１
０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（２ｍＭ Ｃａ２＋を含
む、ｐＨ８．０）にて平衡化しておいたＣＭ Ｂｉｏ−
ＧｅｌＡカラム（２．５×１６ｃｍ；バイオラッド社
製）へ吸着させ、２５０ｍｌの同緩衝液にて洗浄溶出
後、３０ｍＭ 塩化カリウムを含む同緩衝液にて、０か
ら３０ｍＭの塩化カリウム濃度勾配溶出を行った（２２
５ｍｌずつ）。さらに、同様に３０ｍＭから１００ｍＭ
の塩化カリウム濃度勾配溶出を行った（２２５ｍｌず
つ）。２０ｍＭから３０ｍＭの塩化カリウム濃度にて溶
出されてくるアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈを含有す
る画分を集め（１８０ｍｌ）、限外濾過にて濃縮を行っ
た。
０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（２ｍＭ Ｃａ２＋を含
む、ｐＨ８．０）にて平衡化しておいたＣＭ Ｂｉｏ−
ＧｅｌＡカラム（２．５×１６ｃｍ；バイオラッド社
製）へ吸着させ、２５０ｍｌの同緩衝液にて洗浄溶出
後、３０ｍＭ 塩化カリウムを含む同緩衝液にて、０か
ら３０ｍＭの塩化カリウム濃度勾配溶出を行った（２２
５ｍｌずつ）。さらに、同様に３０ｍＭから１００ｍＭ
の塩化カリウム濃度勾配溶出を行った（２２５ｍｌず
つ）。２０ｍＭから３０ｍＭの塩化カリウム濃度にて溶
出されてくるアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈを含有す
る画分を集め（１８０ｍｌ）、限外濾過にて濃縮を行っ
た。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５１】濃縮液（７．２ｍｌ）をあらかじめ１０ｍ
Ｍ トリス−塩酸緩衝液（２ｍＭＣａ２＋を含む、ｐＨ
８．０）にて平衡化しておいたＣＭ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ
Ａカラム（１．６×１６ｃｍ；バイオラッド社製）へ吸
着させ、１５０ｍｌの同緩衝液にて洗浄溶出後、２５ｍ
Ｍ 塩化カリウムを含む同緩衝液にて、０から２５ｍＭ
の塩化カリウム濃度勾配溶出を行った（１５０ｍｌず
つ）。各フラクションの電気泳動の結果から、アルカリ
プロテアーゼＫ−１６Ｈのみを含む画分を集め（１２．
５ｍｌ）、限外濾過にて濃縮し（１ｍｌ）、最終濃度が
２０％（ｖ／ｖ）となるようにグリセロールを添加し、
使用時まで−２０℃にて保存した。
Ｍ トリス−塩酸緩衝液（２ｍＭＣａ２＋を含む、ｐＨ
８．０）にて平衡化しておいたＣＭ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ
Ａカラム（１．６×１６ｃｍ；バイオラッド社製）へ吸
着させ、１５０ｍｌの同緩衝液にて洗浄溶出後、２５ｍ
Ｍ 塩化カリウムを含む同緩衝液にて、０から２５ｍＭ
の塩化カリウム濃度勾配溶出を行った（１５０ｍｌず
つ）。各フラクションの電気泳動の結果から、アルカリ
プロテアーゼＫ−１６Ｈのみを含む画分を集め（１２．
５ｍｌ）、限外濾過にて濃縮し（１ｍｌ）、最終濃度が
２０％（ｖ／ｖ）となるようにグリセロールを添加し、
使用時まで−２０℃にて保存した。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５２】以上の操作により、粗酵素粉末１．５ｇ
（総括性、７９，５６０Ｕ；総蛋白、９１８ｍｇ；比活
性、８６．７Ｕ／ｍｇ）より、ポリアクリルアミドゲル
電気泳並びにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
にて均一なアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈ（総活性、
４０８Ｕ；精製蛋白質、３．４ｍｇ；比活性、１２０Ｕ
／ｍｇ）を得ることができた。
（総括性、７９，５６０Ｕ；総蛋白、９１８ｍｇ；比活
性、８６．７Ｕ／ｍｇ）より、ポリアクリルアミドゲル
電気泳並びにＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
にて均一なアルカリプロテアーゼＫ−１６Ｈ（総活性、
４０８Ｕ；精製蛋白質、３．４ｍｇ；比活性、１２０Ｕ
／ｍｇ）を得ることができた。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５３】
【発明の効果】上述の如く、粗酵素アルカリプロテアー
ゼＫ−１６から均一に精製された本発明のアルカリプロ
テアーゼＫ−１６Ｈは、各種の界面活性剤中で安定であ
る。従って、本発明酵素は洗浄剤配合用酵素として極め
て優れたものであり、洗剤等に有利に利用することがで
きるものである。
ゼＫ−１６から均一に精製された本発明のアルカリプロ
テアーゼＫ−１６Ｈは、各種の界面活性剤中で安定であ
る。従って、本発明酵素は洗浄剤配合用酵素として極め
て優れたものであり、洗剤等に有利に利用することがで
きるものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 川合 修次 栃木県河内郡河内町立伏471−199 (72)発明者 伊藤 進 栃木県宇都宮市東峰町3441−64
Claims (3)
- 【請求項１】 下記の酵素学的性質を有するアルカリプ
ロテアーゼＫ−１６Ｈ。 （１）作 用 単純蛋白質及び複合蛋白質を加水分解し、オリゴペプチ
ド又はアミノ酸を生成する。 （２）基質特異性 カゼイン、ヘモグロビン等の水可溶性蛋白質ならびにケ
ラチン、エラスチン等の水不溶性蛋白質に対して良好な
活性を有する。 （３）至適ｐＨ カゼインを基質とし、種々の緩衝液中で４０℃、１０分
間反応を行った場合、至適ｐＨは、９.０〜１１.０であ
る。さらに、ｐＨ６.０〜１３.０の範囲で最大活性値の
５０％以上の活性を有する。 （４）ｐＨ安定性 種々の緩衝液中にＣａ2+を加え、５５℃で１０分間処理
した場合、ｐＨ５.０〜１２.０の範囲で極めて安定であ
る。 （５）至適温度 カゼインを基質とし、ｐＨ１０.０で反応を行った場
合、至適温度は５５℃である。 （６）耐熱性 ｐＨ９.０、５０℃にて１０分間処理した場合、または
Ｃａ2+を加え６０℃にて１０分間処理した場合、９０％
以上の残存活性を有する。 （７）分子量 ２８,０００±１,０００（ドデシル硫酸ナトリウム（Ｓ
ＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による）。 （８）金属イオンの影響 カゼインを基質とした場合、Ｈｇ2+で活性が阻害され
る。また、Ｃａ2+で熱安定性及びｐＨ安定性が増大す
る。 （９）阻害剤の影響 エチレンジアミン四酢酸、ｐ−クロロマーキュリー安息
香酸、アンチパインで活性が阻害されない。フェニルメ
タンスルホニルフルオリド、キモスタチンによって活性
が阻害される。 （１０）界面活性剤の影響 ポリオキシエチレンアルキル硫酸ナトリウム、α−オレ
フィンスルホン酸ナトリウム、アルカンスルホン酸ナト
リウム、α−スルホ脂肪酸エステル等の界面活性剤が高
濃度に存在しても、極めて安定である。 - 【請求項２】 バチルス属に属する微生物により産生さ
れるものである請求項第１項記載のアルカリプロテアー
ゼＫ−１６Ｈ。 - 【請求項３】 バチルス属に属する微生物が、バチルス
・エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ.）ＫＳＭ−Ｋ１６
である請求項第２項記載のアルカリプロテアーゼＫ−１
６Ｈ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4356562A JP2794371B2 (ja) | 1992-12-22 | 1992-12-22 | アルカリプロテアーゼｋ−１６ｈ |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4356562A JP2794371B2 (ja) | 1992-12-22 | 1992-12-22 | アルカリプロテアーゼｋ−１６ｈ |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06181760A true JPH06181760A (ja) | 1994-07-05 |
| JP2794371B2 JP2794371B2 (ja) | 1998-09-03 |
Family
ID=18449650
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4356562A Expired - Fee Related JP2794371B2 (ja) | 1992-12-22 | 1992-12-22 | アルカリプロテアーゼｋ−１６ｈ |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2794371B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997016541A1 (fr) * | 1995-11-02 | 1997-05-09 | Novo Nordisk A/S | Protease alcaline, procede de production et utilisation de ladite protease, et micro-organisme la produisant |
| JP2009034063A (ja) * | 2007-08-03 | 2009-02-19 | Kao Corp | アルカリプロテアーゼの安定性向上方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01247084A (ja) * | 1988-03-28 | 1989-10-02 | Tosoh Corp | 新規耐熱性アルカリ性プロテアーゼ及びその製法 |
| JPH06506352A (ja) * | 1991-04-03 | 1994-07-21 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 新規プロテアーゼ |
-
1992
- 1992-12-22 JP JP4356562A patent/JP2794371B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH01247084A (ja) * | 1988-03-28 | 1989-10-02 | Tosoh Corp | 新規耐熱性アルカリ性プロテアーゼ及びその製法 |
| JPH06506352A (ja) * | 1991-04-03 | 1994-07-21 | ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ | 新規プロテアーゼ |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997016541A1 (fr) * | 1995-11-02 | 1997-05-09 | Novo Nordisk A/S | Protease alcaline, procede de production et utilisation de ladite protease, et micro-organisme la produisant |
| EP0859050A1 (en) * | 1995-11-02 | 1998-08-19 | Novo Nordisk A/S | Alkaline protease, process for the production thereof, use thereof, and microorganism producing the same |
| US5981255A (en) * | 1995-11-02 | 1999-11-09 | Novo Nordisk A/S | Alkaline protease, process for the production thereof, use thereof, and microorganism producing the same |
| EP0859050A4 (en) * | 1995-11-02 | 2001-10-17 | Novozymes As | ALKALINE PROTEASE, PROCESS FOR PRODUCTION AND USE OF SAID PROTEASE, AND MICROORGANISM PRODUCING THE SAME |
| JP2009034063A (ja) * | 2007-08-03 | 2009-02-19 | Kao Corp | アルカリプロテアーゼの安定性向上方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2794371B2 (ja) | 1998-09-03 |
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